Patateste Tek ve Kombine Streslere Morfolojik ve Fizyolojik Tepkileri Belirlemek için Yüksek Verimli Görüntü Tabanlı Fenotipleme

Sıcak hava dalgalarının yoğunluğu ve sıklığındaki artış, sel ve kuraklık olayları dahil olmak üzere iklim değişikliğinin potansiyel etkileri, büyüyen mahsuller üzerinde olumsuz etkilere sahiptir¹. İklim değişikliğinin mahsul değişkenliği üzerindeki etkisini ve bunun sonucunda yıllık mahsul üretimindeki dalgalanmaları anlamak önemlidir². Artan nüfus ve gıda talebiyle birlikte, mahsul bitkilerinin verimini korumak bir zorluktur, bu nedenle ıslah için iklime dayanıklı mahsuller bulmak acilen gereklidir ^3,4. Patates (Solanum tuberosum L.), yüksek besin değeri ve artan su kullanım verimliliği nedeniyle küresel gıda güvenliğine katkıda bulunan temel gıda ürünlerinden biridir. Bununla birlikte, elverişsiz koşullar altında büyüme ve verimdeki azalma, özellikle duyarlı çeşitlerde^temel bir sorundur ^5,6. Birçok çalışma, tarımsal uygulamalar, toleranslı genotipler bulma ve stresin kalkınma ve verim üzerindeki etkisini anlama dahil olmak üzere patates mahsulü verimliliğini korumak için alternatif yaklaşımların araştırılmasının önemini vurgulamıştır ^7,8,9 ve bu da Avrupalı patates yetiştiricileri (veya çiftçileri) tarafından oldukça talep ^{edilmektedir10}.

Görüntü tabanlı fenotipleme de dahil olmak üzere otomatik fenotipleme platformları, ilgilenilen ilgili özelliklerin seçilmesi için gerekli olan bitki yapısı ve işlevinin nicel analizlerini mümkün kılar^11,12. Yüksek verimli fenotipleme, ilgilenilen çeşitli morfolojik ve fizyolojik özellikleri tekrarlanabilir ve hızlı bir şekilde belirlemek için gelişmiş bir non-invaziv tekniktir ¹³. Fenotip, çevresel etkilerle bağlantılı olarak genotipik farklılıkları yansıtsa da, kontrollü koşullar altındaki bitkileri stresle karşılaştırmak, kapsamlı fenotipleme bilgisinin belirli bir (stres) duruma bağlanmasını sağlar¹⁴. Görüntü tabanlı fenotipleme, fenotipik değişkenliği tanımlamak için esastır ve aynı zamanda popülasyon büyüklüğünden bağımsız olarak bitki gelişimi boyunca bir dizi özelliği tarama yeteneğine sahiptir¹⁵. Örneğin, Kırmızı-Yeşil-Mavi (RGB) görüntüleme sensörleri kullanılarak yaprakların şekli, boyutu ve renk indeksi dahil olmak üzere morfolojik özelliklerin ölçümü, bitki büyümesini ve gelişimini belirlemek için kullanılır. Ayrıca, fotosentetik performans, kanopi sıcaklığı ve yaprak yansıması dahil olmak üzere fizyolojik özelliklerin ölçümleri, klorofil floresansı, termal kızılötesi (IR) ve hiperspektral görüntüleme¹⁶ gibi birden fazla sensör türü kullanılarak ölçülür. Kontrollü ortamlarda yapılan son çalışmalar, patates^17'de ısı, arpada¹⁸ kuraklık, pirinçte^{19 ve buğdayda} kombine kuraklık ve ısıl işlemler gibi abiyotik stresler altındaki bitkilerin farklı mekanizmalarını ve fizyolojik tepkilerini değerlendirmede görüntü tabanlı fenotiplemenin kullanılma potansiyelini göstermiştir. Bitkilerin çoklu stres etkileşimlerine tepkilerini incelemek karmaşık olsa da, bulgular iklim koşullarındaki hızlı değişimle başa çıkmada bitki mekanizmalarını anlamada yeni anlayışlar ortaya koymaktadır²¹.

Bitki fizyolojik ve morfolojik tepkileri, abiyotik stres koşullarından (yüksek sıcaklık, su açığı ve taşkın) doğrudan etkilenir ve bu da verimin düşmesine neden olur²². Patatesin diğer bitkilere göre su kullanım etkinliği yüksek olmasına rağmen, sığ kök mimarisi nedeniyle su açığı verim miktarını ve kalitesini olumsuz yönde etkilemektedir⁵. Kuraklık seviyesinin yoğunluğuna ve süresine bağlı olarak, yaprak alanı indeksi azalır ve stresin sonraki aşamalarında yeni yaprak oluşumunun engellenmesiyle gölgelik büyümesinde gerilik belirginleşir ve bu da fotosentez oranında bir azalmaya yol açar²³. Suyun eşik seviyesi, aşırı su veya uzun süreli kuraklık dönemlerinde kritik öneme sahiptir, bu da oksijen sınırlaması, kök hidrolik iletkenliğinin azalması ve gaz değişiminin kısıtlanması nedeniyle bitki büyümesi ve yumru gelişimi üzerinde olumsuz bir etkiye neden olur^24,25. Ayrıca patatesler, optimum seviyelerin üzerindeki sıcaklıkların yumru başlangıcı, büyümesi ve asimilasyon oranlarının gecikmesine neden olduğu yüksek sıcaklıklara karşı hassastır²⁶. Stresler kombinasyon halinde ortaya çıktığında, biyokimyasal düzenlemeler ve fizyolojik tepkiler bireysel stres tepkilerinden farklıdır ve bu da stres kombinasyonlarına bitki tepkilerinin araştırılmasının gerekliliğini vurgulamaktadır²⁷. Kombine stresler, bitki büyümesinde (daha da fazla) ciddi azalmalara ve üreme ile ilgili özellikler üzerinde belirleyici etkilere neden olabilir²⁸. Stres kombinasyonunun etkisi, her bir stresin diğerleri üzerindeki baskınlığına bağlıdır, bu da bitki tepkisinin artmasına veya bastırılmasına yol açar (örneğin, kuraklık genellikle stomaların kapanmasına neden olurken, stomalar ısı stresi altında yaprak yüzeyinin soğumasına izin vermek için açıktır). Bununla birlikte, birleşik stres araştırmaları hala ortaya çıkmaktadır ve bu koşullar altında bitki tepkilerine aracılık eden karmaşık düzenlemeyi daha iyi anlamak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır²⁹. Bu nedenle, bu çalışma, tek ve kombine stres tedavileri altında morfo-fizyolojik tepkileri değerlendirmek ve patatesin genel performansının altında yatan mekanizmaları anlamak için uygun olabilecek çoklu görüntüleme sensörleri kullanan bir fenotipleme protokolünü vurgulamayı ve önermeyi amaçlamaktadır. Hipotez olarak, birden fazla görüntüleme sensörünün birleştirilmesinin, bitki stresi tepkisi sırasında erken ve sonraki stratejileri karakterize etmek için değerli bir araç olduğu kanıtlanmıştır. Görüntü tabanlı fenotipleme protokolünü optimize etmek, bitki araştırmacıları ve yetiştiricileri için abiyotik stres toleransı için ilgi çekici özellikleri bulmaları için etkileşimli bir araç olacaktır.

