Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Adacık izolasyonu için domuz pankreasının cerrahi perfüzyonu ve izolasyonu

2.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66350

⸱

7 Haziran 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Section of Vascular Surgery, Washington University School of Medicine, 2CardioVascular Research Innovation in Surgery and Engineering Center, Washington University School of Medicine, 3Department of Medicine, Division of Nephrology, Washington University School of Medicine, 4Department of Medicine, Division of Endocrinology, Washington University School of Medicine, 5Department of Surgery, Section of Transplant Surgery, Washington University School of Medicine, 6Division of Molecular Cell Biology, Washington University School of Medicine, 7Department of Biomedical Engineering, Washington University McKelvey School of Engineering

Bu makalede

Özet

Bu protokol, adacık izolasyonu ve saflaştırılması için bir domuz pankreasının satın alınması için adım adım bir kılavuz sağlar.

Özet

Pankreas adacık nakli, tip I diyabet için yeni ortaya çıkan bir tedavi yöntemidir; ancak, donör eşleşmesi ve mevcudiyeti ile sınırlıdır. Domuz adacığı ksenotransplantasyonu, talep üzerine, fonksiyonel adacıkların büyük ölçekli üretim potansiyeli ile allotransplantasyona umut verici bir alternatif sunmaktadır. İzole edilmiş adacıkların verimi ve canlılığı, donör pankreasın kalitesine ve tedarik yöntemine, özellikle sıcak iskemi süresinin süresine karşı oldukça hassastır. Organların korunmasını ve müteakip adacık verimini ve canlılığını iyileştirmek için, domuz pankreasının cerrahi perfüzyonu ve rezeksiyonu için bir protokol geliştirdik. Bu protokolde direkt infrarenal aort kanülasyonu ve organ perfüzyonu kullanılarak sıcak iskemi süresi en aza indirilir ve cerrahi uzmanlık alanı olmayan operatörler için prosedür basitleştirilir. Pankreasın aort yoluyla müteakip arteriyel perfüzyonu, durgun kanı mikrovasküler sistemden temizler, böylece trombozu ve dokudaki oksidatif hasarı azaltır. Bu el yazması, domuz pankreasının cerrahi perfüzyonu ve rezeksiyonu için ayrıntılı bir protokol sağlar, ardından adacık izolasyonu ve saflaştırılması sağlanır.

Giriş

Tip 1 diyabet, pankreas beta hücrelerinin1 otoimmün yıkımından kaynaklanır. Sonuç olarak, hastalar ekzojen insüline bağımlıdır ve bu da onları hiper ve hipoglisemi atakları ile yüksek riskli glisemik dalgalanmalara sokar2. Adacık allotransplantasyonu, tip I diyabet için potansiyel bir tedavidir; Bununla birlikte, pankreas organ bağışçılarının sınırlı mevcudiyeti, prosedürün yaygın olarak benimsenmesinin önünde önemli bir engel olmaya devam etmektedir 2,3. Domuz donörlerinden adacık ksenotransplantasyonu, bu hayvanlar kolayca bulunabildiği için umut verici bir alternatiftir. Domuz pankreas adacık izolasyonunun optimizasyonu ve ölçeklendirilmesi, adacık ksenotransplantasyonunun ilerlemesi için kritik olacaktır.

Daha önce birkaç domuz pankreası tedarik tekniği yayınlanmış olmasına rağmen, bu prosedürlerin çoğu kardiyak ölüm veya kan kaybı indüksiyonundan sonra pankreatektomiyi tanımlar 4,5,6,7,8,9,10. Bu tekniklerin en önemli dezavantajlarından biri, kardiyak ölüm zamanı ile intraarteriyel ve/veya intraduktal koruma solüsyonu infüzyonunun başlatılması arasında meydana gelen değişken sıcak iskemik zamandır (WIT). 10 dakikalık WIT bile adacık verimini ve canlılığını olumsuz yönde etkileyecektir5. WIT'i en aza indirmek, pankreasın bir koruma solüsyonu ile derhal perfüzyonunu gerektirir. Abdominal organ alımı sırasında, aort kanülasyonu ve ardından Wisconsin Üniversitesi (UW) solüsyonu ile intrakorporeal perfüzyon, kanın çıkarılması, intravasküler trombozun önlenmesi, iskemik hasara karşı koruma ve hücresel hasarın en aza indirilmesi için çok önemlidir11,12.

