Yöntem makalesi

Nörofibromatozis Tip 1'de Maternal Diyetin Beslenme ve Nörogelişim Üzerindeki Etkilerini Değerlendirmek için Fetal Murin Beyin ve Serumunun Eş Zamanlı Toplanması

1.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66226

⸱

17 Mayıs 2024

 ,  , 
1Department of Pediatrics, Washington University in St. Louis

Bu makalede

Özet

Bu protokolde, aynı fare embriyosundan fetal beyin dokusunun yanı sıra yüksek kaliteli, hemolize edilmemiş serumun aynı anda toplanması için bir yöntem tarif ediyoruz. Bu tekniği, maternal diyet maruziyetinin Nf1 (Nörofibromatozis Tip 1) için heterozigot farelerde makro besin profillerini ve fetal nörogelişimi nasıl etkilediğini sorgulamak için kullandık.

Özet

Anne diyetinin neden olduğu obezitenin yavrularda nörogelişimi değiştirdiği ve bunun da bilişsel kapasitenin azalmasına, hiperaktiviteye ve sosyal davranışta bozulmalara yol açabileceği gösterilmiştir. Klinik olarak heterojen genetik bozukluk Nörofibromatozis Tip 1 (NF1) olan hastalar benzer eksikliklerle ortaya çıkabilir, ancak şu anda maternal diyet gibi çevresel faktörlerin bu fenotiplerin gelişimini etkileyip etkilemediği ve eğer öyleyse, böyle bir etkinin ortaya çıkacağı mekanizma. Maternal obezojenik diyet maruziyetinin NF1'deki nörogelişimle ilgili sistemik faktörleri nasıl etkilediğinin değerlendirilmesini sağlamak için, yüksek yağlı, yüksek sükroz diyetine karşı kontrol diyeti ile beslenen murin barajlarının fetal yavrularından hemolize edilmemiş serum ve tam veya bölgesel olarak mikro diseke beyinleri aynı anda toplamak için bir yöntem geliştirdik. Beyinler, sonraki RNA veya protein izolasyonu için kullanılmak üzere kriyoseksiyon veya flaş dondurma için işlendi; Toplanan dokunun kalitesi immün boyama ile doğrulandı. Serumun kalitesi, makro besin profilleri analiz edilerek doğrulandı. Bu tekniği kullanarak, maternal obesojenik diyetin WT ve Nf1-heterozigot yavrular arasında fetal serum kolesterolünü benzer şekilde artırdığını belirledik.

Giriş

Nörofibromatozis Tip 1 (NF1), RAS / MAPK (RAt Sarkom virüsü / Mitojenle aktive Edilen Protein Kinaz) sinyal yolunun aktivasyonu ile sonuçlanan germ hattı genetik mutasyonları ile karakterize bir grup bozukluk olan bir RASopati olarak kabul edilir. NF1 RASopatisi olan hastalar, merkezi (optik yolgliomu 1,2, yüksek dereceli glioma 3,4) ve periferik (pleksiform nörofibrom 5,6, malign periferik sinir kılıfı tümörü 7,8) sinir sisteminin hem iyi huylu hem de kötü huylu tümörlerinin yanı sıra kemik displazileri9 ve cilt pigment anormallikleri10 dahil olmak üzere birçok farklı belirti geliştirme riski altındadır (aksiller çiller, café-au-lait makülleri). Bu bozukluğun biliş ve nörogelişim üzerindeki etkisi, NF1 hastalarının öğrenme eksikliği, hiperaktivite ve otizm spektrum bozukluğu insidansında artış göstermesiyle giderek daha fazla tanınmaktadır 11,12,13. Bununla birlikte, 13,14,15,16,17 hastaları arasında bu fenotiplerin gelişiminde önemli bir heterojenlik vardır ve bazı hastaların neden önemli bilişsel bozukluklar gösterirken diğerlerinin etkilenmediği açık değildir. Maternal diyete bağlı obezitenin genel popülasyonda öğrenme ve davranışı benzer şekilde etkilediği gösterilmiştir 18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28, NF1'deki farklı maternal diyet maruziyetlerinin bu klinik heterojenliğin bir kaynağı olabileceğini düşündürmektedir. Özellikle, obez annelerin çocukları hiperaktivite geliştirme riski 18,19,20,23,25,26, otizm 19,24,27, yürütücü işlev eksiklikleri21,23 ve daha düşük tam ölçekli IQ puanlarına sahiptir 22,28. Bununla birlikte, NF1'li hastalar, obezite ve diyabet insidansının azalması da dahil olmak üzere genel popülasyona kıyasla metabolik fenotipleri değiştirmiştir 29,30,31 ve bu da diyet uyaranlarına benzer şekilde yanıt verip vermeyeceklerini belirsiz hale getirmektedir.

