Yöntem makalesi

Dang NS1 Antijeninin Kolorimetrik ve Kantitatif Tespiti için Akıllı Telefon Uygulaması ile Birleştirilmiş Taşınabilir Kağıt Tabanlı İmmünoassay

2.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/66130

⸱

26 Ocak 2024

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacy, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Universitas Islam Indonesia, 2School of Bioresources and Technology, King Mongkut's University of Technology Thonburi, 3Department of Otolaryngology, Phramongkutklao Hospital and College of Medicine, 4Sensor Technology Laboratory, Pilot Plant Development and Training Institute, King Mongkut's University of Technology Thonburi, 5Biosciences and Systems Biology Research Team, National Center for Genetic Engineering and Biotechnology, National Sciences and Technology Development Agency at King Mongkut's University of Technology Thonburi

Bu makalede

Özet

Acil dang humması tanı ihtiyaçlarını ele alarak, burada klinik serum/kan örneklerinde Dang NS1 antijen konsantrasyonunu ölçmek için akıllı telefon uygulamasına entegre bir Dang NS1 Kağıt Tabanlı Analitik Cihazı (DEN-NS1-PAD) tanıtıyoruz. Bu yenilik, kaynakları sınırlı olanlar da dahil olmak üzere çeşitli sağlık hizmeti ortamlarında klinik karar vermeye yardımcı olarak dang humması yönetimini geliştirir.

Özet

Aedes sivrisinekleri tarafından bulaşan dang virüsü (DENV) enfeksiyonu, tropikal ve subtropikal ülkelerde önemli bir halk sağlığı sorunudur. Özellikle çocuklar arasında yıllık yaklaşık 10 milyon vaka ve 20.000-25.000 ölüm insidansı ile pratik tanı araçlarına acil ihtiyaç vardır. Erken enfeksiyon sırasında dang yapısal olmayan protein 1'in (NS1) varlığı, sitokin salınımı, vasküler sızıntı ve endotel disfonksiyonu ile ilişkilendirilmiştir ve bu da onu şiddetli dang humması için potansiyel bir belirteç haline getirir.

Yanal akış testleri (LFA'lar) ve mikroakışkan kağıt tabanlı analitik cihazlar (PAD'ler) gibi kağıt tabanlı immünolojik testler, basitlikleri, hızlılıkları, ucuzlukları, özgüllükleri ve yorumlama kolaylıkları nedeniyle tanı testleri olarak popülerlik kazanmıştır. Bununla birlikte, dang NS1 tespiti için geleneksel kağıt bazlı immünolojik testler tipik olarak görsel incelemeye dayanır ve yalnızca kalitatif sonuçlar verir. Bu sınırlamayı ele almak ve hassasiyeti artırmak için, bir akıllı telefon uygulamasını kolorimetrik ve kantitatif okuyucu olarak entegre eden Kağıt Tabanlı Analitik Cihaz (PAD), yani DEN-NS1-PAD üzerinde oldukça taşınabilir bir NS1 dang humması tespit testi önerdik. Geliştirme sistemi, klinik örneklerde NS1 konsantrasyonlarının doğrudan ölçülmesini sağlar.

Hastalardan elde edilen serum ve kan örnekleri, sistemin prototip performansını göstermek için kullanıldı. Sonuçlar hemen elde edildi ve hem iyi donanımlı sağlık tesislerinde hem de kaynakların sınırlı olduğu ortamlarda klinik değerlendirme için kullanılabilir. Kağıt bazlı bir immünolojik testin bir akıllı telefon uygulaması ile bu yenilikçi kombinasyonu, dang NS1 antijeninin gelişmiş tespiti ve miktar tayini için umut verici bir yaklaşım sunar. Hassasiyeti çıplak gözün yeteneklerinin ötesinde artıran bu sistem, özellikle uzak veya yetersiz hizmet alan bölgelerde, dang humması yönetiminde klinik karar vermeyi iyileştirmek için büyük bir potansiyele sahiptir.

Giriş

Dang virüsü (DENV) enfeksiyonu en hızlı yayılan sivrisinek kaynaklı hastalıktır1 ve dünyada 390 milyondan fazla insan 96 milyon semptomatik enfeksiyon, 2 milyon ciddi hastalık vakası ve yılda 25.000'den fazla ölüm ile enfekte olmaktadır 1,2. Dünya Sağlık Örgütü'ne (WHO) göre, tahminen 3,9 milyar insan dang humması riski altındadır; ~%70'i Asya Pasifik ülkelerinde ve özellikle Güneydoğu Asya'da yaşıyor3. 2019'da DSÖ'ye bildirilen dang humması vakalarının sayısı 4,2 milyondu ve Tayland en az 136.000 dang humması vakasına ve dang humması enfeksiyonundan 144 ölüm vakasına katkıda bulundu4. Tayland'daki dang humması salgını, Nisan'dan Aralık'a kadar olan yağışlı mevsimde, özellikle kuzeydoğu bölgesinde hem kentsel hem de kırsal alanlarda meydana gelir.

DENV enfeksiyonları, subklinik semptomlar, hafif dang humması (DF) ve şiddetli dang hemorajik ateşi (DHF) arasında değişen farklı klinik bulgulara sahiptir. Şiddetli DHF durumunun temel özelliği, vasküler geçirgenliğin artması, ardından şok ve organ fonksiyon bozukluğudur1. Vasküler sızıntıya neden olabilecek moleküler yolu anlamak, etkili dang humması tedavilerinin geliştirilmesinde çok önemlidir. Dang yapısal olmayan protein 1 (NS1), erken virüs enfeksiyonu 5,6 sırasında salgılanan bir glikoproteindir ve viral RNA replikasyonu7 için bir kofaktör olarak işlev görür. NS1, sitokin salınımını tetikleyebilir ve toll benzeri reseptör 4 (TLR4) ve endotelyal glikokaliks 8,9'a bağlanarak vasküler sızıntıya katkıda bulunabilir. İn vitro araştırmalar, NS1'in endotel hücreleri ile etkileşime girdiğini ve apoptozu indüklediğini göstermiştir. Bu durum endotel disfonksiyonuna ve vasküler sızıntıya katkıda bulunabilir10. Serum İnterlökin (IL)-10 seviyeleri ile ilişkili NS1 antijen seviyeleri, ciddi klinik hastalığı olan hastalarda önemli ölçüde artmıştır11. Dang NS1 ayrıca IL-10'u indükleyerek ve DENV'ye özgü T hücresi yanıtlarını baskılayarak hastalık patogenezine katkıda bulunur12,13. Ek olarak, dang NS1 proteini ciddi klinik hastalık ile ilişkiliydi ve hastalığın ilk 3 gününde NS1 > 600 ng mL-1 konsantrasyonu DHF14 gelişimi ile ilişkilendirildi.