Önceki çalışmalar, domuz pankreası alımı sırasında, çölyak gövdesinin ve superior mezenterik arterin UW solüsyonu ile düşük basınçla yıkanmasının adacık verimini ve saflığını iyileştirdiğini göstermiştir4. Bununla birlikte, domuz pankreası temini için daha önce yayınlanmış yöntemler, özellikle daha küçük domuzlar için teknik olarak zor olabilen açık aort kanülasyonunu içerir 13,14,15. Bu yazıda, domuz pankreasının cerrahi perfüzyonu ve tedariki, ardından adacık izolasyonu ve saflaştırılması için eşlik eden görsel yardımcılarla birlikte ayrıntılı, adım adım bir protokol sunuyoruz. Pankreas izolasyonu sırasında bu yeni aort kanülasyonu tekniği, WIT'i en aza indirmek ve pankreas tedarikinin adacık izolasyon verimini ve canlılığını en üst düzeye çıkarmanın bir yolu olarak kansız bir alanda gerçekleştirilmesine izin vermek için özel olarak geliştirilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvanlarla ilgili tüm prosedürler, Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi Karşılaştırmalı Tıp Bölümü'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. 35 ila 35 kg arasında değişen yetişkin Yorkshire domuzları bu prosedür için idealdir; Bununla birlikte, protokol, deneysel bağlama bağlı olarak farklı boyutlardaki domuzlar için uyarlanabilir. Tüm prosedür bir ameliyathane kurulumunda steril bir şekilde gerçekleştirilmelidir.

1. Ameliyat öncesi hazırlık ve anestezi

  1. Domuzu kas içine enjekte edilen 4 mg / kg tiletamin ve zolazepam, 20 mg / kg ketamin ve 2 mg / kg ksilazin kokteyli ile sakinleştirin.
  2. Auriküler ven yoluyla periferik venöz erişim sağlayın.
  3. % 100 oksijen içinde solunan% 1 -% 3 izofluran ile genel anesteziyi indükleyin ve domuzu endotrakeal olarak entübe edin.
    NOT: Daha düzgün bir indüksiyon ve entübasyon prosedürü için indüksiyon için propofol veya başka bir intravenöz indüksiyon ajanının kullanılması tercih edilebilir. Anestezi derinliğini değerlendirmek ve korumak için hayati belirtiler, gelgit sonu CO2, oksijen satürasyonu ve kardiyak dalga formu sürekli olarak izlenir. Abdominal cerrahi düzlem yatak başı ultrason kullanılarak doğrulanır.
  4. Domuzu sternal çentikten iki taraflı kasıklara kadar klorheksidin glukonat ile tıraş edin ve hazırlayın.
  5. Ameliyat alanını tüm karın bölgesini net bir şekilde görecek şekilde örtün (Şekil 1A).

2. Retroperitoneumun operatif kurulumu ve maruz kalması

  1. Orta hat laparotomi insizyonu yapın (Şekil 1B).
    1. Ksifoid işleminden pubise kadar orta hat laparotomisi yapmak için 10 bıçaklı bir neşter ve elektrokoter kullanın. İnsizyonu inferior abdominal ürogenital açıklığın etrafında kıvırmaya özen gösterin.
  2. Sağ viseral rotasyon gerçekleştirin.
    1. Sağ kolonu ve ince bağırsağı steril bir havluya sararak dışsallaştırın.
    2. Bağırsak torsiyonu veya malrotasyonundan kaçınırken sağ retroperitonu ortaya çıkarmak için kolonu ve bağırsağı yavaşça sola geri çekin.
  3. Mesaneyi boşaltın (isteğe bağlı).
    1. Mesane doluysa ve maruziyeti etkiliyorsa, mesaneyi iki DeBakey forseps arasında tutun ve ventral mesane duvarını kesmek için 11 bıçaklı bir neşter kullanın.
    2. İdrarı boşaltmak ve mesaneyi sıkıştırmak için mesaneye bir Yankauer emme ucu yerleştirin.
  4. Sağ retroperitonumun optimal maruziyetini kolaylaştırmak için bir abdominal ekartör seti kurun (Şekil 1C).

