Method Article

Miyelodisplastik Sendrom ve Akut Miyeloid Lösemide Kemik İliği Mikroçevresel Popülasyonlarının Belirlenmesi

DOI:

10.3791/66093

⸱

November 10th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Wilmot Cancer Institute, University of Rochester Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, 3Department of Biomedical Genetics, University of Rochester Medical Center, 4Genomics Research Center, University of Rochester Medical Center, 5Division of Endocrinology and Metabolism, Department of Medicine, University of Rochester Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, miyelodisplastik sendromlar ve akut miyeloid löseminin murin modellerinden kemik iliği mikroçevre popülasyonlarını izole etmek ve karakterize etmek için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Bu teknik, endotelyal ve mezenkimal stromal hücreler dahil olmak üzere hematopoietik olmayan kemik iliği nişindeki değişiklikleri hastalık ilerlemesi ile tanımlar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kemik iliği mikroçevresi, hematopoietik kök hücreler (HSC'ler) için destek sağlayan mezenkimal stromal hücreler, endotel hücreleri, osteolineage hücreleri ve fibroblastlar gibi farklı hücre popülasyonlarından oluşur. Normal HSC'leri desteklemenin yanı sıra, kemik iliği mikroçevresi, miyelodisplastik sendromlar (MDS) ve akut miyeloid lösemi (AML) gibi hematopoietik kök hücre bozukluklarının gelişiminde de rol oynar. HSC'lerde MDS ile ilişkili mutasyonlar, özellikle yaşlılarda farklılaşmada bir bloğa ve ilerleyici kemik iliği yetmezliğine yol açar. MDS sıklıkla tedaviye dirençli AML'ye ilerleyebilir, bu hastalık hızlı bir şekilde olgunlaşmamış miyeloid patlamaların birikmesi ile karakterize bir hastalıktır. Bu miyeloid neoplazmları olan hastalarda kemik iliği mikroçevresinin değiştiği bilinmektedir. Burada, miyelodisplastik sendrom ve akut miyeloid löseminin murin modellerinden kemik iliği mikroçevresel hücrelerini izole etmek ve fenotipik olarak karakterize etmek için kapsamlı bir protokol açıklanmaktadır. Kemik iliği niş popülasyonlarındaki değişikliklerin izole edilmesi ve karakterize edilmesi, hastalığın başlaması ve ilerlemesindeki rollerinin belirlenmesine yardımcı olabilir ve kemik iliği stromal popülasyonlarında kanseri teşvik eden değişiklikleri hedefleyen yeni terapötiklerin geliştirilmesine yol açabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kemik iliği mikroçevresi hematopoietik hücrelerden, hematopoietik olmayan stromal hücrelerden ve hücre dışı matriks 1,2'den oluşur. Bu mikro çevre, hematopoietik kök hücrenin kendi kendini yenilemesini teşvik edebilir, soy farklılaşmasını düzenleyebilir ve kemik dokusuna yapısal ve mekanik desteksağlayabilir 1,2,3,4,5. Stromal niş, osteosoy hücrelerini, fibroblastları, sinir hücrelerini ve endotel hücrelerini6 içerirken, hematopoietik niş, lenfoid ve miyeloid popülasyonlardanoluşur 1,2,3. Normal HSC'leri desteklemenin yanı sıra, kemik iliği mikroçevresi de MDS ve AML 7,8,9,10,11 gibi hematopoietik kök hücre bozukluklarının gelişiminde rol oynayabilir. Osteolineage hücrelerindeki mutasyonların MDS, AML ve diğer miyeloproliferatif neoplazmların gelişimini desteklediği gösterilmiştir 10,12,13,14.

