Taşınabilir Teşhis için CRISPR-Cas Aracılı Multianalit Sentetik İdrar Biyobelirteç Testi

Audrey E. Van Heest; Feiyang Deng; Renee T. Zhao; Nour Saida Harzallah; Heather E. Fleming; Sangeeta N. Bhatia; Liangliang Hao

doi:10.3791/66189

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Taşınabilir Teşhis için CRISPR-Cas Aracılı Multianalit Sentetik İdrar Biyobelirteç Testi

1.9K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66189

⸱

8 Aralık 2023

Audrey E. Van Heest¹ , Feiyang Deng¹ , Renee T. Zhao² , Nour Saida Harzallah²^,³ , Heather E. Fleming³^,⁴ , Sangeeta N. Bhatia²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸ , Liangliang Hao¹^,²^,³

¹Department of Biomedical Engineering, Boston University, ²Institute for Medical Engineering and Science, Massachusetts Institute of Technology, ³Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, ⁴Howard Hughes Medical Institute, ⁵Broad Institute of Massachusetts Institute of Technology and Harvard, ⁶Department of Electrical Engineering and Computer Science, Massachusetts Institute of Technology, ⁷Department of Electrical Engineering and Computer Science, Massachusetts Institute of Technology, ⁸Department of Medicine, Brigham and Women’s Hospital and Harvard Medical School

Bu makalede

Özet

Bu protokol, tümörle ilişkili proteaz aktivitelerinin ex vivo analizi yoluyla bakım noktası kanser teşhisini mümkün kılan bir CRISPR-Cas aracılı, multianalit sentetik idrar biyobelirteç testini açıklar.

Özet

Hassas teşhislerin geliştirilmesi için sentetik biyobelirteçlerin oluşturulması, geleneksel biyoakışkan ölçümleri için kullanılanların ötesindeki yolaklar aracılığıyla hastalığın tespit edilmesini sağlamıştır. Sentetik biyobelirteçler genellikle, hastalık insidansı ve ilerlemesi sırasında yerel hastalık mikroçevresindeki biyokimyasal değişiklikleri yansıtmak için biyosıvıda okunabilir sinyaller sağlayan raporlayıcılardan yararlanır. Raportörlerin farmakokinetik konsantrasyonu ve hastalık sinyalinin biyokimyasal amplifikasyonu, bir tanı testinde yüksek duyarlılık ve özgüllük elde etmek için çok önemlidir. Burada, bir sentetik biyobelirteç formatı kullanılarak bir kanser teşhis platformu oluşturulmuştur: tümör mikroçevresindeki anormal proteolitik imzalarla serbest bırakılabilen, kimyasal olarak stabilize edilmiş DNA raportörleri taşıyan aktivite tabanlı nanosensörler. Bir hastalık raportörü olarak sentetik DNA, barkod olarak kullanılmasıyla çoğullama yeteneği sağlar ve aynı anda birden fazla proteolitik imzanın okunmasına izin verir. İdrara salınan DNA raportörleri, CRISPR RNA'ları ile hibridizasyon yoluyla CRISPR nükleazları kullanılarak tespit edilir ve bu da enzim aktivasyonu üzerine bir floresan veya kolorimetrik sinyal üretir. Bu protokolde, DNA barkodlu, aktivite tabanlı nanosensörler oluşturulur ve bunların uygulamaları, metastatik kolorektal kanserin klinik öncesi fare modelinde örneklendirilir. Bu sistem, hastalık biyolojisine göre oldukça değiştirilebilir ve aynı anda birden fazla hastalık sinyali üretir, bu da yalnızca nanosensör uygulaması, idrar toplama ve hasta başı teşhisi sağlayan bir kağıt testi gerektiren minimal invaziv bir süreçle hastalık özelliklerinin kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını sağlar.

Giriş

Dökülen proteinler ve DNA gibi tümör biyobelirteçlerini tanımlamaya yönelik önemli çabalara rağmen, kanser tanı alanı, dolaşımdaki düşük bollukları veya hızlı bozulmaları nedeniyle zorlanmıştır¹. Tamamlayıcı bir strateji olarak, güçlendirilmiş sinyaller üretmek için hastalık özelliklerine seçici olarak yanıt veren biyomühendislik ürünü sentetik biyobelirteçler, doğru ve erişilebilir teşhise yönelik yeni yolları temsil eder ^2,3. Algılamaya yardımcı olmak için, bu sentetik biyobelirteçler, geliştirilmiş sinyal-gürültü oranına sahip analitler üretmek için enzimatik amplifikasyon gibi tümör....