CRISPR-Cas9 Adeno-İlişkili Virüs (AAV) ve 2 Hücreli Embriyo Elektroporasyonu Kullanılarak Sıçan Embriyolarının Genom Düzenlemesi

CRISPR tabanlı genom düzenleme araçlarının geliştirilmesi, yeni ve daha karmaşık genetiği değiştirilmiş sıçan modellerini verimli bir şekilde üretme yeteneğimizi hızlandırdı. Tek kılavuzlu RNA, Cas9 nükleaz ile birlikte, genom içindeki ilgilenilen DNA dizilerini hedefleyen ve çift sarmallı DNA kırılmalarına neden olan Ribonükleoprotein (RNP) kompleksleri oluşturmak üzere birleştirilir. Hücresel DNA onarım mekanizmaları hataya açık olduğundan, onarım işlemi sırasında hedef genin işlevini bozabilecek eklemeler ve silmeler (INDEL'ler) ortaya çıkar. Genom düzenleme reaktifleri ile birlikte istenen bir tasarlanmış DNA dizisinin (onarım şablonu) birlikte verilmesi durumunda, onarım şablonunun çift sarmallı DNA kırılmasını içeren bölgeye eklenmesi, homolojiye yönelik onarım (HDR) adı verilen bir işlemle gerçekleşir. Bu, hedeflenen DNA eklemeleri/ikameleri (knock-in'ler) ile hayvan modelleri oluşturmak için etkili bir stratejidir. Bir sınırlama, knock-in dizilerinin genellikle büyük boyutlu olmasıdır, bunun gen düzenleme verimliliğini azalttığı ve böylece istenen modelin oluşturulmasını daha zor hale getirdiği gösterilmiştir¹. Zincirleme verimliliği artırmaya yönelik stratejiler, hem çift sarmallı DNA (dsDNA) hem de tek sarmallı DNA (ssDNA) onarım şablonlarının doğrusallaştırılmasını ve DNA onarım şablonlarının kimyasal modifikasyonunu^{içermektedir 2,3,4}. Ek olarak, HDR uyarıcı bileşiklerle birlikte pronükleer mikroenjeksiyon, mikroenjeksiyon ile birlikte elektrik darbelerinin uygulanması ve 2 hücreli embriyolara zamanlanmış mikroenjeksiyon denenmiştir ^5,6,7. Bu yaklaşımların bazılarının başarısına rağmen, 1.0 kb'den daha büyük DNA dizilerinin dahil edilmesi teknik olarak zor olmaya devam etmektedir.

Reaktifleri kültürlenmiş hücre hatlarına sokmak için yaygın bir yöntem olan elektroporasyon, CRISPR-Cas9 bileşenlerini embriyolara vermek için mikroenjeksiyona bir alternatif sunar. İlk olarak sıçan embriyolarında⁸ gösterilen embriyo elektroporasyonu, o zamandan beri farelerde ^{9,10,11,12,13}, domuzlarda^14,15 ve diğer hayvan model organizmalarında 16,17,18 bir dağıtım yöntemi olarak başarıyla kullanılmıştır.. CRISPR-Cas9 reaktifleri içeren ortamda süspanse edilen embriyolar, iki elektrot arasında bir küvete veya bir cam slayt üzerine yerleştirilir ve doğrudan elektrik akımı darbelerine maruz bırakılır. Bu, CRISPR-Cas9 bileşenlerinin embriyolara girdiği zona pellucida ve embriyo plazma zarında geçici açıklıklar oluşturur. Tipik olarak, geçici açıklıkları oluşturmak için orta seviyeli elektriksel "gözenek" darbeleri kullanılır, ardından negatif yüklü genom düzenleme bileşenlerinin hareketini kolaylaştıran daha düşük seviyeli elektriksel "transfer darbeleri" gelir. Embriyo elektroporasyonu verimlidir, yüksek verime sahiptir ve gerçekleştirilmesi kolaydır. Bununla birlikte, embriyo elektroporasyonunun küçük (^<200 bp) ssDNA onarım şablonlarının tanıtımı için oldukça başarılı olduğu gösterilmiş olsa da, daha büyük (^>1.0 kb) onarım şablonlarının başarılı elektroporasyonuna dair çok az rapor vardır^13,19. Bu boyut kısıtlaması, büyük yerleştirmeler gerektiren knock-in hayvan modelleri oluşturmak için embriyo elektroporasyonunun önemli bir sınırlamasını temsil eder.

