Method Article

Alzheimer Hastalığının (AD) Nöral Modelinde Mitokondri ile İlişkili Endoplazmik Retikulum Membranı (MAM) Stabilizasyonunun Kantitatif Analizi

DOI:

10.3791/66129

⸱

January 10th, 2025

 ,  ,  , 
1Genetics and Aging Research Unit, MassGeneral Institute for Neurodegenerative Disease, Henry and Allison McCance Center for Brain Health, Department of Neurology, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Alzheimer's Disease Research Laboratory, Department of Neuroscience, Tufts University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, mitokondri ile ilişkili endoplazmik retikulum (ER) membranlarının (MAM'lar) yapısal stabilizatörlerinin aksonal taşıma hızını, Alzheimer hastalığı (AD) nöronlarından nörotoksik β-amiloid (Aβ) üretimini gerçek zamanlı olarak artırarak veya sürdürerek MAM stabilizasyonunu ölçmek ve AD terapötiklerinin geliştirilmesine yardımcı olmak için doğrudan ve kantitatif bir metrik olarak hizmet etmeyi açıklıyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alzheimer hastalığının (AD) 3 boyutlu (3D) nöral modelinde Mitokondri ile İlişkili endoplazmik retikulum Membranlarının (MAM'lar) stabilizasyonunu ölçmek için bir yöntem burada sunulmaktadır. Başlangıç olarak, ailesel Alzheimer hastalığı (FAD) veya naif ReN hücreleri içeren β-amiloid öncü proteini (APP) eksprese eden taze insan nöro progenitör ReN hücreleri, ince (1:100) Matrigel kaplı doku kültürü plakalarında büyütülür. Hücreler birleştikten sonra, bunlar, mitokondriyi tespit eden AKAP1 (34-63) (Mito-RFP) veya yapısal MAM stabilizatörleri MAM 1X veya MAM 9X'in kırmızı floresan proteini (RFP) ile konjuge mitokondri bağlama dizisini kodlayan ekspresyon plazmitleri ile elektroporasyona tabi tutulur sırasıyla sıkı (6 nm ± 1 nm boşluk genişliği) veya gevşek (24 nm ± 3 nm boşluk genişliği) MAM'ları stabilize eder. 16-24 saat sonra, hücreler toplanır ve floresanla aktive edilen bir hücre sıralayıcı (FACS) ile zenginleştirilir. Eşit sayıda FACS ile zenginleştirilmiş hücre, 3 boyutlu matriste (1: 1 Matrigel) tohumlanır ve 10 gün boyunca olgun nöronlara farklılaşmasına izin verilir. RFP konjuge MAM stabilizatörlerini eksprese eden 10 günlük farklılaşmış hücrelerin canlı hücre görüntüleri, CO2 (% 5), sıcaklık (37 ° C) ve nem (~% 90) tutan bir canlı hücre görüntüleme kültür odası ile donatılmış bir floresan mikroskop altında yakalanır. Bu amaçla, Mito-RFP ile işaretlenmiş serbest mitokondrinin motilitesini ölçmek için canlı hücre görüntüleme ve kimografik analizler gerçekleştirdik veya her bir ReN GA nöronunun en az 500 nm uzunluğundaki en geniş nöronal sürecinde, sırasıyla MAM 1X veya MAM 9X ile stabilize edilmiş sıkı veya gevşek boşluk genişliklerine sahip mitokondri, bunları akson olarak kabul ederek.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ortaya çıkan kanıtlar, biyokimyasal olarak Mitokondri ile İlişkili ER Membranları olarak hasat edilen ve genellikle MAM 1,2 olarak adlandırılan özel Mitokondri ile ilişkili Endoplazmik Retikulum Kontaklarının (MERC'ler), AD 3,4 dahil olmak üzere çeşitli nörodejeneratif hastalıklarda rol oynadığını göstermektedir. Bu MAM'lar, ER'deki kolesterol açısından zengin lipid sal benzeri mikro alanlardan ve MAM'lar arasında yapısal ve fonksiyonel farklılıklar yaratan bir dizi protein tarafından bağlanan mitokondrinin dış zarından oluşur 5,6,7. Yakın zamanda ortaya çıkan MAM hipotezi, MAM'ların artmasının Aβ üretiminin artmasına ve nörofibriler arapsaçı (NFT) oluşumu, kalsiyum dishomeostazı ve nöroinflamasyon dahil olmak üzere AD'nin patojenik kaskadına yol açtığını öne sürmektedir 3,8. Mitokondrinin yaklaşık% 5 -% 20'si MAM'ları oluşturmak için ER ile fiziksel temas kurar9. MAM'ların boşluk genişliği, düzgün ve pürüzlü ER (sırasıyla sER ve rER) tarafından belirlenir. sER-mitokondri (10-50 nm) ve rER-mitokondri (50-80 nm) arasındaki değişken boşluk genişliği, MAM'ların boşluk genişliğinin sıkı (~10 nm) ile gevşek (~80 nm) arasında değişen uzun bir spektruma sahip olduğunu göstermektedir10,11,12,13. MAM boşluk genişliği, kalsiyum homeostazı ve lipid taşınması gibi MAM fonksiyonlarını belirler 1,14. Yakın tarihli bir rapor, sıkıca (~ 10 nm) bağlı ER ile tam MAM olarak adlandırılan mitokondri arasında oluşan MAM'ların apoptotik olduğunu göstermiştir. Buna karşılık, gevşek bağlı (~ 25 nm) ER ve mitokondri arasında oluşan, kusurlu veya orta MAM'lar olarak adlandırılan MAM'lar anti-apoptotiktir 14,15,16. 6 nm ± 1 nm boşluk genişliğine sahip MAM'ların stabilizasyonu, AD'nin yeni bir 3 boyutlu (3D) nöral kültür modelinden Aβ üretimini artırdı. Buna karşılık, boşluk genişliği 24 nm ± 3 nm olan MAM'ların stabilizasyonunun Aβ nesil17 üzerinde hiçbir etkisi yoktur. Bu bulgu, ilk kez, MAM stabilizasyon derecesini düzenlemenin, ancak MAM'ları istikrarsızlaştırmamanın, Aβ üretimini düzenlemenin anahtarı olduğunu göstermektedir. MAM'ları tamamen kararsızlaştırma girişimi istenmeyen sonuçlara yol açabilir, çünkü MAM'lar hücre sağkalımı için kritik olan birkaç hücresel olayı sürdürür12.

