Method Article

Küçük RNA'ları Ölçmek için AQRNA-seq

DOI:

10.3791/66335

⸱

February 2nd, 2024

 ,  , 
1Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2Singapore-MIT Alliance for Research and Technology Antimicrobial Resistance Interdisciplinary Research Group

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mutlak miktar tayini RNA dizilimi (AQRNA-seq), biyolojik karışımlardaki tüm küçük RNA'ların manzarasını ölçmek için geliştirilmiş bir teknolojidir. Burada, açlığın neden olduğu uyku hali sırasında Mycobacterium bovis BCG'deki transfer RNA (tRNA) havuzundaki değişiklikleri ölçen AQRNA-seq'nin hem kütüphane hazırlama hem de veri işleme adımları gösterilmektedir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AQRNA-seq, biyolojik bir numunedeki sıralama okuma sayıları ile küçük RNA kopya sayıları arasında doğrudan doğrusal bir ilişki sağlar, böylece küçük RNA havuzunun doğru bir şekilde nicelleştirilmesini sağlar. Burada açıklanan AQRNA-seq kütüphanesi hazırlama prosedürü, özel olarak tasarlanmış dizileme bağlayıcılarının kullanımını ve ters transkripsiyon sürecini bloke eden metilasyon RNA modifikasyonlarını azaltmak için bir adımı içerir, bu da tam uzunlukta cDNA veriminin artmasıyla sonuçlanır. Ek olarak, eşlik eden biyoinformatik boru hattının ayrıntılı bir uygulaması sunulmaktadır. AQRNA-seq'in bu gösterimi, 20 günlük bir besin yoksunluğu ve 6 günlük resüsitasyon süreci boyunca seçilen 5 günde hasat edilen Mycobacterium bovis BCG'deki 45 tRNA'nın kantitatif bir analizi yoluyla gerçekleştirildi. AQRNA-seq'in verimliliğini ve titizliğini artırmaya yönelik devam eden çabalar da burada tartışılacaktır. Bu, PCR amplifikasyonundan sonra primer dimer sorunlarını azaltmak için jel saflaştırmasını ortadan kaldırmaya ve daha doğru okuma eşlemesi sağlamak için tam uzunlukta okumaların oranını artırmaya yönelik yöntemlerin araştırılmasını içerir. AQRNA-seq'te gelecekteki iyileştirmeler, çeşitli organizmalardan alınan hücre ve doku örneklerindeki tüm küçük RNA türlerinin miktarını belirlemek için bu teknolojinin otomasyonunu ve yüksek verimli uygulamasını kolaylaştırmaya odaklanacaktır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Büyük paralel dizileme olarak da bilinen yeni nesil dizileme (NGS), DNA parçalanmasını, adaptör oligonükleotidlerin bağlanmasını, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tabanlı amplifikasyonu, DNA'nın dizilenmesini ve parça dizilerinin bir genomda yeniden birleştirilmesini içeren bir DNA dizileme teknolojisidir. NGS'nin RNA dizisine (RNA-dizilimi) adaptasyonu, RNA transkriptlerini ve varyantlarını tanımlamak ve ölçmek için güçlü bir yaklaşımdır1. RNA kütüphanesi hazırlama iş akışlarındaki ve biyoinformatik analiz boru hatlarındaki yenilikçi gelişmeler, laboratuvar cihazlarındaki ilerlemelerle birleştiğinde, RNA-seq uygulamalarının repertuarını genişletti ve ekzom dizilemenin ötesine geçerek, kodlamayan RNA profillemesi2, tek hücre analizi3, uzamsal transkriptomik 4,5, alternatif birleştirme analizi6 gibi gelişmiş fonksiyonel omiklere ilerledi, diğerleri arasında. Bu gelişmiş RNA-seq yöntemleri, normal ve hastalıklı hücre ve dokudaki transkriptomun kantitatif analizi yoluyla karmaşık RNA fonksiyonlarını ortaya çıkarır.

RNA dizilimindeki bu ilerlemelere rağmen, birkaç temel teknik özellik yöntemin nicel gücünü sınırlamaktadır. Çoğu RNA-seq yöntemi, deneysel değişkenler (yani biyolojik numuneler ve/veya fizyolojik durumlar) arasındaki RNA seviyelerindeki değişikliklerin kesin ve doğru bir şekilde ölçülmesine izin verirken, bir numune içindeki RNA moleküllerinin seviyelerinin nicel karşılaştırmalarını sağlayamazlar. Örneğin, çoğu RNA-seq yöntemi, eksprese edilen tRNA'ların hücresel bir havuzundaki tek tek tRNA izoseptör moleküllerinin nispi kopya sayısını doğru bir şekilde ölçemez. Eşlik eden yayın7'de vurgulandığı gibi, RNA-seq ile ilgili bu sınırlama, RNA yapısının çeşitli özelliklerinden ve kütüphane hazırlığının biyokimyasından kaynaklanmaktadır. Örneğin, 3' ve 5' uçlu dizileme bağlayıcılarını RNA moleküllerine bağlamak için kullanılan ligasyon enzimlerinin aktivitesi, RNA'nın terminal nükleotidlerinin ve dizileme bağlayıcılarının kimliğinden güçlü bir şekilde etkilenir. Bu, bağlayıcı ligasyonlarının verimliliğinde büyük farklılıklara ve sıralama okumalarında derin artefaktal artışlara yol açar 8,9,10.

İkinci bir sınırlama seti, RNA moleküllerinin doğal yapısal özelliklerinden kaynaklanmaktadır. Spesifik olarak, RNA ikincil yapı oluşumu ve epitranskriptomun düzinelerce transkripsiyon sonrası RNA modifikasyonundaki dinamik değişiklikler, ters transkripsiyon sırasında polimeraz düşmesine veya mutasyonuna neden olabilir. Bu hatalar, eksik veya kesilmiş cDNA sentezi veya değişmiş RNA dizisi ile sonuçlanır. Bu fenomenlerin her ikisi de ikincil yapıları veya bazı modifikasyonları haritalamak için kullanılabilse de, sonraki kütüphane hazırlama adımları kesilmiş cDNA'ları yakalayamazsa veya veri işleme, bir referans veri kümesiyle eşleşmeyen mutasyona uğramış dizileri atarsa, RNA-seq'in nicel doğruluğunu düşürür11,12. Ayrıca, RNA transkriptlerinin muazzam kimyasal, uzunluk ve yapısal çeşitliliğinin yanı sıra uzun RNA'ları düzgün bir şekilde parçalamak için araçların olmaması, çoğu RNA-seq yönteminin tüm RNA türlerineuygulanabilirliğini azaltır 13.

AQRNA-seq (mutlak miktar tayini RNA dizileme) yöntemi, kantitatif doğruluğu sınırlayan bu teknik ve biyolojik kısıtlamaların birçoğunu ortadan kaldırmak için geliştirilmiştir7. RNA dizileme kütüphanesi hazırlığı sırasında yakalama, ligasyon ve amplifikasyonda diziye bağlı önyargıları en aza indiren AQRNA-seq, diğer yöntemlere kıyasla üstün doğrusallık elde eder ve 963 miRNA'dan oluşan bir referans kütüphanesinin %75'ini 2 kat doğrulukla doğru bir şekilde ölçer. Dizileme okuma sayısı ve RNA bolluğunun bu doğrusal korelasyonu, RNA oligonükleotid standartlarının değişken uzunluklu bir havuzunun analizinde ve kuzey blotlama gibi ortogonal yöntemlere atıfta bulunulduğunda da gözlenir. Dizileme okuma sayısı ve RNA bolluğu arasında doğrusallık oluşturmak, AQRNA-seq'in bir numune içindeki tüm RNA türlerinin doğru ve mutlak miktar tayinini elde etmesini sağlar.

Burada, AQRNA-seq kitaplığı hazırlama iş akışı ve beraberindeki aşağı akış veri analizi işlem hattı için protokolün bir açıklaması yer almaktadır. Yöntem, Mycobacterium bovis bacilli de Calmette et Guérin (BCG) tüberküloz modelinde açlığa bağlı uyku hali ve ardından resüsitasyon sırasında tRNA bolluğunun dinamiklerini aydınlatmak için uygulandı. Dizileme verilerinin keşifsel görselleştirilmesi için sonuçlar, çeşitli fenotiplerle ilişkili tRNA bolluğundaki fark edilebilir kalıpları ortaya çıkaran müteakip kümeleme ve diferansiyel ifade analizleriyle birlikte sunuldu.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Şekil 1 , AQRNA-seq kitaplığının hazırlanmasında yer alan prosedürlerin grafiksel bir gösterimini sağlar. Prosedürde kullanılan reaktifler, kimyasallar ve kolonlar/kitler ile ilgili ayrıntılı bilgi Malzeme Tablosunda bulunabilir. (i) %3 agaroz jel elektroforezi, (ii) biyomoleküllerin numune kalite kontrolü için otomatik elektroforez araçları (Malzeme Tablosuna bakınız) ve (iii) UV-Görünür spektrofotometri ve/veya florometrik miktar tayini kullanılarak giriş RNA numunelerinin saflığı, bütünlüğü ve miktarının kapsamlı bir değerlendirmesinin yapılması önerilir. Aksi belirtilmedikçe tüm reaksiyonların ve ana karışımların buz üzerinde tutulması zorunludur. Raf ömürlerini korumak ve kütüphane ara ürünlerinin çoklu donma-çözülme döngülerini önlemek için reaktifleri (örn. enzimler) soğuk kutularda -20 ° C'lik depolamaya ve bu sıcaklıktan taşıyın.