DHF'li hastalarda dang NS1 antijeninin kalıcılığı, şiddetli dang6'nın bir belirteci olarak kullanılabilir. Enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ve hızlı test15 gibi klinik örneklerde NS1'i tespit etmek için çeşitli yöntemler vardır. Klinik ortamda NS1 proteinlerinin konsantrasyonunu ölçmek için altın standart ELISA yöntemidir. Bununla birlikte, ELISA yöntemi pahalıdır ve vasıflı personel ve laboratuvar olanakları gerektirir16. Bu nedenle, bakım noktası testinde (POCT) NS1 proteinlerini tespit etmek ve ölçmek için teknolojinin geliştirilmesi hala devam etmektedir. Son on yılda, yanal akış testleri (LFA'lar) ve mikroakışkan kağıt tabanlı analitik cihazlar (μPAD'ler) gibi kağıt tabanlı immünolojik testler, basitlikleri, hızlılıkları, ucuzlukları ve özgüllükleri nedeniyle tanı testleri olarak popüler hale gelmiştir 17,18,19. Kağıt bazlı bir immünolojik testte, altın nanopartiküller (AuNP'ler)20, manyetik nanopartiküller 21,22, kuantum noktaları23 ve floresan malzemeler24,25 gibi sinyaller üretmek için çeşitli etiketler kullanılmıştır. AuNP'ler, ucuz üretim maliyetleri, üretim kolaylığı, stabilite ve basit okumaları nedeniyle kağıt bazlı immünolojik testlerde kullanılan en yaygın etiketlerdir. Şu anda, dang NS1 için yanal akış deneyleri (LFA'lar) klinik ortamda ünlüolarak kullanılmaktadır 26,27. Bununla birlikte, geleneksel LFA etiket algılama yaygın olarak çıplak gözle kullanılır ve yalnızca kalitatif sonuçlar sağlar.

Son on yılda, dünya çapında 5 milyardan fazla akıllı telefon yaygın olarak kullanılmaktadır ve taşınabilir algılama geliştirme potansiyeli vardır28,29. Akıllı telefonlar, yerleşik fiziksel sensörler, çok çekirdekli işlemciler, dijital kameralar, USB bağlantı noktaları, ses bağlantı noktaları, kablosuz ve uygulama yazılımı gibi çok işlevli kapasitelere sahiptir ve bu da onları çeşitli biyosensör platformlarında kullanıma uygun hale getirir30. Ek olarak, kablosuz teknolojiler verilerin hızlı bir şekilde gönderilmesine olanak tanır ve gerçek zamanlı ve yerinde izleme için kullanılabilir31. Mudanyali ve ark. sıtma, tüberküloz ve HIV32 için taşınabilir, ekipmansız, hızlı, düşük maliyetli ve kullanıcı dostu bir POCT platformu geliştirmek için kağıt tabanlı immünolojik testi ve akıllı telefonları birleştirdi. Ling ve ark. sütte alkalin fosfataz aktivitesini kantitatif olarak tespit etmek için bir akıllı telefon kamerası ile birleştirilmiş bir yanal akış testi bildirdi33. Hou ve ark. ayrıca yanal akış tahlilinde renk veya floresandan gelen kantitatif sinyaller için akıllı telefon tabanlı, çift modaliteli bir görüntüleme sistemi geliştirdi34. Ek olarak, akıllı telefonu kolorimetrik ve kantitatif bir okuyucu olarak kullanmak, çıplak gözle hedef35'in varlığını güvenle bildiremezken hassasiyeti artırabilir.

Dang humması teşhisinde bir atılım sunan DEN-NS1-PAD 36,37,38 (bundan böyle cihaz olarak anılacaktır) taşınabilir ve verimli bir çözüm sunar. Balmumu baskılı mikroakışkan kağıt tabanlı teknolojiyi kullanan bu cihaz, görüntü işleme yoluyla NS1'i yüksek hassasiyet ve özgüllükle ölçer. Kullanışlılığını daha da artırmak için, kolorimetrik ve kantitatif okuma için kullanıcı dostu bir akıllı telefon uygulaması geliştirdik. Tayland hastanelerinden alınan hasta örneklerini kullanan klinik doğrulama, gerçek zamanlı hasta değerlendirmesi üzerindeki anında etkisinin altını çiziyor. İnovasyonumuz, modern, bakım noktası dang humması yönetiminde çok önemli bir ilerlemeye işaret ediyor ve kaynakların sınırlı olduğu sağlık hizmetleri ortamlarında teşhiste devrim yaratmayı vaat ediyor.

Protokol

Kurumsal İnceleme Kurulu Etik Komitesi, Tayland Kraliyet Ordusu Tıp Departmanı, Phramongkutklao Hastanesi, Bangkok, Tayland (IRBRTA 1218/2562) onay verdi. Bu çalışmayı gerçekleştirirken gerekli tüm etik düzenlemelere uyduk.

1. Kağıt bazlı İmmünoassay'in cihaz imalatı

NOT: Kağıt bazlı immünolojik test cihazı, daha önce belirlenmiş yöntemler 36,37 ve Tayland patent talebi no.190100816 38 izlenerek üretilmiştir.

  1. Tasarım ve desen çizimi: Kağıt analitik cihazını (Şekil 1A,B) bilgisayarda 18 PAD mum deseni ile tasarlayın.
    NOT: Tasarım özeldir ve A5 boyutlu kağıda yöneliktir. PAD sayısı, kullanıcının ihtiyaç duyduğu şekilde kağıdın boyutuyla ilgilidir.
  2. Tasarlanan deseni bir balmumu yazıcı (Malzeme Tablosu) kullanarak selüloz kağıda yazdırın.
  3. Balmumu baskılı kağıdı laboratuvar fırınında 150 °C'de 75 saniye eritin. Daha sonra, sonraki adımlar için gerekli olana kadar bir silika kutusunda saklayın.
  4. Hem test hem de kontrol alanlarına 0,5 μL %0,025 poli-L-lizin (PLL) uygulayın. Silika bir kutuda oda sıcaklığında (RT) 2 dakika inkübe edin ve ardından fırında 65 °C'de 5 dakika ısıtın.
  5. Kontrol alanına 0.5 μL 1 μg μL-1 keçi anti-fare IgG antikoru ve 0.5 μL 1 μg μL-1 yakalama antikoru test alanına uygulayın. Damlaların RT'de bir silika jel kutusunda 30 dakika kurumasını bekleyin.
  6. Numune alanına 2 μL, eşlenik alana 3 μL ve algılama alanına 2 μL bloke edici tampon uygulayın. Damlaları bir silika jel kutusunda 30 dakika boyunca RT'de kurumaya bırakın.
  7. Konjuge bölgeye 2 μL altın nanoparçacık-antikor kompleksi (AuNPs-Ab) çözeltisi uygulayın ve RT'de bir silika jel kutusunda 30 dakika kurumasını bekleyin.