MAM'ların modülasyonu, kanser, metabolik bozukluklar ve nörodejeneratif hastalıklar dahil olmak üzere çeşitli bozukluklar için potansiyel etkileri olan yeni ortaya çıkan bir araştırma alanıdır18. Birçok MAM modülatörünün mevcudiyetine rağmen, MAM'ları destabilize etme ve AD patolojisini düşürme yeteneklerini test etmek için şimdiye kadar büyük bir girişimde bulunulmamıştır, çünkü MAM'ların yapısal çeşitliliği onları ilaç keşfi için hedeflemek için oldukça karmaşık bir sistem haline getirmektedir. Ancak, ilaç hedeflerinin ve çevrelerininspesifik özelliklerini dikkate alan yeni geliştirilen yapısal sistem farmakolojisi 18,19 zorlukların üstesinden gelmeli ve AD'de MAM'ları veya MAM ile ilişkili proteinleri hedef alan yüksek etkili ilaçlar geliştirmelidir. Bununla birlikte, MAM stabilizasyonunun etkili bir modülatörü arayışı, MAM stabilizasyonunun derecesini tam olarak ölçmek için yöntemler gerektirir. Elektron mikroskobu (EM) veya süper çözünürlüklü mikroskopi gibi geleneksel tekniklerin MAM stabilizasyonunu belirlemede sınırlamaları vardır. Bu zorlukların üstesinden gelmek, muhtemelen canlı hücrelerde MAM stabilizasyonunun kantitatif ölçümlerini sağlayabilecek yeni, daha dinamik görüntüleme tekniklerinin veya biyokimyasal tahlillerin geliştirilmesini gerektirecektir. Primer nöronların Odaklanmış İyon Işını Taramalı Elektron Mikroskobu (FIB-SEM), ER'nin mitokondriyal motiliteyi sınırlaması muhtemel mitokondri etrafında bir ağ oluşturma eğiliminde olduğunu ortaya koydu20,21. Mitokondriyal taşıma sistemlerinin bozulması, retrograd, anterograd veya her ikisi de, sinaptik ve nöronal fonksiyon üzerinde derin bir etkiye sahipti22. Bu nedenle, burada MAM stabilizasyonunu kantitatif olarak ölçmek için bir metrik olarak tanımlanan ER'ye bağlı mitokondrinin aksonal hızının yeni canlı hücre görüntüleme ve kimografi tabanlı analizi, MAM stabilizasyon eşiğini Aβ üretimini arttırmanın aksine koruyan veya muhtemelen daha düşük olan bir eşiğe geçirebilen MAM modülatörlerinin tanımlanmasını kolaylaştıracaktır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AD nöral kültür modelleri: Bu çalışmada, amiloid öncü protein (APP) geni (APP Swe/Lon), ReN GA hücrelerinde ailesel AD (fAD) mutasyonlarını eksprese eden insan nöral progenitör ReN hücrelerinden [naif ReN (Millipore)] veya ReN hücrelerinden türetilen nöronlar kullanılmıştır. ReN-GA üç boyutlu (3D) kültür sistemi, AD patolojisini, yani Aβ oligomer güdümlü nörofibriler yumakları (NFT'ler) 23,24 özetler. Naif ReN hücreleri ticari olarak temin edilebilir. ReN GA hatları, Massachusetts General Hospital (MGH) Doçenti Dr. Doo Y. Kim'den alındı23,24,25.

