Method Article

Canlı Hücrelerde Hiperozmotik Strese Yanıt Olarak İntrinsik Olarak Düzensiz Bölgelerin Yapısal Duyarlılığının FRET Kullanılarak Tahmini

DOI:

10.3791/66275

⸱

January 12th, 2024

 ,  , 
1Departamento de Bioquímica, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doğası gereği düzensiz bölgeler (IDR'ler), çevresel değişikliklere yanıt olarak konformasyonlarını değiştiren esnek protein alanlarıdır. Topluluk floresan rezonans enerji transferi (FRET), farklı koşullar altında protein boyutlarını tahmin edebilir. Hiperozmotik stres altında yaşayan Saccharomyces cerevisiae hücrelerinde IDR yapısal duyarlılığını değerlendirmek için bir FRET yaklaşımı sunuyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kendinden düzensiz bölgeler (IDR'ler), önemli hücresel süreçlere katılan protein alanlarıdır. Stres koşulları sırasında, hücresel ortamın fizikokimyasal özellikleri değişir ve IDR'lerin konformasyonel topluluğunu doğrudan etkiler. IDR'ler doğası gereği çevresel bozulmalara karşı hassastır. Hücrenin fizikokimyasal özelliklerinin IDR'lerin konformasyonel topluluğunu nasıl düzenlediğini incelemek, işlevlerinin çevresel kontrolünü anlamak için gereklidir. Burada, hiperozmotik stres koşullarına yanıt olarak canlı Saccharomyces cerevisiae hücrelerinde IDR'lerin yapısal duyarlılığını ölçmek için adım adım bir yöntem açıklıyoruz. Herhangi bir ozmolit içeren hücrelere uygulanan hiperozmotik stresin aşamalı bir artışı sırasında IDR'lerin küresel boyutlarının nasıl değiştiğini tahmin etmek için topluluk floresan rezonans enerji transferinin (FRET) kullanımını sunuyoruz. Ek olarak, floresan ölçümlerini işlemek ve farklı IDR'ler için yapısal hassasiyeti karşılaştırmak için bir komut dosyası sağlıyoruz. Araştırmacılar bu yöntemi izleyerek, IDR'lerin değişen ortamlar üzerine karmaşık hücre içi ortamda geçirdikleri konformasyonel değişiklikler hakkında değerli bilgiler edinebilirler.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kendinden düzensiz bölgeler (IDR'ler) hücresel süreçlerde kritik bileşenlerdir1. Yapılandırılmış alanlarla kombinasyon halinde, IDR'ler protein fonksiyonları için gereklidir. IDR'lerin amino asit bileşimi önyargılıdır ve esas olarak yüklü, hidrofilik ve küçük kalıntılarla temsil edilir. Bu özellik nedeniyle, IDR'ler düşük karmaşıklık alanları 2,3 olarak kabul edilir. Çok sayıda IDR, öncelikle bu bölgelerin patolojik durumlarda, özellikle nörodejeneratif hastalıklarda çok önemli bir rol oynaması nedeniyle dikkat çekmiştir. Bu tür hastalıklar, nöronlarda IDR'lerin kendi kendine toplanması ve ardından hücre dışı veya hücre içi birikmesi ile karakterize edilir4. Bu tür IDR'lerin örnekleri arasında Alzheimer hastalığında amiloid-β (Aβ), Huntington hastalığında huntingtin (HTT) ve amyotrofik lateral skleroz ve frontotemporal demansta sarkomda (FUS) kaynaşmış TAR DNA bağlayıcı protein-43 (TDP-43)bulunur 4. Hastalık bağlamında IDR'lerin yapısal yeniden düzenlemelerinin incelenmesi, floresan rezonans enerji transferi (FRET) dahil olmak üzere spektroskopik yöntemlerle önemli ölçüde geliştirilmiştir.

IDR'lerin hidrofilik ve genişletilmiş doğası, onları çözelti ortamının fizikokimyasal özelliklerindeki değişikliklere karşı son derece hassas hale getirir5. IDR'lerin konformasyonel topluluğunun çevre tarafından değiştirilme derecesine yapısal duyarlılık 5,6,7 denir. IDR'lerin konformasyonunu ve dinamiklerini incelemek için dairesel dikroizm (CD) ve küçük açılı X-ışını saçılımı (SAXS)8,9 dahil olmak üzere farklı teknikler kullanılabilir. Ne yazık ki, CD ve SAXS büyük miktarlarda saflaştırılmış protein gerektirir, bu nedenle hücrelerdeki çalışmalar için uygun değildirler. Buna karşılık, FRET, bir IDR'yi spesifik olarak etiketleyen iki floresan molekülünün floresan yoğunluğunu ölçen bir tekniktir, yani canlı hücreler10 gibi karmaşık karışımlarda izlenebilirler. Canlı hücrelerdeki IDR'lerin yapısal duyarlılığının dinamik olarak ölçülmesi, çevrenin düzensiz proteomun konformasyonunu ve işlevini nasıl düzenlediğini anlamak için gereklidir.