1. Bitki materyali hazırlama ve büyüme koşulları

1. İn vitro Patates (Solanum tuberosum L., cv. Lady Rosetta) doku kültüründen elde edilen kesimleri 250 mL'lik kaplara nakledin.
2. Saksıları tamamen doymuş Klasmman Substrate 2 ile doldurun ve 1 hafta boyunca düşük ışık koşullarında büyüme odasında tutun.
3. Bir ışık ölçer kullanarak % beyaz ışık ve 5 kızılötesi kombinasyonu ile kanopi seviyesindeki ışık koşullarını 160 μmol·^m-2·^s-1'e ayarlayın.
4. Bitkileri toprakta in vitro kesimler büyüdükten 10 gün sonra 3 L'lik saksıya (15,5 cm çap, 20,5 cm yükseklik) nakledin.
5. 3 L'lik tencereyi 1850 g 3:1 Klasmann Substrat 2: Kum ile doldurun.
6. Bitkileri% 55 beyaz ışık ve% 81 kızılötesi kombinasyonu ile 320 μmol·^m-2·^s-1 ışık koşulları altında büyüme odasına yerleştirin ve uzun bir gün rejimine (16 saat fotoperiyot) ayarlayın.
7. Büyüme odasındaki sıcaklığı gündüz/gece için 22 °C/19 °C'ye ve tüm deney için bağıl nemi (RH) U'e ayarlayın.
8. Büyümeyi ve verimi^30,31 korumak için uygun kontrol seviyesi olarak saksı ağırlığını ` toprak bağıl su içeriğinde (SRWC) tutun.
   NOT: Önceki denemelere dayanarak, hacimsel su içeriğinin `'ın üzerinde tutulması, toprak yüzeyinde yosun büyümesini teşvik etti ve bitki hastalıkları riskini artırdı. Ek olarak, yosunun varlığı, klorofil floresan görüntülemeden yanıltıcı pozitif sinyaller üretebilir ve bu da filtrelenmesi zordur. Aşağıdaki denklemi kullanın: SRWC% = (FW-DW)/(TW-DW) × 100, burada FW toprağın taze ağırlığı, TW turgor ağırlığı ve DW kuru ağırlık^32'dir.
   1. Toprak örneklerini (100 g) üç farklı Klasmman Substrate 2 karışım torbasından kopya olarak seçin ve toprağın taze ağırlığını tartın.
   2. Saksılar damlamadan su tutana kadar toprağı suyla doyurun ve toprak turgor ağırlığını tartın.
   3. Numuneyi, toprak numuneleri tamamen kuruyana kadar 3 gün boyunca 80 °C'de fırına koyun ve toprağın kuru ağırlığı³³ tartın.
9. Buharlaşmayı azaltmak için mavi paspasları tencere yüzeyine yerleştirin.
   NOT: Görüntü segmentasyonunda toprak arka planını bitki piksellerinden çıkarmak için mavi renk gereklidir.
10. Tedavi başına on biyolojik kopya seçin.
11. Sulama sırasında saksıları rastgele hale getirin (toplamda 50 saksı).
12. Bitkileri desteklemek ve fenotipleme sistemine yerleştirirken mekanik hasarı önlemek için mavi tutucuları ekleyin.