Bu soruları ele almak için, Nf1 ile fetal yavrularda makro besin profilinde obezojenik diyetin neden olduğu değişikliklerin nörogelişimsel değişikliklere katkıda bulunup bulunmadığını belirlemek istedik. Daha önce fetal beyinden nörogelişimsel uygulamalara uygun yüksek kaliteli tam ve bölgesel olarak mikro diseke doku topladık32. Bununla birlikte, küçük vücut boyutu ve düşük kan hacmi nedeniyle fetal kan alımı zordur33. Dekapitasyondan sonra yerçekimi destekli drenaj yoluyla kan toplanması, numunelerimizde düşük toplama hacimlerine ve önemli hemolize yol açtı, bu da aşağı akış uygulama yorumlamasını etkileyebilir. Daha önce bildirildiği gibi fetal kalp veya torasik damarlardan aspirasyon yoluyla toplama33 teknik olarak zordu ve ayrıca sık hemoliz ile sonuçlanıyordu. Bu nedenle, önemli kesme gerilimi olmadan daha yüksek hacimli toplamaya izin vermek için özel kılcal tüpler kullanan fetal serum toplama yöntemi geliştirdik.

Burada, uteroda kontrol diyetine karşı yüksek yağlı, yüksek şekerli bir diyete maruz kalan Nf1-heterozigot yavrulardan embriyonik beyinleri ve fetal serumu aynı anda toplamak için bu yöntemi sunuyoruz (Şekil 1 ve Ek Tablo S1). Beyinler, immünofloresan ile daha sonraki analizler için kriyo-gömülü veya bölgesel olarak mikro disseke edildi ve moleküler biyoloji uygulamalarında daha sonra kullanılmak üzere flaş donduruldu. Makro besin profili oluşturma gibi aşağı akış uygulamaları için uygun yüksek kaliteli serum elde edildi. Bu yöntemi kullanarak, maternal yüksek yağlı, yüksek sükroz diyet maruziyetinin hem WT hem de Nf1-heterozigot yavrularda serum kolesterol seviyelerinin yükselmesine yol açtığını belirledik.

Protokol

Bu çalışmadaki tüm hayvan prosedürleri NIH yönergelerini takip etti ve St. Louis'deki Washington Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı. Hayvanlar standart 12 saat ışıkla barındırıldı: karanlık bisiklet ve yiyecek ve suya ücretsiz erişim.

1. Anne diyeti

  1. Dişi fareleri 4 haftalıkken kontrol yemeğine (CD) veya obezojenik diyete (Ob) yerleştirin.
  2. 8-12 haftalıkken, doğru toplama yaşını belirlemek için sabahın erken saatlerinde barajın mukus tıkacını izleyerek zamanlanmış çiftleşmeyi ayarlayın. Diyete bağlı obeziteyi doğrulamak için, çiftleşme sırasında dişileri tartın.
    NOT: Obezojenik diyetle beslenen dişilerin muadillerine kıyasla fazla kilolu olmalarını sağlamak için ilk çiftleşme kurulumu için 8-12 haftalık bir aralık kullanıldı, bu her zaman 8 haftalıkken ortaya çıkmadı. Fişin günü embriyonik gün 1 (E1) olarak kabul edilir ve bu çalışmada kullanılan tüm hayvanlar E19'da toplanmıştır. Geç fetal zaman noktası, obezojenik diyete maruz kalan hayvanlarda daha önce bu zamanda gözlenen nörogelişimsel değişiklikler nedeniyle seçildi (veriler gösterilmemiştir).

2. Barajdan fetüsün çıkarılması

  1. İlk olarak, barajın ciddi göründüğünden emin olun (karın şekli ve dolgunluğu, karın palpasyonu veya fetal hareket). Şüpheniz varsa, kilo alımını ölçmek için dişiyi tekrar tartın.
    NOT: Geç dönem hamile fareler en az 3-4 g kilo alımı göstermelidir. İstenilen zaman diliminde gebe kalma olasılığını artırmak için, bir erkeğin kafesinden kirli (idrar ve feromon içeren) talaş, kızgınlığı indüklemek için çiftleşmeden 3 gün önce her gün dişinin kafesine eklenebilir34.
  2. Barajı 3 mL izofluran içeren bir kağıt havluyla bir odaya yerleştirerek ötenazi yapın, baraj ile anestezik ile ıslatılmış kağıt havlu arasında doğrudan temastan kaçınmaya dikkat edin. Hayvan sakinleştirildikten sonra, bir kağıt havlu üzerine koyun, kuyruğundan tutun, boynuna diseksiyon makası yerleştirin ve ardından servikal çıkık yapmak için makası başa doğru yukarı doğru zorlayın. Alternatif olarak, izofluran sedasyonundan sonra dekapitasyon yapın.
    NOT: Bu adımda, aşağıda tarif edilene benzer bir metodoloji kullanılarak, ancak daha büyük kılcal tüplerle barajdan serum toplanabilir. Bu isteniyorsa rahim ağzı çıkığı yerine dekapitasyon yapılmalıdır. Ötanaziden hemen önce izofluran uygulamasıyla ilgilenilen fenotipin değişmemesini sağlamak için özen gösterilmelidir.
  3. Barajın ventral tarafı yukarı bakacak şekilde 100 mm'lik bir tabağa yerleştirin. Karın bölgesini kaplayan cildi sıkıştırın ve diseksiyon makası ile orta hat kesisi yapın. Embriyoları içeren uterusu ortaya çıkarmak için cilt flepleri oluşturmak için orta hat insizyonuna dik ek kesiler yapın.
  4. Uterusu karın boşluğundan dışarı çekin. Makas kullanarak uterusu barajdan ayırın. Embriyoları içeren sağlam embriyonik kesesi ("bir ipteki inciler") soğuk steril 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içeren bir kaba yerleştirin. Fetüs tabağını buzun üzerine yerleştirin.
    NOT: Her çöp tipik olarak hem beyin hem de serum için hasat edilecek 6-10 yavru içerdiğinden, doku bozulmasını önlemek için fetüsler buz üzerinde tutulur. Yavruları buzun üzerine yerleştirmek ayrıca yavruların yeterli ötenazisini sağlar, çünkü tek başına anne ötenazisi her zaman yeterli olmayabilir. Sadece serum toplanması isteniyorsa oda sıcaklığında toplama tercih edilebilir.

