Yöntem makalesi

Kronik Akciğer Allogreft Rejeksiyonunun Murin Modellerinde Kollajen Birikiminin Yarı Kantitatif Histopatolojik Değerlendirmesi için Picrosirius Kırmızı Boyama

2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/66395

⸱

21 Mart 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Thoracic Surgery, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 2Department of Plastic and Hand Surgery, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 3Department of Thoracic Surgery, Kyoto University Hospital, 4Department of Otolaryngology, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Picrosirius Kırmızı boyama, murin pulmoner fibrotik yeniden şekillenmesinde kollajen birikimini mekansal olarak çözülmüş bir şekilde objektif olarak değerlendirmek için yarı kantitatif bir yöntemdir. Toplam kollajen birikimini değerlendirmenin yanı sıra, Picrosirius Red boyama, farklı kalınlıklardaki kollajen liflerinin ayırt edilmesine izin verir.

Özet

Fibrozis, akciğer transplantasyonu sonrası kronik rejeksiyonun patofizyolojik belirtisidir ve uzun süreli alıcı sağkalımının önündeki en önemli engeldir. Kronik rejeksiyon çalışması için çeşitli murin akciğer nakli modelleri mevcuttur. Bununla birlikte, greftin fibrotik değişiklikleri ile ilgili heterojen sonuçlar gösterirler ve fibrozisin histolojik yayılımı çoğunlukla kalitatif olarak rapor edilir. Bu nedenle, istatistiksel analize izin veren mekansal olarak çözülmüş bir yaklaşım, bu modellerde fibrozun değerlendirilmesine yardımcı olabilir. Bu çalışmada murin akciğer allogreftlerinde kollajen organizasyonunun yarı kantitatif bir değerlendirmesi için Picrosirius Red boyaması sunulmuş ve standart Hematoksilen ve Eozin, Masson Trikrom ve Herovici boyaları ile karşılaştırılmıştır. Minör ve majör histouyumluluk kompleksi (MHC) uyumsuzluklarına dayalı olarak iki farklı murin transplantasyon modelinden kesitler üzerinde boyama yapıldı. Yöntem, tüm akciğer bölümlerindeki kollajen organizasyonunun yarı kantitatif analizi için kurulmuştur. Böylece, fibrotik akciğer hastalıklarının murin deneysel modelleri için bir araç olarak hizmet edebilir.

Giriş

Akciğer nakli, son dönem akciğer hastalığından muzdarip hastalar için kesin tedavi seçeneğidir. Bununla birlikte, uzun süreli sağkalım, ameliyat sonrası ilk beş yıl içinde alıcıların %50'sini etkileyen kronik reddedilme nedeniyle engellenmektedir1. Küçük hava yollarının ve akciğer parankiminin fibrotik yeniden şekillenmesi, kronik akciğer allogreft rejeksiyonundailerleyici pulmoner fonksiyon kaybının altında yatan histolojik özelliktir 2. Deneysel olarak, kronik akciğer allogreft rejeksiyonu, MHC ile uyumsuz fare suşları arasında murin ortotopik akciğer nakli ile modellenebilir. Kronik reddetmefenotipini elde etmek için farklı suş kombinasyonları önerilmiştir 3. Bunlar arasında, minör MHC uyumsuz C57BL/10 donörü ve C57BL/6 alıcısının nakil kombinasyonu sıklıkla kullanılmaktadır4. Alternatif olarak, BALB/c donör akciğerleri günlük immünosüpresif tedavi alan C57BL/6 alıcılarına nakledilebilir5. Bu modeller histolojik olarak farklı derecelerde fibrotik değişikliklere neden olur6. Bu değişiklikler genellikle standart Hematoksilen ve Eozin ve Masson'un Trikrom boyaması kullanılarak kalitatif olarak rapor edilir.

