Method Article

Beyin Organoidlerinde Tek Hücreli ve Tek Çekirdekli Transkriptomların Oluşumu ve Aşağı Akış Analizi

DOI:

10.3791/66225

⸱

March 29th, 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Berlin Institute for Medical Systems Biology (BIMSB), Max Delbrück Center for Molecular Medicine (MDC), 2Institut für Biologie, Humboldt-Universität zu Berlin, 3Organoid platform, Berlin Institute for Medical Systems Biology (BIMSB), Max Delbrück Center for Molecular Medicine (MDC)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, tek hücreli ve tek çekirdekli RNA dizilimi kullanarak insan beyni organoidlerinin üretilmesi ve aşağı akış analizi için kapsamlı bir protokol sunuyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son on yılda, tek hücreli transkriptomik, tek tek hücrelerin gen ekspresyon profillerinin eşzamanlı analizi için önemli ölçüde gelişti ve hücresel çeşitliliğin yakalanmasına izin vererek standart bir laboratuvar yöntemi haline geldi. İzole edilmesi zor hücre tiplerinin getirdiği sınırlamaların üstesinden gelmek için, dizileme için sağlam hücreler yerine tek çekirdekleri geri kazanmayı amaçlayan alternatif bir yaklaşım kullanılabilir ve bu da tek tek hücrelerin transkriptom profillemesini evrensel olarak uygulanabilir hale getirir. Bu teknikler, beyin organoidlerinin incelenmesinde bir mihenk taşı haline geldi ve onları gelişmekte olan insan beyninin modelleri haline getirdi. Beyin organoid araştırmalarında tek hücreli ve tek çekirdekli transkriptomiklerin potansiyelinden yararlanan bu protokol, organoid ayrışma, tek hücreli veya çekirdek izolasyonu, kütüphane hazırlama ve dizileme gibi temel prosedürleri kapsayan adım adım bir kılavuz sunar. Araştırmacılar, bu alternatif yaklaşımları uygulayarak, nöronal ve nöronal olmayan hücre tiplerinin, gen ekspresyon profillerinin ve hücre soy yörüngelerinin tanımlanmasını sağlayan yüksek kaliteli veri kümeleri elde edebilirler. Bu, beyin gelişimini şekillendiren hücresel süreçler ve moleküler mekanizmalar hakkında kapsamlı araştırmaları kolaylaştırır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son yıllarda, organoid teknolojileri, organ benzeri dokuları kültürlemek için umut verici bir araç olarak ortaya çıkmıştır 1,2,3. Özellikle insan beyni gibi kolayca erişilemeyen organlar için organoidler, gelişim ve hastalık tezahürü hakkında bilgi edinme fırsatı sunar4. Bu nedenle, beyin organoidleri, gelişimsel, psikiyatrik ve hatta nörodejeneratif hastalıklar dahil olmak üzere çeşitli insan beyni bozukluklarını araştırmak için deneysel bir model olarak yaygın olarak kullanılmaktadır 4,5,6.

Tek hücreli transkriptom profilleme teknolojilerinin ortaya çıkmasıyla, birincil insan dokuları ve karmaşık in vitro modeller, sağlık ve hastalıktaki hücre alt popülasyonları düzeyinde gen ekspresyonu değişikliklerine ilişkin mekanik içgörüler sağlayarak ve yeni varsayılan terapötik hedefler hakkında bilgi vererek, benzeri görülmemiş bir ayrıntı düzeyi ile incelenebilir 7,8,9. Organoid alan, hücresel bileşimi, tekrarlanabilirliği ve beyin organoid teknolojilerinin doğruluğunu değerlendirmek için tek hücreli transkriptom profillemesi kullanılarak ilerlemiştir 10,11,12. Tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-dizilimi), hastalıklı organoidlerde hücre sınıflandırmasını ve genetik düzensizliğin tanımlanmasını sağladı13,14. Daha da önemlisi, tek tek hücrelerin profillenmesini sağlayan tekniklerin uygulanmasını gerektiren organoid dokuların karmaşıklığıdır. Toplu transkriptom profillemesi (toplu RNA dizilimi) gibi yöntemler kullanılarak organoidlerin karakterizasyonu, karmaşık doku içindeki tüm hücre tiplerinde ortalaması alınan maskelenmiş hücresel heterojenliğe ve gen ekspresyon profillerine yol açar ve sonuçta sağlık ve hastalıkta organoid gelişimi sırasında devam eden süreçlere ilişkin anlayışımızı sınırlar 15,16,17. ScRNA-seq yöntemleri ilerlemeye devam ettikçe, Allen Beyin Atlası veya Uzquiano ve arkadaşlarının insan beyni organoidlerinin Tek hücreli atlası gibi kaynaklarla örneklenen artan sayıda atlas oluşturulmaktadır.18.