Miyelodisplastik sendromlar, hematopoetik kök hücrelerdeki mutasyonlardan kaynaklanan bir grup pre-lösemik bozukluktur. MDS sıklıkla HSC farklılaşmasında bir blok ve sıklıkla kemik iliği yetmezliğine yol açabilen displastik hücrelerin üretimi ile ilişkilidir. MDS, Amerika Birleşik Devletleri'nde en sık teşhis edilen miyeloid neoplazmdır ve 3 yıllık sağkalım oranı %35-45 arasındadır15. MDS genellikle akut miyeloid lösemiye dönüşüm riski ile ilişkilidir. MDS'den türetilen AML çoğu tedaviye dirençli olduğundan ve nüks etme olasılığı yüksek olduğundan, bu ölümcül bir komplikasyon olabilir. Hematopoietik kök ve progenitörlerdeki translokasyonlar veya mutasyonlar nedeniyle ortaya çıkan AML, genellikle standart kemoterapiye dirençlidir16,17. MDS ve AML esas olarak yaşlıların hastalıkları olduğundan, çoğunluğu 60 yaşın üzerinde teşhis edildiğinden, çoğu hasta küratif kemik iliği nakli için uygun değildir. Bu nedenle, hastalığın ilerlemesinin yeni düzenleyicilerini tanımlamak için önemli bir ihtiyaç vardır. Kemik iliği mikroçevresi malign hücreler için destek sağlayabildiğinden14, kemik iliği nişindeki değişikliklerin hastalık ilerlemesi ile tanımlanması, tümör nişinin yeniden şekillenmesini inhibe etmeyi amaçlayan yeni terapötiklerin tanımlanmasına yol açabilir. Bu nedenle, hastalığın ilerlemesinin yeni düzenleyicilerini tanımlamak için önemli bir ihtiyaç vardır. Bu amaçla, malign hücrelere destek sağlayabilecek kemik iliği stromal hücre popülasyonlarındaki değişiklikleri tanımlamak ve karakterize etmek çok önemlidir.

AML ve MDS'nin birkaç fare modeli oluşturulmuştur ve hastalığın başlaması ve ilerlemesi sırasında kemik iliği mikro ortamındaki değişiklikleri incelemek için kullanılabilir 6,1,19,20,21,22. Burada, retroviral olarak indüklenen AML 6,20'nin murin modellerini ve ayrıca ticari olarak temin edilebilen Nup98-HoxD13 (NHD13) yüksek riskli MDS'den AML'ye dönüşüm19 modelini kullanarak kemik iliği stromal hücre popülasyonlarındaki değişiklikleri tanımlamak için protokoller açıklanmaktadır. De novo AML hücreleri ile nakledilen fareler 20-30 gün içinde hastalığa yenik düşer6. NHD13 fareleri, 15-20 hafta civarında sitopeni ve kemik iliği displazisi geliştirir, bu da sonunda AML'ye dönüşür ve farelerin yaklaşık% 75'i 32 hafta civarında hastalığa yenik düşer. Fare modeli kemik iliği mikroçevre popülasyonlarını analiz etmek için kemikler hasat edilir, kemik iliği ve kemik spikülleri enzimatik sindirim kullanılarak sindirilir ve hücreler daha sonra manyetik sıralama ile CD45-/Ter119-hematopoietik olmayan popülasyonlar için zenginleştirilir. Benzer analizler daha önce 11,13,22,23,24,25 olarak tanımlanmış olsa da, genellikle kemik iliğine veya kemiğe odaklanırlar ve analizlerinde her iki kaynaktan gelen hücreleri içermezler. Bu popülasyonların birleşik karakterizasyonu, gen ekspresyon analizleri ile birlikte, hücresel hematopoietik mikroçevrenin hastalığın başlaması ve ilerlemesi için nasıl destek sağladığının kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını sağlayabilir (Şekil 1). Aşağıda açıklanan protokol retroviral olarak indüklenen AML modeline ve genetik bir MDS modeline odaklanırken, bu stratejiler ilgilenilen herhangi bir murin modelinin kemik iliği nişindeki değişiklikleri incelemek için kolayca uyarlanabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan deneyleri, Rochester Üniversitesi Hayvan Kaynakları Komitesi tarafından onaylanan protokollere uygun olarak gerçekleştirildi. Fareler, Rochester Üniversitesi'ndeki hayvan bakım tesislerinde yetiştirildi ve bakımı yapıldı. Yüksek riskli MDS'yi modellemek için, ticari olarak temin edilebilen NHD13 fare modeli19 kullanılır. Bu modelde, kemik iliği stromal hücreleri, hastalık başlamadan önce 8 haftalıkken dişi NHD13 farelerinde analiz edilir. De novo AML, daha önce açıklandığı gibiüretilir 6,11,20. MLL-AF9 ve NRas gibi AML'yi indüklemek için kullanılan onkogenler, akış sitometrisi kullanılarak lösemik olmayan GFP-kemik iliği popülasyonlarının analizine izin veren GFP veya YFP ile etiketlenir. Kısaca, 10 haftalık dişi C57BL / 6J farelere murin GFP / YFP + AML hücreleri nakledilir ve kemik iliği nakilden 2 hafta sonra toplanır. Bu çalışmada dişi fareler gösteri amaçlı kullanılırken, bu protokol hem erkek hem de dişi farelerle gerçekleştirilebilir. Ayrıca bir femur veya tüm uzun kemikler kullanılarak da gerçekleştirilebilir.