Hematoksilen ve Eosin ile standart histolojik boyama, sitoplazma ve kollajen lifleri kırmızı görünürken, çekirdekleri maviye boyadığı için numuneye genel bir bakış sağlar. Masson'un Trikrom boyaması ile çekirdekler siyaha boyanır, kollajen lifleri yeşilden maviye boyanır ve sitoplazma, fibrin ve kaslar dahil olmak üzere arka plan kırmızıdır. Masson'un Trikrom boyası hafife alınan değerlere yol açabileceğinden, Picrosirius Red boyasının kullanılmasının faydalı olduğu düşünülmektedir7. Picrosirius Red, uzun katyonik kollajen lifleri ile birleşen ve kontrast açısından zengin kırmızı boyama sağlayan doğrusal bir anyonik boyadır. Ayrıca, Picrosirius Red boyama, çapraz polarize ışık8 altında kollajen liflerinin doğal çift kırılmasını arttırır. Bu sayede kollajen lif kalınlığı ve tamponu değerlendirilebilir. Polarize edici bir filtre kullanarak, arka plan kararır ve biriken kollajenin kalınlığını ayırt etmek mümkün hale gelir. Kalın kollajen lifleri kırmızı görünürken, ince kollajen lifleri polarizasyon altında yeşil renkte çıkar. Literatürde çift kırılma ve kollajen alt tipi arasında doğrudan bir ilişki sıklıkla tanımlanmıştır, kırmızı çift kırılma kollajen I'e ve yeşil çift kırılma kollajen III9'a atanmıştır.

Bu protokol, murin akciğer allogreftlerinde fibrozu değerlendirmek için Picrosirius Red boyamanın kullanımını açıklar. Konvansiyonel histolojik boyamaya ek olarak, kronik rejeksiyonun murin modellerinde fibrotik değişimin yarı kantitatif bir değerlendirmesine izin verir, sadece bir boyamada kalın ve ince kollajen lifleri arasında bir ayrım yolu sağlar, uygun maliyetlidir ve gerçekleştirilmesi kolaydır. Bu yöntem, akciğer parankiminin fibrotik yeniden şekillenmesi ile karakterize edilen diğer murin deneysel modellerine de eşit olarak uygulanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan protokolleri, insancıl hayvan araştırmaları için 3R'nin etik ilkelerine uygundur ve yerel veteriner etik komitesi tarafından onaylanmıştır (Veterinäramt Kanton Zürich, İsviçre, Çalışma numarası 45/2014). Aynı şekilde okuyucuların laboratuvar hayvanları üzerinde herhangi bir işlem yapmadan önce ilgili kurumlardan izin almaları gerekmektedir.