Beyin organoidlerinden başarılı bir scRNA dizilimi gerçekleştirmek, sağlam hücrelerin etkili bir şekilde izole edilmesine ve yakalanmasına dayanır. Tek tek hücreler elde etmek için beyin organoidlerinin ayrışması enzimatik sindirime dayandığından, stres ve hücre hasarına neden olarak gen ekspresyon modellerini etkileyebilir19,20. Bu nedenle, dokunun tek tek hücrelere ayrışması en önemli adımdır. Alternatif bir yaklaşım, çekirdeklerin hem taze hem de donmuş dokudan enzim içermeyen ekstraksiyonunu kolaylaştıran tek çekirdekli RNA dizilemesidir (snRNA-dizilimi)21,22. Bununla birlikte, çekirdeklerin bir dokudan izole edilmesi, ilgilenilen hücre tiplerinin zenginleştirilmesi ve hücrelere kıyasla çekirdeklerin düşük RNA içeriği gibi başka zorluklar da ortaya çıkarmaktadır.

Beyin organoidlerinin transkriptom çalışmaları genellikle scRNA-seq 10,18,23 kullanılarak yürütülür. Bununla birlikte, tek çekirdeklerin izolasyonu, organoidlerin transkriptomik profilini araştırmak için ortogonal ve tamamlayıcı bir yöntem sağlayabilir. Burada, beyin organoidleri için scRNA ve snRNA-seq için bir araç kutusu tanıtıyoruz ve en iyi kalitede dizileme verilerini elde etmek için kritik noktaları tartışıyoruz.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Açıklanan protokol, Max Delbrück Moleküler Tıp Merkezi'nin (onay numarası: 138/08) biyogüvenlik seviye 1 laboratuvarında, gerekliliklere uygun olarak ve araştırma etiğine ilişkin AB ve ulusal kurallara uygun olarak gerçekleştirilir.

1. Ön beyin organoidlerinin indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) türetilmesi

NOT: Bu protokol, farklı şirketlerden çeşitli kök hücre ortamlarında kültürlenen birkaç farklı iPSC hattı için test edilmiştir (Tablo 1). Ön beyin organoidlerinin üretimi, yüksek kaliteli iPSC'lere ve protokole başlamadan önce %60-70'lik bir birleşmeye büyük ölçüde bağlıdır. Burada ticari olarak temin edilebilen bir hücre hattı kullandık (Malzeme Tablosuna bakınız).