1. RNA'ların defosforilasyonu

NOT: 5'-fosfatın (P; verici) çıkarılması, RNA'ların 3'-hidroksil'ine (OH; alıcı) kendi kendine bağlanmayı önler. Bağlayıcılar, 3' uçları bir dideoksisitidin (Bağlayıcı 1) veya bir ara parça (Bağlayıcı 2) içerecek şekilde değiştirildiğinden kendi kendini bağlamaz. Bağlayıcılar sadece 5'-P'lerini RNA'ların veya cDNA'ların 3'-OH'sine birleştirerek bağlanabilir.

  1. Defosforilasyon reaksiyonunu steril bir PCR tüpünde hazırlayın (ör., 200 μL veya 500 μL tüp) 2 μL'ye kadar RNA örneği, 0.5 μL 40 U/μL RNaz inhibitörü, 1 μL 0.5 μM dahili standart (Tablo 1), 0.5 μL 10x T4 RNA ligaz reaksiyon tamponu, 1 μL 1 U/μL Karides alkalin fosfataz, ve toplam hacmi 5 μL'ye getirmek için yeterli RNaz içermeyen su.
    NOT: Tipik numuneler için, bu protokolü kullanarak küçük RNA'ların miktar tayini için 75 ng RNA (veya 80 nt RNA için yaklaşık 2 pmol) yeterli kabul edilir.
  2. RNA'ları fosforile etmek için 37 ° C'de 30 dakika ve daha sonra enzimi inaktive etmek ve RNA'ları denatüre etmek için 65 ° C'de 5 dakika inkübe edin. Renatürasyonu önlemek için numuneleri en az 10 dakika 4 °C'de tutun.

2. Bağlayıcı 1'in RNA'ların 3' ucuna bağlanması

  1. 5 μL fosforile edilmiş RNA'lar (adım 1'den ürünler), 0.5 μL 40 U/μL RNaz inhibitörü, 1 μL 100 μM Bağlayıcı 1 (Tablo 1), 3 μL 10 mM ATP, 2.5 μL 10x T4 RNA ligaz reaksiyon tamponu, 15 μL PEG8000 (%50 çözelti), 2 μL 30 U/μL T4 RNA ligaz 1 ve 1 μL RNaz içermeyen su.
    NOT: Numunelerin işlenmesini kolaylaştırmak için reaktifler ana karışım haline getirilebilir. Ana karışıma PEG8000 ve T4 RNA ligaz 1'i dahil etmeyin.
  2. Bağlayıcı 1'i RNA'lara bağlamak için 25 ° C'de 2 saat ve daha sonra 16 ° C'de 16 saat inkübe edin.
  3. Bağlayıcı-1 bağlı RNA'ları kolonla saflaştırın. DNA/RNA geri kazanımı ve temizliği için bir kit kullanın (Malzeme Tablosuna bakınız).
    NOT: Bu kolon saflaştırma protokolü, aynı kiti kullanan sonraki tüm kolon saflaştırması için geçerlidir. Boya sonlandırıcıları sıralama reaksiyonlarından çıkarmak için jel filtrasyon teknolojisini kullanan kitler (Malzeme Tablosuna bakınız), bu tür kitlerin jel filtreleriyle uyumlu olmadığı PEG8000 burada kullanılamaz. Saflaştırmadan sonra her numuneden bir alikot (1.2 μL) tasarruf edilmesi önerilir. Gerektiğinde, bu alikotlar, ticari bir nükleik asit analizörü çalıştırarak ligasyon verimliliğini kontrol etmek için kullanılabilir. Kalan saflaştırılmış numuneleri daha sonraki adımlara kadar buz üzerinde veya -20 °C'de tutun.
    1. 50 μL'< numune hacmi için, 50 μL'ye getirmek için RNaz içermeyen su ekleyin. Numunenin 1 hacmine 2 hacim oligo bağlayıcı tampon (kitte verilir) ekleyin. Numunenin 1 hacmine 8 hacim %100 etanol ekleyin.
    2. Numuneyi (bir seferde 750 μL'ye kadar) 2 mL'lik bir toplama tüpünün (kitte verilir) içine yerleştirilmiş bir kolona yükleyin. RNA'ları kolona bağlamak için, 30 saniye boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin ve akışı (yani toplama tüpündeki sıvıyı) atın. Sütunu tekrar toplama tüpüne yerleştirin.
    3. Kolondaki yabancı maddeleri yıkamak için, kolona 750 μL DNA yıkama tamponu (kitte verilir) ekleyin. 30 saniye boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin ve akışı atın. Sütunu tekrar toplama tüpüne yerleştirin.
    4. Artık DNA yıkama tamponunu çıkarmak için 1 dakika daha maksimum hızda (örneğin, tezgah üstü mikrosantrifüj için 16.000 x g ) santrifüjleyin.
    5. RNA'ları elüte etmek için, sütunu dikkatlice steril 1.5 mL'lik bir tüpe taşıyın, sütuna RNaz içermeyen su ekleyin. Elüsyon işlemi sırasında potansiyel hacim kaybını hesaba katmak için RNA'ları ayrıştırırken gerekenden daha büyük bir hacim kullanın. Örneğin, bir sonraki adım için 15 μL gerekiyorsa, elüsyon için 17 μL RNaz içermeyen su ekleyin. 30 saniye boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin.

3. Transkripsiyon sonrası metilasyonların AlkB demetilaz ile uzaklaştırılması

NOT: AlkB, DNA ve RNA'daki metillenmiş nükleotidlerin hepsinden olmasa da bazılarından metil gruplarını uzaklaştıran bakteriyel bir enzimdir. RNA'daki çeşitli metillenmiş ribonükleotid türlerinin çıkarılması, daha tam uzunlukta okumalara ve modifikasyon bölgelerinin tanımlanmasına izin vermek için ters transkriptazın düşmesini önler. RNA'ların beklenmedik şekilde bozulmasını önlemek için bu adımın düşük bir pH'da kontrol edilmesi gerekir.