1. Örnek alımı

  1. Bireysel ihtiyaçlara ve ilgili etik onaya göre hayvan deneyleri yapın. Tek bir mikrocerrah, tüm ameliyatları herhangi bir ek uzun süreli iskemi süresi olmadan gerçekleştirir.
    NOT: Temsili sonuçlarımızın çoğaltılması için, Charles River Laboratories'den 27-30 g ağırlığında spesifik patojen içermeyen yetişkin erkek C57BL/6J, C57BL/10J ve BALB/c fareleri edinin. İzogreftler için hem verici hem de alıcı olarak C57BL/6J hayvanları kullanın. Küçük uyumsuz modelde, C57BL / 10J donör akciğerlerini C57BL / 6J alıcılarına nakledin. Majör uyumsuz modelde, BALB/c donör akciğerlerini C57BL/6J alıcılarına nakledin ve ameliyat sonrası günde deri altına siklosporin (10 mg / kg / gün) ve metilprednizolon (1.6 mg / kg / gün) enjekte edin5. Perfüzyon için salin solüsyonu kullanın ve 8 hafta (56 gün) sonra akciğerleri alın.
  2. Ötenazi için, hayvanı 20G'lik bir kateter ile entübe edin ve% 2 -% 3 izofluran ile desteklenmiş O2 ile havalandırın. Bir pençe tutamına yanıt verilmemesi nedeniyle yeterli anestezi derinliğini onaylayın.
  3. Karın duvarını cerrahi makasla keserek ve kalbi açığa çıkarmak için sternumun uzunluğunu keserek medyan laparosternotomi yapın. İnferior vena kava ve sol atriyal apendiksiyi anatomik konumlarına göre tanımlayın.
  4. Hızlı bir şekilde art arda, inferior vena kava ve sol atriyal apendiksiyi cerrahi makasla kesin ve pulmoner dolaşımdaki tüm kanı çıkarmak için hayvanı pulmoner arterin kökünden bir şırınga ile 3-5 mL% 0.9 NaCl ile perfüze edin.
    NOT: Ötenazi ilgili etik onaya göre yapılmalıdır. Diğer yöntemler de aynı şekilde uygulanabilir. Pulmoner dolaşımdan kanın tamamen çıkarılması önerilir, bu da dolaşım durmasından sonra perfüzyonla da yapılabilir.
  5. Perfüze akciğerleri makas kullanarak çıkarın.
  6. Koruma için, numuneleri% 4 formalin içinde inkübe edin. Formalin çözeltisini doğrudan bronş ve pulmoner vaskülatüre enjekte edin. Numuneleri formaline batırın ve en az 6 saat inkübe etmelerine izin verin.
    NOT: Akciğerin formalin ile şişirilmesi için, karşılaştırılabilir sonuçlar elde etmek için standart bir prosedür uygulanmalıdır. Bu tür prosedürler için örnek protokoller başka bir yerde yayınlanmıştır10,11.
  7. Organı deneysel ihtiyaçlara göre kesin. Bir bölümdeki bronş ağacının tüm kısımlarını yakalamak için akciğerleri enine ikiye bölün.







  5. figure-protocol-1figure-protocol-2

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Yukarıda tarif edilen protokol, murin akciğer dokusunda kollajen birikiminin objektif bir yarı kantitatif değerlendirmesine izin verir. Fibrotik yeniden şekillenme, akciğer nakli sonrası kronik rejeksiyonun patofizyolojik özelliğidir. Bu nedenle, sol taraflı murin ortotopik akciğer nakli kullanılarak kronik akciğer allogreft rejeksiyon modellerinde Picrosirius Red boyaması uygulandı. Hafif immünosupresyon altında bir BALB/c donöründen bir C57BL/6 alıcısına majör MHC uyumsuz akciğer nakli, insan kronik akciğer allogreft d...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Hematoksilen ve Eozin gibi standart histolojik yöntemler ve Masson'un Trikrom boyaması, murin akciğerlerindeki fibrotik değişiklikleri mekansal olarak çözülmüş bir şekilde tespit etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır16,19. Bununla birlikte, bu değişiklikleri ölçmek ve dokunun kollajen bileşimini değerlendirmek için genellikle ek yöntemler gereklidir.