2. Kağıt bazlı İmmünoassay'in montajı

  1. Yapışkanı ortaya çıkarmak için yapışkan plastik destek kartının arka tarafındaki koruyucu filmi dikkatlice çıkarın.
  2. İşlem görmüş selüloz kağıdı yapışkan plastik destek kartıyla hizalayın ve iki katmanı birbirine sıkıca bastırın.
    NOT: Kirlenme veya cihaza zarar verme riskini en aza indirmek için hidrofilik alana dokunmaktan kaçının.
  3. Kağıdı kaplamak için plastik bir film uygulayın ve birbirine bastırın.
  4. İstenilen cihaz parçasını, tamamen monte edilmiş cihaz tabakalarından makas kullanarak kesin.
  5. DEN-NS1-PAD'ler (Şekil 1C) artık kullanıma hazırdır. Uzun süreli stabilite için 4 °C'de saklayın.

3. AuNPs-Ab eşleniğinin hazırlanması

NOT: AuNPs-Ab, daha önce Prabowo ve ark.36 tarafından açıklandığı gibi hazırlanmıştır.

  1. PBS'de 10 μL 1 mg mL-1 anti-NS1 antikoru, 1 mL 40 nm AuNPs kolloidini ve 0.1 mL 0.1 M borat tamponunu (pH 8.5) birleştirin.
  2. Karışımı 50 rpm'de 60 dakika döndürün ve RT'de inkübe edin.
  3. BBS'de 0.1 mL 10 mg mL-1 BSA uygulayın, 50 rpm'de döndürün ve RT'de 15 dakika inkübe edin.
  4. Çözeltiyi 20.187 × g ve 4 °C'de 30 dakika santrifüjleyin.
  5. Süpernatanı dikkatlice pipetleyin ve çökeltilmiş AuNPs-Ab'den ayırın.
  6. AuNPs-Ab'yi 500 μL BBS'de yeniden süspanse edin ve sonikasyon kullanarak dağıtın.
  7. Santrifüjlemeyi 20.187 × g ve 4 °C'de 30 dakika tekrarlayın.
    NOT: Dispersiyon ve santrifüj işlemlerini 3 kez tekrarlayın.
  8. Süspansiyona 50 μL konjugat tampon ekleyerek konjugat alana uygulamaya hazır hale getirin.

4. Mobil uygulama geliştirme

  1. Görüntü işleme ve makine öğrenimi geliştirme
    1. DEN-NS1-PAD'lerin 900'den fazla otomatik odaklamalı görüntüsünü toplayarak, farklı konsantrasyonlar, kamera markaları (12-13 megapiksel), dönüşler (90° ve 180°) ve aydınlatma ayarları gibi çeşitli koşulları yakalayarak denetimli bir görüntü modeli için bir veri kümesi toplayın. Her özel koşulda 30 görüntü hedefleyin.
    2. Denetimli öğrenme için toplanan görüntülerdeki test ve kontrol alanları olarak iki ilgi alanını belirleyerek ve açıklama ekleyerek temel gerçeği etiketleyin.
    3. Arka plan şeridini tanımlamak için bir algoritma tasarlayın. Test ve kontrol bölgeleri arasındaki merkez çizgisini bulun, orta noktasını hesaplayın ve aynı dönme yönünü korurken iki ana bölgenin ortalama boyutuyla orantılı bir kare bölge oluşturun.
    4. İlgilenilen bölgeleri belirlemek için bir görüntü segmentasyon modeli eğitmek için 4.1.1 ve 4.1.2 adımlarındaki veri kümesini ve temel doğruluk etiketlerini kullanarak bir görüntü segmentasyon modeli oluşturun.
  2. Uygulama algoritması
    1. Test, kontrol ve arka plan bölgelerini otomatik olarak bulmak için eğitilen görüntü segmentasyon modelini yeni görüntülere uygulayın.
    2. İlgilenilen üç bölgenin (test, kontrol ve arka plan) her biri için tek bir yoğunluk değeri elde etmek için temel görüntü işleme tekniklerini kullanın.
    3. Piksel değerlerine erişmek için görüntüyü bir 3B dizi temsiline (y, x kanalı) dönüştürün.
    4. RGB değerlerinin ortalamasını alarak görüntüyü gri tonlamaya dönüştürün ve (255-x) formülüyle ters çevirme uygulayın.
    5. Arka plan alanı değerini çıkararak test ve kontrol alanının değerlerini normalleştirin.
    6. NS1 konsantrasyonunu hesaplamak için önceden belirlenmiş kalibrasyon eğrisini kullanın.
    7. Normalleştirilmiş gri tonlama yoğunluklarından elde edilen 0,1103'lük bir kesme değerine göre sonuçları pozitif veya negatif olarak sınıflandırın37.

5. Kalibrasyon eğrisi ve hassasiyetler

  1. NS1 örneğini 0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 ve 1.0 μg mL-1 konsantrasyonlarında kalibrasyon için insan serumunda hazırlayın.
  2. Numune alanına her konsantrasyondan 50 μL damlatın ve ölçümleri üç kopya halinde gerçekleştirin.
  3. Numunelerin tamamen cihaza girmesine izin verin, bu da sonuçların elde edilmesi 20-30 dakika sürebilir.
  4. 5 dakikalık inkübasyondan sonra bir dijital kamera veya akıllı telefon kullanarak cihazın görüntülerini yakalayın.
  5. ImageJ ve özel bir mobil uygulama kullanarak test ve kontrol alanlarını analiz edin.
  6. Kalibrasyon eğrisini ImageJ ve mobil uygulamadan alınan verilere göre oluşturun.
  7. Aşağıdaki denklemleri (1-3) kullanarak boşluk sınırını (LOB), algılama sınırını (LOD) ve niceleme sınırını (LOQ) hesaplayın:
    LOB = Boş verinin ortalaması + 1:645* ð (boş verinin standart sapması) (1)
    LOD = LOB +1:645*ð (en düşük konsantrasyon verilerinin standart sapması) (2)
    LOQ = Boş verinin ortalaması + 10*ð (boş verinin standart sapması) (3)

6. Klinik örneklerle kağıt tabanlı bir İmmünoassay yapmak

  1. Hastaneye yatışlarının ilk gününde 30 hastadan 300 μL periferik kan toplayın ve iyi klinik uygulamaları takiben mor üst EDTA tüplerine işleyin.
  2. Kanı 2.884 × g ve 4 °C'de 20 dakika santrifüj edin.
  3. Sıvı bileşeni (plazma) bir pipet kullanarak temiz bir polipropilen tüpe aktarın.
  4. Plazmayı daha sonraki analizler için hemen -20 °C'de dondurucuda saklayın.
  5. Cihazın üstündeki numune alanına 20 μL plazma uygulayın. Ardından, 30 μL yıkama tamponu ekleyin (1x fosfat tamponlu salin içinde %0,05 v/v Tween 20).
  6. Numunenin tamamen cihaza girmesine izin verin, bu da sonuçların elde edilmesi 20-30 dakika sürebilir.
  7. Oda sıcaklığında 5 dakikalık inkübasyondan sonra bir dijital kamera veya akıllı telefon kullanarak cihazın görüntülerini yakalayın.
  8. ImageJ ve özel bir mobil uygulama kullanarak test ve kontrol alanlarını analiz edin.