  1. 0. Gün: Embriyoid vücut oluşumu
    1. 96 oyuklu plakanın pluronik çözelti ile işlenmesi için, 96 oyuklu bir U-alt plakanın oyuğu başına 80 μL steril filtreli% 2 pluronik çözelti ekleyin. Oda sıcaklığında (RT) veya 37 °C'de en az 15 dakika inkübe edin.
      NOT: Pluronic ile muamele edilmiş plakalar 4 °C'de 2 haftaya kadar saklanabilir ve embriyoid cisim oluşumu için herhangi bir yıkama adımı olmadan doğrudan kullanılabilir.
    2. Hücreleri tohumlamadan önce bir aspiratör veya çok kanallı bir pipet kullanarak her kuyucuktan pluronik çözeltiyi çıkarın.
    3. Başlamadan önce, 96 oyuklu bir plaka için aşağıdaki reaktifleri hazırlayın: 5 mL önceden ısıtılmış DMEM içeren 15 mL santrifüj tüpü: F12 ortamı; 50 μM Y-27632 ile desteklenmiş 11 mL kök hücre ortamı, pluronik muamele edilmiş plaka (yukarıda tarif edildiği gibi).
    4. % 60-70 birleşik iPSC'lerden oluşan 6 oyuklu bir plakanın bir kuyusundan ortamı aspire edin. Hücreleri PBS ile bir kez yıkayın. 500 μL tripsin bazlı reaktif ekleyin ve 37 °C'de 2-6 dakika inkübe edin.
      NOT: Tripsin bazlı reaktif ile hücrelerin uygun şekilde ayrılması için inkübasyon süresi, hücre yoğunluğuna ve her bir iPSC hattının hücre matrisi yapışkan özelliklerine bağlıdır. Aşırı sindirimi önlemek için, parlak alan mikroskobu kullanarak tripsin bazlı reaktif ile 2 dakikalık inkübasyondan sonra hücre morfolojisinin incelenmesi tavsiye edilir.
    5. 1000 μL'lik bir pipet kullanarak hücreleri ayırın ve ayrışmayı durdurmak için önceden hazırlanmış 15 mL'lik santrifüj tüpüne DMEM: F12 ortamı ile aktarın.
    6. 300 x g'da 3 dakika santrifüj hücresi süspansiyonu. Süpernatanı aspire edin ve hücre peletini saklayın. Hücreleri, 50 μM Y-27632 ile takviye edilmiş 1 mL kök hücre ortamında yeniden süspanse edin.
    7. Bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın ve 50 μM Y-27632 ile takviye edilmiş kök hücre ortamına istediğiniz sayıda hücre ekleyin. Tek bir embriyoid cisminin oluşturulması, hücre hattına bağlı olarak 3.000-12.000 hücre gerektirir.
    8. Hücre süspansiyonunu 10 mL'lik bir pipet kullanarak çok kanallı bir reaktif rezervuarına aktarın. Çok kanallı bir pipet kullanarak, hücre süspansiyonunun 100 μL/oyusunu daha önce pluronik muamele edilmiş 96 oyuklu plakaya yerleştirin.
    9. 96 oyuklu plakayı 37 °C, %5O2 ve %5 CO2'de bir inkübatöre yerleştirin. Embriyoid vücut oluşumu sırasında herhangi bir rahatsızlıktan kaçınmak için plakayı hareket ettirmekten kaçının.
  2. 2. Gün: Embriyoid vücut oluşumu muayenesi
    1. Parlak alan mikroskobunun 10x objektifini kullanarak embriyoid vücut oluşumunu inceleyin. Embriyoid cisimler net kenarlar ve minimum hücre ölümü göstermelidir.
    2. Mümkün olduğu kadar çok besiyerini aspire edin ve 100 μL/kuyu kök hücre besiyeri ile değiştirin. (Kritik) Embriyoid cisimler, orta değişim sırasında kuyudan kolayca çıkarılır. Bunları çıkarmamaya dikkat edin, bu nedenle aspirasyondan sonra ortamı izleyin.
  3. 3. Gün: Nöroektoderm indüksiyonu
    1. Mümkün olduğu kadar çok ortamı aspire edin ve 120 μL/kuyu indüksiyon ortamı ile değiştirin ve plakayı 37 °C, %20O2 ve %5CO2'ye yerleştirin.
  4. 6. Gün: Yerleştirme
    1. iPSC hattına bağlı olarak, nöroektoderm çıkışını indüklemek için 3 veya 4 gün gereklidir. Embriyoid cisimciklerini düzenli olarak izleyin. Kenarlar parlaklaştığında, embriyoid cisimler gömülmeye hazırdır. Aşağıda24 açıklandığı gibi embriyoid cisim gömme için kullanılabilecek iki farklı yöntemden birini kullanın.
    2. Gömme yöntemi 1: Çerez yerleştirme
      1. Seyreltilmemiş hücre dışı matris jelinin bir kısmını 1-2 saat buz üzerinde çözdürün. (Kritik) Katılaşmasını önlemek için hücre dışı matris jelini her zaman buz üzerinde tutun. Çözülme süresini ve tekrarlanan çözülme döngülerini en aza indirmek için alikotları önceden hazırlayın.
      2. Pençe pense kullanarak 200 μL'lik bir pipetin ucunu kesin ve 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 16-32 embriyoid cismi toplayın.
      3. Embriyoid cisimciklerini 67 μL ortamdaki yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 200 μL'lik bir pipet ucu kullanarak 100 μL hücre dışı matris jeli ekleyin ve hafifçe karıştırın.
      4. Embriyoid cisimciklerini 6 cm'lik bir tabağa eşit olarak dağıtın ve hücre dışı matris jelinin katılaşmasına izin vermek için plakayı 5-10 dakika yerleştirin.
      5. Yaklaşık 4 mL farklılaşma ortamı ekleyin ve 37 °C, %20O2 ve %5CO2'de inkübe edin. Ertesi gün, çanağı bir orbital çalkalayıcıya (84 rpm) yerleştirin. Tüm embriyoid cisimciklerinin alttan ayrıldığından emin olun. Değilse, nazikçe ayırmak için kesilmiş bir pipet ucu ve ortam kullanın.
    3. Gömme yöntemi 2: Sıvı gömme
      1. Seyreltilmemiş hücre dışı matris jelinin bir kısmını 1-2 saat buz üzerinde çözdürün ve farklılaşma ortamını buzun üzerine yerleştirin. (Kritik) Hücre dışı matris jeli eklerken ortam buz gibi soğuk olmalıdır.
      2. Ortam soğuduktan sonra,% 2'lik nihai konsantrasyona kadar hücre dışı matris jeli ekleyin. Pençe pense kullanarak 200 μL'lik bir pipetin ucunu kesin ve 24 adede kadar embriyoid cismi 6 oyuklu bir plakanın bir kuyucuğuna aktarın.
      3. Tüm fazla ortamı çıkarın ve 6 oyuklu bir plakanın bir oyuğuna yaklaşık 4 mL% 2 hücre dışı matris jel / farklılaşma ortamı ekleyin. Plakayı hemen orbital çalkalayıcıya (84 rpm) yerleştirin.
  5. 9-20. Gün: Her 3-4 günde bir farklılaştırma medyası kullanarak tam bir medya alışverişi gerçekleştirin.
  6. 21-30. Gün: Organoidleri olgunlaşma ortamına aktarın ve her 3-4 günde bir tam ortam değişimi gerçekleştirin.
  7. Organoidlerin ayrışması: Tek çekirdekler ve hücre ayrışması için yüksek kaliteli organoidler kullanın. Aşırı miktarda hücre ölümünü önlemek için, nekrotik bir çekirdeğin birikmesini önlemek için organoidleri düzenli olarak kesin ve daha fazla analiz için ayırmadan önce 2 hafta boyunca iyileşmelerine izin verin.

