Yeni bileşiklerin demiri şelatlama yeteneğini doğrulamak için ölçülebilir ve ucuz hücresiz floresan yöntemi

Özet

Yeni bileşiklerin demiri şelatlama yeteneğini hızlı ve ucuz bir şekilde doğrulayabilen bir floresan tahlili tarif ediyoruz. Tahlil, bileşiklerin, zayıf demir şelatlama floresan probu Calcein'in demir bağlama aktivitesini aşma yeteneğini ölçer ve şelasyon meydana geldiğinde floresanda ölçülebilir bir artışa neden olur.

Özet

Kanser hücreleri çoğalmalarını sürdürmek için büyük miktarda demire ihtiyaç duyarlar. Demir metabolizması, kanserin ayırt edici özelliği olarak kabul edilir ve demiri kanser karşıtı yaklaşımlar için geçerli bir hedef haline getirir. Yeni bileşiklerin geliştirilmesi ve daha fazla modifikasyon için lead'lerin tanımlanması, mekanizma tahlillerinin kanıtının yapılmasını gerektirir. Proliferasyon üzerindeki etkiyi değerlendirmek için birçok test vardır; Bununla birlikte, demiri şelatlama yeteneği, yüksek ekipman maliyetleri ve şelasyonun gücünü hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde ölçme zorluğu nedeniyle önemli ve bazen gözden kaçan bir son nokta ölçüsüdür. Burada, yeni bileşiklerin demiri şelatlama yeteneğini doğrulamak için ölçülebilir ve ucuz bir hücresiz floresan yöntemini açıklıyoruz. Tahlilimiz, floresansı çoğu floresan mikrotitre plaka okuyucusunda ölçülebilen, ticari olarak temin edilebilen ucuz floresan boya Calcein'e dayanmaktadır. Calcein zayıf bir demir şelatörüdür ve Fe^2+/3+'yı bağladığında floresansı söndürülür; floresan, yeni bir şelatör bağlı Fe^{2 + / 3 +} için Calcein'i geride bıraktığında geri yüklenir. Floresan söndürmenin çıkarılması ve bunun sonucunda floresansta meydana gelen artış, yeni bir varsayılan şelatörün şelasyon kabiliyetinin belirlenmesine izin verir. Bu nedenle, yeni aday şelatör bileşiklerinin hızlı bir şekilde taranmasına izin veren ucuz, yüksek verimli bir test sunuyoruz.

Giriş

Ortak bir dizi değiştirilmiş biyolojik yetenek yoluyla kanserin gelişimi ile ilgili hücrelerdeki fenotipik değişiklikler, artık yaygın olarak kanserin ayırt edici özellikleri olarak adlandırılmaktadır. Bunlar arasında, kanser hücresi biyolojisinde yaygın olan enerji metabolizmasının yeniden programlanmasından kaynaklanan değişiklikler vardır¹. Bu tür metabolik yeniden programlama, hızlı proliferasyonu ve tümör büyümesini desteklemek için demir için artan bir gereksinimi içerir². Demire olan bu susuzluk, kendi başına kanserin ^3,4 ayırt edici özelliği olarak kabul edilen düzensiz demir metabolizmasına yol açar ve düzensizlik tüm aşamalarda^{meydana gelir 5}. Daha yakın zamanda Welch ve Hurst tarafından önerilen metastazın ayırt edici özellikleri, demir^6'nın rolünü içerir, çünkü demir oksidatif stresi indükleyebilir ve bu da genom, epigenom ve proteomdaki değişikliklere aracılık ederek metastaz^{olasılığını artırabilir 7}. Epidemiyolojik çalışmalarla demir seviyeleri ile artan kanser oluşumu arasında bir bağlantı olduğu gösterilmiştir⁸.