7. Mobil uygulama ile miktar tayini

NOT: Kağıt bazlı immünolojik testin yoğunluğu mobil uygulamada analiz edilmiştir (Şekil 2).

  1. Geliştirilen mobil uygulamayı akıllı telefonda açın.
  2. Veri kaynağını seçmek veya karşıya yüklemek için Kamerayı kullan veya Galeriden Yükle'yi seçin. Bunu kamera çekimi yoluyla veya cihazın galerisinden bir görüntü seçerek yapın.
  3. Analitik bölümüne gidin ve ekrandaki Analiz Et düğmesine dokunun.
  4. Uygulamanın verileri analiz etmesini ve sonuçları görüntülemesini bekleyin.

Sonuçlar

Kağıt bazlı immünoassay cihazlarında tekrarlanabilir tahlil performansları sağlamak için bir üretim yönteminin seçilmesi çok önemlidir. Çalışmamızda, kağıt tabanlı bir immünolojik testi gösterme bağlamında çeşitli üretim süreçlerini ve malzemelerini araştırdık. Seçtiğimiz yöntem, kağıt bazlı mikroakışkan cihazlarda hidrofobik bariyerler oluşturmak için bir mum baskı sistemi kullanır. Bu yaklaşım, basitliği, hızı ve tutarlı sonuçları nedeniyle öne çıkıyor. Dikkat çekici bir şekilde, protein adsorpsiyonuna müdahale etme ve selüloz kağıdın hidrofobikliğini artırma potansiyeline sahip fotorezist kimyasalların kullanımından kaçınma avantajı sunar. Ayrıca, mum baskı, akışkan kanalların tutarlı boyutlarını sağlayarak tekrarlanabilir test performansına katkıda bulunur.

Hidrofobik bariyerlerin oluşumunu takiben, immünoassay için gerekli reaktifler selüloz kağıt yüzeyine uygulandı. Elektrostatik adsorpsiyon ile PLL, hem amin fonksiyonel gruplarının pozitif yükü hem de negatif yüklü antikor ile etkileşime girerek biyomolekül immobilizasyonuna yardımcı oldu. Bu adım, üretim işlemleri sırasında antikorların modifikasyonunu ve immobilizasyonunu ve etiket-antikor konjugatlarının uygulanmasını kolaylaştırır. Daha da önemlisi, bu adım paralel olarak gerçekleştirilebilir. Kağıt immünoassay cihazlarının ( Şekil 1A'da gösterildiği gibi DEN-NS1-PAD) montajı, modifiye edilmiş kağıdın yapışkan bir plastik destek kartına istiflenmesi ve plastik bir film ile lamine edilmesiyle tamamlanır.

Bu çalışmanın temel amacı, NS1 konsantrasyonlarını ölçmek için bir akıllı telefon kullanan kullanıcı dostu bir yöntem geliştirmektir. Bu yaklaşım, hem evde hem de klinik ortamlarda bir bakım noktası testi (POCT) cihazı olarak kullanılabilir. Hasta serumundaki çok çeşitli NS1 konsantrasyonları göz önüne alındığında, bu deneylerin sonuçlarına dayanarak basit doğrusal modeller kullanıldı. Her NS1 konsantrasyonu için üç test cihazından oluşan bir veri seti hazırlandı. Cihazların fotoğrafları, standart ayarlar ve optimum aydınlatma koşulları altında bir akıllı telefon kullanılarak çekildi ve karanlık bir kutuya olan ihtiyacı ortadan kaldırdı. PAD'lerin test bölgesi fare dang NS1 monoklonal antikoru içerirken, kontrol bölgesi keçi anti-fare IgG antikoru içerir. Bir sandviç tahlil formatında, numunelerdeki daha yüksek NS1 konsantrasyonları, test bölgesinde artan kırmızı renk yoğunluğuna karşılık gelir. Buna karşılık, kontrol bölgesindeki renk yoğunluğu nispeten sabit kalır. Şekil 1B , özel ekipman gerektirmeden avantajlı bir görsel gözlem sağlayan işlenmemiş akıllı telefon görüntülerini göstermektedir.

Özel bir mobil uygulama kullanarak, yoğunlukları normalleştirdik ve serum örneklerinde sivri uçlu NS1 konsantrasyonları için basit doğrusal modeller hesapladık - mobil uygulamadan elde edilen katsayı korelasyonu (r2). Mobil uygulamadan elde edilen katsayı korelasyonu (r2) 0,92 (Şekil 3) ile beklentilerle uyumlu olarak bulunmuştur. Bu akıllı telefon tabanlı yaklaşım, çıplak gözle gözlemden daha iyi performans göstererek hassasiyeti 8 oranında önemli ölçüde artırdı. Ek olarak, Tablo 1'de gösterildiği gibi normalleştirilmiş yoğunluklar için boşluk limiti (LoB), tespit limiti (LoD) ve miktar belirleme limiti (LoQ) hesaplanmıştır.

DEN-NS1-PAD'lerin klinik ortamlarda pratik işlevselliğini göstermek için gerçek dünya klinik örnekleri kullanıldı. Kağıt bazlı immünolojik test, 20-30 dakika içinde kalitatif renk okumaları üreterek negatif veya pozitif sonuçların görsel olarak belirlenmesine izin verdi. Dang hummasından şüphelenilen hastalardan alınan serum örnekleri cihaza tabi tutuldu. Şekil 4 , hem cihazdan hem de ticari bir hızlı tanı testinden (RDT) elde edilen sonuçları göstermekte ve karşılaştırmaktadır. Tablo 2 , görsel okumaların ve akıllı telefon tabanlı sistemin sonuçlarını özetlemektedir. Ticari RDT ve cihaz, görsel okumadan yedi olumlu ve 23 olumsuz sonuçla benzer sonuçlar verdi. Buna karşılık, cihaza özel olarak uygulanan akıllı telefon tabanlı okuyucu sistemi, klinik örneklerden dokuz pozitif ve 21 negatif sonuç bildirdi.