2. Organoidlerden tek hücrenin türetilmesi

NOT: Tek hücre ayrışması, mekanik ve enzimatik ayrışma kullanan Nöral Doku Ayrışma Kiti (Tablo 2) kullanılarak gerçekleştirilir. Burada manuel bir mekanik ayrışmayı tarif ediyoruz. Alternatif olarak, bir ayrıştırma makinesi kullanılabilir.

  1. Buz üzerinde STOP çözeltisi ve% 0.04 BSA hazırlayın. PBS'de enzim karışımı 1 ve 2 ve% 0.04 BSA'yı hazırlayın ve buzun üzerine yerleştirin.
  2. 6 oyuklu bir plakanın bir oyuğunda 5'e kadar organoid toplayın ve fazla ortamı aspire edin ve kültür ortamını çıkarmak için PBS ile bir kez yıkayın. Organoidleri kuyunun ortasına yerleştirin ve bir neşter kullanarak organoidleri iyice kıyın.
  3. Enzim karışımı 1'i ekleyin ve 37 °C, %20O2 ve %5CO2'ye yerleştirin, 90 rpm'de 10-15 dakika çalkalayın.
  4. 1000 μL'lik bir pipet ucu kullanarak, 10x'e kadar pipetleyerek organoidleri yeniden süspanse edin. Enzim karışımı 2'yi ekleyin ve 1000 μL'lik bir pipet ucu kullanarak pipetleyerek iyice karıştırın. 37 °C, %20O2 ve %5 CO2'ye yerleştirin, 90 rpm'de 10-15 dakika çalkalayın.
  5. Hücre çözeltisini 10 mL soğuk STOP çözeltisi içinde yeniden süspanse ederek ayrışma sürecini durdurun. 70 μM hücre süzgeci kullanarak hücre çözeltisini filtreleyin. Bir pelet oluşturmak için filtrelenmiş hücre çözeltisini 4 ° C'de 300 x g'de 10 dakika santrifüjleyin.
  6. Bir hücre peleti bırakarak aspire edin ve hücreleri 4 mL soğuk% 0.04 BSA'da yeniden süspanse edin. 40 μM'lik bir hücre süzgeci kullanarak hücre çözeltisini filtreleyin ve bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın.
  7. Hücre çözeltisini 4 ° C'de 300 x g'de 10 dakika santrifüjleyin. BSA çözeltisini aspire edin, bir hücre peleti bırakın. NSB+ ortamında mikroakışkan tabanlı snRNA-seq kit kılavuzuna göre hücreleri yeniden askıya alın.

3. Tek çekirdeklerin organoidlerden izolasyonu

  1. Organoidleri soğutulmuş PBS'ye aktarın ve her organoidi 4 parçaya bölün. Organoidleri soğutulmuş PBS ile 2 kez yıkayın.
  2. 1000 μL'lik bir pipetin pipet ucunu makasla kesin ve organoid parçaları 2 mL'lik bir pipete aktarın. PBS'yi tamamen aspire edin ve 1 mL NP40 lizis tamponu ekleyin.
  3. Dounce havaneli A ile 3x ve dounce havaneli B ile 3x dounce yapın. Süspansiyonu 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Douncer'ı ilave 1 mL NP40 lizis tamponu ile yıkayın ve 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. RT'de 5 dakika inkübe edin ve ardından süspansiyonu 5 x g'da 500 dakika santrifüjleyin.
  4. Süpernatanı aspire edin, geride 50 μL süpernatan bırakın. Peleti bozmadan 1 mL NSB+ ekleyin. 5 dakikalık inkübasyondan sonra tekrar askıya alın.
  5. Bir Percoll gradyanının üstünde katman süspansiyonu (alt katman: 1 mL NSB + ve 250 μL Percoll, orta katman: 1 mL NSB+ ve 188 μL Percoll, üst katman: 1 mL NSB+ ve 125 μL Percoll). (Kritik) Katman karışımını önlemek için katmanlamayı çok dikkatli bir şekilde gerçekleştirin.
  6. 4 ° C'de 500 x g'de 5 dakika santrifüjleyin, süpernatanı aspire edin ve NSB + 'da yeniden süspanse edin. 40 μM hücre süzgeci kullanarak çekirdek çözeltisini filtreleyin.
  7. DAPI ve Neubauer Odası kullanarak çekirdekleri boyayın ve sayın. Mikroakışkan tabanlı bir scRNA-seq kit kılavuzuna göre çekirdekleri yeniden askıya alın.