2. Stres uygulaması

1. Erken tüberizasyon aşamasında ( in vitro kesimlerin nakledilmesinden 28 gün sonra), bitkileri beş tedavi grubuna bölün ve tedavi başına on bitkiyi fenotipleyin (Şekil 1).
2. Tek ve birleşik stresi aşağıdaki gibi zararlı olmayan bir seviyeye getirin:
   1. Büyüme odasında, bitkileri kontrol altında tutun, kuraklık ve su basması işlemlerini gündüz / gece 22 ° C / 19 ° C'de (adım 1.7), farklı SRWC yüzdeleri ile:
      Tüm deney için ` SRWC ile kontrol (C).
      7 gün boyunca kademeli olarak% 20 SRWC ile kuraklık (D), ardından 1 günlük iyileşme gelir.
      5 gün boyunca 0 SRWC ile su basması (W), ardından 10 günlük iyileşme.
   2. Su basması tedavisinde su seviyesini toprak yüzeyinin üzerinde tutmak için, boş tencereye plastik bir torba yerleştirin ve ardından toprakla birlikte ana tencereyi hazırlanan ikinci tencereye yerleştirin.
   3. Bitkileri ısıl işlemler için gündüz / gece 30/28 ° C ve% 55 bağıl nemde bir büyüme kapsülüne yerleştirin. Tekli ve birleşik ısı streslerini aşağıdaki gibi uygulayın:
      1. Isı (H) için, sıcaklığı 15 gün boyunca SRWC'nin `'ı ile 30-28 °C arasında tutun.
      2. Isı + Kuraklık + Su basması (HDW) üçlü stresi için, bitkileri ilk 7 gün boyunca 30 °C/28 °C gündüz/gece sıcaklığında (` SRWC tutarak) ısıl işleme maruz bırakın, ardından diğer 7 gün boyunca kuraklık + ısıl kombine işleme ( SRWC ve 30 °C/28 °C) maruz bırakın ve son olarak bitkileri 1 gün boyunca su basması stresine maruz bırakın. İkincisi için, bitkileri büyüme odasına geri koyun (koşullar için adım 1.7'ye bakın) ve 1 gün boyunca su basmasını 0 SRWC'ye kadar indükleyin.
         NOT: İndüklenen streslerin seçilen süreleri, muamele edilen bitkilerin 0 hayatta kalması ile zararlı etkiler olmaksızın stres etkilerini gösteren bir pilot deneye dayanmaktadır. Büyüme odası ortamında, çevresel koşulların değişimi sıcaklık için ± 0.2 °C ve nem için ± %3 aralığındaydı.

3. Fenotipleme için bitki hazırlama

1. Büyüme odalarında sabah 6:00'da ışıklar açıldıktan sonra, fenotipleme protokolünün başlamasından en az 2-3 saat önce bitkilerin sabit büyüme ışığı koşulları (320 μmol·^m-2·^s-1) altında iklimlendirmeye alışmalarına izin verin. Bu, fotosentez ve stoma düzenlemesinin kararlı bir durumda olmasını sağlar³⁴.
2. Ölçümden önce, otomatik puanlama bekleme modundayken ve sera içinde konumlandırılırken, bitkileri yetiştirme yerlerinden bitkilerin sisteme manuel olarak yüklenmesi için kullanılan fenotipleme sisteminin büyüme tampon alanına aktarın (Ek Şekil 1, Ek Şekil 2 ve Ek Şekil 3).
   NOT: Bitkiler 3.5 saat süren fenotipleme periyodu boyunca büyüme tampon alanında tutulmuştur. Serada, çevresel koşulların değişimi sıcaklık için ± 2 °C, nem için ± %5 ve ışık yoğunluğunda dalgalanma aralığındaydı. Bu nedenle, sera koşullarının bitkiler üzerindeki etkisinden kaçınarak ölçümlerin hemen başlaması ve kısa olması gerektiğini göz önünde bulundurun.
3. Fenotipleme platformunda, saksıları, bölüm 4'te belirtilen ölçüm protokollerine göre görüntüleme sensörüne belirli aralıklarla bir konveyör bant üzerinde otomatik olarak hareket eden disklere yerleştirin.
4. Deney boyunca ölçülen verilerin doğru bitkiye atandığından emin olmak için her bitkiyi/tepsiyi benzersiz bir kimlikle etiketleyin.

4. Fenotipleme protokolü

1. Çoklu görüntüleme sensörleri (klorofil floresan, termal IR, RGB ve hiperspektral görüntüleme) kullanarak fenotipleme protokolünü optimize edin, böylece bitkilerin hem fizyolojik hem de morfolojik parametrelerinin aynı anda ölçülmesine izin verin (Şekil 2).
   NOT: Bitki tepkileri çevresel koşulları ve günlük etkileri yansıttığından, saksıların randomizasyonunu ve günün aynı döneminde fenotipleme yapmayı düşünmek önemlidir.
2. Fenotipleme platformunda, bitkilerin sisteme önce bitkinin yüksekliğinin yakalandığı ve ardından her bir sensörün yüksekliğinin sabit çalışma mesafesine göre ayarlandığı bir adaptasyon tünelinden (Şekil 2A) girdiğinden emin olun.
3. Yazılımı kullanarak ölçümleri, ölçüm protokolünde belirtildiği gibi iki tur halinde gerçekleştirin.
   1. İlk turda, klorofil floresan ve termal görüntüleme kullanılarak "hızlı reaksiyonlar" olarak ölçülen fizyolojik tepkilerin ölçümlerini içerir.
   2. Isı stresi tedavileri altındaki fizyolojik parametreleri ölçerek başlayın ve ardından diğer tedavileri yapın.
   3. İkinci turda, yapısal RGB ve hiperspektral görüntüleme dahil olmak üzere daha yavaş tepkileri değerlendirmek için diğer ölçümlerle devam edin, ardından ağırlık değerlendirmesi ve sulama yapın.
4. Tartım ve sulama adımı sırasında, otomatik sulama ve söz konusu işleme göre tartımı sağlamak için her bitki için referans ağırlığı tanımlayın.
   1. Toplam referans ağırlığının, tanımlanan protokolde mavi tutucuyu, mavi matı, saksıyı, toprağı ve bitki biyokütlesini destekleyen konveyör bandında bulunan diskin, ek parçanın ağırlığını içerdiğinden emin olun.
   2. Tartım ve sulama adımı sırasında evapotranspirasyonun doğru ölçümü için referans olarak boş kaplar hazırlayın. Ek olarak, bitki biyokütle ağırlığını düzeltmek için ek saksılar hazırlayın.
5. 50 bitkiyi ölçmek için tüm fenotipleme protokolü süresi 215 dakika sürer (1^{. turda} 85 dakika ve 2^{. turda} 130 dakika).
6. Tüm bitkileri kontrol koşulları altında (tedaviden 1 gün önce) günlük olarak fenotipleyin ve daha sonra dinamik tepkileri izlemek ve indüklenen stresin erken ve geç aşamalarını değerlendirmek için stres tedavilerini indükleyin.