  1. 1.4611 g 2-ketoglutarat (M başına 146.11 g) 10 mL RNaz içermeyen suda çözerek 1 M 2-ketoglutarat stok çözeltisi hazırlayın. Filtre, çözeltiyi 0.2 μm'lik bir şırınga filtresinden sterilize eder. Stok solüsyonunu 2 mL steril tüplere alın ve -20 °C'de saklayın.
  2. 0.88 g L-askorbik asidi (M başına 176.12 g) 10 mL RNaz içermeyen suda çözerek 0.5 M L-askorbik asitten oluşan bir stok çözeltisi hazırlayın. Filtre, çözeltiyi 0.2 μm'lik bir şırınga filtresinden sterilize eder. Stok solüsyonunu 2 mL steril tüplere alın ve -20 °C'de saklayın.
  3. 0.9835 g amonyum demir sülfat hekzahidratı (M başına 392.14 g) 10 mL RNaz içermeyen suda çözerek 0.25 M amonyum demir sülfat hekzahidrattan oluşan bir stok çözeltisi hazırlayın. Filtre, çözeltiyi 0.2 μm'lik bir şırınga filtresinden sterilize eder. Stok solüsyonunu 2 mL steril tüplere alın ve -20 °C'de saklayın.
  4. 2.383 g HEPE'yi (M başına 238.30 g) 10 mL RNaz içermeyen suda çözerek 1 M HECES'lik bir stok çözeltisi hazırlayın. NaOH kullanarak çözeltinin pH'ını 8'e ayarlayın ve çözeltiyi 0.2 μm'lik bir şırınga filtresinden filtreyle sterilize edin. Stok solüsyonunu 2 mL steril tüplere alın ve -20 °C'de saklayın.
  5. 2x AlkB reaksiyon tamponu hazırlayın. 10 mL tampon yapmak için, 1.5 μL 1 M 2-ketoglutarat (adım 3.1'de yapılır), 80 μL 0.5 M L-askorbik asit (adım 3.2'de yapılır), 6 μL 0.25 M amonyum demir sülfat hekzahidrat (adım 3.3'te yapılır), 100 μL 10 mg / mL BSA, 1000 μL 1 M HEPES (adım 3.4'te yapılır; sonuncu ekleyin), ve 8812.5 μL RNaz içermeyen su. Filtre: tamponu 0,2 μm'lik bir şırınga filtresinden sterilize edin.
    NOT: 2x AlkB reaksiyon tamponu, bileşenlerin kimyasal olarak akışkan olması nedeniyle her deneyden hemen önce taze olarak hazırlanmalıdır.
  6. 20 μL Linker-1-bağlı RNA'lar (adım 2'den ürünler), 50 μL 2x AlkB reaksiyon tamponu (adım 3.5'te yapılır), 2 μL AlkB demetilaz, 1 μL RNaz inhibitörü ve 27 μL RNaz içermeyen su ekleyerek steril bir PCR tüpünde AlkB sindirim reaksiyonunu hazırlayın.
  7. RNA'lardan transkripsiyon sonrası metilasyonları çıkarmak için oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
  8. AlkB'yi reaksiyondan çıkarmak için aşağıda açıklanan adımları izleyin.
    1. Temiz bir faz ayrımı için, AlkB reaksiyonuna 50 μL RNaz içermeyen su ekleyin ve ardından 100 μL fenol: kloroform: izoamil alkol 25: 24: 1 (pH = 5.2) ekleyin.
    2. Elle 10 saniye çalkalayın ve ardından 16.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. Tezgah üstü santrifüjün rotorunun PCR tüpleriyle uyumlu olduğundan emin olun. Gerekirse adaptör kullanın.
    3. RNA'ları (yani üstteki sulu tabaka; yaklaşık 140 μL) steril 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın. Kloroform (yani alt tabaka) sulu tabakaya karıştırılırsa, aynı ayarlarla tekrar santrifüjleyin.
    4. Artık fenolü uzaklaştırmak için ekstrakte edilen RNA'lara 100 μL kloroform ekleyin. Elle 10 saniye çalkalayın ve ardından 16.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin.
    5. RNA'ları (yani üstteki sulu tabaka; yaklaşık 120 μL) steril 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın.
  9. Ekstrakte edilen RNA'ları kolonla saflaştırın. DNA/RNA geri kazanımı ve temizliği için bir kit kullanın (Malzeme Tablosuna bakınız). Sütun saflaştırmasını gerçekleştirmek için adım 2.3'te ayrıntılı olarak açıklanan protokolü izleyin.

4. Fazla Bağlayıcının Kaldırılması 1

NOT: Saflaştırmadan sonra her numuneden bir alikot (1.2 μL) saklanması önerilir. Gerektiğinde, bu alikotlar, ticari bir nükleik asit analizörü çalıştırarak RecJf sindiriminin verimliliğini kontrol etmek için kullanılabilir. Transkripsiyonu tersine çevirmek için saflaştırılmış numunelerle hemen devam edin.

  1. 15 μL Linker-1 bağlı RNA (adım 3'ten ürünler), 1 μL 40 U/μL RNaz inhibitörü, 2 μL 10x kit tamponu 2 (bkz . Malzeme Tablosu) ve 2 μL 50 U/μL 5'-deadenilaz ekleyerek steril bir PCR tüpünde deadenilasyon reaksiyonunu hazırlayın.
  2. Bağlayıcı 1'in 5' ucundaki adenini çıkarmak için 30 ° C'de 1 saat inkübe edin. Deadenilasyon reaksiyonuna 2 μL 30 U/μL RecJf ekleyin.
  3. Fazla Bağlayıcı 1'i sindirmek için 37 °C'de 30 dakika inkübe edin. Reaksiyona 2 μL daha 30 U/μL RecJf ekleyin.
  4. Fazla Bağlayıcı 1'in sindirimine devam etmek için 37 ° C'de 30 dakika ve ardından enzimi denatüre etmek için 20 dakika boyunca 65 ° C'de inkübe edin.
  5. Bağlayıcı-1 bağlı RNA'ları kolonla saflaştırın. Kısa kalıntıları (örneğin, 2 ila 10 bp uzunluğunda oligonükleotidler) uzaklaştırmada etkili olduğundan, boya sonlandırıcılarını sıralama reaksiyonlarından çıkarmak için jel filtreleme teknolojisini kullanan bir kit kullanın (Malzeme Tablosuna bakınız). Arıtma için aşağıda açıklanan adımları izleyin.
    1. Jel filtre kolonlarını üreticinin protokolüne göre hazırlayın. Bir sütunu 1,5 mL'lik steril bir tüpe yerleştirin ve sütuna 24 μL numune yükleyin.
    2. RNA'ları saflaştırmak için, 3 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin ve sütunu atın. Saflaştırılmış RNA'lar eluentin içindedir.

5. Ters transkripsiyon (RT) reaksiyonu

NOT: Aşağıdaki RT (Malzeme Tablosuna bakınız) reaksiyon kurulumu, AQRNA-seq uyumluluğuna izin vermek için küçük değişikliklerle üreticinin protokolünü takip eder.

  1. 24 μL şablon RNA (adım 4'ten ürünler), 1 μL 2 μM RT primeri (Tablo 1) ve 1 μL dNTP (her nükleotid tipinden 10 mM) ekleyerek RT primer tavlama reaksiyonunu steril bir PCR tüpünde hazırlayın.
  2. RT primerlerini şablon RNA'lara tavlamak için 80 ° C'de 2 dakika inkübe edin ve ardından hemen 2 dakika buz üzerinde soğutun.
  3. Tavlama reaksiyonu tüpüne 6 μL 5x RT reaksiyon tamponu, 1 μL 40 U/μL RNaz inhibitörü ve 1 μL ters transkriptaz ekleyerek RT reaksiyonunu hazırlayın.
  4. RNA şablonlarını ters kopyalamak için 50 ° C'de 2 saat inkübe edin ve ardından enzimi inaktive etmek için 15 dakika boyunca 70 ° C'de inkübe edin. RT ürünleri (yani RNA-cDNA hibritleri) gece boyunca 4 °C veya -20 °C'de saklanabilir.

6. RNA hidrolizi

  1. RNA-cDNA hibritine 1 μL 5 M NaOH ekleyin (5. adımdaki ürünler). RNA-cDNA hibritinin RNA zincirini hidrolize etmek için 93 °C'de 3 dakika inkübe edin.
  2. Reaksiyonu nötralize etmek için 0.77 μL 5 M HCl ekleyin. HCl ekledikten sonra, karıştırmak için hafifçe vurun ve tüpü aşağı doğru döndürün. Nötralizasyon anlıktır.
    NOT: Tamponlanmış koşullarda 1 μL NaOH'yi nötralize etmek için (örn. pH şeritleri kullanılarak) gerekli olan 5 M HCl'nin kesin miktarının test edilmesi önerilir.
  3. Tek sarmallı cDNA'ları sütunla saflaştırın. DNA/RNA geri kazanımı ve temizliği için bir kit kullanın (Malzeme Tablosuna bakınız). Sütun saflaştırmasını gerçekleştirmek için adım 2.3'te ayrıntılı olarak açıklanan protokolü izleyin.
    NOT: Sıralama reaksiyonlarından boya sonlandırıcıları çıkarmak için jel filtreleme teknolojisini kullanan kitler ( Malzeme Tablosuna bakın), önceki adımlardaki pH değişimi nedeniyle burada kullanılamaz.
  4. Saflaştırılmış cDNA'ları < 5 μL'ye kadar hızlandırın ve ardından hacmi 5 μL'ye geri getirmek için RNaz içermeyen su ekleyin. cDNA'ları tamamen kuruyana kadar hızlı vakumlamamaya dikkat edin.
  5. Saflaştırılmış cDNA'ları steril bir PCR tüpüne aktarın. Saflaştırılmış cDNA'lar -20 °C'de 1 haftaya kadar saklanabilir.

7. Bağlayıcı 2'nin cDNA'ların 3' ucuna bağlanması

  1. 5 μL cDNA (6. adımdan ürünler), 1 μL 50 μM Bağlayıcı 2 (Tablo 1), 2 μL 10x T4 DNA ligaz reaksiyon tamponu, 1 μL 10 mM ATP, 9 μL PEG8000 (%50 çözelti) ve 2 μL 400 U/μL T4 DNA ligaz.
    NOT: Numunelerin işlenmesini kolaylaştırmak için reaktifler ana karışım haline getirilebilir. Ana karışıma PEG8000 ve T4 DNA ligaz dahil etmeyin.
  2. Bağlayıcı 2'yi cDNA'lara bağlamak için 16 ° C'de 16 saat inkübe edin.
  3. Bağlayıcı-2 bağlı cDNA'ları kolonla saflaştırın. DNA/RNA geri kazanımı ve temizliği için bir kit kullanın (Malzeme Tablosuna bakınız). Sütun saflaştırmasını gerçekleştirmek için adım 2.3'te ayrıntılı olarak açıklanan protokolü izleyin.