4. Kütüphane hazırlama ve sıralama

  1. 10.000 hücre ve çekirdeği bir mikroakışkan sisteme yükleyin ve kütüphaneyi mikroakışkan tabanlı scRNA-seq kitinin (Malzeme Tablosu) kılavuzuna göre oluşturun.
  2. Kitaplıkları, snRNA-seq kitaplığı başına tahmini 6 x 108 okuma ve scRNA-seq kitaplığı başına 1,6 x 108 okuma ile sıralayın, bu da snRNA-seq veri seti için %87'lik bir sıralama doygunluğu ve scRNA-seq veri seti için %36'lık bir sıralama doygunluğu ile sonuçlanır.

5. Analiz

  1. scRNA-seq ve snRNA-seq için bir veri analizi boru hattı kullanarak dizileme analizi yapın ve insan GRCh38 genomuna göre hizalayın. Bu boru hattı tarafından oluşturulan sayım matrisini, R-paketi Seurat (Sürüm 4.1.1)25 kullanılarak daha fazla analize tabi tutun.
  2. En az 5 hücrede temsil edilen genleri göz önünde bulundurarak ve en az 300 gen içeren hücreleri birleştirerek Seurat nesnesini oluşturun. scRNA-seq veri seti için 1000'den fazla gen içeren ancak 4000'den az gen içeren hücreleri ve snRNA-seq veri seti için çekirdek başına 800'den fazla, ancak 4000'den az gen içeren hücreleri koruyarak ek kalite kontrol filtrelemesi gerçekleştirin. %5 mitokondriyal okumayı aşan veri kümelerini, hücreleri ve çekirdekleri hariç tutun.
  3. Her iki yöntem arasındaki toplu iş etkilerini azaltmak için, filtrelenmiş her iki veri kümesini entegre edin, Tekdüzen Manifold Yaklaşımı ve Projeksiyonu (UMAP) aracılığıyla normalleştirin ve görselleştirin. Düşük benzersiz moleküler tanımlayıcı (UMI) ve gen sayımlarını gösteren küme 1'i atlayın. Daha sonra, kümeler için bilinen işaretleyici genlere ve Ana Uzquiano et'ten 30 günlük organoid veri setine dayalı hücre kimlikleri atayın. al. (Ek Kodlama Dosyası 1)18.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

scRNA-seq ve snRNA-seq kullanılarak beyin organoidlerinin hücre tipi bileşimini araştırmak için, beyin organoidleri 30 günlük kültürden sonra toplandı, çünkü bu aşamadaki organoidler zaten ara progenitörler ve erken evre nöronlarla çevrili progenitörlerden oluşan nöroepitel döngüleri sergilemektedir 4,18. Büyüme ve kültürleme boyunca organoidlerin kalitesinin izlenmesi, güvenilir tek hücreli ve tek çekirdekli veriler elde etmek için çok önemlidir.

Organoidler, iPSC'lerin embriyoid cisimlere toplanmasıyla oluşur (Şekil 1B,C). Montaj üzerine, bu embriyoid cisimlerinin minimum hücresel kalıntı ile net kenarlar sergilemesi beklenir (Şekil 1C). Nöroektodermin indüksiyonunu takiben, embriyoid cisimler, başarılı bir nöral indüksiyonu gösteren, nispeten daha koyu bir iç bölge ile yüzey çevresinde gözlemlenebilir bir parlaklık gösterir (Şekil 1D). İlerleyen haftalarda, organoidler, esas olarak nöroepitel hücrelerinden oluşan, nöronal rozet benzeri yapılar olan döngüler geliştirir (Şekil 1E, F). Bu organoidler birkaç ay boyunca kültürde muhafaza edilebilse de, artan boyutlarıyla, besin eksikliği ve oksijen mevcudiyeti nedeniyle organoidlerin iç kısmında buna karşılık gelen bir hücre ölümü artışı olduğu ve sonunda nekrotik bir çekirdeğin gelişmesine neden olduğu belirtilmelidir.

Dizileme analizi yoluyla kortikal organoidler içindeki hücresel çeşitliliği keşfetmek için, organoidlerden hem tek hücreleri hem de çekirdekleri izole ettik. Tek bir beyin organoidi partisi içindeki doğal heterojenliği dengelemek için, bir partiden dört havuzlanmış organoidin dizilimini gerçekleştirdik. Ek olarak, izolasyon süreçleri arasında karşılaştırmalı amaçlar için ve snRNA-seq ile scRNA-seq kütüphanesi arasındaki toplu etkileri ortadan kaldırmak için, bu organoidler yarıya bölündü (toplamda sekiz yarım; Şekil 2

Embriyoid vücut oluşumundan olgunlaşma zaman çizelgesine; mikroskopi görüntüleri; Hücre farklılaşma aşamaları.