FRET, IDR'lerin yapısal duyarlılığının yanı sıra canlı hücrelerdeki küresel ve çok alanlı proteinlerin ölçülmesi için güçlü bir yöntemdir. Yöntem, FRET çifti olarak bilinen iki floresan protein (FP) arasına sıkıştırılmış bir IDR'den oluşan bir yapı gerektirir. Bu protokol için, IDR'lerin duyarlılığı6 ile ilgili önceki bir çalışmada bildirilen diğer FP'lere kıyasla, geniş dinamik aralıkları nedeniyle donör FP olarak mCerulean3 ve alıcı FP olarak Sitrin kullanılmasını öneriyoruz. FRET daha önce farklı hücresel bağlamlarda bir bitki IDR'sinin yapısal hassasiyetini ölçmek için kullanılmıştır6. Ek olarak, bu teknik, hem in vitro hem de in vivo olarak farklı araştırma grupları tarafından IDR'lerin genel protein boyutlarını karakterize etmek için kullanılmıştır 5,11.

Burada, canlı maya (Saccharomyces cerevisiae) hücrelerinde IDR'lerin yapısal duyarlılığını incelemek için topluluk FRET yöntemini açıklıyoruz. AtLEA4-5 adlı bir tesis IDR'sine dayanan temsili sonuçları gösteriyoruz. AtLEA4-5 çözelti içinde düzensizdir, ancak makromoleküler kalabalıklaşma indüklendiğinde α-sarmal halinde katlanır in vitro12. AtLEA4-5, bu yöntem için iyi bir referans modeldir, çünkü nispeten küçüktür (158 kalıntı), düzensiz ve in silico ve in vitro 6,12 bildirildiği gibi çevresel bozulmaya duyarlıdır. Burada sunulan yöntem, maya hücrelerinin büyümesi kolay olduğu ve tedavinin küçük hacimlerde uygulandığı için yüksek verimli yaklaşımlar için ölçeklendirilebilir. Ek olarak, protokolde yapılan küçük değişiklikler, bakteri ve bitki hücreleri gibi diğer hücresel sistemlere de uygulanabilir6. Protokol, çoğu araştırma kurumunda bulunan bir ekipman olan floresan modlu bir mikroplaka okuyucuya erişimi olan herhangi bir moleküler biyoloji laboratuvarında gerçekleştirilebilir.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Plazmit yapısı

  1. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile istenen IDR'yi kodlayan açık okuma çerçevesini (ORF) yükseltin. ORF, floresan proteinleri kodlayan genler tarafından kuşatılacağından durdurma kodonunu dahil etmeyin. Amplifikasyon için, SacI (5') ve BglII (3') kısıtlama bölgelerine sahip primerler tasarlayın.
    NOT: Temsili sonuçlar bölümü için, seçilen IDR olarak AtLEA4-5'i kullandık. AtLEA4-5'in ORF'sini pTrc99A-AtLEA4-5 plazmid12'den çoğalttık.
  2. ORF PCR ürününü SacI ve BglII enzimleri13 ile ardışık kısıtlama ile sindirin.
  3. Ticari plazmid pDRFLIP38-AtLEA4-5'i (#178189) Addgene'den (https://www.addgene.org/178189/) edinin.
  4. AtLEA4-5 ORF'yi pDRFLIP38-AtLEA4-5 plazmidinden çıkarmak için SacI ve BglII enzimlerini kullanarak ardışık bir kısıtlama yapın ve FRET çifti13'ü içeren açık bir plazmit bırakın.
  5. Bir agaroz jel elektroforezinden jel geri kazanımı kullanarak sindirilmiş DNA parçalarını saflaştırın14. DNA ligaz15 kullanarak kısıtlı fragmanları bağlayın.
  6. Klonlama reaksiyonunu yetkin Escherichia coli hücrelerine (DH5α veya ilgili suşlar) dönüştürün ve 50 μg / mL ampisilin16 içeren Luria-Bertani (LB) plakalarını seçin. Gece boyunca (AÇIK) 37 °C'de büyütün.
  7. PCR17 ile yeni bir plaka ve genotipte en az beş dönüştürülmüş koloniyi izole edin ve büyütün. Standart miniprep yöntemlerini kullanarak plazmit DNA'sını pozitif dönüştürülmüş bir koloniden saflaştırın18.
  8. Aparoz jel elektroforezi19 kullanarak plazmit DNA'nın ekstraksiyonunu ve bütünlüğünü doğrulayın. Sanger sıralaması20'yi kullanarak yapının doğru klonlandığını doğrulayın.

2. Maya hücrelerinde plazmit ekspresyonu

NOT: Aşağıdaki adımları gerçekleştirmek için standart aseptik teknikleri kullanın. Bir kültür laminer akış başlığı veya çakmak kullanın.

  1. Bir dizi S. cerevisiae BJ5465 (ATCC: 208289) suşunu 3 mL Maya Pepton Dekstroz (YPD) ortamına aşılayın ve 30 °C ve 200 rpm'de AÇIK olarak büyütün.
    NOT: BJ5465, IDR'lerle çalışmak için önerilen proteaz eksikliği olan (CH1) bir türdür. Diğer S. cerevisiae suşları test edilebilir ve kullanılabilir.
  2. Gece boyunca doymuş (OD600 ~ 3-4) maya kültürünün 1 mL'sini 14.000 x g'da 1 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı pipetleyerek dikkatlice çıkarın.
  3. Tüpü hafifçe vurarak peleti 1 mL Tris-EDTA (TE) tamponunda (pH 7.5) yeniden süspanse edin. 14.000 x g'da 1 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice çıkarın.
  4. Pelet, pipetleme yoluyla 500 μL Tembel Kemik tamponunda (@ w/v PEG 3,350; 100 mM lityum asetat; 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA; pH 7.5) yeniden süspanse edin. Yeniden süspanse maya hücrelerine 25 μL haşlanmış (5 dakika 100 °C, ardından 5 dakika buz üzerinde soğutulur) somon sperm DNA'sı (2 mg/mL) ekleyin.
  5. Karışıma 100 ng plazmit DNA ekleyin ve iyice karıştırmayı sağlamak için karışımı 1 dakika vorteksleyin. Karışımı oda sıcaklığında 1-2 saat bekletin.
  6. Maya karışımını 42 °C'de 12 dakika ısıtın, ardından 12 dakika daha buz üzerinde soğutun. Tüpü 1 dakika boyunca 14 000 x g'de santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice çıkarın.
  7. Peletleri 1 mL TE tamponunda (pH 7.5) yeniden süspanse edin. Dönüştürülmüş hücrelerin 100 μL'sini, 15 g / L agar ile desteklenmiş urasil (SD-ura) plakaları içermeyen Maya Sentetik-bırakma Ortamı üzerine yerleştirin.
  8. Plakaları 30 °C'de 2-3 gün inkübe edin (Şekil 1). Yeni bir plakada en az beş maya dönüştürücü çizin ve ON büyütün.