8. Fazla Bağlayıcı 2'nin Kaldırılması

  1. 16 μL Linker-2 ile bağlanmış cDNA, 2 μL 10x kit tamponu 2 ve 2 μL 50 U/μL 5'-deadenilaz ekleyerek steril bir PCR tüpünde deadenilasyon reaksiyonunu hazırlayın. Bağlayıcı 2'nin 5' ucundaki adenin'i çıkarmak için 30 ° C'de 1 saat inkübe edin.
  2. Deadenilasyon reaksiyonuna 2 μL 30 U/μL RecJf ekleyin. Fazla Bağlayıcı 2'yi sindirmek için 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin. Reaksiyona 2 μL daha 30 U/μL RecJf ekleyin.
  3. Fazla Bağlayıcı 2'nin sindirimine devam etmek için 37 ° C'de 30 dakika ve ardından enzimi denatüre etmek için 20 dakika boyunca 65 ° C'de inkübe edin.

9. Dizileme primerleri ile cDNA'ların PCR amplifikasyonu

  1. Numunelere PCR primerleri atayın. Her numune, etkili çoğullama için benzersiz bir ileri ve geri primer kombinasyonuna ihtiyaç duyar (Tablo 1).
  2. Numune hacmini 25 μL'ye getirmek için RNaz içermeyen su ekleyin. PCR'nin tekrarlanması gerekmesi durumunda yedek olarak her numuneden 5 μL'yi steril bir PCR tüpüne kaydedin.
  3. 20 μL cDNA (8. adımdaki ürünler), 1 μL 2.5 μM ileri astar, 1 μL 2.5 μM ters astar, 25 μL 2x DNA polimeraz tamponu, 2 μL RNaz içermeyen su ve 1 μL DNA polimeraz ekleyerek PCR reaksiyonunu hazırlayın (PCR kiti için Malzeme Tablosuna bakın).
    NOT: Numunelerin işlenmesini kolaylaştırmak için reaktifler ana karışım haline getirilebilir. Ana karışıma DNA polimeraz eklemeyin.
  4. 1 dakika boyunca 94 ° C'de ilk denatürasyon ile PCR gerçekleştirin, ardından 20 saniye boyunca 98 ° C'de 18 döngü denatürasyon yapın - 20 saniye boyunca 58 ° C'de tavlama - 68 ° C'de 1 dakika uzatma.
    NOT: PCR'yi doğrusal aralığın ötesine yükseltmeyin. Çoğu deney için toplam 18 döngü en uygun olacaktır, ancak bu bağlama bağlı olabilir.
  5. PCR ürünlerini 25 μL'nin altına hızlı bir şekilde vakumlayın ve ardından hacmi 25 μL'ye geri getirmek için RNaz içermeyen su ekleyin. Boyut dağılımını kontrol etmek için 5 μL PCR ürününü steril 0,5 mL'lik bir tüpe aktarın (bkz. adım 9.6). Kalan 20 μL PCR ürünlerini sonraki adımlara kadar -20 °C'de saklayın.
  6. PCR ürünlerinin boyut dağılımını aşağıda açıklandığı gibi kontrol edin.
    1. TAE tamponunda% 3 agaroz jeli hazırlayın.
      NOT: Bu protokolde, elektroforez sonrası jel boyama için etidyum bromür (EtBr) kullanılır (bkz. adım 9.6.5). Bu aşamada jel çözeltisine uygun DNA boyaları eklenebilir veya daha sonra jel boyama için kullanılabilir.
    2. 1 μL 6x yükleme boyasını 5 μL PCR ürününe (adım 9.5'ten itibaren) karıştırın ve jeli karışımla doldurun.
    3. İlk numuneden önce kuyuya ve son numuneden sonra kuyuya 5 μL DNA merdiveni yükleyin. PCR ürünlerinin 150 bp ile 300 bp arasında daha iyi boyut ayrımına izin vermek için 50 bp veya 100 bp DNA merdivenleri kullanın.
    4. PCR ürünlerini bulmak için jel elektroforezini çalıştırın. Uygun çalışma koşulu bağlama bağlı olabilir. Burada, 17,78 cm (genişlik) x 10,16 cm (yükseklik) x 1 cm (kalınlık) jel levha için 120 V, 400 mA'da 75 dakika çalıştırın.
    5. Jeli bir kutuya yerleştirin ve jel tamamen daldırılana kadar kutuyu deiyonize (DI) su ile doldurun. Jeli ıslatarak DI suyuna 10 μL EtBr ekleyin. Kutuyu folyo ile sarın ve bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Çalkalarken jeli 30 dakika boyunca boyayın.
    6. EtBr içeren atıkları çeker ocak içine yerleştirilmiş bir atık şişesine atın. Jeli DI suyla bir kez durulayın ve EtBr içeren suyu atık şişesine atın.
    7. Jel tamamen daldırılana kadar kutuyu DI suyla doldurun. Kutuyu folyo ile sarın ve bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Jeli çalkalarken 10 dakika yıkayın.
    8. EtBr içeren suyu çeker ocaktaki atık şişesine atın. Bantları görselleştirmek için bir jel görüntüleyici kullanın. Jelin yüksek çözünürlüklü bir görüntüsünü elde edin.

10. Jel saflaştırma

  1. TAE tamponunda% 3 agaroz jeli hazırlayın. Geniş taraklarla (1 mm kalınlık; 5 mm genişlik; 15 mm derinlik) 1 cm kalınlığında bir jel yapın, böylece her bir kuyucuk en az 25 μL numune yükleme boya karışımı içerebilir.
  2. 4 μL 6x yükleme boyasını 20 μL PCR ürünleriyle (adım 9.5'ten itibaren) karıştırın ve jeli karışımla doldurun. Jel eksizyonu sırasında çapraz kontaminasyonu en aza indirmek için numuneler arasında boş şeritler bırakın.
  3. DNA merdivenlerini yükleyin, jel elektroforezini çalıştırın, jeli boyayın ve yıkayın ve adım 9.6'da açıklandığı gibi jel görüntüleri alın.
  4. Hedef boyut aralığında PCR ürünleri içeren jel bloklarını çıkarın. Astar dimerleri (insertsiz 175 bp bağlayıcılar) ile kontaminasyonu en aza indirmek için, boyutu 195 bp'nin üzerinde olan PCR ürünlerini çıkarın (175 bp bağlayıcılar + 20 bp miRNA).
  5. Jel ekstraksiyonu kullanarak PCR ürünlerini saflaştırın. Bir jel ekstraksiyon kiti kullanın (Malzeme Tablosuna bakınız). Saflaştırma protokolü, AQRNA-seq uyumluluğu için küçük değişikliklerle birlikte üreticinin protokolüne dayanmaktadır. Tüm santrifüjleme adımları, aksi belirtilmedikçe, oda sıcaklığında bir tezgah üstü santrifüj kullanılarak 1 dakika boyunca 17.900 x g'da gerçekleştirilmelidir. Aşağıda açıklanan adımları izleyin.
    1. Tüplerin içindeki jel blokların ağırlığını ölçün. 1 hacim jel bloğa (1 mg jel yaklaşık 1 μL'dir) 6 hacim Tampon QG (kitte verilir) ekleyin.
    2. 50 ° C'de 10 dakika veya jel blokları tamamen çözünene kadar inkübe edin. Jel çözünmesini kolaylaştırmak için her 2 dakikada bir vorteks tüpleri. Jeli çözdükten sonra, karışım çözünmüş jel olmadan Buffer QG'nin rengine benzemelidir. Renk turuncu veya mor ise, 10 μL 3 M sodyum asetat (pH = 5.0) ekleyin ve iyice karıştırın.
    3. Karışıma 1 jel hacimde izopropanol ekleyin ve iyice karıştırın. 2 mL'lik bir toplama tüpüne (kitte verilir) bir döndürme sütunu yerleştirin.
    4. DNA'yı bağlamak için numuneyi (her seferinde 750 μL'ye kadar) kolona ve santrifüje uygulayın. Akışı atın ve sütunu aynı toplama tüpüne geri yerleştirin. Sıkma kolonu başına maksimum jel miktarı 400 mg'dır.
    5. Kolona ve santrifüje 500 μL Tampon QG ekleyin. Akışı atın ve sütunu aynı toplama tüpüne geri yerleştirin.
    6. Kirleri yıkamak için, kolona 750 μL Tampon PE (kitte verilir) ekleyin, kolonu 5 dakika bekletin ve santrifüjleyin. Akışı atın ve sütunu aynı toplama tüpüne geri yerleştirin. Kalan yıkama tamponunu çıkarmak için bir kez daha santrifüjleyin.
    7. Kolonu 1,5 mL'lik steril bir tüpe yerleştirin. DNA'yı elüte etmek için, kolon zarının ortasına 30 μL Tampon EB (kitte verilir) ekleyin, kolonun 4 dakika bekletilmesine izin verin ve santrifüjleyin.
    8. Jel ile saflaştırılmış PCR ürünlerini 12 μL Tampon EB içinde hızlandırın ve yeniden süspanse edin.
  6. Oluşturulan kitaplıkların konsantrasyonunu UV-Görünür spektrofotometri ve/veya florometrik miktar tayini ile ölçün.