figure-results-1
Şekil 1: Tasarlanmış ve üretilmiş DEN-NS1-PAD'in görüntüleri. (A,B) Balmumu desenli hidrofobik bariyerden tek bir kanal, numune çözeltisini belirlenen alana soktuktan ve sırasıyla (D) negatif ve (E) pozitif sonuçları gösterdikten önce (C) ve (D,E) olmak üzere üç durumda tasarlanır ve gösterilir. Numune çözeltisi kanal boyunca fitil alır (etiketli oka bakın), kilit konumlardaki bileşenlerle etkileşime girer - konjugat alanda AuNPs-Ab, test alanında anti-NS1 antikoru (pozitif bir dang NS1 sonucunun göstergesi) ve kontrol alanında anti-fare IgG. Sonuçlar çıplak gözle kolayca gözlemlenebilir ve düz yataklı bir tarayıcı veya akıllı telefon kamerası kullanılarak görüntü işleme ile ölçülebilir. Kısaltma: AuNPs-Ab = altın nanopartiküller-antikor konjugat. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Mobil uygulamadan telefon ekranının ekran görüntüleri. (A) Cep telefonu cihazında çalışan Android uygulamasının kullanıcı ekranı, (B) uygulama ekranının görüntüsü, (C) kullanıcıların kamerayı kullanmak veya galeriden resim yüklemek için seçebilecekleri uygulamanın ana menüsü, (D) test için ilgili bir resmin görüntülenmesi, (E) analiz etmek için geri sayım süresinin görüntülenmesi, (F) Test ve kontrol bölgesinin yoğunluğu, enfeksiyon kararı (pozitif/negatif) ve numunedeki NS1 konsantrasyonu dahil olmak üzere test sonuçlarının gösterilmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Serumda NS1 tespiti için doğrusal kalibrasyon eğrisi. Cihaz kullanıldı ve görüntüler, akıllı telefon verilerine dayalı bir uygulama aracılığıyla işlenerek yorumlandı. Hata çubukları ±1 standart sapma, n = 3 gösterir. Kısaltmalar: T = test alanı; C = kontrol alanı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Klinik numune tahlilinden DEN-NS1-PAD'in görüntüsü. Serum (50 μL) kağıt bazlı bir immünolojik testte kullanıldı. (A) Negatif sonuç örneği, (B) pozitif sonuçlar, (C) genel sonuçlar ve RDT ile kağıt bazlı immünolojik testin karşılaştırılması. Kısaltmalar: RDT = Hızlı Tanı testi; Pos = pozitif; Neg = negatif. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

ParametreÇıplak gözlerMobil Uygulama
Boşluk Sınırı (LoB)-43.15 ng mL-1
Algılama Sınırı (LoD)200 ng mL-1112.19 ng mL-1
Miktar Belirleme Limiti (LoQ)-373.58 ng mL-1

Tablo 1: ImageJ'den LoB, LoD ve LoQ ve serumda NS1 veri kalibrasyon standardı ile ilgili mobil uygulama. Kısaltmalar: LoB = boşluk sınırı; LoD = algılama sınırı; LoQ = niceleme sınırı.

Hasta No.Çıplak GözlerAkıllı Telefon UygulamasıResimJ
RDTKağıt Tabanlı İmmünoassay
1----
2----
3----
4----
5----
6----
7----
8----
9++++
10--++
11----
12++++
13----
14----
15----
16++++
17++++
18----
19----
20----
21++++
22++++
23----
24++++
25----
26----
27----
28----
29----
30--++

Tablo 2: Serum örnekleri için görsel okuma ve akıllı telefon tabanlı okuyucu sistemi sonuçlarının karşılaştırılması. (+) ve (-) sırasıyla sonuçların olumlu ve olumsuz yorumlarını gösterir.

Tartışma

Akıllı telefon tabanlı bir okuyucu sistemi için önemli tasarım parametrelerinden biri, numunelerin tekrarlanabilir görüntüleme işlemesini sağlama yeteneğidir. Bu çalışmada, basitlik ve kolaylık sağlamak için, görüntüler üç farklı akıllı telefon markasından 12-13 MP kameralarla görüntüleme kutusu veya aksesuar kullanılmadan çekilmiştir. Kameranın çözünürlüğü, görüntü yakalama süresi, aydınlatma koşulları ve ortam gibi değişken görüntü yakalama koşulları, cihazdaki test ve kontrol noktalarının renk yoğunluğunu etkileyebilir. Farklı görüntü yakalama sürelerinin PAD'in aydınlatılması ve kurutulması üzerindeki etkisi, çeşitli zamanlarda yakalanan görüntüler arasında tutarlı kalan normalleştirilmiş sinyal yoğunlukları kullanılarak en aza indirilmiştir36. Arka plan sinyali çıkarma, renk yoğunluğu ölçümlerinin doğruluğunu artırmak ve aydınlatma koşullarının etkisini etkili bir şekilde azaltmak için bir strateji olarak ortaya çıktı. Bulgumuz, çevresel etkileri en aza indirmede temel veya arka plan çıkarma tekniklerinin etkinliğini vurgulayan önceki araştırmalarla uyumludur39,40.

Bir görüntüleme kutusu veya aksesuarsız bir yöntem kullanmanın üstünlüğünü çevreleyen devam eden tartışma, görüntü işleme için çıkarımlara sahiptir39,41. Bir görüntüleme kutusu, görüntüleme koşullarındaki değişiklikleri en aza indirerek görüntüleme işleme sonuçlarının sağlamlığını artırabilir 41,42,43. Bu çalışmada, görüntü işleme için bulut makine öğrenmesine dayalı bir mobil uygulama kullanılmıştır. Bu yaklaşım, görüntü verilerini otomatik olarak sınıflandırmak, ayıklamak ve zenginleştirmek için bulut tabanlı bir platformda makine öğreniminden yararlanır. Uygulama, arka plan, test ve kontrol bölgelerini kapsayan görüntülerdeki ilgilenilen bölgeyi etkili bir şekilde tanımladı ve işledi. Bu adım, bu bölgeler arasında ayrım yapmada çok önemliydi38. Önceki araştırmalar, makine öğrenimini içeren görüntü işlemenin, kontrol ve test örnekleri için sonuçlar arasında üstün sınıflandırma sağladığını göstermektedir 43,44,45. Bu çalışmada, sabit konum ve arka plan çıkarmanın kullanılması, selüloz μPAD'lerden tutarlı bir arka plan sinyali üreterek, mobil uygulama40,43 tarafından sağlanan okumaların tutarlılığını ve sınıflandırma doğruluğunu artırdı.

Kağıt bazlı bir immünolojik testin gösterilmesindeki tutarlı performanslarla ilgili olarak, üretim yöntemi önemli bir rol oynamaktadır. Önceki bir çalışmada36, DEN-NS1-PAD'ın tasarım ve üretim yöntemi için PLL konsantrasyonları, bloke edici madde ve NS1 antikoru gibi çeşitli optimizasyon koşulları incelenmiştir. Cihaz, NS1'i tampon, hücre kültürü ve insan serumunda hem kalitatif hem de kantitatif olarak başarıyla test etti.