3. Retroperitoneal diseksiyon

  1. Retroperitoneal diseksiyona başlayın (Şekil 2A).
    1. Elektrokoter kullanarak, peritonu orta hattın sağına, sağ böbrek seviyesinden aort bifurkasyonuna kadar kesin.
    2. Kızılötesi aort, inferior vena kava (IVC) ve sağ renal arter ve veni keskin bir şekilde ortaya çıkarın
  2. Büyük bir damar halkası ile distal infrarenal aortun çevresel kontrolünü elde edin.
  3. IVC'yi bağlayın (Şekil 2B).
    1. Orta kızılötesi IVC'nin çevresel kontrolünü elde edin.
    2. IVC'yi 2-0 ipek kravat kullanarak bağlayın.
  4. Böbrek damarlarını bağlayın (Şekil 2C).
    1. Sağ ve sol renal arterlerin ve damarların çevresel kontrolünü elde edin.
    2. Bu yapıları 2-0 ipek bağlar kullanarak bağlayın.
    3. Birden fazla renal arter varsa, benzer şekilde bu damarların her birini izole edin ve bağlayın.

4. İntratorasik diseksiyon

  1. Sağ hemidiyaframı kesin (Şekil 3A).
    1. Sağ hemidiyaframı ortaya çıkarmak için karaciğeri aşağı doğru yavaşça geri çekin. Sağ hemidiyaframın membranöz kısmına iki Allis klempi uygulayın ve elektrokoter kullanarak diyaframı iki klemp arasına kesin.
    2. Diyafram miyotomisini yatay olarak yaklaşık 7 cm'ye kadar uzatın.
  2. İntratorasik IVC'nin çevresel kontrolünü elde edin (Şekil 3B).
    1. İntratorasik IVC'nin etrafına 2-0 ipek bir bağ yerleştirin. IVC'yi tıkamadan sütürün uçlarını küçük bir hemostat ile çekin.
  3. Diyaframotomiyi sol hemidiyafragma kadar uzatın (Şekil 3C).
    1. Diyaframotominin kenarını inferior olarak geri çekmek ve sol hemidiyaframa uzatmak için iki Allis klemp kullanın.
      NOT: Diyaframotomi sırasında perikard içine girmekten kaçının.
  4. Sol posteromedial göğüs bölgesinde inen torasik aortu ortaya çıkarın.

5. İnfrarenal aort kanülasyonu, viseral izolasyon ve perfüzyon

  1. Domuzu sistemik olarak antikoagüle edin.
    1. Periferik venöz erişim yoluyla sistemik heparin (100 U / kg) uygulayın. Aort kanülasyonuna devam etmeden önce 3 dakika bekleyin.
  2. 18 G'lik bir mikropunktur iğnesi kullanarak infrarenal aorta erişin (Şekil 4A).
  3. İğneden bir j telini aort içine geçirin ve iğneyi telin üzerinden çıkarın.
  4. Telin üzerine aort içine 10Fr'lik bir kılıf yerleştirin ve teli çıkarın (Şekil 4B).
  5. IV tüpünü 10Fr kılıfa bağlayın ve steril bir şekilde UW solüsyonunu kılıftan infüze edin. UW çözeltisini 40-60 damla / dk oranında infüze edin.
    NOT: Torasik aort çapraz klemplenene kadar akış başlamayacaktır. İntraaortik kılıfın yer değiştirmesini önlemek için intravenöz borunun gergin olmadığından emin olun.
  6. Hızlı bir şekilde arka arkaya viseral izolasyon ve perfüzyon gerçekleştirin.
    1. Bir aort klempi kullanarak infrarenal aortu klempleyin.
    2. İnen torasik aortu bir aort klempi kullanarak klempleyin.
    3. Daha önce yerleştirilen 2-0'lık beraberlik ile intratorasik IVC'yi bağlayın.
    4. Periferik venöz erişim yoluyla ötenazi için 100 mg / kg KCl uygulayın.
      NOT: Kardiyak ölüm KCl'nin uygulanmasıyla başlar.
    5. İnfrarenal IVC'de 2-0 beraberlikten daha üstün bir venotomi yapın ve venotomiden havuz uçlu emme yerleştirin (Şekil 4C).
    6. İç organları 2-3 L soğuk UW solüsyonu ile perfüze edin.
    7. Perfüzyon sırasında total pankreatektomi için diseksiyona devam edin.
      NOT: İç organlar ve özellikle pankreas, UW solüsyonu katı organ bölgesine perfüze edildiğinde soluklaşmalıdır (Şekil 5A).