11. Kütüphane sıralaması

  1. Oluşturulan kitaplıkları kalite değerlendirmesi ve Illumina dizilemesi için harici bir sıralama merkezine gönderin. Küçük RNA manzaralarının kantitatif haritalanmasında yeterli hassasiyeti sağlamak için, her yönden 75 bp okumalı (yani PE75) eşleştirilmiş uçlu dizilemeyi tercih edin ve her numune için her yönde en az 1,5 M ham dizi okumasını hedefleyin. NextSeq dizilimi için özel astarlar (Tablo 1) kullanın, ancak bu, MiSeq'te sıralama için isteğe bağlıdır.
    NOT: Sıralama, MiSeq veya NextSeq500 platformları kullanılarak gerçekleştirilebilir. Platform seçimi, numunelerin doğasına ve toplam numune sayısına bağlı olabilir.

12. Veri analizi boru hattı

NOT: Şekil 2 , ham dizi okumalarını (FASTQ biçiminde) girdi olarak alan ve ilgilenilen küçük RNA türlerinin üyelerini temsil eden satırlar ve örnekleri temsil eden sütunlar içeren bir bolluk matrisi oluşturan veri analitiği boru hattında yer alan basitleştirilmiş prosedürlerin grafiksel bir gösterimini sağlar. Eşleştirilmiş uç sıralaması için her örnek, biri ileri okumalar ve diğeri geri okumalar için olmak üzere iki FASTQ dosyasına karşılık gelir. Tüm ilişkili komut dosyaları ve her adım için kapsamlı ek açıklamalar içeren bir kılavuzla birlikte eksiksiz veri analizi işlem hattı GitHub'da (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git) mevcuttur.

  1. Harici sıralama merkezinden ham dizi okumalarını alın ve FastQC14 veya fastp15 gibi açık kaynaklı programları kullanarak sıralama kalitesini değerlendirin.
  2. FASTA formatında bir referans dizisi kitaplığı oluşturun.
    NOT: Boru hattının çeşitli küçük RNA sınıflarına uyarlanabilirliğinin anahtarı, uygun bir referans dizisi kitaplığıdır. Belirli RNA ilgili sınıflarının (örneğin, miRNA) üyelerinin doğru bolluk tahminlerini elde etmek için, kullanıcıların boru hattıyla kullanılmak üzere bir referans dizisi kitaplığını titizlikle seçmeleri beklenir. Boru hattı yürütme için diğer tüm talimatlar, farklı küçük RNA sınıfları arasında tutarlı kalır.
  3. Veri analizi işlem hattını uygulamak için AQRNA-seq adlı bir dizin oluşturun ve tüm komut dosyalarını, kalite filtrelenmiş dizi okumalarını ve referans dizisi kitaplığını bu dizine yerleştirin. Farklı organizmaları ve/veya küçük RNA türlerini hedeflemek için alt dizinler hazırlamak ve dosyalarda önemli değişiklikler yapmak için GitHub'daki (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git) ayrıntılı talimatları izleyin, ayrıca işletim sistemi ve/veya iş zamanlayıcının uyumluluğunu izleyin.
  4. Açıklamaları, giriş ve çıkış dosyalarını ve her adım için komut satırlarını içeren GitHub'daki (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git) kılavuzda özetlenen adımları izleyerek veri analizi işlem hattını uygulayın. Özetle, boru hattı (i) okumalardan bağlayıcı dizilerinin ve rastgele nükleotidlerin kırpılmasını, (ii) uzunluklarına göre okumaların filtrelenmesini, (iii) okumaların referans dizileriyle eşlenmesini, (iv) belirsiz eşlemelerin çözülmesini ve (v) bolluk matrisinin oluşturulmasını kapsar.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikobakteri bovis Üstel büyüme geçiren BCG (bacilli de Calmette et Guérin) suşu 1173P2, bir zaman serisine (0, 4, 10 ve 20 gün) besin açlığına tabi tutuldu, ardından daha önce Hu ve ark.7'de sunulduğu gibi besin açısından zengin ortamda 6 günlük bir resüsitasyon izledi. Küçük RNA'lar, belirlenen beş zaman noktasının her birinde üç biyolojik kopya ile bakteri kültüründen izole edildi. Illumina kütüphaneleri, yukarıda açıklanan AQRNA-seq kütüphane hazırlama iş akışı (Şekil 1) kullanılarak oluşturuldu ve ardından Massachusetts Institute of Technology'nin BioMicro Center'daki bir sıralayıcı üzerinde dizileme yapıldı. Dizileme verileri daha sonra tRNA bolluğunun nicelleştirilmesi için özelleştirilmiş AQRNA-seq veri analitiği boru hattı (Şekil 2) kullanılarak işlendi.

cDNA kütüphanesinin dizileme primerleri ile PCR amplifikasyonundan sonra, tüm numunelerde 175 baz çifti (bp) boyutunda PCR ürünlerinin varlığı gözlendi (Şekil 3A), bu da primer dimerlerinin oluşumunu düşündürdü. Primer dimerlerin taşınmasını azaltmak için, boyutu 195 bp'yi aşan PCR ürünleri jelden çıkarıldı ve saflaştırıldı (Şekil 3B).

Kalite filtreli ve kırpılmış dizi okumaları, 45 tRNA izoalıcıları, dahili standart ve kontrol dizileri (yani, 23S rRNA, 16S rRNA, 5S rRNA, rnpB ve ssr) dahil olmak üzere özel bir referans dizi kitaplığına eşlendi. tRNA izoseptörleri, belirli bir numunenin toplam eşlenen okumalarının .5 ila @.2'sini oluşturdu ve kontrol dizilerinden çok daha yüksek bir bolluk gösterdi (Şekil 4). Daha da önemlisi, tRNA izoseptörlerinin nispeten düşük okuma oranları, iç standartların daha yüksek nispi bolluğuna bağlanabilir. Bu nedenle, tRNA izoeseptörlerinin iç standartlara göre okuma oranları (Şekil 4, pembe ve yeşil renk blokları), reaksiyona giren iç standart miktarında ince ayar yapılarak operatör tarafından kontrol edilebilir.

Ham tRNA bolluk verileri, R İstatistiksel Programlama Ortamında (bundan böyle R olarak anılacaktır) 1.36.016 paket versiyonu (bundan böyle v olarak anılacaktır) v 4.2.117 ile uygulanan medyan oran yöntemi kullanılarak normalize edildi. Normalleştirmeden sonra, besin açlığı ve resüsitasyon süresi boyunca Mycobacterium bovis BCG'deki tRNA izoseptörlerinin kantitatif bir manzarası elde edilir (Şekil 5).

tRNA izoseptör bolluğundaki modellere dayalı olarak farklı fenotiplere sahip farklı numune kümelerini ortaya çıkarmak için, R'de v 4.2.117 istatistik paketi kullanılarak normalleştirilmiş tRNA bolluğu verileri üzerinde Temel Bileşen Analizi (PCA) gerçekleştirildi (Şekil 6). Analiz, açlık günü 0 ve resüsitasyon günü 6 örneklerini açlık günü 4, 10 ve 20 örneklerinden ayırdı, bu da besin açısından yoksun ortamda ve besin açısından zengin ortamda yetiştirilen Mycobacterium bovis BCG'nin tRNA manzarasında önemli bir fark olduğunu düşündürdü.