Gen terapisi bağlamında, adeno-ilişkili virüsler (AAV'ler), hem bölünen hem de bölünmeyen hücrelerin in vivo enfektivitesi, patojenite eksikliği ve nadir genomik entegrasyon nedeniyle genetik materyali iletmek için uzun süredir araç olarak kullanılmaktadır^20,21. Son zamanlarda, daha fazla çalışma, DNA onarım şablonlarını ve CRISPR reaktiflerini tanıtmak için AAV'leri CRISPR-Cas9 teknolojisiyle birleştirdi 22,23,24. Bu yaklaşım, mikroenjeksiyon tekniklerine ihtiyaç duymadan daha büyük DNA onarım şablonlarının sunulmasına izin verir.

HDR yolu, hücre döngüsünün geç S ve G2 fazlarında daha aktiftir^25,26. İn vitro olarak yapılan çalışmalarda, CRISPR-Cas9 RNP'lerinin ve DNA onarım şablonlarının G2 ile senkronize hücrelere verilmesi veya Cas9 proteininin varlığının bir Cas9-Geminin füzyon proteini² kullanılarak geç S ve G2 fazlarına kısıtlanmasıyla zincirleme verimlilikte önemli artışlar elde edilmiştir. Ayrıca, 2 hücreli aşama embriyosunun genişletilmiş G2 fazı sırasında meydana gelen büyük bir zigotik genom aktivasyonu (ZGA) olayı vardır ve bu, açık bir kromatin durumu ile ilişkilidir. Bunun, CRISPR-Cas9 RNP'lerine ve onarım şablonlarına genomik DNA'ya daha fazla erişilebilirlik sağladığı tahmin edilmektedir.

Amacımız, embriyo gelişiminin 2 hücreli aşamasında CRISPR-Cas9 RNP'leri tanıtmak için AAV yaklaşımını embriyo elektroporasyonu ile birleştirerek tüm bu gözlemleri geliştirmekti. Bu strateji, DNA eklemelerinin hedeflenen genetik mühendisliği için etkili bir yöntem oluşturmak için AAV'nin daha büyük DNA onarım şablonu dağıtım kapasitesinden, elektroporasyonun teknik kolaylığından ve embriyo gelişimi sırasında genomik erişilebilirlik için daha uygun 2 hücreli zaman noktasından yararlanır. Bu protokolde vurgulandığı gibi, optimize edilmiş yöntemimiz, mikroenjeksiyon tekniklerine ihtiyaç duymadan 1.2 ila 3.0 kb boyutunda DNA dizilerinin eklenmesini taşıyan hedefli knock-in sıçan modellerinin üretilmesine izin verir.

Tüm deneysel prosedürler Missouri Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (ACUC protokolü #25580) tarafından onaylandı ve Laboratuvar Hayvanlarının Kullanımı ve Bakımı Kılavuzu'nda belirtilen yönergelere göre gerçekleştirildi.

1. AAV aracılı DNA onarım şablonu teslimi

1. DNA yapısını, iki homoloji kolu arasında istenen knock-in dizisini içerecek şekilde tasarlayın. Tipik homoloji kol uzunlukları 300-500 bp uzunluğundadır. Uygun bir plazmit omurgasına klonlanarak ve rekombinant ssAAV1 veya ssAAV6'ya (serotip 1 veya 6) paketlenerek tüm DNA onarım şablonunun (homoloji kolları + istenen knock-in dizisi) ters çevrilmiş terminal tekrarları (ITR'ler) ile çevrili olduğundan emin olun.
   NOT: DNA onarım şablonunda sgRNA hedef dizisi mevcutsa, bu diziyi bozmak için sessiz mutasyonlar tasarlamak ve böylece doğru hedeflenmiş alelin CRISPR-Cas9 aracılı düzenlemesini önlemek önemlidir.
   DİKKAT: Rekombinant AAV viral vektörleri entegre değildir ve BSL-1 olarak sınıflandırılır. Virüse maruz kalmış embriyoların pipetlenmesi ve işlenmesi için standart aseptik teknikler kullanılır.
2. 35 mm'lik Petri kabında mineral yağ altında 30 μL KSOM-R ortamına^27,28 3 × 10⁷ genom kopyası (GC)/μL'lik bir nihai konsantrasyona kadar tasarlanmış ssAAV1 veya ssAAV6 (DNA onarım şablonuyla paketlenmiş) ekleyin.
3. Görünür pronükleuslara sahip zigotları, tasarlanmış ssAAV içeren KSOM-R ortamına yerleştirin.
   NOT: Bu protokolü kullanarak, AAV serotip 1 ve 6, verimli DNA onarım şablonu iletimi için kolayca geçebildiğinden, zona pellucida'yı inceltmeye gerek yoktur.
4. Yeterli viral transdüksiyona izin vermek için% 5 CO₂ ve maksimum nem ile 37 ° C'de 18-20 saat inkübe edin.