6. Total pankreatektomi

  1. UW çözeltisi perfüze olurken ince bağırsağı retraksiyondan serbest bırakın.
  2. Viseral perfüzyon sırasında pankreasın duodenal, bağlantılı ve splenik loblarının diseksiyonuna başlayın. Pankreası ortaya çıkarmak için mideyi üst kısımdan geri çekin. Künt diseksiyon ve elektrokoter kombinasyonu ile pankreası omental eklerinden ayırın.
    NOT: Pankreasın gövdesi portal venin etrafını etkili bir şekilde sarar. Portal venin arkaya doğru duodenum lobuna ve daha sonra köprüye ve bağlantı loblarına anterior olarak gitmesini önlemeye dikkat edin.
  3. Pankreas kanalını izole edin (Şekil 5B). Onikiparmak bağırsağına girdiği pankreas kanalını bulun. İki adet 3-0 ipek bağ kullanarak kanalı bağlayın ve kanalı bağlar arasından geçirin.
  4. Komplet pankreatektomi (Şekil 5C).
    1. Duodenum lobunun geri kalanını duodenumun C-halkasından serbestçe hareket edene kadar inceleyin.
    2. Pankreası kalan eklerinden ayırın. Küçük damarları superior mezenterik arterden pankreasa dikkatlice bağlayın ve bölün.
    3. Pankreası portal venden ayırın. Pankreasın gövdesini ve bağlantı lobunu portal venden inceleyin. Dalak damarı da dahil olmak üzere portal venden pankreasa kadar tüm venöz dalları bağlayın.
      1. Portal venden serbest mobilizasyona izin vermek için bağlantı lobu ile dalak lob arasındaki pankreas köprüsünü kesin.
        NOT: Pankreas duodenum lobunu dalak lobundan ayırmamaya özen gösteriniz.
  5. Tüm pankreası soğuk steril UW solüsyonuna batırın ve kabı hemen buzun üzerine yerleştirin. Adacık izolasyonu için pankreası steril bir başlığa taşıyın. Pankreas adacık izolasyonu ile devam edin (Şekil 6).

7. Pankreas kanalı kanülasyonu

  1. Pankreası biyogüvenlik kabininin içindeki buz üzerinde steril bir tepsiye yerleştirin.
  2. Fazla fibröz dokuyu ve kanı pankreastan uzaklaştırın.
  3. Gerekirse, lümeni daha iyi görselleştirmek için kanalı enine kesin. Uygun boyutta bir kateter (16 G) ile kanülü bulun ve kanala ilerletin.
  4. Kateteri 2.0 ipek bir bağ ile yerine sabitleyin, ancak lümeni tıkamaktan kaçının.
  5. Üç dekontaminasyon solüsyonu hazırlayın ve kanüllü pankreası her bir dekontaminasyon solüsyonuna 60 saniye daldırın.

8. Pankreasın perfüzyonu ve şişkinliği

  1. Enzim sindirim çözeltisini hazırlayın (Şekil 6).
    1. Ticari olarak temin edilebilen 100 mg kollajenaz 1 ve 2 çözeltilerini (daha fazla ayrıntı için Malzeme Tablosuna bakınız) istenen miktarda 1x HBSS ve 10.000 U Heparin çözeltisi ile karıştırın. İzole edilen pankreas dokusu 100 g ile 200 g arasındaysa, enzimi toplam 200 mL 1x HBSS ve Heparin solüsyonu ile karıştırın.
  2. Pankreası enzim çözeltisi ile infüze edin.
    1. Kontrollü orta kuvvetle, 60 mL boluslarda enzim çözeltisini pankreas kanalına infüze edin. Enzim çözeltisinin tamamı pankreas içine infüze edilene kadar bu işleme devam edin.
      NOT: Etkili infüzyon pankreas dokusunun şişmesine neden olmalıdır.
    2. Bir miktar enzim çözeltisi pankreas dokusundan steril tepsiye sızarsa, bu kalan çözeltiyi adım 8.3'te pankreasa yeniden enjekte edin veya adım 9.2'de Ricordi odasına yerleştirin.
  3. Kalan herhangi bir enzim solüsyonunu, 22 G'lik bir iğne kullanarak kötü şişmiş pankreas parankim segmentlerine doğrudan enjekte edin.