Tek hücreli ve çekirdekli RNA dizileme diyagramı; enzimatik ayrışma, Percoll gradyan yöntemi.

Çeşitli hücre yoğunluklarını ve boyama modellerini gösteren hücre mikroskobu görüntüleri; Yöntem boyamayı içerir.

Kimliğe göre veri değişkenliğini gösteren keman grafikleri; istatistiksel analiz sonuçları.

scRNAseq ve snRNAseq kümelerini gösteren UMAP diyagramı, nöronal hücrelerde gen ekspresyon analizi.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek hücrelerin ve tek çekirdeklerin transkriptomik analizi, karmaşık dokulardaki gen düzenleyici mekanizmaları anlamak için çok önemli bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Her iki yöntem de beyin organoidlerinin transkriptom çalışmalarını mümkün kılar. Genel olarak başarılı bir deney sağlamak için, başlangıç malzemesinin kalitesi yüksek öneme sahiptir. Bu nedenle, nekrotik bir çekirdek oluşumunu önlemek için organoidleri düzenli olarak kesmek gerekir26. Bu sorunu bir Hava-Sıvı Arayüz kültürü27 ile ortadan kaldırmak da mümkündür. Organoid heterojenliğinden kaynaklanan toplu etkileri azaltmak için, ekstraksiyon başına en az dört organoid kullanmanızı öneririz. Alternatif olarak, tek tek organoidlerin çoklu dizileme işlemlerini gerçekleştirmek mümkündür, bu da ayrıca aynı parti17 içindeki değişkenliğin incelenmesine izin verir. Her iki yöntemi de kullanırken, scRNA-seq ve snRNA-seq, paralel olarak, organoidleri ikiye kesmek ve her yöntem için bölmek, organoid heterojenliğin neden olduğu farklılıkları daha da azaltabilir.

Tek bir hücrenin veya çekirdeğin kaliteli bir transkriptomik profilini elde etmek için, hücresel veya nükleer zarın tüm prosedür boyunca sağlam kalması çok önemlidir. Bu nedenle, organoidin yaşına ve boyutuna göre ayarlanması gereken enzimatik sindirimin hem enzim konsantrasyonunu hem de zamanlamasını optimize etmek çok önemlidir. Ek olarak, doğru sıcaklıkları ve santrifüjleme hızını kullanmak ve sert pipetlemeden kaçınmak çok önemlidir. Canlılığın düşük olması durumunda, organoidlerin tek hücrelere ayrışmasından sonra bir ölü hücre uzaklaştırma kiti kullanılabilir. Tamamlayıcı, çekirdeklerin izolasyonu için organoidi PBS ile dikkatlice yıkamak ve douncer ile vuruş sayısını organoid boyutuna uyarlamak hayati önem taşır. Katmanlamadaki bozuklukları önlemek için Percoll gradyanını dikkatli bir şekilde katmanlamak da önemlidir. İzolasyondan sonra hasarlı çekirdekler kalırsa, Floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması22 yoluyla bir sıralama adımının uygulanması tavsiye edilir. Genel olarak, RNAse inhibitörlerinin kullanımı, her hücrenin veya çekirdeğin yüksek kaliteli RNA'sını korumak için numune ayrışmasından kütüphane oluşturmaya kadar tüm adımlar için hayati önem taşır.

Bu çalışmada, scRNA-seq daha fazla hücre verdi ve hücre popülasyonlarına daha geniş bir genel bakış sağladı. Ek olarak, hücreler daha fazla RNA içerir ve çekirdeklere kıyasla yüzey belirteçleri aracılığıyla belirli hücre tipleri için zenginleştirilmesi daha kolaydır. Bununla birlikte, tek hücreli ayrışma, stresle ilişkili RNA'larıntranskripsiyonunu indükleyebilen enzimatik bir sürece dayanır 19,28. Özellikle artmış stres tepkisi ile ilişkili hastalıklarda, bu dissosiyasyona bağlı artefaktlara neden olabilir20. Ayrıca, tek hücre izolasyonunun hassas hücre popülasyonlarının kaybına yol açtığı gösterilmiştir 3,29. Bu, bu çalışmada belirgin olmasa da, daha yüksek bir hücresel çeşitlilik ile karakterize edilen eski beyin organoidleri kullanıldığında olası bir sonuçtur.

Her iki veri seti de aynı hücre popülasyonlarını aldığından, izolasyon yönteminin seçimi büyük ölçüde araştırma sorularına, doku edinimine ve zaman yönetimine bağlıdır. Ayrışmadan sonra, metanol içinde beyin organoidlerinden tek hücrelerin fiksasyonu ve depolanması iyi kurulmuş olsa da30, donmuş beyin organoidlerinden tek çekirdeklerin izolasyonu hala optimizasyon gerektirir.