3. Maya dönüştürücülerinin validasyonu

  1. 5 μL 20 mM NaOH'yi hafifçe kazıyarak ve ayrı PCR tüplerine yeniden süspanse ederek her dönüştürücü adayının küçük bir kısmını seçin.
  2. Hücreleri parçalamak ve DNA'yı çözeltiye bırakmak için numuneyi 99 °C'de 10 dakika boyunca bir termal döngüleyicide ısıtın. Bu adım, DNA şablonunu PCR için hazırlamak için çok önemlidir.
  3. Kaynatılmış numunenin 1 μL'sini, genotipleme için uygun primerleri ve PCR reaktiflerini içeren ayrı bir PCR reaksiyon karışımına aktarın. Aşağıdaki astarları kullandık: İleri astar: 5'-AAATATACCCCAGCCTCGATCTAGA-3'. Ters astar: 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGCG-3'.
  4. Bir PCR reaksiyonu kurun ve agaroz jel elektroforezi kullanarak doğru plazmitin varlığını doğrulayın. Daha fazla deney için bir dönüştürücü seçin.

4. FRET tahlili için maya hücre kültürünün hazırlanması

  1. Seçilen maya dönüştürücüsünün bir çizgisini 3 mL sıvı 1x SD-Ura ortamına aşılayın.
    NOT: Bu prosedürü laminer akış başlığı ve steril malzeme içinde yapın.
  2. Doygunluğa ulaşmak için en az 12 saat boyunca 30 °C, 200 rpm'de büyütün. OD600'ü ölçün. Büyüme OD600 = 1.0-2.0 arasında olmalıdır.
    NOT: OD600 1.0'dan düşükse, hücrelere büyümeleri için daha fazla inkübasyon süresi verin. OD600 2.0'ı aşarsa, devam etmeyin ve 4.1 adımından yeniden başlatın.

5. FRET testi için maya hücresi hazırlama

  1. Gece boyunca maya kültüründen 2 mL toplayın ve oda sıcaklığında 14.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı pipetleyerek dikkatlice çıkarın.
  2. Peletin 1 mL 50 mM 2- (N-Morfolino) etansülfonik asit (MES) tamponunda (pH 6) yeniden süspanse edilmesi.
  3. Oda sıcaklığında 14.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın.
  4. 5.2 ve 5.3 adımlarını tekrarlayın. Maya hücrelerini 2 mL MES tamponu, pH 6 içinde yeniden süspanse edin ve hacmi bir reaktif rezervuarına dökün.

6. Floresan ölçümlerinin ayarlanması

NOT: Mevcut taramanın floresan modlu bir mikroplaka okuyucuda gerçekleştirildiği kabul edilir.

  1. Temel ayarlar için cihazı aşağıdaki gibi ayarlayın: Ölçüm tipi: Floresan Yoğunluğu (FI) spektrumu; Mikroplaka adı: Greiner 96 F-bottom.
  2. Optik ayarlar için cihazı aşağıdaki gibi ayarlayın: Hayır. dalga boyu tarama noktası sayısı: 91; Uyarma dalga boyu: 433 nm; Uyarma bant genişliği: 10 nm; Emisyon dalga boyu: 460 - 550; Basamak genişliği: 1 nm; Emisyon bant genişliği: 10 nm; Otomatik odaklama ile elde edilen odak yüksekliği; Odak yüksekliği: 5 mm; Kazanç için kullanılan dalga boyu: 490 nm.
  3. Genel ayarlar için cihazı aşağıdaki gibi ayarlayın: Stabilizasyon süresi: 0,1 sn; Okuma yönü: tek yönlü, yatay soldan sağa, yukarıdan aşağıya.
    NOT: Manuel olarak girilen kazanç, dalga boyu taraması boyunca en yüksek floresan yoğunluğu seviyelerini göstermesi beklenen kuyu kullanılarak her ölçüm için ayarlanmalıdır.

