Yöntem makalesi

Sıçanlarda Kalvarial Sütür-Kemik Kompozit Defektlerinin Saptanması: Sütür-Rejeneratif Tedavi İncelemesi İçin Standart Bir Model

2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/66417

⸱

10 Mayıs 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Oral Diseases & National Center for Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 2Department of Endodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University

Bu makalede

Özet

Sıçanlarda kalvarial sütür-kemik kompozit defektlerinin ayrıntılı cerrahi prosedürlerini ve modelin kısa ve uzun vadeli prognozlarını araştırıyoruz. Sütür rejeneratif tedaviler geliştirmek için standart bir model oluşturmayı amaçlıyoruz.

Özet

Büyük ölçekli kalvarial defektler sıklıkla kraniyal sütür bozulması ile çakışır, bu da kalvarial defekt restorasyonunda ve kafatası gelişiminde bozulmalara yol açar (ikincisi gelişmekte olan kafatasında meydana gelir). Bununla birlikte, standart bir modelin olmaması, sütür rejeneratif tedavilerin araştırılmasında ilerlemeyi engellemekte ve farklı çalışmalarda karşılaştırmalı analizler yapmak için zorluklar doğurmaktadır. Bu sorunu ele almak için, mevcut protokol, sıçanlarda kalvarial sütür-kemik kompozit defektlerinin ayrıntılı modelleme sürecini açıklamaktadır.

Model, koronal sütürler boyunca 4,5 mm × 2 mm ölçülerinde tam kalınlıkta dikdörtgen delikler açılarak oluşturulmuştur. Sıçanlara ötenazi yapıldı ve kafatası örnekleri ameliyat sonrası 0. gün, 2. hafta, 6. hafta ve 12. haftalarda toplandı. Ameliyattan hemen sonra toplanan örneklerden elde edilen μBT sonuçları, koronal sütürün ve bitişik kemik dokularının çıkarılmasını içeren sütür-kemik kompozit defektinin başarılı bir şekilde kurulduğunu doğruladı.

Ameliyat sonrası 6. ve 12. haftalardan elde edilen veriler, defektin kapanması için doğal bir iyileşme eğilimi gösterdi. Histolojik boyama, defekt merkezinde artmış mineralize lifler ve yeni kemik göstererek bu eğilimi daha da doğruladı. Bu bulgular, kalvarial defektleri takiben zaman içinde ilerleyici sütür füzyonunu gösterir ve sütür rejenerasyonu için terapötik müdahalelerin önemini vurgular. Bu protokolün, sütür rejeneratif tedavilerin geliştirilmesini kolaylaştıracağını, kalvarial defektlerin fonksiyonel restorasyonu hakkında yeni bilgiler sunacağını ve sütür kaybıyla ilişkili olumsuz sonuçları azaltacağını tahmin ediyoruz.

Giriş

Kraniyal sütürler, kafatası kemikleri arasındaki yoğun fibröz bağlantılardır, hafif kafatası hareketini kolaylaştırmak için eklem görevi görür ve basınç altındaki beyin için koruyucu bir yastık sağlar1. Son yıllarda, artan araştırmalar, kraniyal sütürlerin kafatası gelişimi, kraniyofasiyal homeostaz ve doğal osteo-onarıcı potansiyel 2,3,4,5,6,7,8'deki önemli rolünü vurgulamıştır. Büyüme ve gelişme dönemlerinde, kraniyal sütürler kafatasındaki ana büyüme merkezleri olarak işlev görür4. Sütürlerin her iki tarafındaki osteojenik cephelerde yeni kemik oluşumu meydana gelirken, sütürlerin içindeki hücreler farklılaşmamış bir mezenkimal durumu koruyarak beyin büyümesinin yanı sıra dengeli kafatası genişlemesini sağlar1. Bu sırada kraniyal sütürlerin kaybı, kafatasının ve beynin büyümesi arasında bir tutarsızlığa neden olarak beyin yaralanmaları, hidrosefali, kafa içi basıncın artması ve bilişsel işlev bozukluğu gibi ciddi sorunlara yol açar 3,9.

Ayrıca, kraniyal sütürler kalvarial defektlerin prognozunu belirlemede çok önemli bir rol oynamaktadır 5,7,10. Kalvarial yüzey boyunca rejeneratif potansiyel eşit olmayan bir şekilde dağılmıştır ve kraniyal sütürler, dikişsiz bölgelere kıyasla önemli ölçüde üstün yetenekler göstermektedir10,11. Bir çalışma, kalvarial defekt iyileşme hızının, kraniyal sütür ile yaralanma bölgesi10 arasındaki mesafe ile ters orantılı olduğunu göstermektedir. Spesifik olarak, koronal ve sagital sütürlerin çıkarılması, parietal kemik defektlerininiyileşmemesine yol açar 7, bu da kalvarial defektlerde sütür rejenerasyonunun gerekliliğini vurgulamaktadır. Bununla birlikte, mevcut çalışmaların odak noktası ağırlıklı olarak kranial kemik yapının restorasyonu üzerine yoğunlaşırken, sütür mezenşiminin rejenerasyonu ihmal edilmektedir.