Serum bileşenlerinden kaynaklanan matris etkileri, serum numunelerini test ederken cihazın tespit sınırına müdahale edebilir. Bununla birlikte, sonuçlar, geliştirilen immünolojik testin serum örneklerinde NS1 konsantrasyonlarını başarılı bir şekilde tespit edebildiğini ve ticari RDT'ninkilerle karşılaştırılabilir sonuçlar üretebildiğini göstermektedir (Tablo 2). Görsel inceleme ve mobil uygulama (Şekil 4) kullanılarak elde edilen belirgin sonuçlar gözlemlendi ve testin serum testi için etkinliğinin altını çizdi. Serumun daha yüksek viskozitesi analiz sürelerini etkileyebilse de, sonuçların yorumlanmasını engellemez36. Bir mobil uygulama kullanmak, numune tahlilleri için daha olumlu sonuçlar sağlayabilir, çünkü bir mobil uygulama kullanmak, numune testinin hassasiyetini önemli ölçüde artırır46. Dang NS15,47,48 için RT-PCR1 gibi moleküler tahlillerle daha fazla karşılaştırmanın, potansiyel yanlış pozitif veya yanlış negatif sonuçları belirlemek için gerekli olduğunu belirtmekte fayda var.

Bu çalışmanın dikkate değer bir sınırlaması, kan gibi daha karmaşık bir numune matrisi düşünüldüğünde ortaya çıkar. Kanda bulunan bileşenler gerçekten de cihazın tespit sınırına müdahale edebilir. Bu gibi durumlarda, çalışan tampon emilimini artırmak için ek emici pedlerin kullanılması potansiyel bir çözümü temsil eder. Bu modifikasyon, kan trombositlerini etkileyerek selülozun hemostiptik özelliklerinden yararlanarak kan pıhtılaşmasına yardımcı olabilir49. Başka bir yaklaşım, kan pıhtılaşmasını artırmak için numune pedine %4 (a/h) salin damlası uygulanmasını içerir. Önceki araştırmalar, kalsiyum klorür ve sodyum klorür gibi tuzların kırmızı kan hücresi (RBC) pıhtılaşmasını indüklediğini göstermiştir50,51. Na+, RBC yüzeyindeki elektrikli çift tabakayı baskılayarak ve RBC'ler arasındaki yük itişini azaltarak kandaki RBC'lerin süspansiyonunu dengesizleştirebilir. Ek olarak, yüksek bir tuz konsantrasyonu da kan agregasyonunu indükler52. Ayrıca, Na+'nın karşı iyon değerlik yükü, yüklü çift RBC katmanının kalınlığını bastırarak sönük RBC'lerin toplanmasına yol açar. %4 (a/h) salin çözeltisi (NaCl) ilavesi, selüloz kağıt51 üzerinde plazma ayrımını kolaylaştırır. Bununla birlikte, kan agregasyonu ve altın nanopartikül agregasyonu üzerinde istenmeyen etkilere neden olmaktan kaçınmak için salin konsantrasyonunun dikkatli bir şekilde optimizasyonu gereklidir53,54.

Ticari balmumu yazıcıları, prototip oluşturmanın maliyeti ve basitliğinin ideal bir kombinasyonunu sağladı. Bu yazıcılar 2016 yılında kullanımdan kaldırıldığından, mürekkep püskürtmeli baskı55, serigrafi56 ve fotolitografi57 gibi alternatif üretim yöntemlerine ihtiyaç duyuldu. Bir ofis toner yazıcısı, μPAD üretimi için iyi bir adaydır. Tonerdeki polyester reçine, çeşitli tasarımlarla 200 °C'de 60 dakika boyunca hidrofobik desenler oluşturur58.

Bu araştırmada şirket tarafından belirtildiği gibi antikor NS1 serotip iki kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu antikorun tüm serotiplerle de etkileşime girdiğini bulduk36,37. DENV-4'ün saptanması için duyarlılık diğer serotiplere göre daha düşüktür (%87.5). DENV-1 ve DENV-2'nin duyarlılığı yaklaşık% 88.89'dur ve DENV-3 için% 100'dür 37. Bu bulgular, RDT'nin diğer serotiplere kıyasla DENV-4'e duyarlılığının daha düşük olduğunu bildiren daha önceki araştırmalarla uyumludur59. Cihazın genel duyarlılığı ~%88,89'dur ve özgüllüğü yaklaşık %86,67'dir. DEN-NS1-PAD'in gerçek hassasiyetinin ticari RDT'ninkini geçebileceği dikkat çekicidir. Bununla birlikte, RDT %84.62'lik bir pozitif prediktif değer (PPD) ve %87.67'lik bir doğruluk göstermektedir. Özellikle, DEN-NS1-PAD ilk 5-6 günde dang enfeksiyonunu tespit etmede daha iyi performans gösterirken, RDT sadece ilk 5 günde etkilidir37.

Özetle, taşınabilir kağıt bazlı bir immünolojik testin (DEN-NS1-PAD) bir akıllı telefon uygulamasıyla birleştirilmesi, dang NS1 ölçümü için büyük umut vaat etmektedir. Mobil uygulama, çıplak gözle gözleme kıyasla serum örneklerinde NS1'in miktarını belirlemede duyarlılığı ve verimliliği önemli ölçüde artırır. Mobil uygulamanın avantajları arasında azaltılmış analiz süresi, kullanım kolaylığı ve çeşitli akıllı telefon cihazları, konumları ve aydınlatma koşullarıyla uyumluluk yer alır. Bununla birlikte, hassasiyeti ve performansı artırmak için daha fazla geliştirme gereklidir. Bu arada, kan örnekleriyle uğraşırken performansını artırmak için kağıt bazlı immünolojik testin modifikasyonu gereklidir. Ayrıca, daha önemli sayıda primer enfeksiyon serotipi ve çeşitli hastalardan (çocuklar ve yetişkinler) toplanan seçilmiş örnekler kullanılarak dang hummasını tespit etmek için DEN-NS1-PAD'in kapsamlı değerlendirmeleri gereklidir.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