7. Hipertonik çözeltilerin hazırlanması ve floresan ölçümleri

  1. 0 oyuklu açık tabanlı siyah bir plakada 0 M, 0.2 M, 0.4 M, 0.6 M, 0.8 M, 1 M, 1.5 M ve 2 M NaCl çözeltileri hazırlayın. Her bir oyuktaki nihai hacim 200 μL (150 μL ozmolit çözeltisi + 50 μL maya hücresi süspansiyonu) olacaktır.
    NOT: Hiperozmotik stresi indüklemek için diğer ozmolitler kullanılabilir. Tüm çözeltiler 50 mM MES tamponu pH 6'da hazırlanmalıdır.
  2. A sırasının ilk üç kuyusuna (A1, A2, A3) 150 μL 50 mM MES tamponu, pH 6 yükleyin ve sonraki kuyucuklara soldan sağa doğru artan sırayla 150 μL karşılık gelen çözelti ekleyin (Şekil 2). Önerilen tüm konsantrasyonları test etmek için, B satırındaki yüklemeye devam edin.
    NOT: Bu ayar, her konsantrasyon için 3 teknik kopyanın ölçümlerini dikkate alır.
  3. Her bir oyuğa 50 μL yıkanmış maya hücresi aktarmak için 12 kanallı bir mikropipet kullanın. Maya hücreleri, rezervuarın dibine çökelme eğilimindedir. Hücreleri aktarmadan önce yukarı ve aşağı pipetleyerek maya süspansiyonunu iyice yeniden süspanse ettiğinizden emin olun.
  4. Hücreleri, farklı çözeltileri içeren 96 oyuklu plakaya yükleyin ve en az 4 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın.
  5. Adım 6'nın spesifikasyon ayarlarıyla bir mikroplaka okuyucuda istenen kuyucuklar için floresan yoğunluğu emisyon spektrumlarını hemen ölçün. FRET tahlilinde test edilecek her IDR için prosedürü tekrarlayın.
  6. İsteğe bağlı adım. Varsa, burada açıklanan adımları izleyerek yalnızca donöre özel bir yapı (pDRFLIP38-mCerulean3) ölçün.
    NOT: Her koşulun FRET verimliliğini hesaplamak için bu adımı gerçekleştirmenizi öneririz. Okuyucu bu adımı gerçekleştiremezse, FRET oranı yöntemi kullanılarak FRET hesaplanabilir. FRET hesaplamaları için her iki yöntem de 8. ve 9. adımlarda açıklanmıştır.
  7. Her yapı için üç bağımsız günde en az üç çoğaltma gerçekleştirin.

8. FRET verimlilik yöntemini kullanarak veri işleme

NOT: R programlama dili hakkında bilgi sahibi olan okuyucular için, bu bölümde açıklanan veri işlemeyi gerçekleştirmek için bir dizi R betiği sağlıyoruz. Komut dosyaları https://github.com/Kaz-bits/cuevaslab-procotols/tree/main/FRET'da bulunabilir. README dosyasındaki yönergeleri izleyin.

  1. Verileri mikroplaka okuyucudan .xlsx dosyaları olarak dışa aktarın.
  2. Her tarama dalga boyunda floresan yoğunluğu değerlerini, kullanılan FRET çiftinin izosbestik noktasına normalleştirin.
    NOT: Bu adım, test edilen tüm koşulların spektrumlarını karşılaştırmak için gereklidir. mCerulean3 ve Sitrin FRET çiftinin izosbestik noktası 515 nm'dir. Örneğin, 460 nm/515 nm, 461 nm/515 nm, 462 nm/515 nm vb. floresan yoğunluk değerlerinin oranını elde edin.
  3. Floresan değerleri normalleştirildikten sonra her teknik kopya için ortalamayı hesaplayın. Toplamda, her hiperozmotik stres durumu için bir sütun olmalıdır.
  4. Tüm floresan yoğunluk spektrumlarını aynı grafikte görselleştirin (Şekil 3). Her spektrum, tek tek mCerulean3 ve Sitrinin floresan emisyon spektrumlarının bir kombinasyonunu göstermelidir. FRET verimliliğinin 0 olduğu nadir durumlarda, yalnızca donör floresan emisyon spektrumu gözlenecektir veya FRET verimliliği 1 olduğunda, yalnızca alıcı floresan gözlenecektir. mCerulean3 (donör) için floresan emisyon zirvesi 475 nm'dir ve Sitrin (alıcı) için floresan emisyon zirvesi 525 nm'dir.
  5. Floresan ölçümünün hiperozmotik strese yanıt olarak tipik bir FRET değişikliği gösterip göstermediğini belirleyin. IDR'nin konformasyonu tedaviye duyarlıysa, bu FRET verimliliğinde bir değişiklik olarak yansıyacaktır. FRET verimliliğindeki tipik bir değişiklik, donörün floresan yoğunluğundaki bir azalmayı, alıcının floresan yoğunluğundaki bir artışla birleştirecek veya bunun tersi de geçerli olacaktır.
  6. FRET verimliliğini ölçün (EFRET). IDR yapısı için donör (mCerulean3) normalleştirilmiş tepe değerlerini (475 nm/515 nm) ve her hiperozmotik stres koşulu için yalnızca donöre özel yapıyı elde edin. Teknik kopyaların ortalama normalleştirilmiş tepe değerlerini kullanın. Bu işlemi üç bağımsız çoğaltmanın her biri için gerçekleştirin. EFRET'i aşağıdaki formülle hesaplayın:
    figure-protocol-1
    Burada IDA , IDR yapısından (FRET çifti yapısı) 475 nm/515 nm oranıdır ve ID , yalnızca donör yapısından 475 nm/515 nm oranıdır.
  7. FRET verimliliklerini karşılaştırın. Her hiperozmotik stres koşulunun EFRET değerlerini, stressiz koşulun EFRET'ine (örneğin, 0 M NaCl) normalleştirin. Bir kutu grafiği veya düzgün bir eğri grafiği kullanarak karşılaştırmalar yapın. Tek yönlü bir ANOVA ve ardından post hoc Tukey istatistiksel testi uygulayın (p değerleri: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001).