Sütür rejenerasyonundaki ilerlemelerle ilgili olarak, sütür içeren kemik fleplerinin, mezenkimal kök hücrelerin (MSC'ler) ve yapay biyomateryallerin transplantasyonu ile umut verici sonuçlar gözlenmiştir. Dikişli kemik flepleri kalvarial defektlere nakledildiğinde, kaynamama ve periosteum, dura mater veya osteosit oluşturamama gösteren dikişsizlerin aksine başarılı bir şekilde entegre edildi ve iyileşti5. Benzer şekilde, kemik iliğinden elde edilen MSC'lerin sagital sütür-kemik kompozit defektlerine implantasyonu da sütür benzeri boşlukların oluşumunu kolaylaştırmıştır12. Yakın zamanda yapılan bir çalışmada, intrakraniyal basınç kontrolü, kafatası deformitesinin düzeltilmesi ve gelişmiş nörobilişsel fonksiyona izin veren Gli1+ MSC'ler ile sütür rejenerasyonunun gerçekleştirilmesi vurgulanmıştır13. Rejeneratif tıp ve biyomedikal mühendisliği geliştikçe, araştırmacılar uyarlanabilir ve özelleştirilebilir özellikleri nedeniyle doku mühendisliği biyomalzemelerine giderek daha fazla odaklanmaktadır14. Özellikle, politetrafloroetilen membranların kraniyal kemik ve sütür mezenşiminin aynı anda yeniden yapılandırılmasında etkili olduğu kanıtlanmıştır15,16.

Bununla birlikte, kraniyofasiyal araştırmalar, kemik, deri, kıkırdak ve kaslar gibi diğer dokuları onarmada nispeten olgun modellerin aksine, sütür mezenkimal rejeneratif tedavileri keşfetmek için yerleşik modellerden yoksundur17. Standartlaştırılmış bir modelin olmaması, sütür rejeneratif tedavilerin çalışmasını kısıtlamakta ve farklı çalışmalar arasında karşılaştırmalı analiz yapmayı zorlaştırmaktadır. Bu nedenle, çalışmamızda uygulanabilir ve tekrarlanabilir bir sıçan kalvarial sütür-kemik kompozit defekti saptandı. Bu yöntem ile kranial sütür rekonstrüksiyonu için uygun klinik girişimler geliştirmeyi, kalvarial defektlerin fonksiyonel onarımı ve sütür kaybına bağlı olumsuz sonuçların azaltılması konusunda yeni bakış açıları sunmayı amaçlıyoruz.

Protokol

Bu çalışmadaki tüm hayvan prosedürleri, Sichuan Üniversitesi Batı Çin Stomatoloji Okulu Etik Komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır (WCHSIRB-D-2021-597). Toplam 12 (dört zaman noktasının her birinde 3 sıçan) Sprague-Dawley (SD) sıçan (erkek, 300 g, 8 haftalık) ticari bir kaynaktan elde edildi (bkz.

1. Ameliyat öncesi hazırlık

  1. Cerrahi malzemeler
    1. Kavisli forseps, tek kullanımlık steril neşter, periosteal elevatörler, irrigasyon iğnesi, pamuk topları, düşük hızlı bir el aleti, cerrahi motor, dental düşük hızlı yuvarlak frezler (Şekil 1B, sırasıyla 1.2 mm ve 0.8 mm çap), bir iğne tutucu, 3-0 monofilament sütürler ve düz bir makas dahil olmak üzere Şekil 1A'da gösterilen cerrahi aletleri hazırlayın.
  2. Sterilizasyon ve dezenfeksiyon
    1. Aletleri önceden buhar sterilizasyonu (125-135 °C, 20-25 dakika) ile sterilize edin.
    2. Elektrikli tıraş makineleri gibi ısıya duyarlı tıbbi ekipmanları sterilize etmek için etanol kullanın.
    3. Operasyon platformunu kaplamak için steril tıbbi dokunmamış kumaşlar kullanın ve çevredeki ortamı %75 etanol ile dezenfekte edin.
  3. Anestezi
    1. Hayvanları 1 haftalık bir alışma süresi ile ameliyata hazırlayın.
    2. Anestezi için ameliyattan 20 dakika önce sıçanlara intraperitoneal olarak ksilazin (10 mg / kg) ve ketamin (100 mg / kg) enjekte edin veya genel anestezi elde etmek için uygun bir anestezi protokolü kullanın.
      NOT: Sıçanlarda intraperitoneal olarak uygulanan ketamin-ksilazin anestezik kokteyli tipik olarak 10-15 dakika içinde etkili olur ve enjeksiyondan yaklaşık 35-40 dakika sonra pik anesteziye ulaşır. Anestezi sırasında hipotermiyi önlemek için, sıçanlar en iyi şekilde bir ısıtma yastığına yerleştirilir.
    3. Analjezi sağlamak için preoperatif deri altı 5 mg / kg'da karprofen enjeksiyonu uygulayın.
    4. Sıçanların bilinçli ve duyarlı olup olmadığını belirlemek için "ayak parmağı sıkıştırma yöntemini" kullanın.