İfade plazmitleri: Ubc 6 (283-303) proteinlerinin AKP1 (34-63) ve ER hedefleme dizisi, RFP ile doğrudan bağlantılı (Mito-RFP-ER, MAM 1X olarak gösterilir) veya 9 amino asit bağlayıcı içerir (Mito-9X-RFP-ER, MAM 9X olarak gösterilir) sırasıyla 6 nm ± 1 nm veya 24 nm + 3 nm boşluk genişliklerine sahip MAM'ları stabilize etmek için tasarlanmıştır,15,26 (Şekil 1A).

1. Elektroporasyon

  1. Hücrelerin MAM stabilizatörleri ile transfekte edilmesi (1-2 saat)
    NOT: Nükleofektör kitinin üreticisi tarafından açıklanan protokolü izleyin (Malzeme Listesi). Başlamadan önce, %1 Matrigel içeren DMEM/F12 ile önceden kaplanmış 6 oyuklu cam tabanlı kültür kapları hazırlayın (bundan böyle bazal membran matrisi [BMM] olarak anılacaktır). Her bir kuyuyu kaplamak için 2 mL BMM kullanın. 37 °C'de en az 1 saat inkübe edin. BMM'nin katılaşmasını önlemek için BMM, ortam, pipet uçları ve pipetlerin tümü karıştırılmadan önce önceden soğutulmalıdır.
    1. BMM karışımını aspire edin. Her kuyucukta 2 mL oda sıcaklığında (RT) DMEM / F12 ile değiştirin.
    2. Nükleofektörü Ek 1 ile 4.5: 1 oranında birleştirin (100 μL çözelti için 82 μL: 18 μL Nükleokozmetik / Ek oranı). İstenen her transfeksiyon için 100 μL Nükleofektöre ihtiyaç vardır.
    3. Girdap DNA'sı. Daha sonra, her transfeksiyon için 1 mL mikrosantrifüj tüplerine 1-5 μg DNA (tedavi başına) ekleyin.
    4. Sağlıklı ReN-GA hücrelerinden oluşan bir tabak hasat etmek için acustase kullanın.
      NOT: Genleşme ortamındaki plaka hücreleri (Tablo 1) 100 mm'lik doku kültürü kaplarında ve birleşme %70-80'e ulaşana kadar bekleyin.
      1. Mevcut ortamı aspire edin ve 10 mL PBS ile bir kez yıkayın.
      2. Doğrudan hücrelere 1 mL acutaz ekleyin ve 37 ° C'de 5-10 dakika inkübe edin.
      3. Yemeğin kenarına hafifçe vurarak hücreleri tabaktan çıkarın. Hücrelerin gevşediğinden ve serbestçe aktığından emin olmak için mikroskop altında kontrol edin.
      4. Acutazı 10 mL DMEM / F12 ile nötralize edin ve temiz bir 15 mL tüpe aktarın.
      5. Gerekli sayıda hücreyi 5 dakika boyunca 274 x g'da santrifüjleyin ve ölü hücreleri çıkarmak için süpernatanı aspire edin. Ardından, peleti 10 mL DMEM / F12 içinde yeniden süspanse edin.
    5. Yoğunluğu belirlemek için hücreleri sayın.
      NOT: Bu çalışmada, hücre sayısını saymak için otomatik bir hücre sayacı kullanılmıştır. Elektroporasyon başına 3-5 X 106 hücre gereklidir (örneğin, 5 tedavi 15-25 X 106 hücre gerektirir).