9. FRET oranı yöntemini kullanarak veri işleme

NOT: Yalnızca donör ölçümleri elde edilemiyorsa, FRET oranı yöntemini uygulayın. Bu yöntem, farklı hiperozmotik stres koşulları arasında FRET oranını karşılaştırır. Tipik bir FRET davranışını doğrulamak için 7.1'den 7.5'e kadar olan adımlar bu bölümdeki adımlardan önce gerçekleştirilmelidir. R programlama dili hakkında bilgi sahibi olan okuyucular için, bu bölümde açıklanan veri işlemeyi gerçekleştirmek için bir dizi R betiği sağlıyoruz. Komut dosyaları https://github.com/Kaz-bits/cuevaslab-procotols/tree/main/FRET'da bulunabilir. README dosyasındaki yönergeleri izleyin.

  1. Daha önce mikroplaka okuyucudan dışa aktarılan xlsx dosyasından 475 nm ve 525 nm'de veri ayıklayın. Bu değerler, donör florofor uyarıldığında (433 nm) mCerulean3 (donör, DxDm) için floresan emisyon zirvesine ve Sitrin (alıcı, DxAm) için floresan emisyon zirvesine karşılık gelir.
  2. Floresan yoğunluğu değerlerini 475 nm ve 525 nm'de kullanılan FRET çiftinin izosbestik noktasına normalleştirin. mCerulean3 ve Sitrin FRET çiftinin izosbestik noktası 515 nm'dir. FRET oranını (DxAm/DxDm) elde edin.
  3. FRET oranlarını karşılaştırın. Her hiperozmotik stres koşulunun DxAm/DxDm değerlerini, gerilimsiz koşulun ortalama DxAm/DxDm'sine normalleştirin (örneğin, 0 M NaCl). Bir kutu grafiği veya düzgün bir eğri grafiği kullanarak karşılaştırmalar yapın (Şekil 4 ve Şekil 5). Tek yönlü bir ANOVA ve ardından post hoc Tukey istatistiksel testi uygulayın (p değerleri: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Maya hücrelerini pDRFLIP38-AtLEA4-5 plazmidi ile dönüştürdükten sonra, pozitif transformantların floresansı bir mavi ışık transillightörü ve bir filtre ile gözlendi (Şekil 1). Hiperozmotik stresi indüklemek için farklı çözümlerin hazırlanması zaman alıcıdır, bu nedenle Şekil 2'deki 96 kuyucuklu şablonu izlemenizi öneririz. Değişen konsantrasyonlarda sodyum klorür ile hiperozmotik stres tedavisinden hemen sonra, floresan emisyon spektrumları elde edildi (Şekil 3). Tipik bir FRET değişim davranışını doğrulamak için her koşulun floresan emisyon spektrumları elde edildi. Deneysel hataların düzeltilmesi için floresan yoğunluk değerlerinin izosbestik noktaya normalleştirilmesi gerekir. Bu temsili sonuçlar için, daha önce bildirilen ve oldukça hassas bir bitki olanAtLEA4-5-6'i test ettik. Referans olarak, hafif duyarsız ABP küresel proteinini de test ettik (Şekil 3). Her iki yapının da standart koşullar altında (0 M NaCl) bir dereceye kadar bazal FRET verimliliğini gösteren mCerulean3 ve Sitrin emisyon spektrumlarının (donör ve alıcı FP'ler için tepe noktaları) bir kombinasyonunu sergilediği gözlemlenebilir. AtLEA4-5 için, hiperozmotik stres, vericinin floresan yoğunluğunda bir azalma ile birlikte alıcının floresan yoğunluğunda bir artışa neden oldu ve IDR'nin hiperozmotik strese bağlı sıkışmasını gösterdi (Şekil 3A). Bu eğilim ABP'de gözlenmemiştir (Şekil 3B). Farklı hiperozmotik stres tedavileri arasında yapısal duyarlılıktaki farklılıkları ölçmek için, her koşul için FRET oranını (DxAm / DxDm) çizdik ve Tek yönlü bir ANOVA istatistiksel testi gerçekleştirdik (Şekil 4). Son olarak, AtLE4-5 ve ABP'nin yapısal hassasiyetini karşılaştırdık. AtLEA4-5'in ABP'den anlamlı olarak daha yüksek bir duyarlılık gösterdiğini gözlemledik (Şekil 5).