Kanser hücreleri büyük miktarda demir gerektirdiğinden, demir eksikliğine ve dolayısıyla demir şelasyonuna karşı hassastırlar. Yakın zamanda, onkojenik sinyal yolaklarını bozan NDRG1 yoluyla kanserin çeşitli ayırt edici özelliklerini tersine çevirmede demir şelasyon potansiyelini vurgulayan bir inceleme makalesi yayınladık⁹. Bununla birlikte, demir şelasyonunun tek başına kanser tedavisi olarak kullanılması, toksisiteleri, kısa yarılanma ömürleri, hızlı metabolizmaları ve ortaya çıkan direnç mekanizmaları nedeniyle klinik çalışmalarda olumlu sonuçlar vermemiştir. Bununla birlikte, demir şelatörleri in vitro ve in vivo araştırmalarda umut vaat etmiştir, bu da kanser tedavisi için etkili demir şelatörleri geliştirmek için daha fazla çalışmaya ihtiyaç olduğunu göstermektedir. Spesifik demir şelasyonu, antikanser ilaç keşfinde doğrulanmış bir stratejidir, ancak bugüne kadar sadece birkaç sınıf bildirilmiştir¹⁰.

Yeni demir şelatörlerinin tanımlanması ve karakterizasyonu, bunların çeşitli uç noktalar üzerindeki etkilerini ölçme yeteneğini gerektirir. Bunların birçoğu (proliferasyon, apoptoz, reaktif oksijen türlerinin oluşumu gibi) rutin olarak ölçülmekte ve literatürde kanserin ayırt edici özelliklerini değerlendirmek için yöntemler olarak ana hatlarıyla belirtilmiş ve gözden geçirilmiştir¹¹. Yeni bir demir şelatörünü değerlendirirken, birçok grup rutin olarak anti-proliferatif ve redoks aktiviteleri üzerindeki etkinin yanı sıra demir akışı veya akışı üzerindeki etkileri inceler. In silico tahmin teknikleri¹² , taranabilen büyüyen demir şelatör havuzunu daha da arttırır.

Demirşelatörlerin oluşturulması, ilke kanıtını etkili bir şekilde göstermenin bir yolu olarak demir seviyeleri üzerindeki etkilerini ölçme yeteneğini gerektirir. Şu anda, bunu yapmak için en yaygın yöntem, maliyetli, zaman alıcı ve yetersiz ölçülebilir olan akış sitometrisi^13'tür . Tahlil seçimi genellikle deneysel ekipmanın mevcudiyetine, bir tahlilin hızına ve maliyetine dayanır. Bu nedenle, demiri şelatlama yeteneği, yüksek ekipman maliyetleri ve şelasyonun gücünü hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde ölçme zorluğu nedeniyle gözden kaçan bir son nokta ölçüsü olabilir. Burada, yeni bileşiklerin demiri şelatlama yeteneğini doğrulamak için ölçülebilir ve ucuz bir hücresiz floresan yöntemini açıklıyoruz.

Protokol

1. Stok çözeltisi hazırlama

1. Calcein stok çözeltilerini hazırlarken, çözeltileri karanlıkta tutarak foto bozulmasını önleyin. Dulbecco'nun PBS'sinde magnezyum veya kalsiyum¹⁴ içermeyen 1 mM'lik bir Calcein çözeltisi hazırlayın. 5 mL 1 mM Calcein çözeltisi için, 5 mL Dulbecco'nun PBS'sine 3.1 mg Calcein (622.5 g / M) ekleyin. 1 mM'lik Calcein çorabını kullanarak, Tablo 1'de detaylandırıldığı gibi mikrofüj tüpünde 1 mL ikincil stok çözeltileri hazırlayın.
2. 10 mM ferrik amonyum sülfat (FAS) çözeltisi elde etmek için 19 mg FAS heksahidratı (392.1 g / M) 5 mL Dulbecco'nun PBS'sinde çözerek ferrik amonyum sülfat hekzahidrat stoklarını hazırlayın. Seyreltme yoluyla ikincil FAS stoklarını hazırlayın. 2 mM FAS (fA) stoğu hazırlamak için, 10 mM FAS stoğunun 200 μL'sini PBS ile 800 μL Dulbecco'nun PBS'si ile seyreltin. 100 μM FAS (fB) stoğu hazırlamak için, 50 μL stok fA'yı 950 μL Dulbecco'nun PBS'si ile seyreltin.
3. 10 mM Deferiprone stoğu hazırlamak için, 2.8 mg (139.15 g / M) 2 mL Dulbecco'nun PBS'sinde çözün. 10 mM'lik stoğun 200 μL'sini 800 μL Dulbecco'nun PBS'si ile seyrelterek 2mM demir şelatörünün ikincil stoklarını hazırlayın.
   NOT: Bu tahlilde, tercih edilen demir şelatörü, Dulbecco'nun PBS'sinde magnezyum veya kalsiyum olmadan çözülmelidir. Çalışan bir örnek olarak, demir şelatör Deferiprone'u kullandık.