Belirlenen beş zaman noktası boyunca her bir tRNA izoeperatörünün bolluğunun dinamiklerini profillemek için, R'de DESeq2 paketi v 1.36.0 kullanılarak normalleştirilmiş tRNA bolluk verileri üzerinde diferansiyel ekspresyon analizi yapıldı (Şekil 7). Analiz, 20 izoedüktör ailesinin 17'sinin, zaman noktalarından en az birinde diferansiyel olarak eksprese edilen (yani önemli ölçüde yukarı veya aşağı regüle edilmiş) izoseptörler içerdiğini ortaya koydu, bu da tüberküloz sırasında Mycobacterium bovis BCG'nin kalıcı durumunda tRNA havuzunun düzenlenmesinin potansiyel bir rolünü düşündürmektedir.

figure-results-1
Şekil 1: AQRNA-seq kütüphanesi hazırlama iş akışının şeması. İş akışında özetlenen temel adımlar şemanın ortasında listelenir ve ilgili grafik çizimlerine noktalı çizgilerle bağlanır. Her adımın ayrıntılı açıklaması Protokol bölümünde bulunabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: AQRNA-seq veri analizi boru hattının şeması. Boru hattında özetlenen temel adımlar şemanın ortasında listelenir ve noktalı çizgilerle ilgili grafik çizimlerine bağlanır. Her adımın ayrıntılı açıklaması GitHub'da (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git) mevcuttur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Dizileme primerleri ile PCR amplifikasyonundan sonra cDNA fragmanlarının agaroz jel elektroforezi. (A) Jel ekstraksiyonu ve saflaştırmasından önce jelin görüntüsü. Sol taraftaki 7 ve 14 numaralı şeritler 50 bp DNA merdiveninin 5 μL'sini içerirken, diğer şeritler 15 örneğin her birinden 20 μL içerir. PCR ürünlerinin boyut lokalizasyonu, 175 bp (primer dimerler) ila 300 bp (iki primer + 120 bp 5S rRNA) aralığında en yüksek konsantrasyonlarını gösterir. (B) Jel ekstraksiyonu ve saflaştırılmasından sonra jelin görüntüsü. Her numune için, 200 bp ile 400 bp arasındaki jel blok, sıralama kütüphanesindeki primer dimerlerin kontaminasyonunu en aza indirmek için eksize edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Referans dizi kitaplığına başarıyla eşlenen dizi okumalarının sayısı. X ekseni, örneklerin adlarını (örneğin, D18-69XX) zaman noktasına göre gruplandırılmış olarak gösterir (örneğin, Açlık Günü 0). Her örnek için, çeşitli hedef konu kategorileriyle ilişkili okuma sayısı, üst üste yığılmış renk blokları kullanılarak temsil edilir. Renk bloklarının merkezinde yer alan sayılar, belirli bir örneklem içindeki ilgili hedef konulara karşılık gelen okuma oranlarını temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Mycobacterium bovis BCG'nin tRNA izoalıcılarının açlık ve resüsitasyon zaman seyri boyunca çeşitli zaman noktalarında kantitatif manzarası. Ham tRNA bolluk verileri, medyan oran yöntemi kullanılarak normalize edildi. Burada, her satır, normalleştirilmiş tRNA bolluklarını (y ekseni) her zaman noktasında 3 biyolojik kopya için ortalama ± standart hata olarak gösterir. X ekseninde, aynı aileden izoeperatörler birlikte gruplandırıldı ve karşılık gelen amino asit ile etiketlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: Temel bileşen analizinden (PCA) türetilen örneklerin kare-kosinüs grafiği. PCA, normalleştirilmiş tRNA bolluğuna dayalı olarak gerçekleştirildi. Kare kosinüs, ana bileşenlerin numuneler için önemini gösterir ve numuneler, ilk iki ana bileşenin kare kosinüsüne göre çizilmiştir. Numuneler, numune kimlikleri kullanılarak etiketlendi ve zaman noktasına göre renk kodlandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-7
Şekil 7: Farklı zaman noktalarında tRNA izoepertörlerinin diferansiyel ifadesi. Normalleştirilmiş tRNA bollukları, 3 biyolojik replikat boyunca ortalamalar (çizgi düğümleri) ± standart hata (hata çubukları) olarak özetlendi. Alan sınırlaması nedeniyle, koşullar şu şekilde kısaltıldı: S0-S20 = açlık günleri 0-20; R6 = resüsitasyon günü 6. Her bir tRNA izoeseptörü için, olasılık oranı testi ve Wald testi kullanılarak çeşitli zaman noktalarını ikili bir şekilde karşılaştırarak diferansiyel ekspresyon analizi yapıldı. Kompakt harfler, en az bir ortak harfi paylaşan zaman noktalarında belirli bir tRNA izoalıcısının bolluğunun birbirinden önemli ölçüde farklı olmadığı istatistiksel anlamlılığı temsil etmek için kullanıldı. Örneğin, tRNA-Lys-CTT-1-1'in (Lizin panelinde) bolluğu, S0'dan S4'e ve S4'ten S10'a önemli ölçüde aşağı regüle edildi, ancak S10'dan S20'ye değil. Daha sonra S20'den R6'ya önemli ölçüde yukarı regüle edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: AQRNA-seq kütüphane hazırlama iş akışında yer alan oligonükleotidler. İç standart RNA'dır, diğer tüm oligonükleotidler ise DNA'dır. Listelenen PCR primerleri ve özel dizileme primerleri, dizileme platformlarına özgüdür. Yeni indeks dizileri ile ek PCR primerleri tasarlanabilir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AQRNA-seq kütüphanesi hazırlama iş akışı, bir numune içindeki RNA'ların yakalanmasını en üst düzeye çıkarmak ve ters transkripsiyon 7 sırasında polimeraz düşüşünü en aza indirmek içintasarlanmıştır. İki aşamalı bir bağlayıcı ligasyonu yoluyla, yeni DNA oligoları (Bağlayıcı 1 ve Bağlayıcı 2), numune içindeki RNA'yı tam olarak tamamlamak için fazla miktarda bağlanır. Fazla bağlayıcılar, tek sarmallı DNA'lara özgü 5' ila 3' eksonükleaz olan RecJf ile verimli bir şekilde çıkarılabilir ve bağlanmış ürünler bozulmadan bırakılabilir. Ek olarak, AlkB tedavisi, ters transkripsiyon sırasında polimeraz düşüşüne neden olabilecek RNA'lar18 üzerindeki metil modifikasyonlarını azaltır ve böylece artefakt kesilmiş cDNA ürünleri sorununu hafifletir. AQRNA-seq, ligasyon ve amplifikasyon verimliliklerini sistematik olarak optimize etmek için bildirilen ilk yöntemi temsil eder. AQRNA-seq, kantitatif doğruluğu ve yanlılık artefaktlarının olmaması nedeniyle doğrulanmıştır ve miRNA profilleme çalışmaları için en doğru uygulama olduğu gösterilmiştir.

AQRNA-seq özellikle kapsamlıdır ve kütüphane hazırlığı sırasında sıcaklığa ve/veya zamana duyarlı adımlar için operasyonel bakım önerilir. Spesifik olarak, numunelerin doğası gereği kararsız tek sarmallı RNA (ssRNA) veya DNA bağlayıcı bağlı ssRNA içerdiği cDNA sentezinden önceki adımlar (Şekil 1; adım 1-4), gereksiz kesintiler olmadan gerçekleştirilmelidir. Yüksek sıcaklıkta güçlü baz kullanan RNA hidrolizi (Şekil 1; adım 6), ters transkripsiyondan sonra RNA şablonlarının sindirilmesinde oldukça etkilidir19. Bununla birlikte, özellikle büyük bir numune sayısı göz önüne alındığında, numunenin güçlü baza uzun süre maruz kalmasını ve güçlü asitle gecikmeli nötralizasyonu önlemek için özen gösterilmesi gerekir. Genel olarak, tüm reaksiyonların buz üzerinde hazırlanması ve kütüphane ara ürünleri için tekrarlanan donma-çözülme döngülerinden kaçınılması şiddetle tavsiye edilir.

Kalite kontrolleri ve sürecin zamanında sorun giderme için iş akışı boyunca kilit noktalarda kitaplık ara ürünlerinin örneklenmesi önerilir. Numunelerin otomatik elektroforez araçlarında analiz edilmesi, bağlayıcı ligasyonunun başarısını ve verimliliğini belirleyebilir (Şekil 1; adım 2 ve 7). Dizileme primerlerinin PCR eklenmesinden sonra indekslenmiş cDNA ürünlerinin lokalizasyonunun agaroz jel elektroforezi yoluyla görselleştirilmesi (Şekil 1; adım 9), PCR döngülerinin yeterliliğinin değerlendirilmesinin yanı sıra numunelerin olası bozunmasının ve/veya primer dimerlerinin varlığının belirlenmesine yardımcı olabilir. PCR ve sıralama primerleri, operatörün ilgilendiği dizileme platformuyla uyumlu olacak şekilde yeniden tasarlanabilir.