5. Her görüntüleme sensörü için ayarların yapılması

1. Kinetik klorofil floresan görüntüleme
   NOT: Kinetik klorofil floresan, abiyotik stresler de dahil olmak üzere farklı çevresel koşullara yanıt olarak bitkilerin fotosentetik kapasitesini araştırmak ve fotokimya ve ısı dağılımının (fotokimyasal olmayan süreç) kuantum verimliliği hakkında değerli bilgiler sağlamak için kullanılır.
   1. Farklı tedaviler altındaki bitkilerin tepkilerini ayırt etmek için kısa bir ışık protokolü kullanarak ışığa adapte olmuş bitkilerde klorofil floresan ölçümü yapın.
   2. ⁵⁰⁰ μmol·^m-2·^s-1'de soğuk beyaz LED'lerle (6500 K) donatılmış adaptasyon tünelinde 35 bitkiyi ışık altında 5 dakika boyunca iklimlendirin.
      NOT: Klorofil floresan görüntüleme, bitkilerin fotosentetik kapasitelerindeki değişiklikleri izlemek için kullanılan ışık adaptasyonundan sonraki ilk ölçümdür.
   3. Tesis boyutuna ve gerekli ışık yoğunluklarına göre önceden tanımlanmış protokolü seçin ve optimize edin.
   4. Optimum sinyal-gürültü oranına sahip güçlü bir sinyalin elde edilmesini sağlamak için kamera ve ışık yoğunluğu ayarları dahil olmak üzere ölçüm ayarlarını optimize edin.
      1. Deklanşör (pozlama süresi, flaşların ölçülme süresi) ve hassasiyet (kameranın elektrik kazancı) gibi kamera ayarlarını yapın. Deklanşörü 2 ms'de ve hassasiyeti 'de kullanın.
         NOT: Bu değerler, kanat boyutuna ve şekline ve kanopinin üst kısmı ile görüntüleme sensörü arasındaki tanımlanan mesafeye göre ayarlanmıştır.
      2. Aktinik ışık yoğunluğunu 500 μmol·^m-2·^s-1'de ayarlayın ve doygunluk darbesini aktinik ışıktan en az 6-7 kat daha yüksek olan 3200 μmol·^m-2·^s-1'e ayarlayın.
   5. Işık kararlı durumundaki (Lss) (aşağıda açıklanmıştır) parametreleri ölçmek için, ışığa uyum sağlayan bitkiler, ışık adaptasyon tünelindeki ölçümlerden önce 5 dakika boyunca.
   6. Işığa adapte olmuş bitkilerin kararlı durum fotosistem II (PSII) kuantum verimini tahmin etmek için kısa ışık protokolünü seçin (Şekil 3) ve protokolü aşağıdaki gibi ayarlayın.
      NOT: Protokol süresi bitki başına 10 sn idi.
      1. Işıktaki kararlı durum floresansını (F_t_Lss aka. ölçmek için 500 μmol·^m-2·^s-1'de soğuk beyaz aktinik ışığı 3 saniye boyunca açarak ölçüme başlayın. F_t')
      2. Işıkta (F_m_Lss aka. F_m')
      3. Aktinik ışığı kapatın, ardından PSII'nin karanlıkta 800 ms gevşemesini sağlamak ve ışıkta kararlı durum minimum floresansını (F_o_Lss aka) ölçmek için uzak kırmızı ışığı (735 nm) açın. F_o').
   7. Göreli parametreleri hesaplamak için, arka planı çıkaran ve ilgili parametreleri çıkaran veri analizörü yazılımını kullanın.
      NOT: Kullanılan protokolden çıkarılan parametreler şunlardır: F_v/F_m_Lss olarak belirlenen ışık kararlı durumunda ışığa uyarlanmış numunenin PSII fotokimyasının maksimum verimliliği. F_v'/F_m', fotosistem II kuantum verimi veya ışık kararlı durumunda fotosistem II'nin çalışma verimliliği QY_Lss olarak tanımlanır. φ_PSII = F_q'/F_m' ve PSII'deki (oksitlenmiş QA) açık reaksiyon merkezlerinin fraksiyonu qL_Lss = (F_q'/F_v') x (F₀'/F_t') olarak belirlenir.
2. Termal Kızılötesi (IR) görüntüleme
   NOT: Termal IR görüntüleme, gerçek kanopi sıcaklığının non-invaziv ölçümü için kullanılır, böylece farklı stoma düzenlemeleri belirlenir. Termal IR görüntüleme ünitesinde, yandan görünümden kanopi sıcaklığını ölçmek için robotik kol üzerine yanal olarak bir termal kamera monte edilmiştir.
   1. Görüntü işleme sırasında arka plan sıcaklığının görüntülenen nesnenin sıcaklığına göre kontrastını artırmak için, kontrastı artırmak için termal kameranın karşı tarafında otomatik olarak kontrol edilen ısıtmalı bir duvar kullanın. Duvar sıcaklığını, görüntüleme ünitesindeki hava sıcaklığının 8 °C üzerinde ayarlayın.
      NOT: Termal görüntüler, satır tarama modu³⁵ kullanılarak karanlıkta elde edilmiştir.
   2. Görüntü elde edildikten sonra, RGB yandan görünüm verilerine dayalı bir bitki maskesi oluşturun ve bunu görüntü analizinde termal verilerle birlikte kayıt yapmak için kullanın. Bu, taranan nesnenin hassas bir şekilde tanımlanmasını sağlarken, bitki tutucu gibi arka plan girişimini ortadan kaldırır.
   3. Tüm deney boyunca dalgalanan çevresel koşulların etkisini önlemek için, parametre sıcaklık farkını (delta T veya ΔT) hesaplayın.
      NOT: Delta T (ΔT), yaprak yüzeyinin ölçülen sıcaklığı (bitkinin tespit edilen tüm yüzeyinden elde edilen tüm piksellerin ortalaması) ile görüntüleme kutusunun içindeki ortam havası sıcaklığı arasındaki fark olarak tanımlanır.
3. RGB görüntüleme
   NOT: RGB görüntüleme, bitki morfolojisinin, mimarisinin derinlemesine analizi ve renk indeksi özelliklerinin çıkarılması için kullanıldığı 400-700 nm görünür aralıktaki ışığı algılayan görsel atalet sistemi (VIS) kameralarına dayanmaktadır.
   1. Görüntüleme ünitesi, tepsinin hassas bir şekilde konumlandırılması için döner bir tabla içerir ve aynı zamanda yandan görünümler için çok açılı görüntülemeye izin verir.
   2. Bitkiyi çizgi tarama modunda (RGB1) ve üstten görünüm görüntülemede anlık görüntü modunda (RGB2) çekilen üç açıdan (0°, 120° ve 240°) yakalamak için yandan görünüm görüntülemeye dayalı RGB görüntülemeyi ayarlayın.
   3. Her iki kamera da LED tabanlı bir ışık kaynağına sahiptir, bu da görüntülenen bitkinin homojen bir şekilde aydınlatılmasını sağlar ve böylece morfolojik ve renk özelliklerini doğru bir şekilde belirler.
   4. Veri analizörü yazılımını kullanarak hesaplanan parametreleri ayıklayın.
   5. Yan ve üst görünümlere dayalı ek parametreler için bitki hacmini (dijital biyokütle) ^{hesaplayın36}:
      