9. Pankreasın sindirimi

  1. Rezervuar çözeltisini önceden ısıtmak için 500 mL 1x HBSS içeren devre rezervuarını 47 °C'ye ayarlanmış bir su banyosuna yerleştirin.
    NOT: Enzim çözeltisi 36-38 °C'de en iyi şekilde çalışır ve bu sıcaklığa peristaltik pompayı başlattıktan sonra 5 dakika içinde ulaşılması gerekir. Enzimle aşılanmış pankreas da dahil olmak üzere Ricordi içeriğinin sıcaklığı başlangıçta 4 °C'dir. Devre rezervuarını 47 °C'ye önceden ısıtarak, rezervuarın ve Ricordi odasının içeriği karışacak ve peristaltik pompayı başlattıktan sonraki 5 dakika içinde tüm devre sıcaklığını 36-38 °C'ye getirecektir.
  2. Kateteri pankreas kanalından çıkarın ve atın ve pankreası ~ 1-3 cm'lik parçalar halinde kesin.
  3. Sindirim devresini hazırlayın. Peristaltik pompa, çözeltiyi sindirim devresi rezervuarından, ısıtma bobininden ve Ricordi odasına dolaştıracaktır (Şekil 6).
  4. Dokuz adet 1,5 cm'lik silisyum nitrür bilye içeren pankreas parçalarını Ricordi haznesinin içine yerleştirin ve kalan enzim solüsyonu ile filtre seviyesine kadar doldurun.
  5. Ricordi haznesini kapatmak için, ağ filtreyi ve lastik contayı ve ardından kapağı Ricordi haznesine yerleştirin. Vidaları sıkarak Ricordi haznesinin kapağını sabitleyin ve devam etmeden önce haznenin iyice kapatıldığından emin olun.
  6. Isıtma bobinini 47 °C'lik bir sıcak su banyosuna yerleştirin.
  7. Giriş ve çıkış kanüllerini 500 mL 1x HBSS içeren sindirim devresi rezervuarına yerleştirin.
  8. Tüm hazne sindirim solüsyonu ile dolana kadar pompayı 450 mL/dk'lık bir akış hızında çalıştırın. Sıvı devre içinde dolaşırken akış hızını 100 mL/dk'ya düşürün.
  9. Dokuyu silisyum nitrür mermerlerle çalkalamak için sindirim odasını manuel olarak sallayın.
  10. 8 dakikalık sindirimden başlayarak, sindirim ilerlemesini izlemek için Ditizon (DTZ) boyaması için devre rezervuarından 1 mL'lik bir numune alın.
    1. DTZ boyamasını hazırlamak için 10 mg DTZ'yi 2 mL Dimetil Sülfoksit (DMSO) içinde çözün.
    2. Hazırlanan DTZ boyasından 1 mL sindirim örneğine 1 μL ekleyin. Numuneyi 4x büyütme altında inceleyin. DTZ boyama ile adacıklar koyu kırmızıdan siyaha görünecektir.
      NOT: Gözlenen adacıkların çoğu veya tamamı 'serbest' ve sağlam olduğunda, asiner doku daha küçük kümelere dağıldığında sindirim tamamlanır.
  11. Sindirimin tamamlandığına karar verildiğinde, bobini buz banyosuna aktarın, giriş kanülünü rezervuardan çıkarın ve pompa hızını 210-250 mL/dk'ya yükseltin. Sindirilmiş dokunun Ricordi odasından devre rezervuarına akmasına izin verin.
    NOT: Sindirimden sonra Ricordi odasında çok az doku kaldığını görmek tipiktir. Tipik olarak, sindirilmemiş pankreas dokusunun %<10'u kalacaktır, ancak bu, örneğe özgü faktörlere bağlı olarak değişebilir.
  12. Sindirimin verimliliğini belirlemek için kalan dokuyu tartın. Sindirilmiş dokuyu devre rezervuarından buz üzerinde serin tutulan 250 mL'lik konik tüplere aktarın.