2. Cerrahi süreç

  1. Site hazırlığı
    1. Sıçatanı, bu duruşu korumak için özel cihazlar veya kısıtlamalar gerektirmeden, başı doğal olarak dikey olarak uzanacak şekilde yüzüstü pozisyona getirin (Şekil 2A).
    2. Kornea kuruluğunu önlemek için farenin gözlerine veteriner merhemi, yani Vazelin sürün.
    3. Burun köprüsü ile servikal omurga eklemi arasındaki kafa derisinden elektrikli tıraş makinesi ile kılları çıkarın (Şekil 2B). Cerrahi alanı merkezden yayılan dairesel hareketlerle %2 iyodofor solüsyonu ve ardından %75 etanol ile dezenfekte edin. Hayvanın sırtını ve kesiği çevreleyen kürkü örtmek için cerrahi bir örtü kullanın.
  2. Cerrahi alan açma
    1. Burun kemiğinin orta noktasından başlayarak kafatası orta hattını takip ederek tek kullanımlık bistüri ile 2 cm boyuna cilt kesisi yapın (Şekil 2C).
    2. Bir neşter ile cilt tabakasının başlangıç noktasını ve kapsamını yansıtan orta hat periosteal insizyonu yapın (Şekil 2D). Ardından, parietal kemikleri, frontal kemikleri ve koronal sütürleri ortaya çıkarmak için insizyonun her iki tarafındaki periosteuumu bir periosteal asansör (Şekil 2E1) ile nazikçe kaldırın (Şekil 2E2).
      NOT: Periosteumu keserken, keserken aşırı kanamayı önlemek için kraniyal dikişlere zarar vermemeye dikkat edin. Koronal sütürün yeterli maruziyeti aşağıdaki prosedürler için son derece önemlidir.
    3. Yarayı tuzlu su çözeltisi ile durulayın ve cerrahi bölgeyi pamuk topları ile kurulayın.
  3. Sütür-kemik kompozit defekt modelinin kurulması
    1. Düğmeyi çevirerek cerrahi motoru 35.000 rpm'ye ayarlayın (Şekil 1A, sarı ok), ardından anahtarı açın (Şekil 1A, beyaz ok).
    2. Koronal sütürün herhangi bir noktasından başlayarak, bir atılım hissi hissedilene kadar 1,2 mm çapında yuvarlak bir frez kullanarak dikey kuvvet uygulayın.
      NOT: Penetrasyon için başlangıç noktası olarak koronal sütürün orta noktasını ( Şekil 2E2'de sarı oklarla gösterilmiştir) önerin. Taşlama yaparken, diş matkapları kraniyal yüzeye dik tutulmalıdır. Beyin hasarı veya beyin kanaması da dahil olmak üzere sıçanlara daha fazla zarar vermemek için kafatasının tam kalınlığına nüfuz ettikten sonra delmeye devam etmemeye dikkat edin.
    3. Penetrasyon noktasından, yaklaşık 4 mm uzunluğunda bir konumlandırma oluğu oluşturmak için frezi koronal sütür boyunca yanal olarak hareket ettirin (Şekil 2F1). Başlangıçta dikdörtgen tam kalınlıkta bir kusur oluşturmak için konumlandırma oluğunun her iki yanındaki frez ile kemik dokusunu çıkarın (Şekil 2F2).
    4. Ayrıntıları iyileştirmek için 0,8 mm çapında bir yuvarlak frez kullanın (Şekil 2G1), dik açıların taşlanmasını ve kusur marjlarının düzleştirilmesini içerir, sonuçta 2 mm genişliğinde ve 4,5 mm uzunluğunda standart bir dikdörtgen kusur elde edilir (Şekil 2G2).
      NOT: 300 g SD sıçanlarda sagital ve frontal sütürleri korurken koronal sütürün tamamen çıkarılmasını sağlamak için, mümkün olan maksimum defekt uzunluğu yaklaşık 4,5 mm'dir. Koronal sütürün ön-arka yöndeki genişliği göz önüne alındığında (Ek Şekil S1) defekt genişliği 2 mm olarak ayarlandı.
    5. Kendini karşılaştırmak için koronal sütürün sol ve sağ yarısında iki kusur oluşturun.
    6. Kafatası ve beyinde termal yaralanmaya karşı koruma sağlamak için delme prosedürü sırasında tuzlu su çözeltisinin sürekli sulanmasını sağlayın. Bu arada, operasyon bölgesini kurutmak için pamuk topları kullanın.
  4. Numune boyutu doğrulaması
    1. Tüm numunelerde tutarlılığı sağlamak için sürmeli bir kumpas (Şekil 2H1, H2) kullanarak kusurların uzunluğunu ve genişliğini düzenli olarak doğrulayın.
  5. Cerrahi alan kapatma
    1. Cildi 3-0 monofilament sütürlerle kapatın (Şekil 2I).
  6. Ameliyat sonrası hemen in vivo mikro bilgisayarlı tomografi (μBT)
    1. Mümkünse, cerrahi prosedürün başarısını doğrulamak ve her birey için kusur iyileşme eğilimlerini izlemek için ameliyattan hemen sonra tüm sıçanlarda in vivo μCT taramaları yapın.