      1. Askıya alınmış hücrelerden 10 μL alın ve bir hücre sayma odasının A tarafına ekleyin. Ardından B tarafına 10 μL ekleyin.
        NOT: Pipeti yana doğru açı vererek hücre süspansiyonunu ekleyin. Pipetin pistonundaki ilk dayanağı geçmeyerek kabarcıkları önleyin.
      2. Doldurulmuş sayma haznesini hücre sayacına götürün ve A tarafını öndeki ana yuvaya yerleştirin.
      3. Ölç'e bastıktan sonra, mL başına düşen hücre sayısını not edin.
      4. Hazneyi çıkarın, B tarafına çevirin ve 1.1.5.2-1.1.5.3 adımlarını tekrarlayın.
      5. Bu iki sayıyı bir araya getirin, ardından 4'e bölün (Tripan Mavisi kullanmıyorsanız), ardından süspansiyondaki toplam hücre sayısını elde etmek için sayıyı hücrelerin askıya alındığı mililitre sıvı ile çarpın.
    6. Gerekli sayıda hücreyi 5 dakika boyunca 274 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin.
    7. Elektroporasyon başına 100 μL Nükleofektör karışımında peleti yeniden süspanse edin. (ör., 5 tedavi için 500 μL).
      NOT: Hücreleri Nükleofektör solüsyonunda 15 dakikadan daha uzun süre bırakmak, hücre canlılığını ve genel etkinliği azaltabilir.
    8. DNA içeren tüplerden birine 100 μL hücre süspansiyonu ekleyin ve pipetleyerek karıştırın.
    9. DNA karışımını bir elektroporasyon küvetine aktarın ve verilen kapakla kapatın. Kabarcık oluşmasını önlemek için küveti aşağı doğru eğin ve yavaşça pipetleyin.
    10. Kullanılan cihaza uygun Nukleofektör programını seçin. Bu çalışmada kullanılan cihaz için, transfeksiyon için Program A-033'ü kullanın. Optimize etmek için, her hücre tipi için en uygun olanı belirlemek için 5 Nükleofektör programının tümünü deneyin.
      NOT: Başarılı bir elektroporasyonun teyidi, karışımın üst kısmında görünür köpüktür.
    11. Hemen, sağlanan steril pipetleri kullanarak, önceden doldurulmuş 6 oyuklu plakadan küvete ~ 500 μL DMEM ekleyin. Yavaşça bir kez karıştırın ve ardından elektroporasyonlu hücreleri ve ortamı ilgili kuyuya aktarın.
      NOT: Elektroporasyonun ardından hücreler son derece hassastır, bu nedenle ortamın hızlı bir şekilde aktarılması ve dikkatli bir şekilde pipetlenmesi çok önemlidir.
    12. Kalan tüm DNA tedavileri için 1.1.8-1.1.11 adımlarını tekrarlayın.
    13. Hücreleri gece boyunca CO2 (% 5) varlığında 37 ° C'de inkübe edin.
    14. Ertesi gün, ortamı taze farklılaşma ortamıyla değiştirin (Tablo 2) ve hücrelerin 10 gün boyunca farklılaşmasına izin verin. Her 2-3 günde bir taze ortam ile değiştirin.