2. Elektroporasyon hazırlığı

1. Ertesi gün, steril bir RNaz içermeyen tüpte Opti-MEM ortamında seyreltilmiş 100 ng/μL sgRNA ve 100 ng/μL Cas9 proteini içeren bir elektroporasyon karışımı yapın. Yavaşça karıştırın.
2. RNP oluşumuna izin vermek için oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
3. İnkübasyon süresi boyunca, elektroporatörü açın ve uçları 1,5 mm boşluklu bir cam kayar elektroda bağlayın.
4. Elektroporasyon parametrelerini Tablo 1'de açıklandığı gibi ayarlayın.

3. 2 hücreli embriyo elektroporasyonu

1. Çözeltiye hava kabarcıkları girmemesine dikkat ederek, cam slayt üzerindeki iki elektrot arasına 5 μL CRISPR elektroporasyon karışımını nazikçe pipetleyin.
2. 2 hücreli aşama embriyosunu AAV çözeltisinden çıkarın. 2 hücreli aşamadaki embriyoları, elektrotların kenarlarına dokunmalarına izin vermeden karışımda sıralayın. Bu lizisi önlemek için yapılır.
3. Empedansı ölçmek için Ohm düğmesine basın. Empedansın 0,100 ile 0,300 kΩ arasında olduğundan emin olmak için kontrol edin. Reaksiyon hacmi empedansı değiştirecektir (empedansı azaltmak için hacim ekleyin ve empedansı artırmak için hacmi çıkarın).
4. Başlat'a basın. İşlemin tamamlanması birkaç saniye sürer.
5. Elektroporasyondan hemen sonra embriyoları çıkarın ve 30 μL'lik taze KSOM-R besiyerinde 3 kez yıkayın.
6. Embriyoları, mineral yağ altında 500 μL damla KSOM-R ortamında in vitro kültür için% 5 CO₂ ve maksimum nem ile 37 ° C'lik inkübatöre geri yerleştirin. Alternatif olarak, canlı yavrular üretmek için embriyoları cerrahi olarak 1.5 günlük bir koitum sonrası (dpc) yalancı gebe dişi sıçana aktarın.

Şekil 1: CRISPR-Cas9 genom düzenlemesi için AAV aracılı DNA iletimi ve 2 hücreli embriyo elektroporasyon boru hattının şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protokolü takiben, 2 hücreli embriyolar CRISPR-Cas9 RNP'ler ile elektroporasyona tabi tutulduktan sonra yüksek verimli HDR'ye izin veren DNA onarım şablonunun etkili AAV aracılı iletimi vardır. Videoda gösterildiği gibi, başarılı bir elektroporasyon işlemi, her elektrotta kabarcıkların oluşmasına (Şekil 2C) ve empedansın 0.100 ile 0.300 kΩ aralığında kalmasına neden olur. Elektroporasyondan sonra, embriyoların zona pellucida içindeki perivitellin boşluğunu doldurarak şişmesi nadir değildir (Şekil 3). Bu şişlik kültürde birkaç saat sonra azalmalıdır. 2 hücreli embriyoların elektropoze edilmesinden sonra hücresel füzyon olaylarının küçük bir yüzdesini (% 20'ye kadar) görmek de nadir değildir (Şekil 3). Hücresel füzyon, elektrotlar arasındaki dikey eksen hizalaması yerine dikkatli yatay eksen hizalaması ile potansiyel olarak önlenebilir (Şekil 2B). Bununla birlikte, tipik olarak elektroporasyon işleminden sonra kaynaşmış embriyoları atarız.