figure-results-1
Şekil 1: S. cerevisiae transformantlarının floresan emisyonu. S. cerevisiae ile kaplanmış SD-ura Petri kabı, pDRFLIP38-AtLEA4-5 plazmidi ile dönüştürülmüştür. Floresan, mavi ışık aydınlatıcısı ve turuncu filtre kullanılarak gözlemlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: FRET sistemi için 96 oyuklu bir plaka şablonu. Her hiperozmotik stres koşulu için üç teknik kopya ardışık kuyucuklara yerleştirilir. İlk iki satır (A ve B), bir yapı (IDR1) için sekiz koşula uyar. Aşağıdaki satırlar yeni yapıları barındırabilir (IDR2, IDR3, vb.). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Farklı hiperozmotik stres koşulları altında normalleştirilmiş floresan emisyon spektrumları. Spektrumlar, hiperozmotik stres (NaCl) tedavisine yanıt olarak tipik bir FRET davranışını doğruladı. (A) AtLEA4-5, son derece hassas bir IDR. Alıcının floresan yoğunluğundaki artış, donörün floresan yoğunluğundaki azalma ile birleştirilir. (B) ABP, biraz duyarsız bir küresel protein. FRET çifti mCerulean3 ve Sitrin'e göre 475 nm ve 525 nm'de zirveler gözlenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Farklı hiperozmotik stres koşullarında yapısal duyarlılığın ölçülmesi. Farklı konsantrasyonlarda NaCl ile muamele edilmiş canlı maya hücrelerinin normalleştirilmiş FRET oranı (DxAm/DxDm). (a) LEA4-5'te. (B) Arabinoz bağlayıcı protein (ABP). n = 9 bağımsız ölçüm. Tek yönlü ANOVA. NS: Önemli değil. P değerleri: *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P< 0.0001. Kutular 25-75. yüzdebirlik dilimi (medyandaki çizgi) temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: AtLEA4-5 ve ABP'nin yapısal duyarlılığının karşılaştırılması. (A) AtLEA4-5 ve ABP için farklı hiperozmotik stres koşulları altında normalleştirilmiş FRET oranı (DxAm/DxDm). n = 3 bağımsız ölçüm. (B) AtLEA4-5 ve ABP için Delta FRET değeri (1,5 M - 0 M NaCl). Değişim, FRET sisteminde 1.5 M NaCl'de ölçülen yapıların yapısal duyarlılığı olarak rapor edilir. n = 3 bağımsız ölçüm. Ortalama ± SD. Aşağıdaki p değerlerini kullanan iki yönlü ANOVA: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p< 0.0001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan yöntem, IDR'ler topluluğunun küresel boyutlarının çevresel bozulmaları nasıl algıladığına ve bunlara nasıl tepki verdiğine dair içgörüler elde etmenin bir yolunu sunar. Bu yöntem, genetik olarak kodlanmış bir yapıya dayanır ve maya hücrelerinde plazmit stabil ekspresyonunun ötesinde hiçbir ek bileşen gerektirmez, bu da onu diğer hücre tiplerindeki potansiyel uygulamalar için uyarlanabilir hale getirir. Ayrıca, ökaryotik hücrelerin yaşam döngüleri boyunca yaşadıkları diğer fizikokimyasal bozulmaları keşfetmek için çok yönlüdür21. FRET'in çözünürlüğü dikkate değerdir, enerji transferi yalnızca verici ve alıcı FP'ler arasında 10 nm'den daha az bir yakınlıkta gerçekleşir. Bununla birlikte, ana sınırlama, topluluk FRET yöntemini takiben elde edilemeyen kesin yapısal bilgilerin olmamasıdır.

IDR'lerin doğal heterojenliği ve esnekliği, topluluklarını hücresel bağlamda incelerken zorluklar ortaya çıkarmakta ve X-ışını kristalografisi gibi teknikleri kullanışsız hale getirmektedir. NMR, hücrelerdeki düzensiz proteinleri incelemek için düşünülmüştür, ancak değişen koşullar, sinyal paraziti22 nedeniyle bir sorun olabilir. IDR konformasyonel topluluklarını incelemek için FRET tekniğinin uygulanması, canlı hücreler içindeki popülasyon dağılımının haritalanmasına izin veren benzersiz yetenekler sunar. Ek olarak, çeşitli yaklaşımlara ve deneysel koşullara uyarlanabilirliğini sergileyen tek moleküllü FRET (smFRET) gibi in vitro yöntemlerle tamamlanabilir23. Bu protokol, donör FP olarak mCerulean3'ü ve alıcı FP olarak Sitrin kullanır ve basit ve izlemesi kolay bir sistem sağlar. FRET çiftlerinin seçilmesi,24,25 sinyalleri arasındaki karışmayı azaltmak için spektral örtüşmeyi dikkatlice dikkate almalıdır. Bu yöntemi kullanarak yapısal hassasiyetteki değişiklikleri bildirirken, FRET verimliliği (EFRET) gibi uygun bir FRET metriği seçmek, güvenilir sinyal yorumlaması için çok önemlidir. Alternatif olarak, yapısal duyarlılık FRET oranı (DxAm/DxDm) kullanılarak analiz edilebilir ve karşılaştırılabilir, ancak bu, donör-alıcı floresan çapraz konuşması25 için dikkatli bir düzeltme gerektirir. Mikroplaka okuyuculardan elde edilen floresan verilerinin yorumlanması, floroforların özellikleri, dipol oryantasyonu, molekül içi-FRET sistemlerine karşı termoleküler-FRET sistemleri, numune hazırlama ve veri analizi gibi çeşitli faktörlerden etkilenebilir25.

Intermolecular-FRET, topluluk FRET yönteminin önemli bir sınırlamasıdır, çünkü verilerin ilk analizinden atılması mümkün değildir. Bu, okuyucu için önemli bir husustur, çünkü bazı IDR'lerin biyomoleküler kondensatlara26,27 girdiği bilinmektedir. Biyomoleküler kondensatlardaki makromoleküllerin yerel konsantrasyonu yüksektir, bu da moleküller arası etkileşimleri indükleyebilir ve böylece FRET okumasını etkileyebilir. AtLEA4-5 için, maya hücrelerinde hiperozmotik stres üzerine ayrı noktasal yapılar halinde kendiliğinden birleştiğigösterilmiştir 6. İntermoleküler-FRET'in etkisini ekarte etmek için yazarlar, hücreleri biyomoleküler kondensatları bozan bir molekül olan 1,6-heksandiol (1,6-HD) ile inkübe ettiler. 1,6-HD işlemi, AtLEA4-5 kondensatlarını çözdü, ancak FRET seviyeleri azalmadı, bu da protein yoğunlaşmasının istenmeyen moleküller arası FRET'e neden olmadığını gösteriyor. Bu etki her IDR'ye bağlı olacağından, okuyucular alıcı fotoağartma veya yalnızca donör ve yalnızca alıcı yapıların birlikte ekspresyonu gibi ek yaklaşımlar gerçekleştirmelidir6. Yine de, canlı hücrelerdeki FRET topluluğundan elde edilen bilgiler, IDR'lerin yapısal duyarlılığını karakterize etmek için önemlidir.