3. Ameliyat sonrası bakım

  1. Hayvan bakım protokollerine göre, ameliyattan sonra gerektiği gibi analjezikler, örneğin carprofen (5 mg / kg, deri altı kullanım) uygulayın.
  2. Ameliyat sonrası iyileşme için fareleri sabit bir ısıtma yastığına (37 °C) aktarın.
  3. Tamamen bilinçli olduktan sonra, fareleri temiz yatak takımları içeren barınak kafeslerine yerleştirin.
    NOT: Ameliyat sonrası fareleri sürekli olarak izleyin. Sternal yaslanmayı sürdürene kadar onları gözetimsiz bırakmayın. Ameliyat edilen fareleri tamamen iyileşene kadar diğerlerinden izole edin.
  4. 24 saat boyunca analjezi yönetimi ve postoperatif izleme yapın, ardından ameliyattan sonraki ilk hafta boyunca günlük değerlendirmeler yapın. Daha sonra fareleri haftada en az 1-2 kez izleyin.

4. Numune toplama ve veri analizi

  1. Numune hazırlama
    1. Ameliyat sonrası 0. gün, 2. hafta, 6. hafta ve 12. haftalarda kafatası örneklerini toplayın. CO2 inhalasyonu kullanarak sıçanları ötenazi yapın.
    2. Daha fazla analizden önce numuneleri 4 °C'de 24 saat boyunca %4 paraformaldehit içinde sabitleyin.
  2. μCT değerlendirmesi
    1. Ameliyat sonrası 0. gün, 6. hafta, 12. haftanın kranial kemikleri üzerinde aşağıdaki tarama parametreleriyle μCT taramaları gerçekleştirin: X-ışını tüpü potansiyeli, 70 kVp; X-ışını yoğunluğu, 0.2 mA; filtre, AL 0,5 mm; entegrasyon süresi, 1 x 300 ms; ve voksel boyutu, 10 μm.
    2. Görüntü işleme yazılımı ile 3D rekonstrüksiyon ve kesit görüntüleri elde edin (bkz. Malzeme Tablosu).
    3. Artık kusur hacmini ölçün ve ilgili yazılımla istatistiksel analiz yapın (bkz. Malzeme Tablosu).
  3. Histolojik boyama
    1. Kafatası kemiklerini %12 (a/h) etilen diamin tetraasetik asit çözeltisinde (pH = 7.2) 4 hafta boyunca 4 ° C'de kireçten arındırın.
      NOT: Numuneleri her 3 günde bir çözelti değişiklikleriyle kireçten arındırın. Süreci hızlandırmak için bir çalkalayıcı kullanın. Tamamlama, 25 G'lik bir iğne numuneye kolayca nüfuz ettiğinde gösterilir.
    2. Standart protokolleri18 kullanarak dehidrasyon, parafin gömme ve 6 μm'lik bölümlerin hazırlanması ile devam edin.
    3. Hematoksilen ve eozin (H & E) ve Masson'un trikrom boyamasını kullanarak kit protokolü18'i kullanarak histolojik analiz yapın.

Sonuçlar

Bu çalışmada, sıçan kalvarial sütür-kemik kompozit defekti, koronal sütür boyunca 4.5 mm x 2 mm'lik dikdörtgen bir delik açılarak kuruldu. Cerrahi şematik çizim ve araştırma akış şeması Şekil 3'te gösterilmiştir. Postoperatif 0 günlük örneklerin, yani ameliyattan hemen sonra toplanan örneklerin 3D görüntüsü ve kesitsel görünümü, koronal sütürün yanı sıra her iki uçtaki bitişik kemik yapılarının tamamen çıkarılmasını içeren tam kalınlıkta bir kalvarial defektin başarılı bir şekilde oluşturulduğunu doğruladı (Şekil 4A). Ameliyattan 6 hafta sonra μBT görüntüleri ve ilgili istatistiksel analiz sonuçları, defekt içinde oluşan düzensiz kalsifiye nodüllerin eşlik ettiği defekt kapanmasına doğru doğal bir eğilim gösterdi (Şekil 4). Bu eğilim ameliyattan 12 hafta sonra daha belirgin hale geldi (Şekil 4), bu da zaman ilerledikçe potansiyel sütür füzyonunu gösteriyor. Daha ileri histolojik analizler H&E ve Masson'un trikrom boyaması kullanılarak yapıldı. Ameliyattan iki hafta sonra, yoğun ve kalın fibröz doku oluşturan ve defekt alanını etkili bir şekilde kapatan periost ve dura materde belirgin bir ekstansiyon ve devamlılık gözlemledik (Şekil 5). Özellikle, bu erken zaman noktasında, ameliyattan 6 hafta sonra varlığı önemli bir artış gösteren mavi lekeli mineralize liflerin ortaya çıktığı tespit edildi (Şekil 5). Ameliyat sonrası 12 haftada, defekt merkezinde büyük yeni kemik parçaları gözlendi (Şekil 5), bu da stromal kalsifikasyon ve sütür kapanmasının olumsuz prognozunu yeniden doğruladı. Sütür-kemik kompozit defektlerinin olumsuz doğal iyileşme sonuçları, biyomateryallerin implantasyonu gibi terapötik müdahaleler yoluyla kraniyal sütür rejenerasyonunun gerekliliğini vurgulamaktadır 13,15,16.