3. Fetal serum toplanması

  1. # 5 forseps ile dikkatlice diseksiyon yaparak fetüsü embriyonik keseden çıkarın. Embriyoyu taze soğuk steril 1x PBS ile kavisli forseps kullanarak bir tabağa aktarın.
  2. Numuneden kalan amniyotik sıvıyı ve PBS'yi çıkarmak için hayvanı bir kağıt havlu üzerinde nazikçe kurulayın.
  3. Hayvanı karnından tutun. Ventral boynunda bir kesi yaparak hayvanın mikro makasla kısmen kafasını kesin. Kan damarlarının kesildiğinden emin olun, ancak başı tutan deri hala yapışıktır.
    NOT: Kanın vücuttan ve kafadan aynı anda alınabilmesi için kafa takılı kalmalıdır.
  4. Kesi aşağı bakacak şekilde vücudu 45°'lik bir açıyla tutun. 50 μL'lik miniveti (kılcal boru), kanın bir damlacık oluşturduğu barajın kesi bölgesine paralel tutun. 50 μL'lik kılcal borunun dikkatlice kanla dolmasına izin verin.
    NOT: Kılcal boru x2 veya 100 μL kılcal tüp, ~75 μL'ye kadar kan toplamak için kullanılabilir.
  5. Daha fazla doku toplanması için başlığı soğuk, steril 1x PBS içeren 60 mm'lik yeni bir kaba yerleştirin (bölüm 4).
  6. Kan kılcal borunun içine girdikten sonra, pistonu hızlı bir şekilde 1,5 mL'lik bir tüpe bastırın. Kanın tüpün dibinde olduğundan emin olmak için tüpü hafifçe vurun veya hızlıca döndürün.
  7. Çöpün geri kalanı için tekrarlayın.
    NOT: Yavruları buz üzerinde tutmak ve aralarında hızlı hareket etmek, toplama hacmini sınırlayacak ölüm sonrası pıhtılaşma riskini azaltmak için çok önemlidir.
  8. Kanı oda sıcaklığında 30 dakika pıhtılaştırın.
  9. Kan örneklerini 4 °C, 16.000 × g'da 20 dakika santrifüjleyin.
  10. Serumu 200 μL'lik bir pipet ile 500 μL'lik taze tüplere, tüpün altındaki kan hücresi peletini bozmadan aktarın.
    NOT: Serum saman renginde olmalı ve kırmızı kalıntı içermemelidir. Her fetüs 15-30 μL serum vermelidir.
  11. Toplanan serumu -80 °C'de saklayın.

4. Fetal beyin toplanması

  1. Diseksiyon mikroskobundan bakarak, kavisli forseps kullanarak burnu tutun ve kafatası kapağındaki cildi dikkatlice soymak için #5 forseps kullanın ve tutma kolaylığı için burnuna bağlı tutun. Açı #5 kafatasına göre 45 ° 'ye kadar forseps, gelişmekte olan kafatası olan şeffaf zarı dikkatlice delin, forsepsleri kafatasına paralel olarak kaydırın, kafatası kapağının altına yerleştirin ve ardından bir tarafa sıkıştırın ve soyun. Bir taraf çıkarıldıktan sonra, kalan tarafı #5 forseps ile kavrayın ve diğer tarafa soyun.
  2. Bir mikro kaşık kullanarak beyni nazikçe kafatasından çıkarın ve beyni soğuk 1x PBS içeren 60 mm'lik taze bir tabağa aktarın.
    NOT: Bu noktada, tüm beyinler immün boyama için sabitlenebilir ve gömülebilir. Daha önce yayınlanmış metodolojiyebakınız 32.
  3. Diğer moleküler uygulamalar için dokunun dondurulması gerekiyorsa, ilgilenilen alanı alt diseksiyon yapın. Lateral, üçüncü ve dördüncü ventriküllerin etrafındaki periventriküler dokunun izolasyonu aşağıda açıklanmıştır.
    1. Kavisli forsepsleri kullanarak, beyni baskın olmayan el ile arka beyin ve ön beynin birleştiği yerde tutun. Baskın el ile neşteri bıçak beynin yüzeyine paralel olacak şekilde tutun. Orta kortikal bölgeye sıkıca bastırın (Şekil 1).
    2. Hala arka beyni tutarak, ön beyinden ayırmak için arka beynin önünde ikinci bir kesi yapın (Şekil 1). En ön bölümde, lateral ventriküller olan yatay düzlem içinde yer alan iki küçük yarım daire biçimli boşluk arayın. Beyni yerinde tutmak için her ventrikülün ortasına yerleştirilmiş kavisli forsepsleri kullanın, # 5 forseps kullanarak astarı dikkatlice inceleyin ve taze temiz 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne çıkarın.
    3. Orta bölümde, üçüncü ventrikül olan ventral yüzeyde küçük bir doğrusal boşluk arayın. # 5 forseps kullanarak, ventriküler yüzeyin her iki tarafındaki astarı dikkatlice sıkıştırın, ardından taze temiz 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne çıkarın.
    4. En arka bölümde, dördüncü ventrikül olan arka beynin merkezinde küçük bir doğrusal boşluk arayın. # 5 forseps kullanarak her iki taraftaki astarı inceleyin, ardından taze temiz 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne çıkarın.
      NOT: Arka beynin dilimlenmesi temiz bir kesim değilse, dördüncü ventrikül dokusu gizlenebilir ve/veya tahrip olabilir.
    5. Adım 4.3.2-4.3.4 için, doku mikrosantrifüj tüplerine yerleştirildikten hemen sonra, tüpleri hızlı bir şekilde sıvı nitrojen içeren kriyo güvenli bir kaba yerleştirin.
      NOT: Tüpler, kalan numuneler diseke edilene kadar sıvı nitrojen içinde tutulabilir. DİKKAT: Sıvı nitrojen şiddetli donmalara neden olabilir. Ellerinizi doğrudan sıvı nitrojene batırmayın ve sıçramalarını önleyin.
    6. Donmuş tüp(ler)i kuru buz üzerine yerleştirin ve donmuş dokuyu kullanana kadar -80 °C'lik bir dondurucuya aktarın.