2. Calcein floresansının doğrusal aralığının belirlenmesi ile tahlil validasyonu

1. Stok çözelti tablosunda açıklandığı gibi 1 mM ila 1 μM arasında bir dizi Calcein stoğu hazırlayın (bkz. Tablo 1). Fotokimyasal bozulmayı önlemek için stok çözeltilerini karanlıkta tutun.
2. Tek kanallı manuel pipet veya çok kanallı manuel pipet kullanarak 90 μL fosfat tamponlu salin (PBS) A'dan H'ye kadar olan kuyulara ve 96 oyuklu bir plakanın 1 ila 12'sine pipetleyin.
3. Tek kanallı bir manuel pipet kullanarak 96 oyuklu plakanın 12. sütununa, A'dan H'ye kadar olan sütunlara 10 μL 1 mM Calcein stoğu ekleyin.
4. Önceden hazırlanmış 800 μM Calcein stoğundan 10 μL ekleyin (Tablo 1), tek kanallı bir manuel pipet kullanarak sütun 11, A'dan H'ye kadar olan 96 oyuklu bir plakaya.
5. Sütun 10, 10 μL'lik 400 μM'lik stoktan 10 μL'sini ve sütun 9'daki 10 μL'lik 200 μM'lik stoğu vb. içerecek şekilde Tablo 1'deki stoklarla ekleme prosedürünü tekrarlayın. Sütun 2, 1 μM stoğun 10 μL'sini içerene kadar sütunlar boyunca bu adım adım prosedüre devam edin.
   NOT: Her bir oyuktaki nihai Calcein konsantrasyonu, 1:10 seyreltme nedeniyle stok çözeltilerinden 10 kat daha düşüktür.
6. Sütun 1, satır A'dan E'ye 10 μL PBS ekleyin.
7. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin ve analizörü bir mikroplaka okuyucu üzerinde 490 nm'lik bir uyarıma ve 530 nm'lik bir algılamaya (veya Calcien floresansı için uygun filtre seti) ayarlayın.

3.Calcein floresansını azaltmak için Fe^{2 +} iyon söndürme ile tahlil doğrulaması

1. 10 μM'lik bir Calcein (cB) stoğu ve 2 mM'lik bir FAS stoğu (fA) hazırlayın (bkz. Malzeme Tablosu). Fotodegradasyonu önlemek için Calcein stoğunu karanlıkta tutun.
2. Tek kanallı manuel pipet veya çok kanallı manuel pipet kullanarak, 2 ila 10 arasındaki sütunlara, A'dan E'ye kadar olan sıralara 50 μL PBS ekleyin. PBS'yi sütun 11'e eklemeyin.
3. Tek kanallı bir manuel pipet kullanarak sütun 11'deki (A'dan E'ye Sıralar) 96 oyuklu bir plakaya 2 mM'lik 100 μL FAS (fA) stoğu ekleyin.
4. Çok kanallı bir manuel pipet kullanarak sütun 11'den 50 μL fA'yı çıkarın ve zaten sütun 10'da bulunan PBS'ye pipetleyin, pipetleyerek iyice karıştırın.
5. Bu kademeli çift seyreltme prosedürüne 9 kuyulu plakanın 2-96 sütunu, A'dan E'ye kadar olan sıralar boyunca devam edin ve pipetleme ile karıştırın.
6. Sütun 2'den pipetleme yoluyla 50 μL çözeltiyi çıkarın ve çözeltiyi çöpe atın.
7. İçinde bir çözelti bulunan tüm kuyucuklara, sütun 2-12, A'dan E'ye kadar olan sıralara 40 μL PBS ekleyin.
8. Kuyu sütun 1, A-E satırlarına 90 μL PBS ekleyin. Bu kuyucuklar 1 μM Calcein ve 0 μM FAS'ın pozitif kontrolü olarak görev yapar.
9. İçinde bir çözelti bulunan her bir oyuğa 10 μL 10 μM Calcein stoğu (cB) ekleyin (sütun 1'den 12'ye, A'dan E'ye kadar olan sıralar). Bu, sütun 11'de 1000 μM FAS'lık bir üst konsantrasyon ile sonuçlanır ve FAS konsantrasyonu sütun 10, 9, 8 için sütun 2'ye kadar yarıya iner. Sütunlardan elde edilen kuyucukların her biri 1 μM Calcein ve bir FAS seyreltmesi içerir.
10. Yalnızca PBS kontrolü için 100 ile 1 arasındaki sütunların F satırına 5 μL PBS ekleyin. Tek başına FAS kontrolü için 6 ila 10 arasındaki sütunların F satırına 100 μL 2 mM FAS ekleyin. Karanlıkta 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
11. 490 nm'lik uyarılmaya ve 530 nm'lik algılamaya ayarlanmış bir mikroplaka okuyucuda (veya Calcein floresansı için uygun filtre seti) analiz edin.