Genel olarak, protokollerimiz, beyin organoidlerindeki tek tek hücrelerin ve çekirdeklerin transkriptomik profilini araştırmak için çok yönlü ve uyarlanabilir bir platform sağlayarak, in vitro insan beyni modellerinde gelişimsel ve hastalıkla ilgili soruların derinlemesine araştırılmasının yolunu açar.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar rekabet eden hiçbir mali çıkar beyan etmemektedir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Miltenyi Nöral Ayrışma kitinin orijinal talimatları için Valeria Fernandez-Vallone'ye teşekkür ederiz. Ayrıca, Max Delbrueck Centrum'un Genomik Teknoloji Platformuna, NP40 lizis tamponunun tarifini ve bu protokolü kurarken değerli tavsiyeleri sağladığı için teşekkür ederiz. Ayrıca Margareta Herzog ve Alexandra Tschernycheff'e laboratuvar organizasyonel desteği için teşekkür ederiz.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-DITHIO-DL-THREIT-LSG., F. D. MOL.-BIOL., ~1 M IN H2O (DTT)Sigma  43816-10ML
1.5 ml DNA düşük bağlayıcı tüplerVWR525-0130mikrosantrifüj tüpü
10x Cellranger boru hattı analiz pipline
15 ml FalconFalconSantrifüj tüpü
2-Merkaptoetanol (BME)Life Technologies21985023
50 ml FalconFalconSantrifüj tüpü
A83-01Bio Technologies379762
Antibiyotik/Antimikotik Çözelti (100X)Life Technologies15240062
B-27 Plus TakviyesiYaşam Teknolojileri17504044
A vitamini içermeyen B-27 TakviyesiYaşam Teknolojileri12587010
Sığır serum albümini, yağ asidi içermez (BSA)Sigma AldrichA8806-5G 
cAMPBiyogemleri6099240
cAMPBiyogemleri6099240
C-CHIP NEUBAUER GELİŞTİRİLMİŞVWRDHC-N01
Hücre süzgeci 40 & mNeolab352340
Hücre süzgeci 70 & m (beyaz) NaylonSigmaCLS431751-50EA
Krom Kontrol Cihazı & Sonraki GEM Aksesuar Kiti10X Genomik1000204
Krom Sonraki GEM Çip G Tek Hücre Kiti, 16 rxns10X Genomik1000127
Krom Sonraki GEM Tek Hücre 3' Kiti v3.110X Genomik1000268
Tamamlandı,  EDTA İçermeyen Proteaz İnhibitörü CocktaillRoche11873580001
DAPIMERCK Kimyasalları0000001722
DMEM/F12Yaşam Teknolojileri11320074
Dounce doku öğütücü seti 2 mL tamSigma Aldrich10536355
Esansiyel E8 Flex OrtaÖmür TeknolojileriA2858501
EVE Hücre Sayımı SlaytlarVWREVS-050 ( 734-2676)
Fetal sığır serumu tetrasiklin içermez (FBS)PAN BiotechP30-3602
Geltrex LDEV-Free (kaplama)Life TechnologiesA1413302 
gentleMACSMiltenyi Biotecayrışma makinesi
GlutaMAX takviyeleriYaşam Teknolojileri35050038
Heparin sodyum hücre kültürü test edildiSigmaH3149-10KU
insan rekombinant BDNFKök Hücre Teknolojileri78005.3
insan rekombinant GDNFKök Hücre Teknolojileri78058.3
İnsülin Çözeltisi İnsanSigma AldrichI2643-25MG
Nakavt serum replasmanıYaşam Teknolojileri10828028
LDN193189 Hidroklorür %98Sigma Aldrich130-106-540
MEM esansiyel olmayan amino asit (100x)Sigma AldrichM7145-100ml
MgCl2 Magnezyum Klorür (1M) RNAse içermeyenTermo ScientificAM9530G
mTeSR PlusKök Hücre Teknolojileri100-0276kök hücre ortamı
mTeSR1Kök Hücre Teknolojileri85850kök hücre ortamı
N2 Takviyesi Kök Hücre Teknolojileri17502048
Nöral Doku Ayrışma KitiMiltenyi Biotec BV & Co. KG130-092-628
Nörobazal PlusYaşam TeknolojileriA3582901
NextSeq500 sistemiIlluminaSequencer
NP-40 Yüzey Aktif-Amper Deterjan Çözeltisi YaşamTeknolojileri28324
PBS Dulbecco' sInvitrogen14190169
PenStrep (Penisilin - Streptomisin)Life Technologies15140122
PercollTh. Geyer10668276
Pluronic (R) F-127Sigma AldrichP2443-1KG
RiboLock RNase İnhibitörüLife Technologies EO0382
Kaya İnhibitörü (Y-27632 dihidroklorür) SBBiomolCay10005583-10
SB 431542 Sodyum
StemFlex MediumThermo ScientificA3349401kök hücre ortamı
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyi Biotec130-104-368kök hücre ortamı
TC-Platte 96 Kuyu, yuvarlak tabanlıSarstedt83.3925.500
TISSUi006-ATissUse GmbHhttps://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A
Tripan MavisiT8154-20mlSigma
TrypLE Express Enzim, fenol içermezKırmızı Yaşam Teknolojileri12604013Tripsin bazlı reaktif
UltraPure 1M Tris-HCl Tampon, pH 7.5Yaşam Teknolojileri15567027
XAV939Enzo Yaşam bilimleriBML-WN100-0005
klorür NaCl (5M), RNaz içermeyen-100 mL Invitrogen 3014193 AM9760G Serisi