Picrosirius Kırmızı boyama ilk olarak 1964 yılın...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Birte Ohm, Freiburg Üniversitesi Tıp Fakültesi, Klinisyen Bilim İnsanları için Berta-Ottenstein Programı tarafından desteklenmektedir. Steffen U Eisenhardt, Alman Araştırma Vakfı'nın (DFG) Heisenberg Profesörüdür ve bu çalışmayı kişisel hibelerle desteklemiştir. Ayrıca, teknik yardımı için Sheena Kreuzaler'e teşekkür ederiz. Şekil 1, Biorender.com yardımıyla oluşturulmuştur. Görüntüleme, kısmen Freiburg Üniversitesi Tıp Fakültesi (Proje Numaraları 2023/A2-FOL; 2021/B3-Fol), DKTK ve DFG (Proje Numarası 450392965) tarafından finanse edilen Deniz Feneri Çekirdek Tesisi'nde gerçekleştirildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Asetik asitHoneywell, Charlotte, ABD33209
Axio ObserverZeiss, Oberkochen, Almanya4633000956 (seri numarası)
Lamel 1.5Roth, Karlsruhe, AlmanyaKCY5.1
Formaldehit %37Fisher Scientific, Leicestershire, İngiltereF/1501/PB15
Meyer'in hemalum çözeltisiMerck, Darmstadt, Almanya109249
Picrosirius Red SolutionMorphisto, Offenbach Main, Almanya13422Kullanılabilecek alternatifler: ab150681, abcam, Cambridge, İngiltere; SRS250 ScyTek Laboratuvarları, Logan City ABD
Polarize filtreZeiss, Oberkochen, Almanya000000-1121-813
Döner mikrotom, HistoCore AUTOCUTLeica, Wetzlar, Almanya149AUTO00C1, 14051956472
ROTI Histokitt montaj ortamıRoth, Karlsruhe, Almanya6638.1
ROTI Plast ParafinRoth, Karlsruhe, Almanya6642.5
Rotilabo gömme kasetler, POMRoth, Karlsruhe, AlmanyaK113.1
Superfrost Plus Yapışma Mikroskobu slaytepredia, Portsmouth, İngiltereJ1800AMNZ
Doku İşlemcisi Leica, Wetzlar, AlmanyaTP 1020
Software
Fiji yazılım sürümü 2.14.0/1.54fAçık Kaynak
Görüntüleme Yazılımı ZEN 3.4.91Zeiss, Oberkochen, Almanya