10. Pankreas dokusunun toplanması

  1. Sindirilmiş pankreas dokusunu 250 mL konik tüplerde 250 × g'da 4 °C'de 1 dakika frensiz santrifüj edin.
  2. Tüpleri santrifüjden dikkatli bir şekilde çıkarın ve peletin bozulmasını önlerken serolojik bir pipet kullanarak süpernatanı aspire edin.
  3. Her bir konik tüpteki peletleri nazikçe yeniden süspanse edin ve bunları 250 mL'lik bir konik tüpte birleştirin. ≤50 mL doku varsa, peleti Adacık Toplama Çözeltisinde toplam 100 mL hacme kadar yeniden süspanse edin. >50 mL doku varsa, peleti Adacık Toplama Çözeltisinde toplam 200 mL hacme kadar yeniden süspanse edin. 100 mL'den fazla doku toplanması durumunda, iki Hücre İşlemcisi saflaştırma döngüsü çalıştırın.
  4. Toplam 100 mL hacim yapmak için (50 mL doku toplandığı varsayılarak) dokuyu RPMI ortamında yeniden süspanse edin ve Hücre İşlemcisine yükleyin.

11. Sürekli gradyan yöntemini kullanarak adacık saflaştırma

  1. Hücre İşlemcisini üreticinin talimatlarına göre hazırlayın.
  2. Sürekli gradyan oluşturucuya 125 mL Yüksek Yoğunluklu gradyan çözeltisi yükleyin, ardından Yüksek Yoğunluklu gradyan çözeltisini 200 mL/dk'ya ayarlanmış bir pompa kullanarak Hücre İşlemcisine yükleyin.
  3. Hücre İşlemcisi santrifüj işlevini 1.000 RPM'de başlatın.
  4. Sistemdeki havayı boşaltın ve Yüksek Yoğunluklu Gradyan Çözümü ile yeniden astarlayın.
  5. Degrade oluşturucuya 125 mL Yüksek yoğunluklu gradyan çözeltisi ve 130 mL Düşük yoğunluklu Çözelti ekleyin.
  6. 100 mL sindirilmiş doku süspansiyonunu yükleyin.
  7. Hücre İşlemci hızını 3 dakika boyunca 2.000 RPM'ye yükseltin.
  8. Saflaştırılmış adacık fraksiyonu toplama için 16 adet 50 mL konik tüp hazırlayın. Her tüpe 25 mL RPMI ortamı ekleyin ve tüm tüpleri artan sırada düzenleyin.
  9. Saflaştırılmış adacık fraksiyonlarını hazırlanan toplama konik tüplerinde toplayın.

12. Adacık değerlendirmesi ve boyama

  1. Saflaştırılmış adacık fraksiyonlarının her birinden 100-200 μL alikot toplayın ve bunları adacık içeriğini değerlendirmek için DTZ boyaması için ve her saflaştırma fraksiyonundan 24 oyuklu bir doku kültürü plakasına yerleştirin. Her bir fraksiyonu 4x büyütmeli ışık mikroskobu kullanarak inceleyin. DTZ boyama ile adacıklar koyu kırmızıdan siyaha görünecektir.
  2. Adacıklar tanımlandıktan sonra, en yüksek adacık içeriğine sahip kesirleri seçin. Saflaştırılmış fraksiyonu 250 × g'da frensiz 4 °C'de 1 dakika santrifüjleyin.
  3. Süpernatanı dikkatlice aspire edin ve adacık peletini adacık büyüme ortamında yeniden süspanse edin. Saflaştırılmış adacıkları 1-4 T-125 kültür şişesine aktarın.
  4. Saflaştırmanın ardından adacıkları miktar, canlılık ve işlev açısından değerlendirin.
    1. Adacık sayısını ve boyut dağılımını değerlendirmek için bir adacık hücresi sayacı kullanın (Şekil 7A). Tüm bir pankreas tipik olarak 1-2 milyon adacık eşdeğeri verecektir.
    2. Canlı boyama için, 2 μL kalsein ve 2 μL etidyum homodimer-1'i (CaAM / EthD-1) 1.000 μL PBS ile karıştırın (Şekil 7B). Adacıkların 30 dakika lekelenmesine izin verin, ardından bunları 4x veya 10x büyütme ile değerlendirin. Canlı adacıklar yeşile boyanırken, cansız adacıklar kırmızıya boyanır.