Sonuçlar

Bu teknikle elde edilen beyin dokusunun kalitesini göstermek için, daha önce bildirilen bir teknik32'ye göre GFAP için immün boyalı Nestin-CFPnuc farelerinden35 alınan örnek fetal beyinleri gösteriyoruz. Nestin+ hücreleri, yüzeyden uzanan GFAP+ filamentleri ile lateral ventrikülü kaplarken görülür (Şekil 2A). WT veya Nf1-heterozigot suşlarda Ob'ye maruz kalan farelere karşı CD'nin lateral ventrikülündeki Nestin veya GFAP ekspresyonu arasında fark gözlemlemedik (Şekil 2A, B). Daha sonra mikrodiseke dokunun kalitesini değerlendirdik. İlk olarak, Ob'ye maruz kalan farelere karşı CD'nin lateral ventriküllerinden izole edilen mikrodiseke doku üzerinde temizlik proteini β-aktin için western blotting36 gerçekleştirdik. Tüm numuneler, beklendiği gibi güçlü β-aktin ekspresyonu gösterdi (Şekil 2C). Daha sonra daha önce bildirilen metodolojiye32 göre mikrodiseke edilmiş dokudan RNA'yı izole ettik. İzole RNA, hem yüksek saflık (260/280 ≥ 2) hem de bütünlük (RIN değerleri ≥ 9) gösterdi, bu da yüksek saflıkta, bozulmamış RNA'nın göstergesidir (Şekil 2D).

Daha sonra farklı serum izolasyon yöntemlerini karşılaştırdık. Minivette yöntemimizi kullanarak, rutin olarak daha büyük hacimlerde hemolize edilmemiş serum topladık, yerçekimi drenajı ve torasik ponksiyon birçok örnekte oldukça değişken hacim toplama ve hemoliz ile sonuçlandı (Şekil 3A,B). Bu teknikle elde edilen serumun kalitesini göstermek için, üreticinin talimatlarına göre toplam kolesterol reaktifini kullanarak toplam serum kolesterol seviyelerini ölçtük. Fetal kolesterol seviyeleri, insan fetüslerinde yapılan önceki çalışmalara dayanarak geç gebelik yavruları için beklenen aralıktaydı37. Ob'ye maruz kalan farelerde, hem vahşi tip (Şekil 3C, solda) hem de Nf1-heterozigot yavrular (Şekil 3C, sağda) için CD'ye maruz kalanlara kıyasla seviyeler artmıştır. Sağ panelin, her iki suşta da benzer profiller görüldüğünden, hasta tarafından tanımlanan germ hattı mutasyonları (R681X, C383X)32,38,39 ile iki farklı Nf1-heterozigot suştan birleştirilmiş verileri gösterdiğine dikkat edin.