2. Canlı hücre görüntüleme

  1. Canlı hücre mikroskobu için hücrelerin hazırlanması (30 dk)
    1. Canlı hücre odası hazırlığı (hücreleri odaya taşımadan önce)
    2. CO2 tankının ve nemlendiricinin hazneye bağlı olduğundan, vanaların açık olduğundan ve tankların doldurulduğundan emin olun.
    3. Sıcaklığı 37 °C'ye, CO'yu %2 ila %5'e ve nemi %95'e ayarlayın. (Seviyelerin dengelenmesi biraz zaman alabilir).
    4. Hazneye hücreler içeren 6 oyuklu bir plaka yerleştirin ve hücreler görünür hale gelene kadar mikroskobun odağını ayarlayın.
    5. Lazeri açın (Malzeme Tablosu).
    6. RFP sinyalini yakalamak için 594 nm lazer kullanarak floroforu uyarın ve 570-640 nm emisyon kullanın. GFP için, uyarma için 488 nm lazer ve 510-540 nm emisyon kullanın.
    7. Yerleşik floresan filtreyi kullanarak, arka plan sinyali dağılana kadar sinyal yoğunluğunu ayarlayın (neredeyse sabit siyah olmalıdır).
  2. Aksonların canlı videosunun çekilmesi (toplamda 10 saat-15 saat)
    NOT: NIS Element AR yazılımı kullanılarak floresan görüntüleri yakalamak için bir Nikon C2 Eclipse Ti2 ters konfokal mikroskop kullanılmıştır. 512 piksel çözünürlükte 60x büyütme kullanın ve 3 dakika boyunca saniyede 1 kare hızında videolar çekin, daha temiz kymograflar üretin.
    1. RFP biyosensörlerini ifade eden bir hücre bulun. Video çekmeden önce daha sonra başvurmak üzere hücrenin bir görüntüsünü dışa aktarın.
    2. Tarama alanını aksonun etrafına sığacak şekilde kırpın. Daha küçük bir tarama alanı kullanmak, mikroskobun işlem süresini azaltır ve kimografi üretimini çok daha kolay hale getirir.
    3. Yazılımın daha sorunsuz çalışmasına yardımcı olmak için tüm lazerleri kapatın. Lütfen, program tüm lazerler etkinken çalıştırıldığında, tüm karelerin yakalanmadığını unutmayın.
      NOT: Somadan gelen kırmızı floresan sinyali, aksondakinden çok daha parlaktır. Bu nedenle, aksondaki genel sinyal yoğunluğunu artırmak için soma hariç tutulur. Zaman Ölçümü sekmesine gidin.
    4. Aralığı saniyede 1 kare olarak ayarlayın ve toplam süreyi 181 sn olarak ayarlayın.
    5. Çalıştır'a tıklayın.
    6. Bu dosyayı bir .nds dosyası olarak kaydedin (uygun şekilde etiketlenmiş) ve işlemi MAM stabilizatörleri (MAM 1X veya MAM 9X) başına ~10 kez tekrarlayın.
      NOT: Lazerin gücü bazen çok uzun süre taranırsa RFP sinyali üzerinde gözle görülür bir ağartma etkisi üretti. Video çekmek için hızlı çalışmak dikkate alınması önemlidir.

3. İşlem sonrası (7 gün)

NOT: Taşımayı analiz etmek ve kymograflar oluşturmak için Fiji ImageJ makroları kullanıldı. 0.1 mm/s'den daha az hareket eden veziküller sabit olarak kategorize edildi. Parçacık hareketinin frekansı, belirli bir yönde hareket eden (anterograd, retrograd) veya hareket etmeyen (durağan) parçacıkların sayısının kimografide analiz edilen toplam parçacık sayısına bölünmesiyle hesaplandı. Her bir vezikülün duraklamak veya hareket etmek için harcadığı süre, analiz edilen her nörondaki tüm veziküller için her bir durumda harcanan sürenin ortalaması alınarak hesaplandı. Hız ve çalışma uzunluğu için frekans dağılımı, her deney koşulu için sadece hareketli veziküller kullanılarak hesaplandı. Analiz 100 mm'lik aksonal traktlarda 3 dakika süreyle yapıldı.