MHP, Universitas Islam Indonesia'nın (UII) burs araştırma fonunu minnetle kabul eder. Yazarlar, mobil uygulamanın geliştirilmesi boyunca değerli uzmanlığı ve yardımı ve el yazmasına katkıları için Bay Nutchanon Ninyawee'ye şükranlarını sunarlar. Ayrıca yazarlar, Tayland Bilim Araştırma ve İnovasyon (TSRI), Temel Araştırma Fonu: 2023 Mali Yılı (proje no. FRB660073/0164) King Mongkut Teknoloji Üniversitesi Thonburi'nin Akıllı Sağlık Programı kapsamında.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Malzemeler< / güçlü >
0.1 M fosfat tamponlu tuzlu su (PBS, pH 7.2) 
%0.1 Tween 20, %10 sükroz ve %1 kazein içeren BBS   konjuge alan işleme ve bloke edici tampon
Borat tamponlu salin (BBS) (pH 8.2'de 25 mM sodyum borat ve 150 mM sodyum klorür)% 1 BSA ve nbsp ile desteklenmiştir;konjugasyon işlemi sırasında yıkama tamponu AuNP'ler antikor
Borik asitMerck10043-35-3
ile Sığır serum albümin fraksiyonu V (BSA)   PAA Lab GmbH (Almanya)K41-001 
KazeinMerck9005-46-3
Kromatografi kağıdı Sınıf 2 GE Sağlık3002-911 
Şeffaf laminat film3M (Kırtasiye dükkanları)
Disodyum hidrojen fosfatMerck7558-79-4
Çift bant yanKırtasiye dükkanları
Keçi anti-fare IgG antikoru MyBiosource (ABD)MBS435013
Altın nanopartiküller (40 nm)   Serve Science Co., Ltd. (Tayland)
İnsan IgG poliklonal antikoru   MerckAG711-M
Fare dang humması NS1 monoklonal antikoru MyBiosource (ABD)MBS834415
Fare dang humması NS1 monoklonal antikoru MyBiosource (ABD)MBS834236
NS1 serotip 2 antijenleriMyBiosource (ABD)MBS 568697
PBS 1X, telüsyon tamponu
Plastik destek kartı 10x30 cmPacific Biotech Co., Ltd. (Tayland)
Poli-L-lizin (PLL)Sigma AldrichP4832
Potasyum KlorürMerck104936
Potasyum monofosfatMerck104877
Sodyum KlorürMerck7647-14-5
Sodyum tetraborat Sigma Aldrich1303-96-4
SükrozMerck57-50-1
Tween 20Sigma Aldrich9005-64-5
Instruments
CytationTM 5 çok modlu okuyucuBioTek
Cep telefonlarıHuawei Y7, iPhone 11, Samsung a20
Fotoğraf tarayıcıEpson Perfection V30
FırınMemmert
Wax yazıcı Xerox ColorQube 8880-PS
Software
Could AutoML Vision Nesne Algılama belgeleriGoogle Cloud
ImageJUlusal Sağlık Enstitüsü, Bethesda, MD, ABD
Inkscape 0.91 Yazılımı
olarak %0.1 Tween 20 kullanıldı