figure-results-1
Şekil 1: İş akışının grafiksel özeti. Yavrular önce hamile barajlardan izole edilir. Daha sonra yavrulardan serum toplanır. Son olarak, tüm beyinler yavrulardan izole edilir ve istenirse ilgilenilen bölgeler için mikrodiseke edilir. BioRender.com ile oluşturulan grafik. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Açıklayıcı sonuçlar, beyin dokusu. (A) Nestin promotörü kontrolü altında nükleer olarak lokalize bir camgöbeği floresan proteini eksprese eden Nestin-CFPnuc farelerinden kriyoseksiyonel beyinler bu yöntemle hasat edildi ve daha önce bildirilen metodolojiye göre GFAP (kırmızı) için immünostained32. Nestin pozitif hücreler, endojen Nestin-CFPnuc ekspresyonu (yeşil) yoluyla görselleştirilir. Çekirdekler bis-benzimid (mavi) ile karşı boyandı. CD ve OB'ye maruz kalan WT beyinleri arasında önemli bir fark yoktu. Ölçek çubuğu = 100 μm. (B) Nestin-CFPnuc; Nf1mut/+ yavruları da benzer şekilde değerlendirildi. GFAP ve Nestin-CFP dağılımı WT'ye benzer göründü ve diyet koşullarına göre değişmedi. Ölçek çubuğu = 100 μm. (C) Protein, LV'den mikrodiseke edilmiş dokudan izole edildi. Western blotlama, daha önce bildirilen metodolojiyegöre gerçekleştirildi 36 ve şerit başına 20 μg protein yüklendi. Tüm örneklerde güçlü β-aktin ekspresyonu tespit edilebilirdi. (D) RNA, daha önce bildirilen metodolojiye göre mikrodiseke edilmiş dokudanizole edildi 32. RNA kalitesi 260/280 oranları ve RIN değerleri ile değerlendirildi. Tüm numuneler, bozulmamış RNA'nın iyi izolasyonunu gösteren mükemmel 260/280 oranları (≥2) ve RIN değerleri (≥9) sergiledi. Kısaltmalar: CFP = camgöbeği floresan proteini; GFAP = glial fibriler asidik protein; WT = vahşi tip; LV = lateral ventrikül; RIN = RNA bütünlük numarası. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Açıklayıcı sonuçlar ve serum. (A) Serum, tarif edilen yöntemlerin her birinden toplandı. Minivette ile toplama, yerçekimi destekli drenaj ve torasik ponksiyona kıyasla hemolize edilmemiş serumun rutin olarak toplanmasını sağladı. (B) Tipik serum toplama hacimleri gösterilmiştir. Minivette koleksiyonu, daha büyük hacimlerde serumun daha tekrarlanabilir bir koleksiyonuna izin verdi. İstatistiksel anlamlılık, çoklu karşılaştırmalarla tek yönlü ANOVA ile belirlenir. (C) Toplam serum kolesterolü, Ob'ye maruz kalan WT (solda) ve Nf1-heterozigot (sağda) havuzlanmış fetal seruma karşı CD'den ölçüldü; OB'ye maruz kalan hayvanlar her iki genotipte de daha yüksek serum kolesterolü sergiledi. İstatistiksel anlamlılık t-testi ile belirlendi. Hata çubukları: SEM. Kısaltmalar: WT = vahşi tip; CD = kontrol diyeti; Ob = obezojenik diyet. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo S1: Diyet Bileşimleri. Bu el yazmasında kullanılan kontrol ve obezojenik diyetlerin bileşimi gösterilmiştir. NOT: D12331'deki bireysel diyet bileşenlerini daha iyi kontrol eden düşük yağlı, sükroz içermeyen bir diyet için D12328 diyeti (researchdiets.com) tercih edilebilir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Farelerden kan almak için geleneksel yöntemler arasında retrobulbar, kuyruk damarı, safen damarı, yüz damarı ve juguler ven kanamasıbulunur 40,41,42. Ne yazık ki, bu yöntemler hayvanın büyüklüğü ve küçük, hassas damar sistemi nedeniyle embriyonik kan toplama için ideal değildir. Dekapitasyondan sonra yerçekimi destekli drenaj yoluyla kan toplanması, numunelerimizde hem düşük toplama hacimlerine hem de önemli hemolize yol açmıştır. Önceki protokoller, torasik kan damarlarından kanı boşaltmak için modifiye edilmiş bir 20 G iğne kullanarak hacimlerin arttığını bildirmiştir33; Bununla birlikte, bu tekniği teknik olarak zorlayıcı bulduk ve yüksek hemoliz oranları gözlemledik, bu da onu birçok aşağı akış uygulaması için uygun hale getirmedi. Yöntemimiz, aspirasyonun neden olduğu stresten kaynaklanan hemoliz riskini azaltarak pasif kan akışı yoluyla toplama avantajına sahiptir. Kılcal boru üzerindeki piston ayrıca kanı toplama tüpüne iletmek için hızlı ve verimli bir yol sağlar, havaya maruz kalmayı en aza indirir ve kan pıhtılarının parçalanmasını sınırlar. Daha da önemlisi, tam veya bölgesel olarak mikrodiseke edilmiş beyin dokusu daha sonra aynı hayvandan toplanabilir ve bu da toplam deney hayvanı ihtiyaçlarını azaltır.

Bu protokol, toplama kalitesini ve verimliliğini optimize etmek için ayarlamalar yapılmadan değildir. Serum toplanması için, kan alımından önce embriyonik sıvının ve ekstra PBS'nin hayvandan nazikçe çıkarılması çok önemlidir, çünkü fazla sıvı hayvanı kaygan hale getirebilir ve kan alma kalitesini olumsuz yönde etkileyen zayıf veya dengesiz konumlandırma olasılığını artırabilir. Ek olarak, embriyoyu tutarken parmağın konumlandırılması çok önemlidir, çünkü parmak kılcal boruya bitişikse, toplama sırasında eldivenli bir parmağa kan yapışacaktır. Kılcal borunun açıklığını, akan kanın içine daldırmak yerine, ona bitişik tutmak da önemlidir; Tüp suya batırılırsa kılcal damar toplanması bozulacaktır. Son olarak, serum toplamayı optimize etmek için aşağı akış uygulamasını dikkatli bir şekilde düşünmek gerekir. Örneğin, glikoz oda sıcaklığında işlenmemiş tüplerde zamanla bozunur, bu nedenle glikoz seviyelerini43,44 doğru bir şekilde ölçmek için sodyum florür veya EDTA içeren tüplere toplama gerekli olabilir.