Kısmen kütüphane hazırlığında yer alan farklı tasarımlar nedeniyle, AQRNA-seq veri analitiği boru hattı, öncelikle yalnızca bir avuç mevcut biyoinformatik programını içeren özel komut dosyalarından oluşan bir şekilde oluşturulmuştur. Bununla birlikte, dizi okumalarını referans dizi kitaplığına göre hizalamak için, AQRNA-seq veri analizinin özel ihtiyaçlarını karşılayan çeşitli güçlü yönleri nedeniyle Temel Yerel Hizalama Arama Aracı (BLAST)20 kullanılmıştır. Bunlar arasında (i) 20 bp'den daha kısa okumaları hizalama ve alt dize hizalamaları gerçekleştirme yeteneği, (ii) belirsiz tabanların (N'ler) mantıklı bir şekilde ele alınması, (iii) biraz daha yüksek hizalama doğruluğu ve (iv) çeşitli aşağı akış analizlerine elverişli olan uyumsuzluklar ve boşluklar gibi önemli ayrıntılar sağlayan bilgilendirici çıktı yer alır.

Özellikle, hem kütüphane hazırlama iş akışında hem de AQRNA-seq'in veri analitiği hattında, daha fazla optimizasyonu garanti eden ve mevcut devam eden çalışmanın odağını temsil eden çeşitli tasarım zorlukları bulunmaktadır. İlk olarak, AQRNA-seq'in geleneksel RNA-seq yöntemlerine kıyasla üstün kantitatif doğruluğu, 50-75 ng küçük RNA girişi ile elde edilirken, iş akışı şu anda duyarlılığını artırmak için azaltılmış miktarlarda giriş RNA'ları ve faydasını genişletmek için daha uzun RNA'lar ile test edilmektedir. İkincisi, transkripsiyon sonrası metilasyon AlkB ile enzimatik olarak uzaklaştırılsa da, ters transkripsiyon10 sırasında polimeraz düşüşüne neden olabilecek başka RNA modifikasyonları da vardır. Bu, tam uzunlukta tRNA'ların biyolojik olarak anlamlı 5' bozunmasından etkili bir şekilde ayırt edilemeyen artefakt kesilmiş cDNA ürünlerine yol açabilir. Bu nedenle, ters transkriptaz prosesitivitesini daha da iyileştirmenin birkaç olası yolu şu anda AQRNA-seq ile etkinlik ve uyumluluk açısından değerlendirilmektedir. Üçüncüsü, jel ekstraksiyonu ve saflaştırma yoluyla primer dimerlerinin uzaklaştırılması verimsizdir ve her zaman hedef fragmanların kaybına ve kütüphaneler arasında değişkenliğin artmasına neden olur. Bu nedenle, hedef parçaları kaybetmeden primer dimerlerinin potansiyel taşınmasını azaltmak, AQRNA-seq'in hassasiyetini ve nicel doğruluğunu daha da artırmak için bir fırsatı temsil eder. Daha da önemlisi, hem AlkB işlemi hem de jel ekstraksiyonu ve saflaştırılması emek yoğundur ve bu da onları çok sayıda numuneyi işlemek için yetersiz hale getirir. Yukarıdaki alanlarda elde edilen iyileştirmelerle, gelecekte AQRNA-seq yönteminin otomasyonu ve yüksek verimli işlenmesi sağlanacaktır. Veri analizi boru hattının devam eden iyileştirmesi, verimlilik, nicel doğruluk ve esneklikteki iyileştirmelere öncelik verir. Mevcut boru hattı, dizi okumalarından 3' adaptörleri etkili bir şekilde keserken, bir okuma alt kümesi, muhtemelen ligasyon sırasında bağlayıcıların 3' ucunun yetersiz bloke edilmesi nedeniyle 5' adaptör dizilerine de sahiptir. 5' adaptör dizilerinin varlığı, dizi okuma hizalamasına müdahale ederek nicel doğruluğu tehlikeye atabilir. Bu nedenle, hem 3' hem de 5' adaptör dizilerinin uygun şekilde çıkarılması, Cutadapt21 gibi ek adaptör kırpma araçları kullanılarak garanti edilecektir. Verimliliği artırmak için, revize edilmiş boru hattı, bilgi işlem süresini azaltmak için rasyonel stratejileri entegre edecektir. Bu, önemli bir örtüşme tanımlayarak ileri ve geri okumaları birleştirmek için eşleştirilmiş bir son okuma montaj adımını ve her kitaplıktaki oluşumlarıyla birlikte benzersiz dizilerin çıkarılmasını içerir. Bu tür stratejilerin, (i) her iki yönden gelen okumaların ve (ii) AQRNA-seq kitaplıklarının dizi okuma havuzuna hakim olabilecek yinelenen dizilerin gereksiz analizinden kaçınarak aşağı akış hesaplama süresini önemli ölçüde azaltması beklenmektedir. İleriye dönük olarak, AQRNA-seq'in hem kütüphane hazırlama iş akışının hem de veri analitiği boru hattının sinerjik optimizasyonu, tüm RNA formlarının (örneğin, transkriptom, tRNA fragmanları ve dolaşımdaki tümör RNA'ları gibi nadir RNA türleri), tRNA modifikasyonlarının haritalanması ve biyobelirteç ve keşif biyolojisinin diğer önemli alanlarının titiz kantitatif araştırmasında muhtemelen çeşitli fırsatlar açacaktır.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