   6. Göreceli büyüme oranını (RGR) ^{hesaplayın37}:
      
      Burada T_n ve T_n+1 zaman aralığını (gün) gösterir.
4. Hiperspektral görüntüleme
   NOT: Hiperspektral görüntüleme, bitkilerin spektral yansımasının görselleştirilmesi için kullanılır. Yaprak yansımasındaki değişiklikler, verilen bitkinin farklı fizyolojik durumunun göstergeleridir.
   1. 380-900 nm aralığında görünür-yakın kızılötesi (VNIR) hiperspektral kamera ve 900-1700 nm aralığında kısa dalga boylu kızılötesi kamera (SWIR) ile ışık spektrumlarının görünür kısmındaki kanopi yansımasını ölçmek için hiperspektral görüntüleme sensörünü kullanın.
   2. Kameralar, XZ alanı boyunca hareket eden görüntü alımı sırasında homojen ve spektral olarak uygun numune aydınlatması için uygulanmış bir halojen tüp ışık kaynağına (600 W) sahip bir robotik kol üzerine monte edilmiştir.
   3. Her iki kamera da satır tarama modunda çalışır ve ışık yalıtımlı bir görüntüleme kutusuna yerleştirilir.
   4. Her ölçüm turundan önce iki kalibrasyon ölçümü yapın (otomatik olarak): karanlık akım kalibrasyonu ve spektral yansıma Teflon standardını kullanarak radyometrik kalibrasyon.
   5. Karanlık akım gürültüsünü gidermek için karanlık kalibrasyon görüntüsü ham ve beyaz kalibrasyon görüntüsünden çıkarılır. Ardından, çıkarmadan sonra ham görüntüyü beyaz kalibrasyon görüntüsüne bölerek son hiperspektrali oluşturun.