1. Kemik iliği hasadı

NOT: Hayvan diseksiyon protokolü ile ilgili ayrıntılar için lütfen Amend et al.26'ya bakın.

  1. Harcı ve tokmağı %70 etanol ile temizleyin, soğutulmuş FACS tamponu ile durulayın (Tablo 1) ve hasada başlamadan önce soğuması için buzun üzerine koyun. Ayrıca, oda sıcaklığına ulaşmasını sağlamak için MAC tamponunu (Tablo 1) tezgahın üzerine yerleştirin.
  2. Kurumsal hayvan bakımını takip ederek hayvana ötenazi yapın ve kılavuz ve protokolleri kullanın.
  3. Tezgahta, kürkü ıslanana kadar fareye iyice %70 etanol püskürtün. Forseps ve kavisli makas kullanarak, karın üzerindeki cildi kaldırın ve farenin her iki tarafında, karından yanal olarak yaklaşık 0,5 mm uzunluğunda iki kesi yapın. Ardından, karından distalde 0,5 mm'lik bir kesi yapın. Farenin bacaklarındaki deriyi ve kürkü çıkarmak için aşağı çekin.
  4. Makası pelvise dik olarak yerleştirin, forseps ile femuru yukarı çekerken aşağı doğru bastırın. Femur başı pelvisten ayrılmalıdır. Patellofemoral eklemde femur ve tibiayı ayırın. Kemikleri buz üzerinde 6 oyuklu bir plakada FACS tamponuna yerleştirin.
  5. Laboratuvar sınıfı doku kullanarak kemiklerden doku çıkarın ve temizlenmiş kemikleri buz üzerinde taze FACS tamponu ile 6 oyuklu yeni bir plakaya yerleştirin.
  6. Tüm kemikleri 2-5 mL FACS tamponu ile harca yerleştirin, böylece tüm kemikler tampona daldırılır (tampon hacmini kaç kemik işlediğinize göre ayarlayın). Kemik iliği dokusu serbest kalana kadar havaneli kullanarak kemikleri dairesel hareketlerle ezin ve öğütün.
  7. 3 mL'lik bir şırınga kullanarak, sıvıyı harçtan yukarı çekip aşağı akıtarak kemik iliğini homojenize edin.
  8. 3 mL'lik bir şırınga kullanarak, sıvıyı harçtan yukarı çekin ve 70 μm'lik bir hücre süzgecinden buz üzerinde 50 mL'lik bir tüpe süzün. Filtredeki kemik/doku parçalarını FACS tamponu ile tekrar harca durulayın ve ikinci kez homojenize etmek ve süzmek için adım 1.7'ye dönün. Bu kemik iliği fraksiyonunu oluşturur.
  9. Kalan kemik parçalarını (spikülleri) FACS tamponu ile harcın içine geri durulayın ve maksimum hücre verimini sağlamak için FACS tamponu kullanarak 15 mL'lik bir tüpe yıkayın. Bu kemik spikülleri fraksiyonudur.

2. Kemik iliğinin sindirimi

  1. Kemik iliğini 300 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltın ve atın.
  2. Kemik iliğini 2 mL kemik iliği sindirim karışımında (Tablo 1) tekrar süspanse edin ve 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Bir döndürücü üzerinde 37 °C'de 45 dakika inkübe edin.
  3. Enzimatik sindirimi durdurmak için 10 mL FACS tamponu ekleyin. Karışımı 70 μm'lik bir hücre süzgecinden 50 mL'lik yeni bir tüpe süzün.
  4. Karışımı 400 x g'da 4 °C'de 7 dakika boyunca peletleyin.
  5. Kemik iliği peletini 1 mL RBC lizis tamponunda yeniden süspanse edin (bkz. Buz üzerinde 4 dakika inkübe edin.
  6. Lizizi durdurmak için 10 mL FACS tamponu ekleyin. Karışımı 70 μm'lik bir hücre süzgecinden 50 mL'lik yeni bir tüpe süzün.
  7. Karışımı 300 x g'da 4 °C'de 5 dakika boyunca peletleyin. Süpernatanı çıkarın ve peleti 100 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin.