Beyin dokusunun toplanması için, başın her iki yanındaki cildin ve şeffaf kafatasının dikkatli bir şekilde çıkarılması, temiz bir ekstraksiyon için kritik öneme sahiptir. Sadece bir taraf diseke edilirse, beyin çıkarılmaya çalışıldığında kafatasına yapışabilir ve bu da dokunun yırtılmasına ve bozulmasına neden olabilir. Beyni bölümlere ayırmak için, ön korteksi orta korteksten ve orta korteksi arka beyinden ayırmak için tek, temiz dilimler yapmak önemlidir. Birden fazla kesiğe sahip olmak, dokunun yapısal bütünlüğünü bozabilir veya sonraki mikrodiseksiyon için referans noktanızı gizleyebilir. Son olarak, numunelerin fiksasyon veya ani donma işlemine kadar buz üzerinde tutulması, numunenin bozulmasını önlemek için çok önemlidir.

Daha yüksek hacimli, hemolize edilmemiş serumun rutin olarak toplanması nedeniyle bu yöntemi tercih etsek de, dezavantajları da yok değildir. Her ne kadar diğer tekniklere göre hemoliz azalmış olsa da bu yöntem riski ortadan kaldırmaz. Kılcal boru, kan akışı durduğunda bir kan pıhtısı ile de tıkanabilir, bu nedenle pıhtılaşma nedeniyle başarısız toplama riskini azaltmak için dekapitasyondan sonra hızlı bir şekilde çalışmak önemlidir. Bu protokolde numune bütünlüğünü korumak için yapılan numunelerin buz üzerinde bekletilmesi de bazı fenotipleri olumsuz etkileyebilir ve tüm uygulamalar için uygun olmayabilir.

Sonuç olarak, bu metodoloji aynı fetüsten serumun yanı sıra tam veya bölgesel olarak mikrodiseke edilmiş beyinleri aynı anda izole etmek için kullanılabilir. Bu teknik, makro besin profilinde maternal diyetin neden olduğu değişiklik gibi sistemik faktörlerin NF1 veya diğer bozukluklarda nörogelişimi nasıl etkileyebileceğini ele almak için kullanılabilir.

Açıklamalar

Yazarların herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

N Brossier, Nörofibromatozis Terapötik Hızlandırma Programı (NTAP, Hibe # 210112) tarafından finanse edilen Nörofibromatozis Klinik ve Translasyonel Araştırmalarında Francis S. Collins Scholars Programı tarafından desteklenmektedir. Bu yayın, kısmen Johns Hopkins Üniversitesi Tıp Fakültesi'ndeki NTAP'tan sağlanan fonlarla desteklenmiştir. İçeriği yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Johns Hopkins Üniversitesi Tıp Fakültesi'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir. St. Louis Çocuk Hastanesi (FDN-2022-1082'den NMB'ye) ve St. Louis Diyabet Araştırma Merkezi'ndeki Washington Üniversitesi (NIH P30 DK020579) tarafından ek destek. Mikroskopi, Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi, Washington Üniversitesi Çocuk Keşif Enstitüsü ve St. Louis Çocuk Hastanesi (CDI-CORE-2015-505 ve CDI-CORE-2019-813) ve Barnes-Yahudi Hastanesi Vakfı (3770 ve 4642) tarafından desteklenen Washington Üniversitesi Hücresel Görüntüleme Merkezi (WUCCI) kullanılarak gerçekleştirildi. Nestin-CFPnuc35 fareleri Grigori Enikolopov (Rönesans Tıp Okulu, Stony Brook Üniversitesi, NY) tarafından cömertçe sağlandı ve R681X veya C383X germ hattı mutasyonu 32,38,39 için heterozigot Nf1 fareleri David Gutmann (Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi, St. Louis, MO) tarafından cömertçe sağlandı. Şekil 1, BioRender.com ile oluşturulmuştur.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
#5/45 ForsepsDumont 11251-35uç şekli: açılı 45 & derece;
4200 TapestationAgilentG2991BARNA bütünlüğünü ve kalitesini doğrulayın, RIN değerlerinin ölçümü
Tezgah Üstü Sıvı Nitrojen KabıThermo Fisher2122Veya diğer kriyo-güvenli kap
Kontrol ChowPicoLab5053Araştırma diyetleri D12328 (az yağlı, düşük şekerli) de kullanılabilir.
Kavisli Forseps ColeParmerUX-10818-25Uç şekli: kavisli 90 derece;
Diseksiyon bıçağı sapıCole-Parmer Essentials10822-20SS Siegel Tipi, # 10 ila # 15 bıçaklar
EMS SuperCut Diseksiyon MakasıElektron mikroskobu bilimleri72996-015 & frac12; " (139.7 mm), Düz GFAP
AntikoruAbcamab72601:350 seyreltin. 0.3 M Glisin içeren% 10 serum ile bloklayın.
Glassvan Karbon Çelik Cerrahi Bıçaklar, Boyut 11MYCO medical2001T-11# 11 bıçaklar düz, düz kesime izin verir
Mikro laboratuvar kaşığıAz ScilabA2Z-VL001paslanmaz çelik, otoklavlanabilir
Mikro makasRubis78180-1C3model 1C300
Minivette  POCT nötrSarstedt17.2111.050nominal hacim: 50 &mikro; L, hazırlık olmadan
NanoropThermo Fisher13-400-519RNA konsantrasyonunu ölçün, 260/280 oranları
Obezojenik diyetResearchdiets.comD12331Yüksek yağlı, yüksek sükroz
Toplam Kolesterol ReaktifiThermo FisherTR13421Kolorimetrik algılama
ve beta;-aktin antikoruHücre Sinyali84571: 1.000 seyreltin.