P.C.D., yayınlanan çalışmayla ilgili iki patentin (PCT/US2019/013714, US 2019/0284624 A1) mucididir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmanın yazarları, AQRNA-seq teknolojisinianlatan orijinal makalenin yazarlarına minnettardır 7. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (ES002109, AG063341, ES031576, ES031529, ES026856) ve Singapur-MIT Araştırma ve Teknoloji Antimikrobiyal Direnç IRG İttifakı aracılığıyla Singapur Ulusal Araştırma Vakfı'ndan alınan hibelerle desteklenmiştir.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-ketoglutarat Sigma-Aldrich75890Çalışan bir çözelti (1 M) hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın; C
2100 Biyoanalizör CihazıAgilentG2938C
Adenozin 5'-Trifosfat (ATP) New England BiolabsM0437M (bileşen #: N0437AVIAL)NEB M0437M, T4 RNA Ligaz 1 (30 U/μ L), T4 RNA Ligaz Reaksiyon Tamponu (10X), PEG 8000 (1X) ve ATP (100 mM); çalışan bir çözelti (10 mM) hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın; C
AGAROSE GPG/LEAmericanBioAB00972-00500Ortam sıcaklığında saklayın
Amonyum demir(II) sülfat hekzahidratSigma-AldrichF2262Çalışan bir çözelti (0.25 M) hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın; C
Biyoanalizör Küçük RNA AnaliziAgilent5067-1548 Küçük RNA Analizi, girdi RNA'larının kalitesini ve enzimatik reaksiyonların verimliliğini kontrol etmek için kullanılır (örneğin, Bağlayıcı 1 ligasyonu)
Sığır Serum Albümini (BSA; 10 mg / mL) New England BiolabsB9000Bu ürün 12/15/2022 tarihinde kullanımdan kaldırılmış ve Rekombinant Albümin, Moleküler Biyoloji Sınıfı (NEB B9200) ile değiştirilmiştir.
Kloroform Macron İnce Kimyasallar4441-10
Demetilaz ArrayStarAS-FS-004Demetilaz, rtStar tRNA Ön Arıtma ve Birinci İplikli cDNA Sentez Kiti (AS-FS-004
)Deoksinükleotid (dNTP) Çözelti KarışımıNew England BiolabsN0447L (bileşen #: N0447LVIAL)Bu dNTP Çözelti Karışımı, dATP, dCTP, dGTP ve dTTP'nin eşmolar konsantrasyonlarını içerir (her biri 10 mM)
Dijital Çift Isı BloğuVWR Bilimsel Ürünler13259-052Isıtma bloğu QIAquick  ile birlikte kullanılır; Jel Ekstraksiyon Kiti 
Boya Ex  2.0 Döndürme Kiti Qiagen63204 Kısa kalıntıların uzaklaştırılmasında etkilidir (örneğin, uzunluğu 10 bp'den az olan oligolar)
Elektroforez GüçKaynağı Bio-Rad LabrotoriesPowerPac 300
Eppendorf PCR Tüpleri (0,5 mL)Eppendorf0030124537
Eppendorf Güvenli Kilit Tüpleri (0,5 mL)Eppendorf022363611
Eppendorf Güvenli Kilit Tüpleri (1,5 mL)Eppendorf022363204
Eppendorf Güvenli Kilit Tüpleri (2 mL)Eppendorf022363352
Etil alkol (Etanol), SafSigma-AldrichE7023 Saf etanol, Zymo Research'ün Oligo Temizleme ve Yoğunlaştırıcı Kiti ile birlikte kullanılır
Jel Görüntüleme SistemiAlpha InnotechFluorChem 8900
Jel Yükleme Boyası, Mor (6X), SDS yokNew England BiolabsN0556S (bileşen #: B7025SVIAL)NEB N0556S, Hızlı Yükleme Mor 50 bp DNA Merdiveni ve Jel Yükleme Boyası içerir, Mor (6X), SDS
yok GENESYS 180 UV-Vis SpektrofotometreThermo Fisher Scientific840-309000Spektrofotometre, Bira yasasını kullanarak oligo konsantrasyonlarını ölçmek için kullanılır
HEPESSigma-AldrichH4034Çalışma çözeltisi hazırlayın (1 M; NaOH ile pH = 8) ve -20 °C'de saklayın; C
Hidroklorik asit (HCl) VWR Bilimsel ÜrünlerBDH3028 Çalışan bir solüsyon (5 M) hazırlayın ve ortam sıcaklığında saklayın
İzopropil Alkol (İzopropanol), SafMacron İnce Kimyasallar3032-16İzopropanol, QIAquick  ile birlikte kullanılır; Jel Ekstraksiyon Kiti 
L-Askorbik asitSigma-AldrichA5960Bir çalışma çözeltisi (0,5 M) hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın; C
MikrosantrifüjEppendorf5415D
NanoDrop 2000 SpektrofotometreThermo Fisher ScientificND-2000
NEBuffer 2 (10X)New England BiolabsM0264L (bileşen #: B7002SVIAL)NEB M0264L, RecJf (30 U/μ L) ve NEBuffer 2 (10X); -20 & °C'de saklayın; C
Nükleaz İçermeyen Su (DEPC ile Arıtılmamış)Thermo Fisher ScientificAM9938 
Oligo Temiz & Konsantratör Kiti Zymo AraştırmaD4061 Ortam sıcaklığında saklayın
PEG 8000 (%50 çözelti) New England BiolabsM0437M (bileşen #: B1004SVIAL)NEB M0437M, T4 RNA Ligaz 1 (30 U/μ L), T4 RNA Ligaz Reaksiyon Tamponu (10X), PEG 8000 (1X) ve ATP (100 mM); çalışan bir çözelti (10 mM) hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın; C
Peltier Termal DöngüleyiciMJ AraştırmaPTC-200
Fenol: choloroform: izoamil ve nbsp; alkol 25:24:1 pH = 5.2 Thermo Fisher BilimselJ62336 
PrimeScript Tamponu (5X)TaKaRa2680A 
PrimeScript Ters TranskriptazTaKaRa2680A 
QIAhızlı  Jel Ekstraksiyon Kiti Qiagen28704çalışmak için bir ısıtma bloğu ve izopropanol gerektirir
New England BiolabsN0556S (bileşen #: N0556SVIAL)NEB N0556S, Hızlı Yükleme Mor 50 bp DNA Merdiveni ve Jel Yükleme Boyası, Mor (6X) içerir, SDS içermez
RecJf  (30 U/μ L) New England BiolabsM0264L (bileşen #: M0264LVIAL)NEB M0264L, RecJf (30 U/μ L) ve NEBuffer 2 (10X); -20 & °C'de saklayın; C
RNaz İnhibitörü (murin; 40 U/μ L) New England BiolabsM0314L ( bileşen #: M0314LVIAL)-20 derecede saklayın > C
SeqAMP  DNA Polimeraz TaKaRa638509 TaKaRa 638509 SeqAMP  içerir; DNA Polimeraz  ve SeqAMP  PCR Tamponu (2X)
SeqAMP  PCR Tamponu (2X) TaKaRa638509 TaKaRa 638509 SeqAMP  içerir; DNA Polimeraz  ve SeqAMP  PCR Tamponu (2X)
Karides Alkalin Fosfataz (1 U/μ L) New England BiolabsM0371L ( bileşen #: M0371LVIAL)
Sodyum hidroksit (NaOH)Sigma-Aldrichve nbsp; S5881Çalışan bir çözelti (5 M) hazırlayın ve ortam sıcaklığında saklayın
T4 DNA Ligaz (400 U/μ L) New England BiolabsM0202L ( bileşen #: M0202LVIAL)NEB M0202L, T4 DNA Ligaz (400 U/μ L) ve T4 DNA Ligaz Reaksiyon Tamponu (10X)
T4 DNA Ligaz Reaksiyon Tamponu (10X)  New England BiolabsM0202L ( bileşen #: B0202SVIAL)NEB M0202L, T4 DNA Ligaz (400 U/μ L) ve T4 DNA Ligaz Reaksiyon Tamponu (10X)
T4 RNA Ligaz 1 (30 U/μ L) New England BiolabsM0437M (bileşen #: M0437MVIAL)NEB M0437M, T4 RNA Ligaz 1 (30 U/μ L), T4 RNA Ligaz Reaksiyon Tamponu (10X), PEG 8000 (1X) ve ATP (100 mM)
T4 RNA Ligaz Reaksiyon Tamponu (10X)  New England BiolabsM0437M (bileşen #: B0216SVIAL)NEB M0437M, T4 RNA Ligaz 1 (30 U/μ L), T4 RNA Ligaz Reaksiyon Tamponu (10X), PEG 8000 (1X) ve ATP (100 mM)
Bu kit, Hızlı Yükleme Mor 100 bp DNA Merdiveni New England Biolabs N0551S (bileşen #: N0551SVIAL) Hızlı Yükleme Mor 50 bp DNA Merdiveni ile

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Byron, S. A., Van Keuren-Jensen, K. R., Engelthaler, D. M., Carpten, J. D., Craig, D. W. Translating RNA sequencing into clinical diagnostics: opportunities and challenges. Nat Rev Gen. 17 (5), 257-271 (2016).
  2. Grillone, K., et al. Non-coding RNAs in cancer: platforms and strategies for investigating the genomic "dark matter.". J Exp Clin Cancer Res. 39 (1), 117(2020).
  3. Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Exp Mol Med. 50 (8), 1-14 (2018).
  4. Goh, J. J. L., et al. Highly specific multiplexed RNA imaging in tissues with split-FISH. Nat Methods. 17 (7), 689-693 (2020).
  5. Moses, L., Pachter, L. Museum of spatial transcriptomics. Nat Methods. 19 (5), 534-546 (2022).
  6. Cummings, B. B., et al. Improving genetic diagnosis in Mendelian disease with transcriptome sequencing. Sci Transl Med. 9 (386), 5209(2017).
  7. Hu, J. F., et al. Quantitative mapping of the cellular small RNA landscape with AQRNA-seq. Nat Biotech. 39 (8), 978-988 (2021).
  8. Alon, S., et al. Barcoding bias in high-throughput multiplex sequencing of miRNA. Genome Res. 21 (9), 1506-1511 (2011).
  9. Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure. PLoS One. 10 (5), e0126049(2015).
  10. Pang, Y. L. J., Abo, R., Levine, S. S., Dedon, P. C. Diverse cell stresses induce unique patterns of tRNA up- and down-regulation: tRNA-seq for quantifying changes in tRNA copy number. Nuc Acids Res. 42 (22), e170(2014).
  11. Machnicka, M. A., Olchowik, A., Grosjean, H., Bujnicki, J. M. Distribution and frequencies of post-transcriptional modifications in tRNAs. RNA Biol. 11 (12), 1619-1629 (2014).
  12. Li, F., et al. Regulatory impact of RNA secondary structure across the Arabidopsis transcriptome. Plant Cell. 24 (11), 4346-4359 (2012).
  13. García-Nieto, P. E., Wang, B., Fraser, H. B. Transcriptome diversity is a systematic source of variation in RNA-sequencing data. PLOS Comput Biol. 18 (3), e1009939(2022).
  14. FASTQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010).
  15. Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y., Gu, J. Fastp: an ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor. Bioinformatics. 34 (17), i884-i890 (2018).
  16. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550(2014).
  17. R Core Team. R: a language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. (2022).
  18. Ougland, R., et al. AlkB restores the biological function of mRNA and tRNA inactivated by chemical methylation. Mol Cell. 16 (1), 107-116 (2004).
  19. Bernhardt, H. S., Tate, W. P. Primordial soup or vinaigrette: did the RNA world evolve at acidic pH. Biol Direct. 7, 4(2012).
  20. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
  21. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet. J. 17 (1), 10-12 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

AQRNA SeqSmall RNA QuantificationtRNA ModificationsLibrary PreparationReverse TranscriptionGel ElectrophoresisBioinformatics PipelineProtein TranslationMicroRNA MappingPhenol Chloroform Extraction

Related Articles