6. Verileri dışa aktarma ve Görüntü analizi

1. Görüntü işleme boru hattının otomatik ekstraksiyonu, arka plan çıkarması ve Bitki Maskesi segmentasyonu için veri analizörü yazılımını kullanın (Şekil 2B).
2. Yazılım, maske uygulamasının, bitkilerin arka planlarından izole edildiği arka plan çıkarmanın ve parametre hesaplamasının RGB görüntüleme³⁸ ve termal görüntüleme²⁰ için açıklandığı gibi işlendiği tam otomatik bir analiz gerçekleştirir.
3. Ölçülen ve hesaplanan parametreleri, RGB görüntü tarafından oluşturulan Bitki Maskesi ve Tepsi Maskesi tarafından tanımlanan bitkiye özgü piksellerden çıkarın.
4. Görüntüler tam olarak seçilmemişse, daha sonraki gelişim aşamalarında bitki örtüsü yeşilliğindeki değişiklikler veya stres tedavisinin etkisi nedeniyle meydana gelebilirse, yazılımda yerel veri analizi bölümünü açın ve her sensöre bağlı olarak veri analizörü yazılımında Bitki Maskesi ayarlarını yeniden ayarlayın.
5. Klorofil floresan görüntü işlemede, klorofil floresan Bitki Maskesi ayarları analiz parametrelerini ayarlayın (Ek Şekil 4).
   1. Eşiği Doğru olarak ayarlayın, bu da bitki segmentasyonunun otomatik olarak gerçekleştirildiği anlamına gelir.
   2. Maske Çerçevesi İndeksi'ni Yanlış olarak ayarlayın, yani Bitki Maskesi algılaması için Zaman-Görsel çerçevesi klorofil floresan protokolünde tanımlandığı gibi kullanılır.
6. Termal görüntü işlemede, Bitki Maskesi analizi için parametreleri ayarlayın (Ek Şekil 5).
   1. Nesne Maskesi Oluşturma için otomatik eşiği False olarak ayarlayın.
   2. Analiz için kullanılmak üzere RGB yan görüntüsünden maskeyi True olarak ayarlayın.
7. RGB görüntü işlemede, türe ve gelişim aşamasına bağlı olarak Bitki Maskesi ayarları analiz parametrelerini (Ek Şekil 6 ve Ek Şekil 7) ayarlayın.
   1. Nesne maskesi oluşturmanın tanımı olan ve kullanılan renk bileşenini (Kırmızı, Yeşil, Mavi bileşen) tanımlayan 4*G-3*BR formülünü seçin.
      NOT: Bu standart formül ve diğer ayarlar, kullanılan kamera türüne (Üstten veya boyuta görünüm), uygulanan işleme ve farklı çeşitlere bağlı olarak değişebilir.
   2. Geliştirilmiş yeşil kanala sahip gri tonlamalı görüntüyü, tesisin kapladığı yüzeyi belirleyen ikili bir görüntüye dönüştürmek için kullanılan Eşiği ayarlayın.
   3. Gürültüyü ve geçersiz pikselleri azaltmak için kullanılan Medyan Filtre Boyutunu ayarlayın ve eksik olanları doldurun.
   4. Analize dahil edilecek nesnenin piksel cinsinden minimum boyutunu ayarlayın.
   5. Maske nesnelerindeki deliklerin Minimum Boyutu'nu piksel cinsinden, genellikle onlarca piksel olarak ayarlayın. Bu değerden daha küçük olan delikler kapatılır ve nesne piksellerinin içine alınır.
   6. Her pikseldeki RGB değerlerini normalleştirmek için Yansıma Azaltmayı Kullan'ı Doğru olarak ayarlayın.
   7. Bitki maskesinden fazla/az pozlanan pikselleri kırpmak için Kötü Maruz Kalan Noktaları Atla'yı Doğru olarak ayarlayın (örneğin, yüzey yansımalarının veya gürültünün sinyalden daha büyük olduğu koyu piksellerin ihmal edilmesi).
8. Stres tepkileri ve bitki yaşlanması ile ilgili renk değişiklikleri hakkında bilgi sağlamak için veri analizörü yazılımını kullanarak RGB'den analiz edilen segmentasyon ayarlarını renklendirin.
   NOT: Yeşillik, bitki gelişiminin tüm aşamalarını temsil eden önceden tanımlanmış bir renk aralığı kullanılarak tahmin edilir. Bitki yüzeyine karşılık gelen tüm piksellerden gelen renk kanallarındaki yoğunluk, renk segmentasyonu için bir kaynak renk haritası olarak kullanılmak üzere gruplandırıldı ve kümelendi.
   1. İşlenmiş RGB görüntüsünü (kaldırılan arka plan), renk haritasını - belirli analiz için tonların listesini, yazılımda bir girdi olarak sağlayın.
   2. Tarafsız sonuçlar elde etmek için, bir "eğitim" veri seti kullanarak ton seçimi yapın ve farklı gelişim aşamaları ve tedavileri seçin.
      NOT: Analiz, bu eğitim veri kümesindeki her görüntünün her pikselinin R, G ve B değerlerini kaydeder.
   3. Her kanal için 0-255 arasında değişen renk tanımı çıktısı için yazılımı kullanarak ton sayısını tanımlayın (6 ton seçin).
   4. Veri çözümleyici yazılımında oluşturulan tonların listesini sağlayın (Renkler).
9. Hiperspektral görüntü işlemede, elde edilen hiperspektral verileri, radyometrik ve karanlık gürültü kalibrasyonu, arka plan çıkarma ve bitki maskesi segmentasyonu içeren hiperspektral analizör yazılımında uygulanan piksel piksel analizi kullanarak işleyin. Daha fazla analiz için ortalama spektrumları ve bitki örtüsü indekslerini kullanın.
10. VNIR Hiperspektral kamera tarafından çekilen VNIR görüntüsünden hiperspektral görüntüden veri çıkarma için maskeyi oluşturun. SWIR hiperspektral taraması için, SWIR analizine dayalı bir bitki maskesi oluşturun.
    1. VNIR Bitki Maskesinde, R'nin belirli bir dalga boyundaki yansıtma değerini temsil ettiği görüntüleri görselleştirmek için 1.2*(2.5*(R740-R672)-1.3*(R740-R556)) formülünü kullanın (Ek Şekil 8).
    2. SWIR Bitki Maskesinde, görüntüleri görselleştirmek için görüntü işlemede (R960-R1450)-(R960-R1200) formülünü kullanın (Ek Şekil 9).

7. Tartma ve sulama

1. Tartım ve sulama prosedürü sırasında ağırlığı (sulamadan önce) saklayın. Daha sonra sulama uygulayın ve sulamadan sonra da ağırlığı koruyun.
2. Tepsileri referans modunda sulayın - her tepsinin veritabanında saklanan ve her zaman sulandığı bir referans değeri vardı. Tedaviye göre referansı belirleyin.

8. Veri analizi

1. Verileri ANOVA ve Shapiro testi kullanarak analiz edin.
2. (dplyr), (tidyverse), (rstatix) ve (ggpubr) paketlerini kullanarak R studio'da (sürüm 4.2.3) Pairwise Wilcox testi ile farklı tedaviler arasında ikili karşılaştırmalar yapın.
   NOT: Görüntü analizi, veri analiz yazılımı kullanılarak otomatik olarak yapılmıştır. Görüntü elde etmenin daha fazla analizi için sensöre özel veri analizörü yazılımı kullanın.

Bu çalışmada, patatesin (cv. Lady Rosetta) tek ve birleşik stres altındaki morfolojik ve fizyolojik tepkilerini araştırmak için otomatik görüntü tabanlı fenotipleme kullanılmıştır. Uygulanan yaklaşım, yumru başlangıç aşamasında stres indüklendiğinde bitkilerin yüksek uzaysal-zamansal çözünürlükte dinamik tepkilerini göstermiştir. Stresin erken ve geç evrelerini değerlendirmek için sonuçlar 3 zaman periyodu ([0-5 günlük fenotipleme (DOP)], [6-10 DOP] ve [11-15 DOP]) olarak sunuldu (Şekil 1). 0 DOP'a kadar, tüm bitkiler kontrol koşulları altında (C), daha sonra su basması stresi (W) ve ısı stresinin (H) uygulandığı 1-5 DOP arasında yetiştirildi. Böylece, yanıtlar aşağıdaki gibi gözlendi: (i) 0-5 DOP'ta, başlangıçtaki ısı ve su basmasını gösterdi; (ii) 6-10 DOP'ta erken kuraklığı yansıtan (D) ve birleşik ısı ve kuraklık (HD) gözlendi ve (iii) 11-15 DOP'da geç sıcaklık, kuraklık ve birleşik ısı + kuraklık + su basması (HDW) streslerini gösterdi. Su basmasından geri kazanım 6-10 DOP ve 11-15 DOP'ta gözlendi.