figure-results-1
Şekil 1: Cerrahi aletler. (A) Cerrahi malzemeler, (1) kavisli forseps, (2) tek kullanımlık steril neşter, (3) periosteal asansör, (4) sulama iğnesi, (5) pamuk topları, (6) düşük hızlı el aleti, (7) cerrahi motor (sarı ok RPM topuzunu ve beyaz ok anahtarı temsil eder), (8) dental düşük hızlı yuvarlak frezler, (9) iğne tutucu, (10) 3-0 monofilament sütürler ve (11) düz makas. (B) 1,2 mm ve 0,8 mm çapında düşük hızlı yuvarlak frezler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Cerrahi prosedür. (A) Fareyi yüzüstü pozisyonda konumlandırın. (B) Saç derisindeki saçları elektrikli bir tıraş makinesiyle tıraş edin. (C) Tek kullanımlık bir neşter ile cildi kesin. (D) Periosteumu bir neşter ile kesin. (E1, E2) Bir periosteal asansör ile koronal sütürleri ortaya çıkarmak için periosteuumu yükseltin. Sarı oklar koronal sütürleri gösterir. (F1) Bir konumlandırma oluğu delin. (F2) Başlangıçta 1,2 mm yuvarlak frez ile dikdörtgen bir kusur oluşturun. (G1, G2) Standart 4,5 x 2 mm dikdörtgen şekil elde etmek için kusuru 0,8 mm yuvarlak frez ile kesin. (H1, H2) Kusurun genişliğini ve uzunluğunu sürmeli bir kumpas ile kalibre edin. (I) Cildi 3-0 monofilament sütürler kullanarak kapatın. Bu tasvir, gelişmiş anatomik görselleştirmeyi kolaylaştırmak için kasıtlı olarak örtüsüz bırakılan bir kadavra kullanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Kalvarial sütür-kemik kompozit defektinin şematik gösterimi ve bu çalışmanın araştırma stratejisi. Kısaltmalar: H&E = hematoksilen ve eozin; μCT = mikro bilgisayarlı tomografi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Kalvarial sütür-kemik kompozit defektinin kapanma eğilimi. (A) Postoperatif 0. gün, 6. hafta ve 12. haftalarda temsili μBT görüntüleri ve sütür-kemik kompozit defektlerinin kesitsel görünümleri. Kesitler, 3D görüntülerde sarı kesikli çizgilerle gösterilen konumları gösterir. Ölçek çubukları = 2 mm. (B) μCT değerlendirmeleri yoluyla ameliyat sonrası rezidüel defekt hacminin kantitatif analizi. n = 6 kopya/grup. Veriler ortalama ± SD. Tek yönlü varyans analizi ve ardından Dunnett'in çoklu karşılaştırma testi olarak ifade edilmiştir. sayfa <0.001. Kısaltmalar: PO = ameliyat sonrası; μCT = mikro bilgisayarlı tomografi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Sütür-kemik kompozit defektlerinde histolojik varyasyonlar. (A) H&E ve (B) PO 2. hafta, 6. hafta ve 12. haftalarda sütür-kemik kompozit defektlerinin Masson'un trikrom boyaması. Kırmızı kesikli ana hatlar, kusur alanını kaplayan fibröz dokuyu gösterir. Siyah pentagramlar, mavi lekeli mineralize lifleri temsil eder. Sarı pentagramlar, defekt merkezinde oluşan yeni kemiği vurgular. Ölçek çubukları = 500 μm; 200 μm (iç kısımlar). Kısaltmalar: PO = ameliyat sonrası; H&E = hematoksilen ve eozin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S1: Anterior-posterior yönde koronal sütür genişliği (sagital düzlem kalvarial görüntü). Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Konvansiyonel kalvarial defekt modelleri, kraniyal sütürler içersin ya da içermesin, öncelikle sert dokunun onarımına odaklanır ve genellikle sütür mezenşiminin hayati rejenerasyonunu ihmal eder19,20. Sütür rejenerasyonu araştırmalarında, Mardas ve ark.15,16 tarafından yapılanlar gibi önceki modeller, sıçanların sagital sütürü boyunca 5 mm'lik dairesel bir defekt oluşturmak için bir trephine frez kullanarak, önemli miktarda sert doku kaybına neden olmuş ve böylece sütür rejenerasyonunun birincil hedefinden sapmıştır. Benzer şekilde, Wilk ve ark.7 tarafından hazırlanan ve hem sagital hem de sağ koronal sütürlerin çıkarılmasını ve sağ parietal kemikte kritik bir kemik defekti oluşturulmasını kapsayan metodoloji, bilgilendirici olmasına rağmen, çoklu defekt bölgelerinin varlığı nedeniyle karmaşıklıklar ve potansiyel kafa karıştırıcı değişkenler ortaya çıkarmıştır. Buna karşılık, protokolümüz koronal sütür boyunca bilateral dikdörtgen defektler oluşturarak daha akıcı ve hedefe yönelik bir araştırma modeli hedeflemektedir. Majör kraniyal sütürler arasında koronal, sagital, metopik ve lambdoid sütürler bulunur21. Kafatası üzerinde uzunlamasına düzenlenen metopik ve sagital sütürlerden farklı olarak, koronal ve lambdoid sütürler enine yerleştirilir ve iki yarıya bölünebilir, bu da aynı koşullara sahip iki kusurun oluşturulmasını kolaylaştırır. Lambdoid sütürün aksine, kafa derisi insizyonu ile açığa çıkan cerrahi alan, koronal sütürde bir dizi prosedür için daha erişilebilirdir. Koronal sütürün hem sol hem de sağ yarısında defektler oluşturmak ve her bölgeye farklı müdahaleler uygulamak, kendi kendini kontrol etme yoluyla farklı tedavilerin daha basit bir şekilde karşılaştırılmasını kolaylaştırır. Ayrıca, bu yaklaşım, tedavi edilen ve tedavi edilmeyen taraflar arasında bir karşılaştırmaya izin vererek, müdahale edilen iyileşme süreci ile doğal iyileşme süreci arasındaki eşitsizlikler hakkında fikir verir. Bu nedenle, çalışmamız, sıçanlarda koronal sütürlerin her iki tarafında sütür-kemik kompozit defektlerinin oluşturulmasının, sütür-rejeneratif tedavileri incelemek için uygun bir cerrahi model olduğunu düşündürmektedir.