4. Demir şelatörlerin Fe 2 + iyonları için zayıf şelatör Calcein'i geride bırakma yeteneğini ölçmek için test

1. Tablo 1'de belirtildiği gibi 10 μM'lik bir Calcein stoğu (cB), 100 μM'lik FAS stoğu (fB) ve 2 mM'lik demir şelatör stokları hazırlayın. Fotodegradasyonu önlemek için Calcein stoğunu karanlıkta tutun.
2. Tek kanallı bir manuel pipet veya çok kanallı bir manuel pipet kullanarak, 96 oyuklu bir plakanın 2 ila 10 arasındaki sütunlara, A'dan E'ye kadar olan sıralara 50 μL PBS ekleyin. PBS'yi sütun 11'e eklemeyin.
3. Demir şelatörlerin 2 mM'lik stoğunun (fA) 100 μL'sini, tek kanallı bir manuel pipet kullanarak sütun 11'deki 96 oyuklu bir plakaya, A'dan E'ye kadar olan sıralara ekleyin.
4. Çok kanallı bir manuel pipet kullanarak sütun 11'den 50 μL fA'yı çıkarın ve sütun 10'da, A'dan E'ye kadar olan sıralardaki PBS'ye pipetleyin ve pipetleyerek iyice karıştırın.
5. Bu kademeli çift seyreltme prosedürüne plakanın kalan sütunları 9-2, A'dan E'ye kadar olan sıralar boyunca devam edin, her birini pipetleyerek karıştırın. Sütun 2'den 50 μL çıkarın ve atın. Bu, 96 oyuklu plaka sütunu 11 ila 2, A'dan E'ye kadar olan sıralar boyunca 2 mM demir şelatörün (Deferipron) çift seyreltilmesini sağlar.
6. 30 μL PBS'yi, içinde bir çözelti bulunan tüm oyuklara pipetleyin (örneğin, sütun 2-11 satır A'dan E'ye).
7. Çok kanallı bir pipet kullanarak, 10 μL 100 μM FAS stoğunu (fB) 2-12 arasındaki sütunlara, A'dan E'ye kadar olan satırlara ekleyin. Bu, her bir oyukta 1 μM Calcein ve 10 μM FAS'lık bir konsantrasyon ve şelatörlerin çift seyreltilmesi ile sonuçlanır, konsantrasyon her bir sütunu plaka boyunca yarıya indirir, sütun 11-2, en yüksek demir şelatör konsantrasyonu 1000 μM'de 11 kuyucuk A'dan E'ye.
8. Çok kanallı bir pipet kullanarak, 10 μL 10 μM Calcein stoğunu (cB) 2-12 arasındaki sütunlara, A'dan E'ye kadar olan sıralara ekleyin.
9. 80 μL PBS ve 10 μL Calcein stoğunu (cB) ve 10 μL FAS stoğunu (fB) bir pipet kullanarak sütun 1, A-E sıralarına pipetleyin. Numuneleri pipetleme ile karıştırın. Bu, 10 μM FAS ile ve şelatör olmadan 1 μM Calcein'in kontrolünü sağlar.
10. 100 μL PBS'yi 1 ila 5 arasındaki F sütunlarına pipetleyin. Bu, PBS negatif kontrolünü sağlar.
11. F satırına, 6 ila 10 arasındaki sütunlara 100 μL 2 mM demir şelatör (Deferiprone) ekleyin. Bu, şelatörün tek başına kontrolünü sağlar.
12. Karanlıkta 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. 490 nm'de uyarma ve 530 nm'de algılama için ayarlanmış çok modlu bir mikroplaka okuyucu (veya Calcien floresansı için uygun filtre seti) üzerinde analiz edin.