  1. Kimografi oluşturma
    1. .nds dosyasını Fiji ImageJ'de açın.
    2. Görüntü sekmesine gidin ve Özellikler'e tıklayın. Piksel-mikron oranını kaydedin. Bu daha sonra hesaplama için gereklidir.
    3. Dosyayı > klasörüne >.tiff olarak kaydetmek için Tiff Olarak Kaydet'i tıklatın (Makro, oluşturulan her şeyi otomatik olarak bu klasöre kaydeder).
    4. Kymo makrosunu ImageJ'ye sürükleyin. Kod, Ek Kodlama Dosyası 1'de sağlanır. Çalıştır'a tıklayın.
    5. Tamam'a basmayın. MAX_raw penceresine geçin. Akson boyunca manuel olarak sol tıklayın ve izlemeyi bitirmek için çift tıklayın.
      NOT: Aksonu soma'dan, yani akson terminalinden takip ettiğinizden emin olun. Bu şekilde anterograd ve retrograd hesaplamalar doğru olacaktır.
    6. ROI yöneticisinde T veya Ekle komutuna basın.
    7. Şimdi Tamam'ı tıklayın. Daha önce yapılan klasörde bir kymograph oluşturulacaktır. (X ekseni mikron cinsinden akson uzunluğudur ve Y ekseni saniye cinsinden zamandır).
  2. Kimografinin izlenmesi
    1. Kymografı Fiji Image J'ye sürükleyin (Daha önce yapılan klasöre otomatik olarak yerleştirilmelidir).
    2. Track (İz) makrosunu Image J (Görüntü J) içine sürükleyin.
    3. Aşağıdaki komut isteminde Tamam'ı tıklatın. Daha önce çalışmaya devam ediyorsanız, devam etmek için sayı noktasını girin ve ardından Tamam'a basın.
    4. Seç panelindeki Dikdörtgen aracını kullanarak, kymografın ortasına yakın, 60 piksel yüksekliğinde ve her zaman 100 μm genişliğinde bir alan seçin. Bunu yapmak için, 100'ü adım 3.1.2'de kaydedilen piksel-mikro oranına bölün.
    5. Bir alan seçtikten sonra, ROI'ye i t eklemek için Ctrl T tuşuna basın ve ROI'yi çalışılan klasöre kaydedin (ROI menüsünde Daha Fazla'ya ve ardından Kaydet'e basın).
      NOT: Seçilen alanı Ctrl+Shift+I tuşlarına basarak ters çevirmek izlemeyi kolaylaştıracaktır.
    6. Tek bir vezikülün hareketini izlemek için, yukarıdan aşağıya sol tıklarken Ctrl tuşunu basılı tutun.
    7. Yapılması için, sağ tıklarken Ctrl tuşunu basılı tutun ve aksonların nerede izlendiğini gösteren bir pencere açılacaktır. Bu iyi görünüyorsa, Tamam'a basın.
    8. Devam etmek ve başka bir vezikül seçmek için Evet'e tıklayın ve 3.2.6-3.2.8 adımlarındaki işlemi tekrarlayın. Görünen her vezikül izlendikten sonra Hayır'a basın. Bu, elle izlenen kaplamayı otomatik olarak aynı klasöre kaydedecektir.
  3. Kimografi verilerinin ölçülmesi
    1. Yeni bir klasör oluşturun. Oluşturulan her metin dosyasını klasöre sürükleyin.
    2. Kymograph dosyasını açın ve boyutları kaydedin.
    3. Ölçü makrosunu Görüntü J'ye sürükleyin.
    4. Daha önce kaydedilen mikron-piksel oranını PixelScale'e girin.
    5. Düşük hız sınırını 0,1 olarak değiştirin. (Bu sınırın altında hareket eden veziküller durağan olarak kabul edilir).