3. Kemik spiküllerinin sindirimi

  1. Kemik spiküllerini adım 1.9'dan itibaren girdap haline getirin ve yerleşmelerine izin verin. Süpernatanı boşaltın ve kemiği altta tutun.
  2. Kemik spiküllerini 1 mL kemik spikülü sindirim karışımında tekrar süspanse edin (Tablo 1).
  3. Tüpleri 37 °C'de 60 dakika boyunca bir tüp döndürücüye yerleştirin.
  4. Enzimatik sindirimi durdurmak için 10 mL FACS tamponu ekleyin. Karışımı 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirerek RBC ile parçalanmış ve sindirilmiş kemik iliği içeren 50 mL'lik tüpe süzün.

4. Boyama

  1. Kemik spiküllerini ve kemik iliği hücresi süspansiyonunu nazikçe karıştırın.
  2. Yayınlanmış protokoller27'de açıklandığı gibi,% 0.4 Tripan mavisi bazlı boyama kullanarak bir hemositometredeki canlı hücre sayısını saymak için 10 μL hücre süspansiyonu kullanın. Hücre süspansiyonundan lekesiz bir kontrol için 50.000 hücre toplayın.
  3. Kalan hücreleri 300 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve 100 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin.
    NOT: İdeal seyreltmeyi belirlemek için antikorlar titre edilebilir. Antikor seçimi (epitoplar ve florokromlar) özelleştirilebilir.
  4. Manyetik tükenme için antikorlarla boyama için, FC Blok (25 x 106 hücre başına 1 μL), CD45-APC (25 x 106 hücre başına 10 μL) ve Ter119-APC (25 x 106 hücre başına 4 μL) ekleyin (bkz.
  5. 20 dakika buz üzerinde inkübe edin. FACS tamponu ile yıkayın, APC lekeli kontrol için 50.000 hücreyi (~ 50 μL) çıkarın, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin ve 100 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin.
  6. Manyetik tükenme için hücre süspansiyonunun mikro boncuklarla boyanması için, mIgG (25 x 106 hücre başına 8 μL) ve Anti-APC mikro boncuklar (25 x 106 hücre başına 20 μL) ekleyin (bkz.
  7. 20 dakika buz üzerinde inkübe edin. 10 mL FACS tamponu ile yıkayın, 300 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.

5. Manyetik ayırma ile numunenin tükenmesi

NOT: Bu adım, üreticinin talimatlarına göre piyasada bulunan bir manuel manyetik ayırıcı kullanılarak gerçekleştirilir. Bu adım, otomatik bir ayırıcı ile de gerçekleştirilebilir (bkz.

  1. LD kolonunu 2 mL MAC tamponu ile yıkayarak hazırlayın (Tablo 1). Atık suyu atın ve toplama tüpünü değiştirin.
  2. MAC tamponunda 1 x 108 hücreye kadar yeniden süspanse edin ve bunları 35 μm hücre süzgeci kapağına sahip 5 mL'lik bir test tüpünden süzün.
  3. LD sütununu manyetik ayırıcı standına yerleştirin. Elüatı toplamak için kolonun altına 5 mL'lik bir test tüpü yerleştirin.
  4. Hücre süspansiyonunu hazırlanan LD sütununa ekleyin. Negatif fraksiyonun toplama tüpüne akmasına izin verin. Kolonu 1 mL MAC tamponu ile iki kez yıkayın ve elüatı aynı tüpte toplayın. Bu, aşağıdaki adım 5.6'da kullanılan negatif kesirdir.
  5. LD kolonunu manyetik ayırıcı standından çıkarın ve yeni bir 5 mL test tüpüne yerleştirin. Kolon pistonunu kullanarak pozitif olarak etiketlenmiş hücreleri temizlemek için kolona 3 mL tampon dağıtmak için bir pipet kullanın.
  6. Negatif ve pozitif fraksiyonları 300 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Bunları 100 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin.
  7. % 0.4 Tripan mavisi ile negatif ve pozitif fraksiyonların 10 μL'sini sayın. Aşağıdaki osteo-analiz/endotel paneli boyama hacimleri bu hücre sayısına dayanacaktır.
  8. Akış sitometrisi geçit kontrolleri için pozitif fraksiyondan 50.000 canlı hücre kullanın.