13. Pankreas Adacıklarının hücre kültürü

  1. İlk 48 saat boyunca, yeterli besin sağlamak için adacıkları 37 ° C'de geri kazanım ortamında kültürleyin (~ 1.000 adacık / mL geri kazanım ortamı).
  2. 2-21. günler arasında, adacıkları 37 ° C'de standart büyüme ortamında kültürleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Ameliyat düzeneği ve orta hat laparotomisi Şekil 1'de gösterilmiştir. Laparotomi insizyonu, ürogenital açıklığı önlemek için kavisli olmalıdır (Şekil 1B). Ekartörü kurarken, Omni veya Bookwalter ekartör direğini masanın sol, alt köşesine takın. İdeal retraksiyonda sağ karın duvarı için iki, sol karın duvarı için iki ve steril bir havluya sarılmış sağ kolon ve ince barsak için 1-2 ekartör bıçağı bulunur (Şekil 1C). Gövde duvarı, spla...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Domuz donörleri kullanılarak yapılan pankreas adacık ksenotransplantasyonu, Tip I diyabetin tedavisi için umut verici bir stratejidir. Adacık izolasyonu zordur ve nihai adacık canlılığı ve verimi, organ alımı sırasında karşılaşılan hipotansiyon ve doku iskemisine oldukça duyarlıdır16,17. Pankreas tedarikini ve korunmasını optimize etmek için bu protokol, adacık izolasyonundan önce domuz pankreasının tedariki sırasında aort kanüla...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması bildirmemiştir.

Teşekkürler

Bu el yazması, Orta Amerika Organ Nakli Vakfı'ndan bir klinik yenilik hibesi ile desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 M NaOH, 100 mLMillipore Sigma1310-73-2
10x HBSS, 500 mL (15 ila 30 &derece; C)Thermo Fisher14065056
1x D-PBS, 500 mLThermo Fisher14200075
1x HBSS, 1 LThermo Fisher14025076
250 mL Konik TüplerMillipore SigmaCLS430236-6EA
Amfoterisin B [50 mg]
%10Millipore Sigma25655-41-8
BioRad Gradyan EskiBioRad395
Kalsiyum Klorür dihidratThermo Fisher10035-04-8
COBE Hücre İşlemcisiEbay317690 & nbsp;
Çürütme devresi rezervuarı, Gibco şişesi, 1 LThermo Fisher10341001
Dimetilsülfoksit (DMSO)Thermo Fisher85190
DithizoneThermo Fisher60-10-6
Degrade Eski Bağlantı KitiBioRad1652008
Heparin [1000 U/mL]Acil Tıbbi Ürünler0409-2720-01
HEPES Tamponu (1 M), 100 mLThermo Fisher15630080
İnsan Serumu Albümini %25, 100 mLCelprogenHSA2001-25-1
İzofluranCovetrusÜrün #: 11695067772
KetaminPattersonÜrün #: 07-894-8462
Liberaz (100 mg)Millipore Sigma5401020001
CANLI / ÖLÜ Canlılık / SitotoksisiteKiti Thermo FisherL3224
Lenfolit 1.1 Medya 500 mLCedarlane LabsCL5020
Masterflex LS 16 Boru Masterfle96419-16
Masterflex Peristaltik PompaMasterflex07522-30
PenStrep (2 mg / mL)CelprogenPS-30-002
Pulmozim (1 mg / mL, 2.5 mL / flakonDornase Alfa8931278
Geri Kazanım Ortamı, PIM (R)Prodo Laboratories, Inc.PIM-R001GMP
RPMI 1640Millipore SigmaR8758-1L
Standart Kültür Ortamı, PIM (S)Prodo Laboratories, Inc.PIM-S001GMP
Tzed ve ticaret; (Tiletamin ve Zolazepam) Enjeksiyon CPattersonÜrün #:07-894-6240
Wisconsin Üniversitesi (UW) Çözümü, 3 LKüresel Nakil Çözümleri1000-0046-06
Su BanyosuSigma AlderichCLS6783-1EA
KsilazinPattersonÜrün #:07-891-6165
Antiseptik Povidon İyot PHR1662 Milipore Sigma

