Hücre sferoidlerinin seri üretimi için üç boyutlu akustik montaj cihazı

Konvansiyonel 2D kültür modellerine kıyasla daha fazla in vivo benzeri yapısal ve morfolojik özellikler sağlayan 3D in vitro kültür modelleri, doku mühendisliği, hastalık modellemesi ve ilaç taraması gibi çeşitli biyomedikal uygulamalarda umut verici sistemler olarak kabul edilmiştir ^1,2,3. Bir tür 3D kültür modeli olarak, hücre sferoidleri tipik olarak hücre agregasyonuna atıfta bulunur ve gelişmiş hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimleri ile karakterize edilen 3D küresel yapılar oluşturur ^4,5,6. Bu nedenle, hücre sferoidlerinin üretilmesi, çeşitli biyolojik çalışmalara olanak sağlamak için güçlü bir araç haline gelmiştir.

Sferoidleri elde etmek için asılı damla⁷, yapışkan olmayan plakalar⁸ veya mikrokuyu cihazları⁹ dahil olmak üzere çeşitli teknikler geliştirilmiştir. Prensip olarak, bu yöntemler genellikle hücreler ve substrat arasındaki etkileşimleri en aza indirirken yerçekimi kuvveti gibi fiziksel kuvvetleri kullanarak hücre montajını kolaylaştırır. Bununla birlikte, genellikle emek yoğun süreçleri içerirler, düşük üretkenliğe sahiptirler ve^{küresel boyut 10,11'i} kontrol etmek için zorluklar oluştururlar. Daha da önemlisi, istenen büyüklükte ve homojenlikte yeterli miktarda sferoidlerin üretimi, spesifik biyolojik uygulamaları karşılamak için son derece önemlidir. Yukarıda belirtilen yöntemlerin aksine, akustik dalgalar, bir tür dış kuvvetle çalışan teknik^olarak 12,13,14, dış kuvvetler yoluyla hücre agregasyonunu artırma ilkesine dayalı olarak, hücre sferoidlerinin yüksek kalite ve verimle seri üretimi için potansiyel göstermiştir 15,16,17,18. Elektromanyetik veya manyetik kuvvetlerin aksine, akustik tabanlı hücre manipülasyon teknikleri non-invaziv ve etiketsizdir, mükemmel biyouyumluluk ile sferoid oluşumunu sağlar^19,20.

Yaygın olarak, duran yüzey akustik dalgaları (SAW'lar) ve toplu akustik dalgalar (BAW'lar) tabanlı cihazlar, karşılık gelen duran akustik alanlar ^21,22,23 tarafından üretilen akustik düğümleri (AN'ler) kullanarak sferoidler oluşturmak için geliştirilmiştir. Özellikle, uygun üretim, kolay kullanım ve mükemmel ölçeklenebilirlik özelliklerine sahip BAW'lara dayalı akustik montaj cihazları, hücre sferoidlerinin^imalatında dikkat çekmiştir ^24,25. Kısa bir süre önce, yüksek verim²⁶ ile sferoidler üretme yeteneğine sahip, BAWS tabanlı basit bir akustik montaj cihazı geliştirdik. Önerilen cihaz, sırasıyla X/Y/Z düzleminde düzenlenmiş üç kurşun zirkonat titanat (PZT) dönüştürücüye sahip bir kare polimetil metakrilat (PMMA) odasından oluşur. Bu düzenleme, hücre montajını yürütmek için havaya kaldırılmış akustik düğümlerden (LAN'lar) oluşan bir 3B nokta dizisi modelinin oluşturulmasını sağlar. Yalnızca 1D veya 2D ANs ^27,28,29 dizisi oluşturabilen daha önce bildirilen BAW'lar veya SAW'lar tabanlı cihazlarla karşılaştırıldığında, mevcut cihaz, jelatin metakriloyl (GelMA) çözeltisi içinde hızlı hücre agregası oluşumu için bir 3D nokta LAN dizisi sağlar. Daha sonra, hücre agregaları, üç günlük ekimden sonra fotokürlenmiş GelMA iskeleleri içinde yüksek canlılığa sahip sferoidlere olgunlaştı. Son olarak, aşağı akış uygulamaları için GelMA iskelelerinden tek tip boyuta sahip çok sayıda sferoid kolayca elde edildi.