6. Osteo-analiz / endotelyal panel boyası

NOT: Kompanzasyon, tüm uygun boyama ve geçit kontrolleri dahil olmak üzere standart akış sitometri protokolleri izlenerek yapılmalıdır.

  1. CD45 / Ter119 negatif fraksiyonunun boyanması için (1 x 106 hücre başına her antikorun 1 μL'si), CD31-PE-Cy7, Sca-1-BV421, CD51-PE ve CD140a-PE-Cy5 ekleyin (bkz.
  2. 20 dakika buz üzerinde inkübe edin. 2 mL FACS tamponu ile yıkayın, ardından 300 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
  3. Canlı/ölü boyama için 1 mL FACS tamponu ve 1:1000 PI seyreltmesi ekleyin, ardından numuneyi 35 μm hücre süzgeci kapağına sahip 5 mL'lik bir test tüpünden süzün.
  4. Hücreleri çok renkli bir akış sitometresinde analiz edin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, MDS ve lösemi murin modellerinden endotelyal ve mezenkimal stromal hücreler gibi kemik iliği mikroçevre popülasyonlarını analiz etmek için akış sitometrisine dayalı bir yöntemi açıklamaktadır (Şekil 1). Şekil 2 , sindirilmiş ve CD45/Ter119 tükenmiş fraksiyondaki hücrelerin (P1) seçiminden başlayarak, ileri ve yan saçılma profili boyunca ilgilenilen popülasyonların tespiti için geçit stratejisini göstermektedir. Bir lösemi örneğindeki hücrelerin örnek ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Murin lösemi modelleri, agresif miyeloid lösemi ilerlemesini destekleyen hücre içsel ve niş odaklı sinyalleri tanımlamak için yaygın olarak kullanılmıştır 6,19,21. Burada, MDS ve AML'nin murin modellerinde kemik iliği mikroçevresinin hücresel bileşimini tanımlamak için kapsamlı bir akış sitometrisi tabanlı protokol sunulmaktadır.

Deneysel numunelerden akış sitometrik verilerini elde etmeden önce, flor...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmedi.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