Kaynaklar

  1. Listernick, R., Darling, C., Greenwald, M., Strauss, L., Charrow, J. Optic pathway tumors in children: the effect of neurofibromatosis type 1 on clinical manifestations and natural history. J Pediatr. 127 (5), 718-722 (1995).
  2. Fisher, M. J., et al. Integrated molecular and clinical analysis of low-grade gliomas in children with neurofibromatosis type 1 (NF1). Acta Neuropathol. 141 (4), 605-617 (2021).
  3. Cimino, P. J., et al. Expanded analysis of high-grade astrocytoma with piloid features identifies an epigenetically and clinically distinct subtype associated with neurofibromatosis type 1. Acta Neuropathol. 145 (1), 71-82 (2023).
  4. Lucas, C. -H. G., et al. Multiplatform molecular analyses refine classification of gliomas arising in patients with neurofibromatosis type 1. Acta Neuropathol. 144 (4), 747-765 (2022).
  5. Fisher, M. J., et al. Management of neurofibromatosis type 1-associated plexiform neurofibromas. Neuro-Oncol. 24 (11), 1827-1844 (2022).
  6. Packer, R. J., et al. Plexiform neurofibromas in NF1. Neurology. 58 (10), 1461-1470 (2002).
  7. Evans, D. G. R., et al. Malignant peripheral nerve sheath tumours in neurofibromatosis 1. J Med Genet. 39 (5), 311(2002).
  8. Prudner, B. C., Ball, T., Rathore, R., Hirbe, A. C. Diagnosis and management of malignant peripheral nerve sheath tumors: Current practice and future perspectives. Neurooncol Adv. 2, Suppl 1 i40-i49 (2020).
  9. Ma, Y., et al. A molecular basis for neurofibroma-associated skeletal manifestations in NF1. Genet Med. 22 (11), 1786-1793 (2020).
  10. Ozarslan, B., Russo, T., Argenziano, G., Santoro, C., Piccolo, V. Cutaneous findings in neurofibromatosis Type 1. Cancers. 13 (3), 463(2021).
  11. Hyman, S. L., Shores, A., North, K. N. The nature and frequency of cognitive deficits in children with neurofibromatosis type 1. Neurology. 65 (7), 1037-1044 (2005).
  12. Morris, S. M., et al. Disease burden and symptom structure of autism in neurofibromatosis type 1: a study of the International NF1-ASD Consortium Team (INFACT). JAMA Psychiatry. 73 (12), 1276-1284 (2016).
  13. Geoffray, M. -M., et al. Predictors of cognitive, behavioural and academic difficulties in NF1. J Psychiatr Res. 140, 545-550 (2021).
  14. Monroe, C. L., Dahiya, S., Gutmann, D. H. Dissecting clinical heterogeneity in neurofibromatosis type 1. Ann Rev Pathol. 12 (1), 53-74 (2017).
  15. Kehrer-Sawatzki, H., Mautner, V. -F., Cooper, D. N. Emerging genotype-phenotype relationships in patients with large NF1 deletions. Hum Genet. 136 (4), 349-376 (2017).
  16. Hou, Y., et al. Predictors of cognitive development in children with neurofibromatosis type 1 and plexiform neurofibromas. Dev Med Child Neurol. 62 (8), 977-984 (2020).
  17. Biotteau, M., et al. Sporadic and familial variants in NF1: an explanation of the wide variability in neurocognitive phenotype. Front Neurol. 11, 368(2020).
  18. Rodriguez, A., et al. Maternal adiposity prior to pregnancy is associated with ADHD symptoms in offspring: evidence from three prospective pregnancy cohorts. Int J Obes (Lond). 32 (3), 550-557 (2008).
  19. Andersen, C. H., Thomsen, P. H., Nohr, E. A., Lemcke, S. Maternal body mass index before pregnancy as a risk factor for ADHD and autism in children). Eur Child Adolesc Psychiatry. 27 (2), 139-148 (2018).
  20. Pugh, S. J., et al. Gestational weight gain, prepregnancy body mass index and offspring attention-deficit hyperactivity disorder symptoms and behaviour at age 10. Bjog. 123 (13), 2094-2103 (2016).
  21. Mina, T. H., et al. Prenatal exposure to maternal very severe obesity is associated with impaired neurodevelopment and executive functioning in children. Pediatr Res. 82 (1), 47-54 (2017).
  22. Oken, E., et al. Analysis of maternal prenatal weight and offspring cognition and behavior: Results from the Promotion of Breastfeeding Intervention Trial (PROBIT) Cohort. JAMA Netw Open. 4 (8), e2121429-e2121429 (2021).
  23. Buss, C., et al. Impaired executive function mediates the association between maternal pre-pregnancy body mass index and child ADHD symptoms. PLOS ONE. 7 (6), e37758(2012).