1. 3D akustik montaj cihazının imalatı

1. Lazer kesim³⁰ ile 1 mm kalınlığında dört adet PMMA tabakası hazırlayarak başlayın ve ardından iç genişliği 21 mm ve yüksekliği 10 mm olan kare bir oda oluşturmak için bunları birbirine yapıştırmaya devam edin.
2. Ardından, biyomürekkep için bir tutucu görevi görmesi için haznenin altına 1 mm kalınlığında başka bir PMMA tabakası takın.
3. Üç kurşun zirkonat titanat (PZT) dönüştürücüsünü (her biri 20 mm uzunluğunda, 10 mm genişliğinde, 0.7 mm kalınlığında ve birincil rezonans frekansı 3 MHz, Malzeme Tablosuna bakınız) sırasıyla odanın üç ortogonal duvarının dışına dikkatlice yapıştırın. Alt PZT dönüştürücünün haznenin altında ortalandığından emin olun.
4. Her PZT dönüştürücünün iki iletken alanına lehim telleri.
5. Son olarak, alt PZT'nin diğer tezgahlarla temas etmesini önlemek için cihazı içi boş bir tabana sabitleyin.

2. Akustik montaj sisteminin kurulması

1. Akustik cihazı bir mikroskop tablasına monte ederek başlayın, odanın iç kısmının üstten görünüşlü gözlemine izin verin.
2. Cihazın PZT transdüserlerinden arındırılmış yan tarafına, odanın iç kısmının yandan görünümünün gözlemlenmesini sağlayan bir dijital mikroskop yerleştirin.
3. Üç PZT dönüştürücüsünden gelen kabloları seri olarak üç güç amplifikatörüne ve fonksiyon üreteçlerinin üç çıkış kanalına bağımsız olarak bağlayın (Malzeme Tablosuna bakın).
4. Sinüzoidal dalga formu, frekans ve genlik gibi parametreleri belirterek her PZT dönüştürücü için fonksiyon üreteçlerindeki ayarları programlayın.
5. Sterilizasyonu sağlamak için, akustik cihazın haznesini 5 dakika boyunca% 75 alkolle doldurun, ardından steril PBS solüsyonu ile iyice temizleyin. Daha sonra, odayı en az 1 saat boyunca temiz bir tezgahta UV ışığı ile ışınlayın.

3. Hücre kültürü ve hasat prosedürü

1. Bir insan hepatoselüler karsinom hücre hattı olan C3A hücrelerini, %10 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamını (DMEM) kullanarak bir T25 hücre kültürü şişesinde kültürleyerek başlayın (bkz.
2. C3A hücreleri yaklaşık% 80 birleşmeye ulaştığında, hücre geçişini aşağıdaki gibi gerçekleştirin: ilk olarak, kültür şişesinin tabanını PBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra, hücre kültürü şişesine 2 mL %0.05 tripsin-EDTA ekleyin ve hücre ayrılmasını kolaylaştırmak için 37 °C'de inkübe edin. 2 mL tam kültür ortamı ekleyerek tripsinizasyon işlemini durdurun.
3. Hücre çözeltisini 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve bir hücre peleti elde etmek için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüjleyin.

4. Bioink'in hazırlanması

1. 0.3 g GelMA ve 0.025 g LAP'ı (Malzeme Tablosuna bakınız) 5 mL fosfat tampon çözeltisi (PBS) içinde çözerek% 0.5 (a / h) lityum fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinat (LAP) içeren% 6 (a / h) GelMA çözeltisi hazırlayın. Karışımı 47 °C'lik bir su banyosunda 1 saat bekletin.
2. Hücrelerle karıştırmadan önce, sterilizasyon için GelMA çözeltisini 0.22 μm'lik bir filtreden (Malzeme Tablosuna bakınız) geçirin.
3. Yukarıda bahsedilen hücre peletini (adım 3.3) hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin. Az miktarda hücreyi% 0.4 tripan mavisi çözeltisi ile boyayın ve ardından hücre sayımı için temiz bir hemositometre kullanın.
4. 2 × 10⁶ hücre/mL hücre yoğunluğuna sahip biyomürekkebi hazırlamak için yukarıda elde edilen hücre yoğunluğuna göre hesaplanan uygun miktarda C3A hücresini sterilize edilmiş GelMA solüsyonu ile karıştırın.
5. Birleştirilmiş hücre sferoidlerinin görselleştirilmesi için, C3A hücrelerini 2 μM hücre izleyici (DiO boyası, Malzeme Tablosuna bakınız) ile 37 °C'de 20 dakika inkübe ederek önceden boyayın. Daha sonra, etiketli hücreleri kullanmadan önce üç kez taze hücre kültürü ortamıyla yıkayın.