URMC Flow Sitometri Çekirdeğine teşekkür ederiz. Bu çalışma, Amerikan Hematoloji Derneği Akademik Ödülü, Lösemi Araştırma Vakfı ödülü ve NIH hibeleri R01DK133131 ve JB'ye verilen R01CA266617 tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL pipet uçları Genesee Bilimsel 24-165RL
1.7 mL Mikrosantrifüj TüpleriAVANTL211511-CS
10 & mikro; L pipet uçlarıGenesee Scientific 24-140RL
10 mL Ayrı Ayrı Sarılmış Steril Serolojik PipetlerGlobe scientific1760
1000 mL Vakum Filtrasyon ŞişesiNEST344021
15 mL Santrifüj TüpüVWR10026-076
2 mL Aspirasyonlu PipetNEST325011
200 & mikro; L pipet uçlarıGenesee Scientific 24-150-RL
25 mL Ayrı Ayrı Sarılmış Steril Serolojik PipetlerGlobe scientific1780
5 mL Ayrı Ayrı Sarılmış Steril Serolojik PipetlerGlobe scientific1740
5 mL Polistiren Yuvarlak Tabanlı Tüp  12 x 75 mm stilFalcon352054
5 mL Hücre Süzgeç Kapaklı Polistiren Yuvarlak Tabanlı Boru 12 x 75 mm stilFalcon
50 mL Santrifüj TüpüNEST602052
6 Kuyulu, Düşük Buharlaşma Kapaklı Düz TabanlıFalcon353046
Su Geçirmez Nem Bariyerli Emici Alt PedlerVWR56616-031
APC MicroBeadsMiltenyi 130-090-855
autoMACS Pro AyırıcıMiltenyi Biotec GmBH4425745
BD Pharmingen Saflaştırılmış Sıçan Anti-Fare CD16 / CD32 (Fare BD Fc Bloğu)BD Biosciences5531410.5 mg / mL & nbsp;
Sığır Serumu AlbüminiSigma-AldrichA790666.000 g/mol
Parlak Menekşe 421 anti-fare Ly-6A/E (Sca-1) Antikor (D7)İnvitrojen404-59810.2 mg/mL
C57BL/6J FarelerJackson Laboratuvarı 664
Karbondioksit Gaz TankıHava GazıCD50
CD31 (PECAM-1) Monoklonal Antikor (390), PE-Siyanin7İnvitrojen25-0311-820.2 mg / mL
CD45 Monoklonal Antikor (30-F11), APCİnvitrojen17-0451-820.2 mg / mL
Hücre Süzgeci 70 & mikro; m Naylon Falcon352350
Cole-Parmer Essentials Havan ve Havaneli Akik, 125 mLCole-ParmerEW-63100-62
Clostridium histolyticumSigma-AldrichC5138-500MG
Kollajenaz Tip I'den Kollajenaz7415
Corning Mini SantrifüjCORNING6770
Corning Stripettor Ultra Pipet Kontrol CihazıCorning4099
Sığır pankreasından DeoksiribonükleazI Sigma-AldrichD4513
Dispase II, tozGibco117105041
DPBS 10xgibco14200-075
eBioscience 1x RBC Lizis TamponuInvitrogen00-4333-57
Etanol mutlak, KOPTEC, BP, Ph. Eur., USP (200 Kanıt)VWR89125-174'ünanalitik spesifikasyonlarını karşılar
İnce makas - keskinİnce Bilim Araçları14061-10
Temel B Fetal Sığır SerumuGeminiBio900-208
Gilson  PIPETMAN L Pipet Başlangıç KitleriFisherScientific 
Graefe ForsepsGüzel Bilim Araçları11051-10
Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) 10xgibco14185-052
HemositometreFisher02-671-10
İnkübatör BINDERC150-UL
KimwipesKIMTECHK222101
LABGARD Sınıf II, Tip A2 Biyolojik Güvenlik KabiniNuaireNU-425-400
LD SütunlarMiltenyi Biotec GmBH130-042-901
LSE Vorteks KarıştırıcıCORNING6775
LSRII/Fortessa/Senfoni A1Becton, Dickinson ve Şirketi647800L6
MACS ÇOKLU STAND Miltenyi Biotec GmBH130-042-303
MACsmix Tüp Döndürücü Miltenyi Biotec GmBH130-090-753
mIgGMillipore-Sigma18765-10mg2 mg / mL & nbsp;
Nup98-HoxD13 (NHD13) FarelerJackson Laboratuvarı 
PE anti-fare CD51 Antikoru (RMV-7)Biolegend1041060.2 mg / mL
PE / Siyanin5 anti-fare CD140a Antikoru (RUO)Biolegend1359200.2 mg / mL
Penisilin-Streptomisin ve nbsp;Gibco1514012210.000 U/mL
Plastipak 3 mL ŞırıngaBecton, Dickinson and Company309657
Propidium İyodür - Suda 1.0 mg/mL ÇözeltiThermoFisher ScientificP3566
QuadroMACS  Ayırıcı Miltenyi Biotec GmBH130-090-976
Sorvall X Pro / ST Plus Serisi SantrifüjThermo Scientific 
TER-119 Monoklonal Antikor (TER-119), APCİnvitrojen17-5921-820.2 mg / mL
Tripan Mavisi Çözeltisi% 0.4Gibco15-250-061
Ultra saf 0.5 M EDTA, pH 8.0  Canlandırıcı15575-038
352235F167370G01050575009521