Morfolojik özellikleri
Farklı gerilmelerin ve kombinasyonların yer üstü bitki büyümesi üzerindeki etkisini belirlemek için RGB görüntüleme uygulanmıştır. Şekil 4'teki sonuçlar, ısıl işlem ve su basması stresinin (0-5 DOP), kontrole kıyasla tesis hacminde ve RGR'de bir azalmaya neden olduğunu göstermektedir. 6-10 DOP sırasında, kontrol tesislerinin bitki hacmi ve RGR'si sürekli olarak artarken, ısı, birleşik ısı, kuraklık ve su basması altında, bitki hacmindeki bu artış açıkça azalmıştır (Şekil 4A). Bitkiler su basması stresine çok duyarlı olduklarından, RGR'de bir azalma gözlenmiştir (Şekil 4B). SRWC'nin% 20'de tutulduğu geç kuraklık stresi (11-15 DOP) sırasında, kontrole kıyasla RGR'de net bir azalma gözlenmiştir. Bununla birlikte, kombine HDW'nin geç fazında, su basması tedavisinin uygulanması, stresin son gününde RGR'de bir artışa neden oldu.

Fizyolojik özellikler
Strese daha fazla tepki vermek için yapısal ve fizyolojik fenotipleme kombinasyonu uygulandı. Birden fazla görüntüleme sensörünün kullanılması, stresin erken evresinde fizyolojik tepkilerin belirlenmesini sağlar. Klorofil floresan verilerinin daha ileri analizi, su basmasının, Fv'/Fm' (Fv/Fm_Lss) 0-5 DOP ve 6-10 DOP'ta önemli ölçüde azaldığı fotosentetik verimliliği olumsuz etkilediğini gösterdi, ancak Fv'/Fm'nin biraz arttığı 11-15 DOP'ta bir toparlanma tepkisi gözlendi (Şekil 5A). Geç stres fazında (11-15 DOP), kuraklık ve birleşik ısı ve kuraklıkta Fv' / Fm' değerinde bir azalma gözlendi. Su ile tıkanmış tesislerde, bitkilerin (QY_Lss diğer adıyla φPSII) işletme verimliliği, 0-5 DOP ve 6-10 DOP'taki diğer işlemlere kıyasla önemli ölçüde daha düşüktü, ancak 11-15 DOP'ta hafif bir artış oldu, bu da bitki geri kazanımını gösterdi (Şekil 5B). Ayrıca, PSII'nin korunmasına katkıda bulunan verimliliği düzenlemedeki farklı mekanizmalar, hafif kararlı durumda (qL_Lss) PSII'deki açık reaksiyon merkezlerinin fraksiyonu hesaplanarak belirlenmiştir (Şekil 5C). Sadece kuraklık altında, muhtemelen fotoinhibisyon nedeniyle qL'de bir artış gözlendi.

Bu bulgular, stresler altında altta yatan farklı mekanizmaları yansıtan IR verileriyle uyumluydu (Şekil 6). Su bastığında deltaT'de (ΔT) bir artış gözlendi ve bu da gaz döviz kurunu düşürdü. Geç kuraklık ve birleşik ısı ve kuraklık stresleri altında, ΔT'deki artış, aşırı su kaybını önlemek için birincil tepkilerden biri olarak kabul edilen stomaların kapanmasından kaynaklanıyordu. Öte yandan, terleme verimliliğini artırmak ve yaprak yüzeyini soğutmak için stomalar açılırken ısıl işlemler altında ΔT'de bir azalma gözlenmiştir.

Hiperspektral verileri araştırarak, yaprak yansıma indekslerini değerlendirmek için hiperspektral VNIR verilerinden, klorofil içeriğinin bir göstergesi olarak NDVI ve fotosentez etkinliğinin bir göstergesi olarak PRI dahil olmak üzere iki parametre seçildi. Sonuçlar, morfolojik özelliklerde gözlenen azalmaya bağlı olarak sadece su basması altında NDVI ve PRI'de bir azalma olduğunu göstermiştir (Şekil 7A, B). Ayrıca, bitkilerdeki su içeriğini değerlendirmek için kullanılan SWIR hiperspektral verilerinden, 0-5 DOP sırasında su basmasında su indeksinde bir artış gözlenmiştir (Şekil 7C). Bununla birlikte, ısıl işlemler altında, su indeksinin kontrolden daha düşük olduğu durumlarda zıt bir tepki gözlenmiştir. Bu bulgular, RGB Üstten görünümün renk segmentasyonundan bitki örtüsünün incelenmesine uygundu. Tonların oranındaki değişiklikler, zaman içindeki stres tepkilerini gösterir (Şekil 8). Yeşillenme indeksi, kuraklık altında pigment içeriğinde bir azalma ve geç stres fazında kombine HDW ve su basması işleminden kademeli iyileşme gösterdi. Bu nedenle, çoklu görüntüleme sensörlerinin kullanılması, morfo-fizyolojik özelliklerin korelasyonunu yansıttı ve abiyotik stresler altında genel bitki performansının değerlendirilmesini sağladı.