5. Akustik cihazı kullanarak hücre sferoidlerinin montajı

1. Sterilize edilmiş hazneye 1 mL'den fazla biyomürekkebi pipetleyin. Sıvı yüzeyi ile hazne tabanı arasındaki yüz yüze mesafenin, akustik dalga boyunun yarısının tam sayı katı olduğundan emin olun.
   NOT: Eklenen biyomürekkebin hacmini ayarlayarak bu mesafe kontrol edilebilir. Akustik dalga boyu (λ), λ = c/f formülü kullanılarak tahmin edilebilir, burada c ortamdaki ses hızını temsil eder ve f, PZT dönüştürücünün frekansıdır.
2. Fonksiyon üretecini ve gücü açın amplifier her bir PZT dönüştürücünün çalıştırılmasını başlatmak için.
   NOT: Optimum paralel hat hücresel modelini elde etmek için önce her bir PZT dönüştürücüsünün ayrı ayrı çalıştırılması önerilir. Bu, her bir PZT dönüştürücü için birincil rezonans frekansına yakın 0.001 MHz'lik bir adım boyutuna sahip bir frekans taraması gerçekleştirilerek elde edilebilir. Daha sonra, beklenen 3D noktalı hücresel modeli elde etmek için bu optimum sinyalleri aynı anda üç PZT dönüştürücüsüne de uygulayın. Her bir giriş sinyalini uygulamadan önce, hafifçe çalkalayarak hücrelerin biyomürekkep içinde eşit şekilde dağıldığından emin olun.
3. Akustik olarak bir araya getirilen hücre agregalarını kapsülleyen bir 3D hidrojel iskele oluşturmak için mavi ışık (405 nm, 60 mW/^cm2, 30 s) kullanarak biyomürekkebi çapraz bağlayın. Ardından, fonksiyon üretecini ve güç amplifikatörünü kapatın.
4. 3D hidrojel iskeleyi hazneden dikkatlice bir Petri kabına aktarın ve temiz bir tıraş bıçağı kullanarak küçük parçalara (örn. 2 mm × 2 mm × 2 mm) kesin.
5. Yetiştirme için hücre kültürü ortamı ekleyin.
   NOT: Kültür ortamını her gün değiştirmeyi unutmayın.

6. Hücre sferoidlerinin alınması

1. Ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak iskelelerin farklı katmanlarında küresel oluşumu gözlemleyerek başlayın.
2. 3 günlük kültürden sonra, kültür ortamını çıkarın ve hidrojel iskeleleri PBS ile iki kez iyice yıkayın.
3. İskeleleri, bir hücre inkübatöründe 30 dakika boyunca hücre kültürü ortamı ile 1: 200 seyreltmede 2 mL'den fazla GelMA lizis tamponu ile inkübe edin. Bu adım, hidrojel iskelelerini çözmeyi amaçlar.
4. Çözeltiyi önceki adımdan bir tüpe aktarın ve ardından hücre sferoid peletini elde etmek için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüjleyin.
5. Süpernatanı atın ve sonraki uygulamalar için peleti taze kültür ortamında yeniden süspanse edin.

7. Küresel canlılık analizi

1. Hücre sferoidlerinin hidrojel iskeleleri içinde veya alınan sferoidlerde canlılığını canlı/ölü boyama kiti kullanarak değerlendirin (bkz.
2. Numuneleri farklı kültür zaman noktalarında 1 μL Calcein-ve 2 μL Propidyum İyodür (PI) içeren 1 mL PBS çözeltisi ile 37 °C'de 15 dakika inkübe edin.
3. Hidrojel iskelelerdeki numuneler için, bunları doğrudan PBS ile iki kez yıkayın. Alınan sferoidler için, bir küresel pelet elde etmek için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüjleyin ve gözlemden önce iki kez yıkayın.
4. Bir floresan mikroskobu kullanarak numuneleri gözlemleyin ve floresan görüntülerini yakalayın.
5. Küresel canlılığı belirlemek için ImageJ kullanarak Calcein-ile boyanan alanın hem Calcein-hem de PI ile boyanan toplam alana oranını hesaplayın.

Bu çalışma, hücre kürelerinin seri üretimi için bir 3D akustik montaj cihazı tasarladı. Akustik cihaz, odanın dış yüzeyinde X-düzlemine ve Y-düzlemine bağlı iki PZT dönüştürücü ve odanın tabanında bir PZT dönüştürücü bulunan kare bir odadan oluşuyordu (Şekil 1A,B). PZT transdüserlerini harekete geçirmek için üç bağımsız sinüzoidal sinyal üretmek için iki fonksiyon üretecinden üç çıkış kanalı üç güç amplifikatörüne bağlandı (Şekil 1C).