    6. Daha önce kaydedilen kymograph boyutlarını girin. Özet dosyası, oluşturulan metin klasöründe otomatik olarak oluşturulacaktır. Her özet doldurma, %Kat Edilen Süre, Toplam Hız (μm/s), Toplam Mesafe, Kat Edilen Ortalama Segment, Durdurulma Sayısı ve Tersine Çevrilme Sayısını içerir. Kymograf verilerinin oluşturulması, izlenmesi ve ölçülmesi için kod, Ek Kodlama Dosyası 1 olarak sağlanır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mito-RFP ile etiketlenmiş serbest mitokondrinin motilitesini ölçmek için canlı hücre görüntüleme ve kimografik analizler yapıldı (6 nm ± 1 nm) veya gevşek (24 nm ± 3 nm) MAM 1X veya MAM 9X ile stabilize edilmiş sıkı (6 nm 3 nm) temas genişlikleri, her bir ReN GA (AD) veya ReN (naif) nöronun en az 500 nm uzunluğundaki en uzun nöronal sürecinde, bunu bir akson olarak düşünürsek (Şekil 1 ve Şekil 2). Hareketlerin frekansları (genel, retrograd ve anterograd), hare...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sigma-1 reseptörünün (S1R) inhibisyonu, nöronal süreçlerde MAM stabilizasyonunu aşağı regüle etti ve aksonlardan Aβ üretimini önemli ölçüde azalttı (~% 90), ancak amiloid öncü protein [APP] genindeki (ReN GA) ailesel AD [FAD] mutasyonlarını ifade eden insan nöral progenitör (ReN) hücrelerinin üç boyutlu (3D) kültür sisteminin soma'sından değil23,24,25,27. Sıkı (6 nm ± 1 nm) ve gevşek (...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Philadelphia Thomas Jefferson Üniversitesi'nden Profesör Dr. György Hajnóczky'ye, RFP-Mito, MAM 1X, MAM 9X ve MAM 18X'i kodlayan ekspresyon plazmitlerini cömertçe sağladığı için teşekkür ederiz. Brigham and Women's Hospital Kıdemli Görüntüleme Bilimcisi Dr. Lai Ding'e, kimograf verilerini oluşturmak, izlemek ve ölçmek için kod yazmamıza yardımcı olduğu için özel bir teşekkür. Bu çalışma, RB'ye Cure Alzheimer's Fund ve RET'e NIH hibesi 5R01NS045860-20 tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
6 Kuyulu Cam Alt PlakaCellvisP06-1.5H-N
B-27 Takviyesi (50X), serum içermeyenGibco/Thermo Fisher Scientific17504044
bFGFR& D Sistemi 233-FB
BSA BSAFisher Scientific501781532
Kontes Hücre Sayma Odası SlaytlarıInvitrogenC10283
DMEM / F12;Gibco/Thermo Fisher Bilimsel11320-033
EDTA   Yaşam Teknolojileri41116134
EGFSigma-Aldrich92090408
Falcon 6 Kuyu Plakaları VWR Uluslararası41122107
GAPDH Poliklonal AntikorThermo Fisher ScientificPA1-988
Jelatin VWR International9000-70-8
Graphpad Prizma N/APrizma 9, sürüm 9.5.0N/A
HeparinSigma-Aldrich 
ImageJ Yazılımı ImageJ 1.53aN/A
Matrigel Temel Membran Matrisi   Corning356234
mCherry Poliklonal AntikorİnvitrojenPA5-34974
MS Excel   Microsoft Excel, sürüm 2302N/A
Çok dizili elektrokemilüminesans test kitiMeso Scale Diagnostics (MSD)K15200E-2V-PLEX Aβ Peptit Panel 1 (6E10) kiti
NaCl   Fisher Scientific7647145
NuPAGE 4– % 12 Bis-Tris jel   İnvitrojenNP0321BOX
Penisilin / Streptomisin / Amfoterisin B Lonza  17-745E
PhotoshopAdobe Photoshop CC 20.0.10 N/A
Sıçan Nöron Nükleofektör KitiLonzaVPG-1003
StemPro Accutase GibcoA1110501
Tris-HCL, pH 7.6   Boston BioProducts42000000
Triton X-100   Sigma-AldrichT8787
Tween 20Fisher Bilimsel501657287
L-glutamin ile H0200000