Kaynaklar

  1. Weigt, S., DerHovanessian, A., Wallace, W., Lynch, J., Belperio, J. Bronchiolitis Obliterans Syndrome: The Achilles' heel of lung transplantation. Semin Respir Crit Care Med. 34 (3), 336-351 (2013).
  2. Verleden, G. M., et al. Chronic lung allograft dysfunction: Definition, diagnostic criteria, and approaches to treatment-A consensus report from the Pulmonary Council of the ISHLT. J Heart Lung Transplant. 38 (5), 493-503 (2019).
  3. Lama, V. N., et al. Models of lung transplant research: A consensus statement from the National Heart, Lung, and Blood Institute workshop. JCI Insight. 2 (9), e93121(2017).
  4. Martinu, T., et al. Spectrum of chronic lung allograft pathology in a mouse minor-mismatched orthotopic lung transplant model. Am J Transplant. 19 (1), 247-258 (2019).
  5. de Vleeschauwer, S., et al. Chronic rejection pathology after orthotopic lung transplantation in mice: The development of a murine BOS model and its drawbacks. PLoS One. 7 (1), e29802(2012).
  6. Yamada, Y., et al. Chronic airway fibrosis in orthotopic mouse lung transplantation models-An experimental reappraisal. Transplantation. 102 (2), e49-e58 (2018).
  7. Whittaker, P., Kloner, R. A., Boughner, D. R., Pickering, J. G. Quantitative assessment of myocardial collagen with picrosirius red staining and circularly polarized light. Basic Res Cardiol. 89 (5), 397-410 (1994).
  8. Puchtler, H., Waldrop, F. S., Valentine, L. S. Polarization microscopic studies of connective tissue stained with picro-sirius red FBA. Beitr Pathol. 150 (2), 174-187 (1973).
  9. Junqueira, L. C. U., Cossermelli, W., Brentani, R. Differential staining of collagens type I, II and III by Sirius Red and polarization microscopy. Arch Histol Jpn. 41 (3), 267-274 (1978).
  10. Davenport, M. L., Sherrill, T. P., Blackwell, T. S., Edmonds, M. D. Perfusion and inflation of the mouse lung for tumor histology. J Vis Exp. (162), e60605(2020).
  11. Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. Instillation and fixation methods useful in mouse lung cancer research. J Vis Exp. (102), e52964(2015).
  12. Segnani, C., et al. Histochemical detection of collagen fibers by Sirius Red/Fast Green is more sensitive than van Gieson or Sirius Red alone in normal and inflamed rat colon. PLoS One. 10 (12), e0144630(2015).
  13. Courtoy, G. E., et al. Digital image analysis of Picrosirius Red staining: A robust method for multi-organ fibrosis quantification and characterization. Biomolecules. 10 (11), 1585(2020).
  14. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  15. Ségard, B. D., et al. Quantification of fibrosis extend and airspace availability in lung: A semi-automativ ImageJ/Fiji toolbox. PloS. 2 (2), e0298015(2024).
  16. Zhou, X., Moore, B. B. Lung section staining and microscopy. Bio Protoc. 7 (10), e2286(2017).
  17. Herovici, C. Picropolychrome: histological staining technic intended for the study of normal and pathological connective tissue. Rev Fr Etud Clin Biol. 8, 88-89 (1963).
  18. Sweat, F., Puchtler, H., Rosenthal, S. Sirius Red F3BA as a stain for connective tissue. Arch Pathol. 78, 69-72 (1964).
  19. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (6), 655-658 (2014).
  20. Montes, G. S., Junqueira, L. C. The use of the Picrosirius-polarization method for the study of the biopathology of collagen. Mem Inst Oswaldo Cruz. 86, Suppl 3 1-11 (1991).
  21. Rittié, L. Method for Picrosirius Red-polarization detection of collagen fibers in tissue sections. Methods Mol Biol. 1627, 395-407 (2017).
  22. Diehm, Y. F., et al. Stem cell-enriched hybrid breast reconstruction reduces risk for capsular contracture in a hybrid breast model. Plast Reconstr Surg. 152 (3), 572-580 (2023).
  23. Rich, L., Whittaker, P. Collagen and Picrosirius Red staining: A polarized light assessment of fibrillar hue and spatial distribution. Braz J Morphol Sci. 22 (2), 97-104 (2005).
  24. Datar, U. V., et al. Clinicopathologic study of a series of giant cell fibroma using picrosirius red polarizing microscopy technique. Arch Iran Med. 17 (11), 746-749 (2014).
  25. Nishat, R., Kumar, H. Collagen fibers in oral submucous fibrosis - A polarizing microscopy study using two special stains. Indian J Pathol Microbiol. 62 (4), 537-543 (2019).
  26. Lattouf, R., et al. Picrosirius red staining: a useful tool to appraise collagen networks in normal and pathological tissues. J Histochem Cytochem. 62 (10), 751-758 (2014).
  27. López De Padilla, C. M. Picrosirius Red staining: Revisiting its application to the qualitative and quantitative assessment of collagen type I and type III in tendon. J Histochem Cytochem. 69 (10), 633-643 (2021).
  28. Junqueira, L. C. U., Bignolas, G., Brentani, R. R. Picrosirius staining plus polarization microscopy, a specific method for collagen detection in tissue sections. Histochem J. 11 (4), 447-455 (1979).
  29. Zheng, L., et al. Scar collagen deposition in the airways of allografts of lung transplant recipients. Am J Respir Crit Care Med. 155 (6), 2072-2077 (1997).
  30. Astbury, S., et al. Reliable computational quantification of liver fibrosis is compromised by inherent staining variation. J Pathol Clin Res. 7 (5), 471-481 (2021).
  31. Feingold, B., et al. Diffuse myocardial fibrosis among healthy pediatric heart transplant recipients: Correlation of histology, cardiovascular magnetic resonance, and clinical phenotype. Pediatr Transplant. 21 (5), 12986(2017).
  32. vander Ploeg, E. A., Melgert, B. N., Burgess, J. K., Gan, C. T. The potential of biomarkers of fibrosis in chronic lung allograft dysfunction. Transplant Rev (Orlando). 35 (3), 100626(2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kronik Akci er ReddiMurin Akci er TransplantasyonuYar Kantitatif De erlendirmeFibrozis AnaliziPolarizasyon MikroskopisiMasson TrikromDijital G r nt Analizi

İlgili makaleler