Odanın X/Y/Z düzlemlerine bağlı üç PZT dönüştürücüyü harekete geçirmek için kullanılan optimum rezonans frekansları sırasıyla 3.209 MHz, 3.283 MHz ve 3.215 MHz idi. Her üç PZT transdüseri için optimum genlik, bir osiloskop ile ölçülen 10 tepeden tepeye çıkış voltajı (Vpp) idi. Şekil 2A , 3D akustik montaj cihazı kullanılarak üretilen hücre agregalarının çalışma mekanizmasını göstermektedir. Sinyal uygulandığında, hücreler akustik radyasyon kuvvetinin (ARF) etkisi altında akustik düğümlere sürülür. Hücre sferoidlerini görselleştirmek için, hücreler 2 μM DiO (yeşil floresan) ile önceden boyandı. Akustik hücre montajından sonra, 3D akustik olarak monte edilmiş hücre agregalarını gözlemlemek için konfokal bir mikroskop kullanıldı. Bu hücre agregatlarının, tek tip yeşil floresan sinyalleri ile düzenli bir 3D nokta dizisi modelinde düzenlendiği gözlemlendi (Şekil 2B). Parlak alan görüntülerinin farklı üstten görünümleri, her katmanda oluşan kümelerin 2B nokta dizisi düzeninde düzenlendiğini de göstermiştir (Şekil 2C).

Hidrojel içindeki hücre agregalarının farklı zaman noktalarında büyümesi gözlemlendi. Sonuçlar, bir araya getirilen agregaların, sferoid çapında bir artışla birlikte 3. günde kademeli olarak bütünleştiğini ve sıkı sferoidler oluşturduğunu gösterdi (Şekil 3A,B). Hücre sferoidlerinin canlılığını değerlendirmek için canlı/ölü boyama yapıldı. 3. günden önce iyi hücre canlılığı (% >90) elde edilirken, canlılık bir haftalık kültürden sonra biraz azaldı (Şekil 3C, D).

Sferoidlerin alınması için, hidrojel iskelelerini ayırmak ve kapsüllenmiş hücre sferoidlerini serbest bırakmak için bir GelMA lizis tamponu kullanıldı (Şekil 4A). Sonuç olarak, üç günlük ekimden sonra, küçük hidrojel iskele parçaları, 30 dakika boyunca 37 ° C'de GelMA lizis tamponu ile muamele edildi. Serbest bırakılan sferoidler, albümin ekspresyonu ve arzu edilen canlılık ile birlikte dar bir boyut dağılımı ile iyi bir küresel morfolojiyi korudu (Şekil 4B-D).

Şekil 1: 3D akustik montaj cihazı. (A) Üç PZT dönüştürücüye bağlı bir PMMA odasından oluşan 3D akustik montaj cihazının üstten görünümünü gösteren şematik diyagram. (B) Gerçek 3D akustik montaj cihazını gösteren fotoğraf. (C) İki fonksiyon üreteci ve üç güç amplifikatörü ile bağlanmış 3D akustik montaj cihazını gösteren fotoğraf. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Akustik olarak birleştirilmiş hücre agregaları. (A) Hücrelerin akustik radyasyon kuvveti ile akustik düğümlere sürüldüğü 3D akustik montaj cihazı tarafından üretilen hücre agregalarının çalışma mekanizmasını gösteren şematik. (B) 3D akustik olarak bir araya getirilmiş hücre agregalarını farklı perspektiflerden gösteren konfokal görüntüler. (C) Hidrojel iskelesi içindeki çeşitli katmanlarda oluşan hücre agregalarını gösteren parlak alan görüntüleri. Ölçek çubuğu 250 μm'yi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: GelMA iskelesi içinde hücre agregatlarının sferoidlere dönüşmesi. (A) 3 günlük bir kültür periyodundan sonra kompakt hücre sferoidlerinin oluşumunu gösteren parlak alan görüntüleri. (B) Küresel boyutların ölçülmesi. (C) Bir haftalık kültürden sonra hidrojel iskelesi içindeki sferoidlerin canlı/ölü boyanması. (D) Hücre sferoid canlılığının ölçülmesi. Ölçek çubuğu 250 μm'yi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Akustik olarak üretilmiş hücre sferoidlerinin alınması. (A) Akustik olarak üretilmiş hücre sferoidlerini alma adımlarını gösteren resim. (B) Alınan sferoidleri farklı büyütmelerde gösteren parlak alan görüntüleri. Ölçek çubuğu 250 μm'yi temsil eder. (C) Alınan sferoidlerin canlılık ve işlevselliğinin analizi. Ölçek çubuğu 100 μm'yi temsil eder. (D) Alındıktan sonra sferoidlerin boyut dağılımı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.