Kaynaklar

  1. Gillespie, K. M. Type 1 diabetes: pathogenesis and prevention. CMAJ. 175 (2), 165-170 (2006).
  2. Shapiro, A. M., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nat Rev Endocrinol. 13 (5), 268-277 (2017).
  3. Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343 (4), 230-238 (2000).
  4. Anazawa, T., et al. Improved method of porcine pancreas procurement with arterial flush and ductal injection enhances islet isolation outcome. Transplant Proc. 42 (6), 2032-2035 (2010).
  5. Dufrane, D., et al. Parameters favouring successful adult pig islet isolations for xenotransplantation in pig-to-primate models. Xenotransplantation. 13 (3), 204-214 (2006).
  6. Hilling, D. E., Rijkelijkhuizen, J. K., Tons, H. A., Terpstra, O. T., Bouwman, E. Porcine islet isolation outcome is not affected by the amount and distribution of collagen in the pancreas. Xenotransplantation. 17 (3), 250-255 (2010).
  7. Lamb, M., et al. In vitro maturation of viable islets from partially digested young pig pancreas. Cell Transplant. 23 (3), 263-272 (2014).
  8. Otsuka, R., et al. Pancreas preservation with a neutrophil elastase inhibitor, alvelestat, contributes to improvement of porcine islet isolation and transplantation. J Clin Med. 11 (15), 4290(2022).
  9. Vanderschelden, R., Sathialingam, M., Alexander, M., Lakey, J. R. T. Cost and scalability analysis of porcine islet isolation for islet transplantation: comparison of juvenile, neonatal and adult pigs. Cell Transplant. 28 (7), 967-972 (2019).
  10. Weegman, B. P., et al. Temperature profiles of different cooling methods in porcine pancreas procurement. Xenotransplantation. 21 (6), 574-581 (2014).
  11. Hart, N. A., et al. Determination of an adequate perfusion pressure for continuous dual vessel hypothermic machine perfusion of the rat liver. Transpl Int. 20 (4), 343-352 (2007).
  12. Tullius, S. G., et al. Accumulation of crystal deposits in abdominal organs following perfusion with defrosted University of Wisconsin solutions. Am J Transplant. 2 (7), 627-630 (2002).
  13. Ching, C. D., et al. A reliable method for isolation of viable porcine islet cells. Arch Surg. 136 (3), 276-279 (2001).
  14. Lu, Y., et al. Adult pig islet isolation. J Vis Exp. (176), (2021).
  15. Taylor, M. J., Baicu, S., Greene, E., Vazquez, A., Brassil, J. Islet isolation from juvenile porcine pancreas after 24-h hypothermic machine perfusion preservation. Cell Transplant. 19 (5), 613-628 (2010).
  16. Iwanaga, Y., Sutherland, D. E., Harmon, J. V., Papas, K. K. Pancreas preservation for pancreas and islet transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 13 (4), 445-451 (2008).
  17. Pratschke, J., et al. Brain death and its influence on donor organ quality and outcome after transplantation. Transplantation. 67 (3), 343-348 (1999).
  18. vander Windt, D. J., et al. Early islet damage after direct exposure of pig islets to blood: has humoral immunity been underestimated. Cell Transplant. 21 (8), 1791-1802 (2012).
  19. Wright, M. J., Cavanagh, T. J., Fetterhoff, T. J., Wile, K. J. Effect of blood content on porcine pancreatic dissociation and islet yield. Transplant Proc. 26 (6), 3442(1994).
  20. Toso, C., et al. Isolation of adult porcine islets of Langerhans. Cell Transplant. 9 (3), 297-305 (2000).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Pankreas AdacıklarıKsenotransplantasyonAortik KanülasyonOrgan KorumaPankreas DigestionuAdaçık SaflaştırmaGradyan Santrifüjleme
Adacık izolasyonu için domuz pankreasının cerrahi perfüzyonu ve izolasyonu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.