Kaynaklar

  1. Cattarino, L., Rodriguez-Barraquer, I., Imai, N., Cummings, D. A. T., Ferguson, N. M. Mapping global variation in dengue transmission intensity. Science Translational Medicine. 12 (528), 1-11 (2020).
  2. World Health Organization (WHO). Treatment, prevention and control global strategy for dengue prevention and control. , WHO, Geneva. 1-34 (2012).
  3. WHO Dengue and severe dengue. , https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/dengue-and-severe-dengue (2020).
  4. Department of Disease Control Ministry of Health Thailand. Weekly Disease Forecast Dengue. , (2020).
  5. Malavige, G. N., Ogg, G. S. Pathogenesis of vascular leak in dengue virus infection. Immunology. 151 (3), 261-269 (2017).
  6. Paranavitane, S. A., et al. Dengue NS1 antigen as a marker of severe clinical disease. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 570(2014).
  7. Muller, D. A., Young, P. R. The flavivirus NS1 protein: Molecular and structural biology, immunology, role in pathogenesis and application as a diagnostic biomarker. Antiviral Research. 98 (2), 192-208 (2013).
  8. Modhiran, N., et al. Dengue virus NS1 protein activates cells via Toll-like receptor 4 and disrupts endothelial cell monolayer integrity. Science Translational Medicine. 7 (304), 304ra102(2015).
  9. Glasner, D. R., et al. Dengue virus NS1 cytokine-independent vascular leak is dependent on endothelial glycocalyx components. PLOS Pathogens. 13 (11), e1006673(2017).
  10. Lin, C. -F., et al. Antibodies from dengue patient sera cross-react with endothelial cells and induce damage. Journal of Medical Virology. 69 (1), 82-90 (2003).
  11. Adikari, T. N., et al. Dengue NS1 antigen contributes to disease severity by inducing interleukin (IL)-10 by monocytes. Clinical and Experimental Immunology. 184 (1), 90-100 (2016).
  12. Malavige, G. N., et al. Suppression of virus specific immune responses by IL-10 in acute dengue infection. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (9), e2409(2013).
  13. Malavige, G. N., et al. Serum IL-10 as a marker of severe dengue infection. BMC Infectious Diseases. 13 (1), 341(2013).
  14. Libraty, D. H., et al. High circulating levels of the dengue virus nonstructural protein NS1 early in dengue illness correlate with the development of dengue hemorrhagic fever. The Journal of Infectious Diseases. 186 (8), 1165-1168 (2002).
  15. World Health Organization (WHO) and the Special Programme for Research and Tropical Diseases (TDR). Dengue: guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control -- New edition. , https://www.who.int/publications-detail-redirect/9789241547871 (2009).
  16. Axelrod, T., Eltzov, E., Marks, R. S. Capture-layer lateral flow immunoassay: a new platform validated in the detection and quantification of dengue NS1. ACS Omega. 5 (18), 10433-10440 (2020).
  17. Kim, S. -W., Cho, I. -H., Lim, G. -S., Park, G. -N., Paek, S. -H. Biochemical-immunological hybrid biosensor based on two-dimensional chromatography for on-site sepsis diagnosis. Biosensors and Bioelectronics. 98, 7-14 (2017).
  18. Fu, Q., et al. Development of a novel dual-functional lateral-flow sensor for on-site detection of small molecule analytes. Sensors and Actuators B: Chemical. 203, 683-689 (2014).
  19. Dzantiev, B. B., Byzova, N. A., Urusov, A. E., Zherdev, A. V. Immunochromatographic methods in food analysis. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 55, 81-93 (2014).
  20. Hu, J., et al. Advances in paper-based point-of-care diagnostics. Biosensors and Bioelectronics. 54 (4), 585-597 (2014).
  21. Zhong, Y., et al. Gold nanoparticles based lateral flow immunoassay with largely amplified sensitivity for rapid melamine screening. Microchimica Acta. 183 (6), 1989-1994 (2016).
  22. Figueredo, F., Garcia, P. T., Cortón, E., Coltro, W. K. T. Enhanced analytical performance of paper microfluidic devices by using Fe 3 O 4 nanoparticles, MWCNT, and graphene oxide. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (1), 11-15 (2016).
  23. Bahadır, E. B., Sezgintürk, M. K. Lateral flow assays: Principles, designs and labels. TrAC - Trends in Analytical Chemistry. 82, 286-306 (2016).
  24. He, M., Liu, Z. Paper-based micro fluidic device with upconversion fluorescence assay. Analytical Chemistry. 85, 11691-11694 (2013).
  25. Derikvand, F., Yin, D. L. T., Barrett, R., Brumer, H. Cellulose-based biosensors for esterase detection. Analytical Chemistry. 88 (6), 2989-2993 (2016).
  26. Kumar, S., Bhushan, P., Krishna, V., Bhattacharya, S. Tapered lateral flow immunoassay-based point-of-care diagnostic device for ultrasensitive colorimetric detection of dengue NS1. Biomicrofluidics. 12 (3), 034104(2018).
  27. Sinawang, P. D., Rai, V., Ionescu, R. E., Marks, R. S. Electrochemical lateral flow immunosensor for detection and quantification of dengue NS1 protein. Biosensors and Bioelectronics. 77, 400-408 (2016).
  28. Zhang, D., Liu, Q. Biosensors and bioelectronics on smartphone for portable biochemical detection. Biosensors and Bioelectronics. 75, 273-284 (2016).
  29. Preechaburana, P., Suska, A., Filippini, D. Biosensing with cell phones. Trends in Biotechnology. 32 (7), 351-355 (2014).
  30. Laksanasopin, T., et al. A smartphone dongle for diagnosis of infectious diseases at the point of care. Science Translational Medicine. 7 (273), 273re1(2015).
  31. Kim, J., et al. Noninvasive alcohol monitoring using a wearable tattoo-based iontophoretic-biosensing system. ACS Sensors. 1 (8), 1011-1019 (2016).
  32. Mudanyali, O., et al. Integrated rapid-diagnostic-test reader platform on a cellphone. Lab on a Chip. 12 (15), 2678(2012).
  33. Yu, L., Shi, Z., Fang, C., Zhang, Y., Liu, Y., Li, C. Disposable lateral flow-through strip for smartphone-camera to quantitatively detect alkaline phosphatase activity in milk. Biosensors and Bioelectronics. 69, 307-315 (2015).
  34. Hou, Y., et al. Smartphone-based dual-modality imaging system for quantitative detection of color or fluorescent lateral flow immunochromatographic strips. Nanoscale Research Letters. 12 (1), 291(2017).
  35. You, D. J., Park, T. S., Yoon, J. -Y. Cell-phone-based measurement of TSH using Mie scatter optimized lateral flow assays. Biosensors and Bioelectronics. 40 (1), 180-185 (2013).
  36. Prabowo, M. H., Chatchen, S., Rijiravanich, P. Dengue NS1 detection in pediatric serum using microfluidic paper-based analytical devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412, 2915-2925 (2020).
  37. Prabowo, M. H., et al. Clinical evaluation of a developed paper-based Dengue NS1 rapid diagnostic test for febrile illness patients. International Journal of Infectious Diseases. 107, 271-277 (2021).
  38. Preparation and detection method for the diagnostic device of dengue NS1 detection in serum, cell medium, and buffer. Thai Patent. , 1901000816 (2019).
  39. Kong, T., et al. Accessory-free quantitative smartphone imaging of colorimetric paper-based assays. Lab on a Chip. 19 (11), 1991-1999 (2019).
  40. Jung, Y., Heo, Y., Lee, J. J., Deering, A., Bae, E. Smartphone-based lateral flow imaging system for detection of food-borne bacteria E. coli O157:H7. Journal of Microbiological Methods. 168, 105800(2020).
  41. Chen, G., et al. Improved analytical performance of smartphone-based colorimetric analysis by using a power-free imaging box. Sensors and Actuators B: Chemical. 281, 253-261 (2019).
  42. Kim, H., et al. Smartphone-based low light detection for bioluminescence application. Scientific Reports. 7 (1), 40203(2017).
  43. Kim, H., Awofeso, O., Choi, S., Jung, Y., Bae, E. Colorimetric analysis of saliva-alcohol test strips by smartphone-based instruments using machine-learning algorithms. Applied Optics. 56 (1), 84(2017).
  44. Qin, Q., et al. Algorithms for immunochromatographic assay: review and impact on future application. The Analyst. 144 (19), 5659-5676 (2019).
  45. Yan, W., et al. Machine learning approach to enhance the performance of MNP-labeled lateral flow immunoassay. Nano-Micro Letters. 11 (1), 7(2019).
  46. Srisa-Art, M., Boehle, K. E., Geiss, B. J., Henry, C. S. Highly sensitive detection of Salmonella typhimurium using a colorimetric paper-based analytical device coupled with immunomagnetic separation. Analytical Chemistry. 90 (1), 1035-1043 (2018).
  47. Santiago, G. A., et al. Performance of the Trioplex real-time RT-PCR assay for detection of Zika, dengue, and chikungunya viruses. Nature Communications. 9 (1), 1391(2018).
  48. Lanciotti, R. S., Calisher, C. H., Gubler, D. J., Chang, G. J., Vorndam, A. V. Rapid detection and typing of dengue viruses from clinical samples by using reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology. 30 (3), 545-551 (1992).
  49. Yang, X., et al. Design and development of polysaccharide hemostatic materials and their hemostatic mechanism. Biomaterials Science. 5 (12), 2357-2368 (2017).
  50. Li, H., Han, D., Pauletti, G. M., Steckl, A. J. Blood coagulation screening using a paper-based microfluidic lateral flow device. Lab Chip. 14 (20), 4035-4041 (2014).
  51. Nilghaz, A., Shen, W. Low-cost blood plasma separation method using salt functionalized paper. RSC Advances. 5 (66), 53172-53179 (2015).
  52. Ataullakhanov, F. I., Pohilko, A. V., Sinauridze, E. I., Volkova, R. I. Calcium threshold in human plasma clotting kinetics. Thrombosis Research. 75 (4), 383-394 (1994).
  53. Pamies, R., et al. Aggregation behaviour of gold nanoparticles in saline aqueous media. Journal of Nanoparticle Research. 16 (4), 2376(2014).
  54. Christau, S., Moeller, T., Genzer, J., Koehler, R., Von Klitzing, R. Salt-induced aggregation of negatively charged gold nanoparticles confined in a polymer brush matrix. Macromolecules. 50 (18), 7333-7343 (2017).
  55. Abe, K., Kotera, K., Suzuki, K., Citterio, D. Inkjet-printed paperfluidic immuno-chemical sensing device. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 398 (2), 885-893 (2010).
  56. Sameenoi, Y., Nongkai, P. N., Nouanthavong, S., Henry, C. S., Nacapricha, D. One-step polymer screen-printing for microfluidic paper-based analytical device (µPAD) fabrication. The Analyst. 139 (24), 6580-6588 (2014).
  57. Mora, M. F., et al. Patterning and modeling three-dimensional microfluidic devices fabricated on a single sheet of paper. Analytical Chemistry. 91 (13), 8298-8303 (2019).
  58. Ng, J. S., Hashimoto, M. Fabrication of paper microfluidic devices using a toner laser printer. RSC Advances. 10 (50), 29797-29807 (2020).
  59. Pal, S., et al. Multicountry prospective clinical evaluation of two enzyme-linked immunosorbent assays and two rapid diagnostic tests for diagnosing dengue fever. Journal of Clinical Microbiology. 53 (4), 1092-1102 (2015).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Dengue NS1 TespitiKolorimetrik TespitMikroak kan Ka t CihazAlt n Nanopar ac k KonjugatKan rne i AnaliziYanal Ak AnaliziG r nt Analizi

İlgili makaleler