Burada sunulan protokolün karmaşık bir yönü, hiperozmotik strese duyarlı davranış sergileyen bir organizma kullanmasıdır. Yüksek dış sodyum klorür konsantrasyonlarının varlığında, su hücreyi terk eder, toplam protein konsantrasyonunu arttırır ve kalabalık bir ortam oluşturur28. IDR'ler makromoleküler kalabalık 5,6,11,12 değişikliklerine duyarlıdır. Spesifik olarak, bu protokolde bir model olarak kullanılan protein olan AtLEA4-5, farklı moleküler ağırlık kalabalıklarına duyarlıydı, ancak in vitro6'da yüksek konsantrasyonlarda tuzlara veya gliserole duyarlı değildi. Gliserol birikimi, maya hücrelerinin hiperozmotik strese29 tepkisi ve alışması için önemli olduğundan, AtLEA4-5 sıkıştırmasına ana katkının, ozmo-algılamanın erken olayları sırasında makromoleküler kalabalıklaşma olduğunu vurgulamak önemlidir. AtLEA4-5'in yapısının, gliserol biriktiğinde, sonraki alışma aşamalarında nasıl değiştiği, daha fazla araştırma gerektirir.

Düzensiz proteinlerde konformasyonel dinamikleri araştırmak çeşitli teknikleri kapsar. Bu bağlamda, FRET çok önemli bir yöntemdir. İncelenen spesifik araştırma sorgularına ve özelliklerine bağlı olarak, araştırmacılar IDR30'u karakterize etmek için in vivo NMR spektroskopisi kullanabilirler. Ek olarak, smFRET in vivo çalışmalar için değerli bir araçtır23. Elektron paramanyetik rezonans (EPR) spektroskopisi, IDR'leri hücresel bağlamda kantitatif olarak incelemek için kullanılan başka bir tekniktir31. Kütle spektrometresi tabanlı yöntemler de güçlü yaklaşımlardır, çünkü proteinlerin hücresel konformasyonu hakkında yapısal bilgi sağlayabilirler32. Bu yöntemler arasında doğal kütle spektrometrisi (doğal-MS) ve iyon hareketliliği kütle spektrometrisi (IM-MS)32,33 bulunur. Tüm bu yöntemler, araştırmacıların bir IDR'nin çoklu konformasyonlarını ve dinamiklerini araştırmalarını sağlayarak hücre biyolojisine katkılarına ışık tutar. Bu çalışmada açıklanan protokol, yapısal hassasiyetin ilk taramasını yüksek verimli bir şekilde gerçekleştirmek için kullanılabilir. Takip çalışmaları, istenen bir hücre tipinde yapısal duyarlılığın test edilmesine veya smFRET, CD veya SAXS gibi in vitro yöntemlerle mekanik içgörü elde etme potansiyeline odaklanabilir. Hücrelerin değişen ortamlarında IDR'nin yapısal duyarlılığının net bir resmini elde etmek için yöntemlerin kombinasyonu gereklidir.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Makalenin eleştirel incelemesi için Cuevas-Velazquez laboratuvarı üyelerine teşekkür ederiz. Bu çalışma, Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica, Dirección General de Asuntos del Personal Académico, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM-PAPIIT) proje numarası IA203422; Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnología (CONAHCYT), proje numarası 252952; ve Programa de Apoyo a la Investigación y el Posgrado, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México, Grant 5000-9182. CET (CVU 1083636) ve CAPD (CVU 1269643), M.Sc. Bursları için CONAHCYT'e teşekkür eder.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
96 kuyulu plakaGreiner Bio-One655096
AgarSigma-Aldrich5040
BglIINew England BioLabsR0144S
BJ5465 hücreleriAmerikan Tipi Kültür Koleksiyonu208289
Tamponu MES 50 mMSigma-AldrichM8250
Tampon Tris-HCl 10 mMInvitrogen
EDTA 1 mMMerck108452
Falcon tüpleriCorning352057
LB ortamıSigma-AldrichL2897
Lityum asetat 0.1 MSigma-AldrichL6883
Düşük Eriyik AgarozGOLDBIOA-204-25
Mikrosantrifüjeppendorf5452000010
Miniprep kitiZymoPureD4210
NaOH 0.02 MMerck106462
PEG 3,350 %40Sigma-Aldrich1546547
plazmid pDRFLIP38-AtLEA4-5addgene178189
Plaka okuyucuBMG LABTECHCLARIOstar Plus
SacINew England BioLabsR3156S
Somon sperm DNA'sı 2 mg/mLThermo Fisher Scientific15632011
SD-UraSigma-AldrichY1501
Sodyum kloridSigma-AldrichS9888
Taq polymesarePromegaM5123
TransilümatörAccuris cihazlarıE4000
UV-Görünür spektrofotometreThermo Fisher ScientificBiomate3
YPD ortamıSigma-AldrichY1500
15506017