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
  2. Boulais, P. E., Frenette, P. S. Making sense of hematopoietic stem cell niches. Blood. 125 (17), 2621-2629 (2015).
  3. Pinho, S., Frenette, P. S. Haematopoietic stem cell activity and interactions with the niche. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (5), 303-320 (2019).
  4. Kfoury, Y., Scadden, D. T. Mesenchymal cell contributions to the stem cell niche. Cell Stem Cell. 16 (3), 239-253 (2015).
  5. Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
  6. Bajaj, J., et al. Cd98-mediated adhesive signaling enables the establishment and propagation of acute myelogenous leukemia. Cancer Cell. 30 (5), 792-805 (2016).
  7. Konopleva, M. Y., Jordan, C. T. Leukemia stem cells and microenvironment: Biology and therapeutic targeting. J Clin Oncol. 29 (5), 591-599 (2011).
  8. Kim, Y. W., et al. Defective notch activation in microenvironment leads to myeloproliferative disease. Blood. 112 (12), 4628-4638 (2008).
  9. Walkley, C. R., et al. A microenvironment-induced myeloproliferative syndrome caused by retinoic acid receptor gamma deficiency. Cell. 129 (6), 1097-1110 (2007).
  10. Kode, A., et al. Leukaemogenesis induced by an activating β-catenin mutation in osteoblasts. Nature. 506 (7487), 240-244 (2014).
  11. Hanoun, M., et al. Acute myelogenous leukemia-induced sympathetic neuropathy promotes malignancy in an altered hematopoietic stem cell niche. Cell Stem Cell. 15 (3), 365-375 (2014).
  12. Raaijmakers, M. H., et al. Bone progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia. Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).
  13. Frisch, B. J., et al. Functional inhibition of osteoblastic cells in an in vivo mouse model of myeloid leukemia. Blood. 119 (2), 540-550 (2012).
  14. Bajaj, J., Diaz, E., Reya, T. Stem cells in cancer initiation and progression. J Cell Biol. 219 (1), e201911053(2020).
  15. Sekeres, M. A., Taylor, J. Diagnosis and treatment of myelodysplastic syndromes: A review. Jama. 328 (9), 872-880 (2022).
  16. Zeisig, B. B., Kulasekararaj, A. G., Mufti, G. J., So, C. W. Snapshot: Acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 22 (5), 698-698.e1 (2012).
  17. Krivtsov, A. V., Armstrong, S. A. Mll translocations, histone modifications and leukaemia stem-cell development. Nat Rev Cancer. 7 (11), 823-833 (2007).
  18. Yoshimi, A., et al. Coordinated alterations in rna splicing and epigenetic regulation drive leukaemogenesis. Nature. 574 (7777), 273-277 (2019).
  19. Lin, Y. W., Slape, C., Zhang, Z., Aplan, P. D. Nup98-hoxd13 transgenic mice develop a highly penetrant, severe myelodysplastic syndrome that progresses to acute leukemia. Blood. 106 (1), 287-295 (2005).
  20. Kwon, H. Y., et al. Tetraspanin 3 is required for the development and propagation of acute myelogenous leukemia. Cell Stem Cell. 17 (2), 152-164 (2015).
  21. Bajaj, J., et al. An in vivo genome-wide crispr screen identifies the rna-binding protein staufen2 as a key regulator of myeloid leukemia. Nat Cancer. 1 (4), 410-422 (2020).
  22. Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by mll-af9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
  23. Baryawno, N., et al. A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia. Cell. 177 (7), 1915-1932.e16 (2019).
  24. Tikhonova, A. N., et al. The bone marrow microenvironment at single-cell resolution. Nature. 569 (7755), 222-228 (2019).
  25. Balderman, S. R., et al. Targeting of the bone marrow microenvironment improves outcome in a murine model of myelodysplastic syndrome. Blood. 127 (5), 616-625 (2016).
  26. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. JoVE. 110, e53936(2016).
  27. JoVE Science Education Database. Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. , JoVE. (2023).
  28. Passaro, D., et al. Increased vascular permeability in the bone marrow microenvironment contributes to acute myeloid leukemia progression and drug response. Blood. 128 (22), 2662(2016).
  29. Xu, C., et al. Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow. Nat Commun. 9 (1), 2449(2018).
  30. Baccin, C., et al. Combined single-cell and spatial transcriptomics reveal the molecular, cellular and spatial bone marrow niche organization. Nat Cell Biol. 22 (1), 38-48 (2020).
  31. Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, M., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells. Arch Oral Biol. 93, 74-79 (2018).
  32. Abreu-Velez, A. M., Howard, M. S. Collagen IV in normal skin and in pathological processes. N Am J Med Sci. 4 (1), 1-8 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Bone Marrow MicroenvironmentMyelodysplastic SyndromeAcute Myeloid LeukemiaMesenchymal Stromal CellsFlow CytometryMagnetic SeparationEndothelial CellsOsteolineage CellsHematopoietic Stem CellsCell Population Isolation

Related Articles