Kusur boyutlarının seçimi, pratik ve anatomik hususlar tarafından titizlikle yönlendirilir. Bu spesifik hayvan modeli için birincil zorluk, sagital ve frontal sütürleri korurken minimal kemik dokusu çıkarılması ile koronal sütürün tamamen çıkarılmasında yatmaktadır. Bu nedenle optimal strateji, koronal sütür boyunca hassas bir dikdörtgen defektin oluşturulmasını gerektirir. Bu stratejik karar vazgeçilmezdir, çünkü koronal sütürde veya komşu sütürlerde kalan herhangi bir mezenşim, tedavinin gerçek rejeneratif etkisinin değerlendirilmesinde yanlışlıklara neden olabilir. Sonuç olarak, yaklaşık 4,5 mm'de 300 g erkek SD sıçanlar için mümkün olan en büyük kusur uzunluğunu belirledik. Ayrıca, koronal sütürün ön-arka yöndeki genişliğini ( Ek Şekil S1'de gösterildiği gibi sagital düzlemde yaklaşık 1,5 mm) dikkate alarak, sütürün kraniyal yüzeyden derinliğine kadar tamamen çıkarılmasını sağlamak için defekt genişliğini 2 mm olarak ayarladık. Kusurun hem uzunluk hem de genişlik açısından spesifik boyutlarının, hayvanın türü ve yaşı gibi faktörlerin yanı sıra deneysel hedeflere bağlı olarak ayarlama gerektirebileceğini belirtmek gerekir. Başka bir çalışma, koronal sütür boyunca ince, 0.3-0.4 mm genişliğinde, dikdörtgen bir defekt oluşturdu ve farelerin daha küçük boyutunu barındırdı13.

Özellikle, bu cerrahi modelin oluşturulmasındaki zorluk, standart ve tek tip dikdörtgen kusurların oluşturulmasında yatmaktadır. Numuneler arasında tek tip bir biyoaktif faktör dozajını garanti etmek ve böylece hem gruplar arası hem de grup içi varyasyonları en aza indirmek için kusur şeklindeki tutarlılığı korumak zorunludur. Bu bağlamda, sütür-kemik kompleksinin çıkarılması sürecinde, başlangıçta koronal sütürün yerini belirlemek ve tam kalınlıkta dikdörtgen defektin kaba bir taslağını oluşturmak için 1,2 mm çapında yuvarlak bir frez kullandık (Şekil 1B). Daha sonra, dik açılı dönüşleri iyileştirmek ve kusurlu kenarları düzeltmek için en küçük yuvarlak freze (0,8 mm çap) geçtik (Şekil 1B). Her bir kusurun uzunluk ve genişliğinin tutarlılığını sağlamak için, delme işlemi sırasında aşırı veya yetersiz taşlamayı önlemek için sürmeli bir kumpas kullanıldı. Bu yaklaşıma rağmen, μCT taraması, oluşturduğumuz dikdörtgen kusurun hala bir şekilde yay şeklinde olduğunu ortaya çıkardı (Şekil 4), bu da hassas taşlama şekilleri elde etmek için modelleme yönteminin daha fazla optimizasyonunun gerekliliğini ortaya koydu.