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wright, P. E., Dyson, H. J. Intrinsically disordered proteins in cellular signalling and regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (1), 18-29 (2015).
  2. Covarrubias, A. A., Romero-Pérez, P. S., Cuevas-Velazquez, C. L., Rendón-Luna, D. F. The functional diversity of structural disorder in plant proteins. Arch Biochem Biophys. 680, 108229(2019).
  3. Ahmed, S. S., et al. Characterization of intrinsically disordered regions in proteins informed by human genetic diversity. PLoS Comput Biol. 18 (3), e1009911(2022).
  4. Birol, M., Melo, A. M. Untangling the conformational polymorphism of disordered proteins associated with neurodegeneration at the single-molecule level. Front Mol Neurosci. 12, 309(2019).
  5. Moses, D., et al. Revealing the hidden sensitivity of intrinsically disordered proteins to their chemical environment. J Phys Chem Lett. 11 (23), 10131-10136 (2020).
  6. Cuevas-Velazquez, C. L., et al. Intrinsically disordered protein biosensor tracks the physical-chemical effects of osmotic stress on cells. Nat Commun. 12 (1), 5438(2021).
  7. Holehouse, A. S., Sukenik, S. Controlling structural bias in intrinsically disordered proteins using solution space scanning. J Chem Theory Comput. 16 (3), 1794-1805 (2020).
  8. Martin, E. W., Hopkins, J. B., Mittag, T. Small-angle X-ray scattering experiments of monodisperse intrinsically disordered protein samples close to the solubility limit. Methods Enzymol. 646, 185-222 (2021).
  9. Miles, A. J., Drew, E. D., Wallace, B. A. DichroIDP: a method for analyses of intrinsically disordered proteins using circular dichroism spectroscopy. Commun Biol. 6 (1), 823(2023).
  10. Kaminski, C. F., Rees, E. J., Schierle, G. S. K. A quantitative protocol for intensity-based live cell FRET imaging. Method Mol Biol. 1076, 445-454 (2014).
  11. Moses, D., et al. Structural biases in disordered proteins are prevalent in the cell. bioRxiv. , (2022).
  12. Cuevas-Velazquez, C. L., Saab-Rincón, G., Reyes, J. L., Covarrubias, A. A. The Unstructured N-terminal Region of Arabidopsis Group 4 Late Embryogenesis Abundant (LEA) Proteins Is Required for Folding and for Chaperone-like Activity under Water Deficit. J Biol Chem. 291 (20), 10893-10903 (2016).
  13. JoVE Science Education Database. Restriction enzyme digests. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  14. JoVE Science Education Database. Gel purification. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  15. JoVE Science Education Database. DNA ligation reactions. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  16. JoVE Science Education Database. Bacterial transformation using heat Ssock and competent cells. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  17. JoVE Science Education Database. PCR: Principle, instrumentation, and applications. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  18. JoVE Science Education Database. Plasmid purification. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  19. JoVE Science Education Database. DNA gel electrophoresis. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  20. JoVE Core Molecular Biology. Sanger/chain termination sequencing using dideoxynucleotides - Concept. , Available from: https://app.jove.com/science-education/v/12020/sanger-sequencing (2023).
  21. Theillet, F. X., et al. Physicochemical properties of cells and their effects on intrinsically disordered proteins (IDPs). Chem Rev. 114 (13), 6661-6714 (2014).
  22. Brutscher, B., et al. NMR methods for the study of instrinsically disordered proteins structure, dynamics, and interactions: General overview and practical guidelines. Adv Exp Med Biol. 870, 49-122 (2015).
  23. Metskas, L. A., Rhoades, E. Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins. Annu Rev Phys Chem. 71, 391-414 (2020).
  24. Roebroek, T., et al. Simultaneous readout of multiple FRET pairs using photochromism. Nat Commun. 12 (1), 2005(2021).
  25. Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls. Nat Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
  26. Lyon, A. S., Peeples, W. B., Rosen, M. K. A framework for understanding the functions of biomolecular condensates across scales. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (3), 215-235 (2021).
  27. Belott, C., Janis, B., Menze, M. A. Liquid-liquid phase separation promotes animal desiccation tolerance. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (44), 27676-27684 (2020).
  28. Miermont, A., et al. Severe osmotic compression triggers a slowdown of intracellular signaling, which can be explained by molecular crowding. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5725-5730 (2013).
  29. Saito, H., Posas, F. Response to hyperosmotic stress. Genetics. 192 (2), 289-318 (2012).
  30. Selenko, P., Wagner, G. Looking into live cells with in-cell NMR spectroscopy. J Struct Biol. 158 (2), 244-253 (2007).
  31. Cattani, J., Subramaniam, V., Drescher, M. Room-temperature in-cell EPR spectroscopy: alpha-Synuclein disease variants remain intrinsically disordered in the cell. Phys Chem Chem Phys. 19 (28), 18147-18151 (2017).
  32. Beveridge, R., Chappuis, Q., Macphee, C., Barran, P. Mass spectrometry methods for intrinsically disordered proteins. Analyst. 138 (1), 32-42 (2013).
  33. Beveridge, R., et al. Ion mobility mass spectrometry uncovers the impact of the patterning of oppositely charged residues on the conformational distributions of intrinsically disordered proteins. J Am Chem Soc. 141 (12), 4908-4918 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Intrinsically Disordered RegionsStructural SensitivityHyperosmotic StressFRET MeasurementSaccharomyces CerevisiaeFluorescence IntensityProtein ConformationMicroplate ReaderOsmolyte ResponseYeast Cell Stress

Related Articles