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Giacomello, M., Pellegrini, L. The coming of age of the mitochondria-ER contact: a matter of thickness. Cell Death Differ. 23 (9), 1417-1427 (2016).
  2. Degechisa, S. T., Dabi, Y. T., Gizaw, S. T. The mitochondrial associated endoplasmic reticulum membranes: A platform for the pathogenesis of inflammation-mediated metabolic diseases. Immun Inflamm Dis. 10 (7), e647(2022).
  3. Schon, E. A., Area-Gomez, E. Mitochondria-associated ER membranes in Alzheimer disease. Mol Cell Neurosci. 55, 26-36 (2013).
  4. Erpapazoglou, Z., Mouton-Liger, F., Corti, O. From dysfunctional endoplasmic reticulum-mitochondria coupling to neurodegeneration. Neurochem Int. 109, 171-183 (2017).
  5. Sala-Vila, A., et al. Interplay between hepatic mitochondria-associated membranes, lipid metabolism and caveolin-1 in mice. Sci Rep. 6, 27351(2016).
  6. Fujimoto, M., Hayashi, T. New insights into the role of mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane. Int Rev Cell Mol Biol. 292, 73-117 (2011).
  7. Hung, V., et al. Proteomic mapping of cytosol-facing outer mitochondrial and ER membranes in living human cells by proximity biotinylation. eLife. 6, e24463(2017).
  8. Area-Gomez, E., Schon, E. A. On the pathogenesis of Alzheimer's disease: The MAM hypothesis. FASEB J. 31 (3), 864-867 (2017).
  9. Rizzuto, R., et al. Close contacts with the endoplasmic reticulum as determinants of mitochondrial Ca2+ responses. Science. 280 (5370), 1763-1766 (1998).
  10. Sukhorukov, V. S., et al. Molecular mechanisms of interactions between mitochondria and the endoplasmic reticulum: A new look at how important cell functions are supported. Mol Biol. 56 (1), 59-71 (2022).
  11. Zhang, P., Konja, D., Zhang, Y., Wang, Y. Communications between Mitochondria and endoplasmic reticulum in the regulation of metabolic homeostasis. Cells. 10 (9), 2195(2021).
  12. Ziegler, D. V., Martin, N., Bernard, D. Cellular senescence links mitochondria-ER contacts and aging. Commun Biol. 4 (1), 1323(2021).
  13. Csordas, G., et al. Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria. J Cell Biol. 174 (7), 915-921 (2006).
  14. Cieri, D., et al. SPLICS: a split green fluorescent protein-based contact site sensor for narrow and wide heterotypic organelle juxtaposition. Cell Death Differ. 25 (6), 1131-1145 (2018).
  15. Carpio, M. A., et al. BOK controls apoptosis by Ca(2+) transfer through ER-mitochondrial contact sites. Cell Rep. 34 (10), 108827(2021).
  16. Prudent, J., et al. MAPL SUMOylation of Drp1 stabilizes an ER/mitochondrial platform required for cell death. Mol Cell. 59 (6), 941-955 (2015).
  17. Zellmer, J. C., Tarantino, M. B., et al. Stabilization of mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes regulates Abeta generation in a three-dimensional neural model of Alzheimer’s disease. Alzheimer’s Dement. , 1-20 (2024).
  18. Magalhaes Rebelo, A. P., et al. Chemical modulation of mitochondria-endoplasmic reticulum contact sites. Cells. 9 (7), 1637(2020).
  19. Berger, S. I., Iyengar, R. Role of systems pharmacology in understanding drug adverse events. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 3 (2), 129-135 (2011).
  20. Friedman, J. R., Webster, B. M., Mastronarde, D. N., Verhey, K. J., Voeltz, G. K. ER sliding dynamics and ER-mitochondrial contacts occur on acetylated microtubules. J Cell Biol. 190 (3), 363-375 (2010).
  21. Wu, Y., et al. Contacts between the endoplasmic reticulum and other membranes in neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (24), E4859-E4867 (2017).
  22. Cagin, U., et al. Mitochondrial retrograde signaling regulates neuronal function. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (44), E6000-E6009 (2015).
  23. Choi, S. H., et al. A three-dimensional human neural cell culture model of Alzheimer's disease. Nature. 515 (7526), 274-278 (2014).
  24. Kim, Y. H., et al. A 3D human neural cell culture system for modeling Alzheimer's disease. Nat Protoc. 10 (7), 985-1006 (2015).
  25. Kwak, S. S., et al. Amyloid-beta42/40 ratio drives tau pathology in 3D human neural cell culture models of Alzheimer's disease. Nat Commun. 11 (1), 1377(2020).
  26. Csordas, G., et al. Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface. Mol Cell. 39 (1), 121-132 (2010).
  27. Bhattacharyya, R., et al. Axonal generation of amyloid-beta from palmitoylated APP in mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes. Cell Rep. 35 (7), 109134(2021).
  28. Tebo, A. G., Gautier, A. A split fluorescent reporter with rapid and reversible complementation. Nat Commun. 10 (1), 2822(2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondria Associated MembranesMAM StabilizationAlzheimer s Disease ModelNeural Progenitor CellsLive Cell ImagingKymographic AnalysisElectroporation TechniqueFluorescence MicroscopyMito RFP LabelingAxonal Mitochondria Motility

Related Articles