2 hücreli embriyo CRISPR-Cas9 RNP elektroporasyon tekniği ile AAV aracılı DNA dağıtımımızın, hedeflenen yerleştirmelerle knock-in sıçan modelleri oluşturmak için oldukça etkili olduğu kanıtlanmıştır. Yöntemimizi sıçan embriyolarında test ederken ve loxP bölgeleri içeren tasarlanmış kısa bir yapay intron'un yerleştirilmesi için kültürlenmiş blastosistleri tarayarak, blastosistlerin% 60'ından fazlasının Yeni Nesil Dizi (NGS) analizine dayalı olarak doğru hedeflenmiş knock-in alelini içerdiğini kaydettik (Şekil 4). Ayrıca, canlı knock-in sıçanlar üretme yöntemimizi test ederek, sıçan Drd2 geninin ATG başlangıç bölgesini hedefleyen bir Cre rekombinaz kodlama dizisi tasarlamak için bir proje tasarladık. AAV ile paketlenmiş DNA donör şablonu, AAV paketlemesi için gerekli ITR dizileri, bir 5' homoloji kolu (422bp uzunluğunda), bir Cre-pA dizisi (1,339bp uzunluğunda) ve bir 3' homoloji kolundan (477bp uzunluğunda) oluşuyordu (Şekil 5A). Doğan 11 yavrudan 10'u, sıçan Drd2'nin ATG başlangıç bölgesine doğru şekilde yerleştirilmiş Cre-pA dizisi için PCR analizi ile pozitifti (Şekil 5B-D). Hedeflenen yerleştirme daha sonra DNA dizi analizi ile doğrulandı. 7 farklı projenin bir özeti olarak, homoloji kol bağlantılarında PCR analizi ve DNA dizisi doğrulaması ile belirlenen kurucu hayvanlarda ortalama %76'lık bir nakavt başarı oranı elde ettik (Tablo 2).

Tablo 1: Elektroporasyon parametreleri. Elektroporasyon sırasında Akım Limitinin AÇIK olduğundan emin olun.

Şekil 2: 2 hücreli embriyo elektroporasyon işlemi. (A) Cam slayt elektrodu. (B) CRISPR-Cas9 genom düzenleme reaktiflerinde süspanse edilen ve elektroporasyondan önce cam slayt elektroda yüklenen embriyolar. (C) Elektroporasyon sırasında her elektrotta hava kabarcığı oluşumu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Elektroporasyon sonrası embriyo görünümü. Elektroporasyondan sonra 2 hücreli embriyoların% 20'sine kadar hücresel füzyon görülür. Embriyonik hücreler ayrıca perivitellin boşluğunu dolduran zona pellucida'nın içinde şişebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Kültür sıçan blastosistlerinde AAV aracılı DNA iletimi ve 2 hücreli embriyo elektroporasyon knock-in etkinliği. Veriler, Yeni Nesil Dizileme (NGS) ile doğru knock-in alel tespiti için pozitif blastosistlerin yüzdesi olarak sunulmuştur. N=28 blastokist (sadece kültür kontrol grubu), N=37 blastosist (sadece elektroporasyon (EP) kontrol grubu) ve N=35 blastosist (AAV+EP grubu). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Bir Drd2-Cre knock-in sıçan modelinin oluşturulması. (A) Sıçan Drd2 geninin hedeflenmesi. RNP kompleksi, kodlama bölgesi başlangıç bölgesini içeren Exon 2'yi hedeflemek için tasarlanmıştır. AAV donör şablonu, viral ters çevrilmiş terminal tekrar dizileri (ITR), 5' ve 3' Drd2 gen homoloji kolları (HA) ve bir poliA dizisine sahip Cre genini içeriyordu. Donör şablonunun başarılı bir şekilde entegrasyonu, Cre geni 3'ü Exon 2 içindeki başlangıç bölgesine vurur. Bu, Cre genini Drd2 promotörün kontrolü altına alırken aynı zamanda Drd2 genini devre dışı bırakır. Başarılı knock-in'in doğrulanması için kullanılan PCR primerlerinin yeri mor oklarla gösterilir. (B) Potansiyel olarak genomu düzenlenmiş hayvanların (Lanes B10-C8) 5' homoloji kolu boyunca uzanan primerlerle PCR analizi. Şerit C9: vahşi tip (negatif kontrol); Şerit C10: şablon yok (negatif kontrol). Knock-in pozitif hayvanlar için beklenen amplikon boyutu 601bp'dir. (C) Potansiyel olarak genomu düzenlenmiş hayvanların (Lanes D8-E6) PCR analizi, 3' homoloji kolu boyunca uzanan primerlerle. Şerit E7: vahşi tip; Şerit E8: şablon kontrolü yok. Knock-in pozitif hayvanlar için beklenen amplikon boyutu 676bp'dir. (D) Cre geni tespiti. Beklenen amplikon boyutu 381bp'dir. Şeritler C7-D5: potansiyel kurucular; Şerit D6: vahşi tip; Şerit D7: şablon kontrolü yok. PCR reaksiyonları, 15bp-3kb hizalama belirteçleri (yeşil ile gösterilmiştir) ile kapiler elektroforez ile analiz edildi. QX DNA boyut işaretleyicisi, baz çiftlerinde (bp) PCR amplikon boyutuna karşılık gelen tepe boyutuyla her görüntünün solunda gösterilir. Bu şekil, referans24'ün izniyle değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: Knock-in model başarı oranları

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.