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Finkbeiner, S. R., et al. Stem cell-derived human intestinal organoids as an infection model for Rotaviruses. mBio. 3 (4), e00159-e00212 (2012).
  2. Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nat Commun. 6, 8715(2015).
  3. Guan, Y., et al. Human hepatic organoids for the analysis of human genetic diseases. JCI Insight. 2 (17), e94954(2017).
  4. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  5. Dang, J., et al. Zika virus depletes neural progenitors in human cerebral organoids through activation of the innate immune receptor TLR3. Cell Stem Cell. 19 (2), 258-265 (2016).
  6. Inak, G., et al. Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome. Nat Commun. 12 (1), 1929(2021).
  7. Karlsson, M., et al. A single-cell type transcriptomics map of human tissues. Sci Adv. 7 (31), eabh2169(2021).
  8. Piwecka, M., Rajewsky, N., Rybak-Wolf, A. Single-cell and spatial transcriptomics: deciphering brain complexity in health and disease. Nat Rev Neurol. 19 (6), 346-362 (2023).
  9. Lim, B., Lin, Y., Navin, N. Advancing cancer research and medicine with single-cell genomics. Cancer Cell. 37 (4), 456-470 (2020).
  10. Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).
  11. Fiorenzano, A., et al. Single-cell transcriptomics captures features of human midbrain development and dopamine neuron diversity in brain organoids. Nat Commun. 13 (1), 3312(2022).
  12. Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
  13. Notaras, M., et al. Schizophrenia is defined by cell-specific neuropathology and multiple neurodevelopmental mechanisms in patient-derived cerebral organoids. Mol Psychiatry. 27 (3), 1416-1434 (2022).
  14. Rybak-Wolf, A., et al. Modelling viral encephalitis caused by herpes simplex virus 1 infection in cerebral organoids. Nat Microbiol. 8 (7), 1252-1266 (2023).
  15. Bock, C., et al. The organoid cell atlas. Nat Biotechnol. 39 (1), 13-17 (2021).
  16. Brazovskaja, A., Treutlein, B., Camp, J. G. High-throughput single-cell transcriptomics on organoids. Cur Opinion Biotechnol. 55, 167-171 (2019).
  17. Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570, 523-527 (2019).
  18. Uzquiano, A., et al. Proper acquisition of cell class identity in organoids allows definition of fate specification programs of the human cerebral cortex. Cell. 185 (20), 3770-3788.e27 (2022).
  19. Mattei, D., et al. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. Int J Mol Sci. 21 (21), 7944(2020).
  20. Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nat Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  21. Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nat Med. 26 (5), 792-802 (2020).
  22. Santos, M. D., et al. Extraction and sequencing of single nuclei from murine skeletal muscles. STAR Protoc. 2 (3), 100694(2021).
  23. Fleck, J. S., et al. Inferring and perturbing cell fate regulomes in human cerebral organoids. Nature. 621 (7978), 365-372 (2021).
  24. Martins-Costa, C., et al. Morphogenesis and development of human telencephalic organoids in the absence and presence of exogenous extracellular matrix. EMBO J. 42 (22), e113213(2023).
  25. Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587.e29 (2021).
  26. Choe, M. S., et al. A simple method to improve the quality and yield of human pluripotent stem cell-derived cerebral organoids. Heliyon. 7 (6), e07350(2021).
  27. Giandomenico, S. L., et al. Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output. Nat Neurosci. 22 (4), 669-679 (2019).
  28. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130(2020).
  29. Wen, F., Tang, X., Xu, L., Qu, H. Comparison of single-nucleus and single-cell transcriptomes in hepatocellular carcinoma tissue. Mol Med Rep. 26 (5), 339(2022).
  30. Alles, J., et al. Cell fixation and preservation for droplet-based single-cell transcriptomics. BMC Biol. 15 (1), 44(2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Cell TranscriptomicsSingle Nuclei TranscriptomicsBrain OrganoidsOrganoid DissociationNuclei IsolationLibrary PreparationRNA SequencingSpatial TranscriptomicsCell Type RecoveryGene Expression Profiles

Related Articles