Prognozu değerlendirmek için μCT taramaları, kemik dokusu iyileşmesinin değerlendirilmesi ve kraniyal sütürlerin durumunun, kapalı veya tıkasız olup olmadıklarının değerlendirilmesi de dahil olmak üzere en doğrudan araçları sağlar. Ayrıca, histopatolojik düzeyde inceleme kraniyal sütür rejenerasyonu çalışmaları için esastır. Histopatolojik boyama, mezenkimal doku oluşumu, kemik restoratif inhibisyonu veya materyal yer kaplamasına bağlı defektlerin kapanmamasını ayırt etmede yardımcı olur. Sadece mezenkimal dokunun rejenerasyonunu kolaylaştıran yaklaşımların kraniyal sütür rejenerasyonu potansiyeline sahip olması muhtemeldir. Ayrıca, model yapımı sırasında ilgili deneylerin yapılmamasına rağmen, terapötik girişimleri takiben rejenere doku içinde sütür MSC belirteçlerinin protein düzeyinde ekspresyonunun tespit edilmesi şiddetle tavsiye edilir. İmmünofloresan, immünohistokimya veya akış sitometrisi gibi tekniklerin kullanıldığı bu analiz, sütür rejenerasyonunun başarısının doğrulanmasına katkıda bulunur. Spesifik sütür MSC belirteçleri arasında Cd51, Cd200, Gli1, Axin2, Prrx1, Ctsk ve daha fazlasıbulunur 1,22.

Özetle, bu çalışmada kros sütür kalvarial defektlerin prognozunu incelemek ve kraniyal sütürlerin rejenere edilmesi için uygun tedaviler geliştirmek amacıyla sıçanlarda kalvarial sütür-kemik kompozit defektlerinin ayrıntılı modelleme süreci bildirilmiştir. Kraniyal sütür rejenerasyonu alanının, kraniyal sütürlerin rejenere edilmesi için literatürde yaygın olan standart modeller veya yöntemler olmaksızın gerçekten niş olduğunu belirtmek yerinde olacaktır. Bu nedenle, protokolümüzün sütür rejeneratif yaklaşımları araştırmak için sağlam bir metodolojik temel sağladığına ve hastaların yaşam kalitesini artırma nihai hedefi ile kalvarial defektlerin fonksiyonel restorasyonu hakkında yenilikçi bakış açıları sunduğuna inanıyoruz.

Açıklamalar

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı 82100982 (FL), 82101000 (HW), 82001019 (BY), Sichuan Eyaleti Bilim ve Teknoloji Departmanı 2022NSFSC0598 (BY), 2023NSFSC1499 (HW) ve Sichuan Üniversitesi Batı Çin Stomatoloji Okulu/Hastanesi'nden Araştırma Fonu (RCDWJS2021-5). Şekil 3 Biorender.com ile oluşturulmuştur.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 4 paraformaldehitBiosharpBL539A
% 2 İyodofor çözeltisiChengdu Jinshan Kimyasal Reaktif Co., Ltd.Hiçbiri
%75 EtanolChengdu Jinshan Kimyasal Reaktif Co., Ltd.Yok
Pamuk toplarıHaishi Hainuo Group Co., Ltd. Yok
Pamuklu çubuklarLakong Medical Devices Co., Hiçbiri
Kavisli forsepsChengdu Shifeng Co., Ltd.Yok
Kalıntı kusur hacmi değerlendirmeleri için Dataviewer ve Ctan yazılımıBrukerYok
Dental düşük hızlı yuvarlak bursDreybird Medical Equipment Co., Ltd.RA3-012
RA1-008
Tek kullanımlık steril neşterHangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd.Yok
Tek kullanımlık şırıngalar (22 G)Chengdu Shifeng Co., Ltd.SB1-089(IX)
Elektrikli tıraş makinesiJASEBM320210
Etilen Diamin Tetraasetik Asit (EDTA)BioFroxx1340GR500
Hematoksilen ve Eozin Leke KitiBiosharpBL700B
Sulama iğnesi (23 G)Sichuan New Century Medical Polymer Products Co., Ltd.Yok
Düşük hızlı el aletiGuangzhou Dental Guard Technology Co., Ltd.Hiçbiri
Masson' s Trikrom Leke KitiSolarbioG1340
Tıbbi dokunmamış kumaşlarHenan Yadu Industrial Co., Ltd. Yok Mikro
bilgisayarlı tomografi (&mikro; CT) Scanco Medikal AGve mikro; Kesitsel görüntüler için CT45
Mimics 20.0MateryalizeYok
İğne tutucularChengdu Shifeng Co., Ltd.Yok
Periosteal asansörChengdu Shifeng Co., Ltd.Yok Tuzlu
su çözeltisiSichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.Yok
3D görüntü rekonstrüksiyonu için Scanco tıbbi görselleştirici yazılımıScanco Medical AGYok
İstatistiksel analiz için SPSS Statistics 20.0IBMYok
sıçanları Byrness Weil Biotech LtdYok
Düz MakasChengdu Shifeng Co., Ltd.Yok
Cerrahi MotorMARATHONN3-140232
Cerrahi sütürler (3-0 monofilament)Hangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd.hiç kimse
Sprague-Dawley