  24. Li, Y. -M., et al. Association between maternal obesity and autism spectrum disorder in offspring: a meta-analysis. J Autism Dev Disord. 46 (1), 95-102 (2016).
  25. Dow, C., Galera, C., Charles, M. -A., Heude, B. Maternal pre-pregnancy BMI and offspring hyperactivity-inattention trajectories from 3 to 8 years in the EDEN birth cohort study. Eur Child Adolesc Psychiatry. 32 (10), 2057-2065 (2023).
  26. Fast, K., et al. Prevalence of attention-deficit/hyperactivity disorder and autism in 12-year-old children: A population-based cohort. Devl Med Child Neurol. 66 (4), 493-500 (2023).
  27. Carter, S. A., et al. Maternal obesity and diabetes during pregnancy and early autism screening score at well-child visits in standard clinical practice. Autism. 28 (4), 975-984 (2023).
  28. West, Z., et al. Relationships between maternal body mass index and child cognitive outcomes at 3 years of age are buffered by specific early environments in a prospective Canadian birth cohort. J Dev Orig Health Dis. 14 (1), 42-52 (2023).
  29. Gutmann, D. H., et al. Neurofibromatosis type 1. Nat Rev Dis Primers. 3, 17004(2017).
  30. Martins, A. S., et al. Lower fasting blood glucose in neurofibromatosis type 1. Endocr Connect. 5 (1), 28-33 (2016).
  31. Martins, A. S., et al. Increased insulin sensitivity in individuals with neurofibromatosis type 1. Arch Endocrinol Metab. 62 (1), 41-46 (2018).
  32. Brossier, N. M., Thondapu, S., Cobb, O. M., Dahiya, S., Gutmann, D. H. Temporal, spatial, and genetic constraints contribute to the patterning and penetrance of murine Neurofibromatosis-1 optic glioma. Neuro Oncol. 23 (4), 625-637 (2020).
  33. de Lurdes Pinto, M., et al. Technical Report: Mouse fetal blood collection taking the best out of the old needle-syringe method. Scandinavian Journal of Laboratory Animal Science. 35 (1), 5(2008).
  34. Musillo, C., et al. Bdnf-Nrf-2 crosstalk and emotional behavior are disrupted in a sex-dependent fashion in adolescent mice exposed to maternal stress or maternal obesity. Transl Psychiatry. 13 (1), 399(2023).
  35. Encinas, J. M., Vaahtokari, A., Enikolopov, G. Fluoxetine targets early progenitor cells in the adult brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8233-8238 (2006).
  36. Anastasaki, C., et al. Human induced pluripotent stem cell engineering establishes a humanized mouse platform for pediatric low-grade glioma modeling. Acta Neuropathol Commun. 10 (1), 120(2022).
  37. Cai, H. -J., Xie, C. -L., Chen, Q., Chen, X. -Y., Chen, Y. -H. The relationship between hepatic low-density lipoprotein receptor activity and serum cholesterol level in the human fetus. Hepatology. 13 (5), 852-857 (1991).
  38. Toonen, J. A., et al. NF1 germline mutation differentially dictates optic glioma formation and growth in neurofibromatosis-1. Hum Mol Genet. 25 (9), 1703-1713 (2016).
  39. Guo, X., Pan, Y., Gutmann, D. H. Genetic and genomic alterations differentially dictate low-grade glioma growth through cancer stem cell-specific chemokine recruitment of T cells and microglia. Neuro Oncol. 21 (10), 1250-1262 (2019).
  40. Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
  41. Meyer, N., et al. Impact of three commonly used blood sampling techniques on the welfare of laboratory mice: Taking the animal's perspective. PLOS ONE. 15 (9), e0238895(2020).
  42. Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. J Appl Toxicol. 21 (1), 15-23 (2001).
  43. Jung, J., Garnett, E., Rector, K., Jariwala, P., Devaraj, S. Effect of collection tube type on glucose stability in whole blood. Ann Clin Lab Sci. 50 (4), 557-559 (2020).
  44. Bonetti, G., et al. Which sample tube should be used for routine glucose determination. Prim Care Diabetes. 10 (3), 227-232 (2016).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Fetal Beyin ToplamaSerum ToplamaMurin ModelObezojenik DiyetBeyin DiseksiyonuMakrobesin AnaliziOptik Yol Gliomu
Nörofibromatozis Tip 1'de Maternal Diyetin Beslenme ve Nörogelişim Üzerindeki Etkilerini Değerlendirmek için Fetal Murin Beyin ve Serumunun Eş Zamanlı Toplanması
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.