Şekil 1: İn vitro kesimlerin nakledilmesinden sonraki günlerde bitkilerin yaşı da dahil olmak üzere farklı tedavilerin uygulanma zaman çizelgesi. Fenotiplemenin (DOP) 0. günü kontrol (C) koşulları altında ölçüldü ve daha sonra farklı stresler farklı sürelerde indüklendi. 1-5 DOP arasında su basması (W) gerilimi uygulanmış ve ısıl işlemin ilk tepkisi (H) elde edilmiştir. Takip eden günlerde, kuraklık stresi (D) ve birleşik ısı ve kuraklık stresinin (HD) başlangıç aşamasının sunulduğu 6-10 DOP sunuldu. 11-15 DOP sırasında, bitkilerin kuraklık ve ısıl işlemlerin geç aşamasına tepkisi ve 1 gün boyunca HD'ye (HDW) su basması uygulaması yansıtıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Fenotipleme protokolünü ve veri analizini özetleyen şema. (A) Fenotipleme protokolüne genel bakış. Bitkiler, FS-WI büyüme odasındaki (PSI) kontrollü koşullardan fenotipleme sistemine taşınır. Bitkiler, ölçümlerden önce 500 μmol.m-2.s-1'de 5 dakika boyunca ışık adaptasyon odasında ışığa alıştırıldı. Morfolojik ve fizyolojik özellikleri belirlemek için çoklu görüntüleme sensörleri kullanıldı, ardından ağırlıklandırma ve sulama istasyonu geldi. Arıtmaya bağlı olarak, bitkiler 22 °C/19 °C veya 30 °C/28 °C'de kontrollü koşullara geri yerleştirildi. (B) Her görüntüleme sensöründen görüntü işleme boru hattının otomatik olarak çıkarılması ve segmentasyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Klorofil floresan görüntüleme için kısa ışık protokolüne genel bakış. Ölçüm protokolü, ışıktaki kararlı durum floresansını (Ft_Lss) ölçmek için soğuk beyaz aktinik ışığı açarak ve ardından ışıktaki kararlı durum maksimum floresansını (Fm _Lss) ölçmek için bir doygunluk darbesi uygulayarak başladı. Aktinik ışık kapatıldı ve ışıktaki kararlı durum minimum floresansını (Fo_Lss) belirlemek için Uzak kırmızı ışık açıldı. Protokolün süresi bitki başına 10 sn idi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Morfolojik değerlendirme için kullanılan RGB görüntüleme. (A) RGB üst ve yan görünüm alanından hesaplanan bitki hacmi. (B) Yumru başlatma aşamasında nispi büyüme oranı (RGR). Veriler, standart sapma (n = 10) ± ortalama değerleri temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Işığa adapte olmuş bitkilerde klorofil floresan görüntüleme. (A) Işık kararlı durumunda (Fv / Fm_Lss) ışığa uyarlanmış numunenin PSII fotokimyasının maksimum verimliliği. (B) Fotosistem II kuantum verimi veya ışık kararlı durumunda fotosistem II'nin çalışma verimliliği (QY_Lss). (C) Hafif kararlı durumda (oksitlenmiş QA) PSII'deki açık reaksiyon merkezlerinin fraksiyonu (qL_Lss). Veriler, standart sapma (n = 10) ± ortalama değerleri temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Termal IR görüntülerinden çıkarılan kanopi ortalama sıcaklığı ile hava sıcaklığı (ΔT) arasındaki farkı hesaplamak için termal IR görüntüleme kullanıldı. Veriler, standart sapma (n = 10) ± ortalama değerleri temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Bitki örtüsü indekslerini ve su içeriğini belirlemek için hiperspektral görüntüleme. (A) Normalleştirilmiş Fark Bitki Örtüsü İndeksi (NDVI). (B) VNIR görüntülemeden hesaplanan Fotokimyasal Yansıma İndeksi (PRI). (C) SWIR görüntülemeden hesaplanan su indeksi. Veriler, standart sapma (n = 10) ± ortalama değerleri temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: Farklı tedaviler altındaki bitkiler için yeşillenme indeksi. Görüntü işleme, orijinal RGB görüntüsünün tanımlanmış 6 renk tonundan oluşan bir renk haritasına dönüştürülmesine dayanır. Veriler, standart sapma (n = 10) ± ortalama değerleri temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Fenotipleme (DOP) günlerinde ölçülen ışık yoğunluğu. 09:00 - 12:35 arasındaki ölçümlerin süresi. LI_Buff, serada dağıtılan 5 ışık sensöründen gelen medyan verileri ifade eder. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: Fenotipleme (DOP) günlerinde ölçülen bağıl nem (RH). 09:00 - 12:35 arasındaki ölçümlerin süresi. RH_Buff, serada dağıtılan 5 nem sensöründen gelen medyan verileri ifade eder. RH2, adaptasyon odasındaki bağıl nemi ifade eder. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 3: Fenotipleme (DOP) günlerinde ölçülen sıcaklık. 09:00 - 12:35 saatleri arasındaki ölçümlerin süresi, serada dağıtılan 5 sıcaklık sensöründen gelen medyan verileri ifade T_Buff. T2, adaptasyon odasındaki sıcaklığı ifade eder. T3, ısıtma duvarının sıcaklığını ifade eder. T4, termal IR görüntüleme ünitesindeki sıcaklığı ifade eder. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 4: Klorofil floresan görüntüleme sensörlerinde bitki maskesi analizi için ayarlanan parametreleri gösteren veri analizörü yazılımından alınan ekran görüntüsü. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 5: Termal kızılötesi görüntüleme sensörlerinde bitki maskesi analizi için ayarlanan parametreleri gösteren veri analizörü yazılımından ekran görüntüsü. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 6: RGB 1 yandan görünüşlü görüntüleme sensörlerinde bitki maskesi analizi için ayarlanan parametreleri gösteren veri analizörü yazılımından ekran görüntüsü. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 7: RGB2 üstten görünüm görüntüleme sensörlerinde bitki maskesi analizi için ayarlanan parametreleri gösteren veri analizörü yazılımından ekran görüntüsü. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 8: VNIR görüntüleme sensörlerinde bitki maskesi analizi için ayarlanan parametreleri gösteren veri analizörü yazılımından ekran görüntüsü. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 9: SWIR görüntüleme sensörlerinde bitki maskesi analizi için ayarlanan parametreleri gösteren veri analizörü yazılımından ekran görüntüsü. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarlar, bu yazıda rapor edilen çalışmayı etkilemiş gibi görünebilecek bilinen hiçbir rekabet eden mali çıkarları veya kişisel ilişkileri olmadığını beyan ederler.