Kaynaklar

  1. Li, B., et al. Cranial suture mesenchymal stem cells: insights and advances. Biomolecules. 11 (8), 1129(2021).
  2. Opperman, L. A. Cranial sutures as intramembranous bone growth sites. Dev Dyn. 219 (4), 472-485 (2000).
  3. Lenton, K. A., Nacamuli, R. P., Wan, D. C., Helms, J. A., Longaker, M. T. Cranial suture biology. Curr Top Dev Biol. 66 (4), 287-328 (2005).
  4. Slater, B. J., et al. Cranial sutures: A brief review. Plast Reconstr Surg. 121 (4), 170-178 (2008).
  5. Zhao, H., et al. The suture provides a niche for mesenchymal stem cells of craniofacial bones. Nat Cell Biol. 17 (4), 386-396 (2015).
  6. Maruyama, T., Jeong, J., Sheu, T. -J., Hsu, W. Stem cells of the suture mesenchyme in craniofacial bone development, repair and regeneration. Nat Commun. 7 (1), 10526(2016).
  7. Wilk, K., et al. Postnatal calvarial skeletal stem cells expressing PRX1 reside exclusively in the calvarial sutures and are required for bone regeneration. Stem Cell Reports. 8 (4), 933-946 (2017).
  8. Doro, D. H., Grigoriadis, A. E., Liu, K. J. Calvarial suture-derived stem cells and their contribution to cranial bone repair. Front Physiol. 8, 956(2017).
  9. Kajdic, N., Spazzapan, P., Velnar, T. Craniosynostosis-recognition, clinical characteristics, and treatment. Bosn J Basic Med Sci. 18 (2), 110-116 (2018).
  10. Park, S., Zhao, H., Urata, M., Chai, Y. Sutures possess strong regenerative capacity for calvarial bone injury. Stem Cells Dev. 25 (23), 1801-1807 (2016).
  11. Quarto, N., Behr, B., Longaker, M. T. Opposite spectrum of activity of canonical Wnt signaling in the osteogenic context of undifferentiated and differentiated mesenchymal cells: Implications for tissue engineering. Tissue Eng Part A. 16 (10), 3185-3197 (2010).
  12. Kaku, M., et al. Mesenchymal Stem Cell-Induced Cranial Suture-Like Gap in Rats. Plast Reconstr Surg. 127 (1), 69-77 (2011).
  13. Yu, M., et al. Cranial suture regeneration mitigates skull and neurocognitive defects in craniosynostosis. Cell. 184 (1), e18 243-256 (2021).
  14. Koons, G. L., Diba, M., Mikos, A. G. Materials design for bone-tissue engineering. Nat Rev Mater. 5 (8), 584-603 (2020).
  15. Mardas, N., Kostopoulos, L., Karring, T. Bone and suture regeneration in calvarial defects by e-PTFE-membranes and demineralized bone matrix and the impact on calvarial growth: an experimental study in the rat. J Craniofac Surg. 13 (3), 453-462 (2002).
  16. Kostopoulos, L., Karring, T. Regeneration of the sagittal suture by GTR and its impact on growth of the cranial vault. J Craniofac Surg. 11 (6), 553-561 (2000).
  17. Mosaddad, S. A., Hussain, A., Tebyaniyan, H. Exploring the use of animal models in craniofacial regenerative medicine: A narrative review. Tissue Eng Part B Rev. , (2023).
  18. Tan, X., et al. PgC3Mg metal-organic cages functionalized hydrogels with enhanced bioactive and ROS scavenging capabilities for accelerated bone regeneration. J Mater Chem B. 10 (28), 5375-5387 (2022).
  19. Yazdanian, M., et al. Fabrication and properties of βTCP/Zeolite/Gelatin scaffold as developed scaffold in bone regeneration: in vitro and in vivo studies. Biocybern Biomed Eng. 40 (4), 1626-1637 (2020).
  20. Soufdoost, R. S., et al. In vitro and in vivo evaluation of novel Tadalafil/β-TCP/Collagen scaffold for bone regeneration: A rabbit critical-size calvarial defect study. Biocybern Biomed Eng. 39 (3), 789-796 (2019).
  21. Russell, W. P., Russell, M. R. Anatomy, head and neck, coronal suture. StatPearls. , (2022).
  22. Menon, S., et al. Skeletal stem and progenitor cells maintain cranial suture patency and prevent craniosynostosis. Nat Commun. 12 (1), 4640(2021).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kalvaryal DefektlerS t r RejenerasyonuS an ModeliKoronal S t rKemik yile mesiMikro BT G r nt lemeHistolojik BoyamaKompozit Defekt ModeliKranyal S t r BozulmasYeni Kemik Olu umu

İlgili makaleler