5. Veri analizi

1. Calcein floresansının doğrusal aralığının belirlenmesi ile tahlil validasyonu için analiz.
   1. Adım 1'den itibaren 96 oyuklu plakanın sütunlarındaki her bir Calcein konsantrasyonu için AH satırlarının ortalama Bağıl Floresan Birimlerini (RFU) hesaplayın ve konsantrasyona göre çizin. Y eksenindeki ortalama RFU'ya karşı x eksenindeki Calcein konsantrasyonunun çizgi grafiğini çizin ve en iyi uyum çizgisini sağlamak için doğrusal bir regresyon kullanın.
   2. Her sütundaki (2-11) Calcein konsantrasyonlarını, sütun 1 satırları A'dan E'ye kadar olan PBS'nin kontrolüyle karşılaştırarak istatistiksel anlamlılığı ölçün. İstatistiksel anlamlılığı belirlemek için p <0.001 eşiği ile En Az Anlamlı Fark (LSD) kullanarak post hoc analiz uygulayın ( Şekil 1'de ** ile gösterilir).
2. Calcein floresansını azaltmak için Fe^{2 +} iyon söndürme ile tahlil validasyonu analizi.
   1. Sütun 2-11'deki her FAS konsantrasyonu için A'dan E'ye kadar olan satırların ortalama Bağıl Floresan Birimlerini (RFU) hesaplayın. Çizim: y eksenindeki her FAS konsantrasyonu için ortalama RFU. X ekseninde, verileri daha iyi dağıttığı için bir Log2 ölçeği kullanarak FAS'ın konsantrasyonlarını çizin. Doğrusal regresyon kullanarak en uygun çizgiyi çizin.
   2. Her bir sütunun ortalamasını PBS, 1 μM Calcein, 0 μM FAS (sütun 1 satır A'dan E'ye) kontrolünün ortalama RFU'suna karşılaştırarak istatistiksel anlamlılığı ölçün. İstatistiksel anlamlılığı belirlemek için p <0.001 eşiğine sahip LSD post hoc analizi ile bir ANOVA gerçekleştirin.
3. Tahlil analizi: Demir şelatörlerin Fe²⁺ iyonları için zayıf şelatör Calcein'i geride bırakma yeteneğinin ölçülmesi.
   1. 2-11 sütunlarındaki her bir şelatör konsantrasyonu için A'dan E'ye kadar olan satırların ortalama Bağıl Floresan Birimlerini (RFU) hesaplayın. Çizim: y eksenindeki her bir şelatör konsantrasyonu için ortalama RFU. X ekseninde, verileri daha iyi dağıttığı için bir Log2 ölçeği kullanarak şelatör konsantrasyonlarını çizin.
   2. Her bir sütunu karşılaştırarak istatistiksel anlamlılığı ölçün, PBS 1 μM Calcein ve 10 μM FAS kontrolünün ortalama RFU'suna (sütun 1, satır A'dan E'ye). İstatistiksel anlamlılığı belirlemek için p <0.001 eşiğine sahip LSD post hoc analizi ile bir ANOVA gerçekleştirin.

Sonuçlar

Adım 2'de gösterilen yöntem için, bu ilk deney (Şekil 1), Calcein floresan emisyonlarını tespit ederken mikrotitre floresan plaka okuyucusunun doğrusal aralığını belirledi. Temsili sonuçlarımız, 0-100 μM arasında geniş bir doğrusal Calcein floresan aralığı göstermektedir. LSD post hoc analizi ile ANOVA, 0 μM Calcein kontrolü ile karşılaştırıldığında tüm Calcein konsantrasyonları için ortalama RFU'da istatistiksel olarak anlamlı bir fark olduğunu göstermektedir. Daha sonraki deneylerde, 0 μM ...

Tartışma

Kanserlerin metabolizmalarını beslemek için demire aşırı bağımlı olmaları, demir şelasyonunu terapötik rejimlere potansiyel bir katkı haline getirir⁴. Bununla birlikte, demir iyonlarını bağlama yetenekleri nedeniyle yeni metal iyon şelatörlerini hızlı bir şekilde taramak için sınırlı bir yetenek vardır. Yaygın olarak kullanılan ve yaygın olarak bulunan floresan probu Calcein'in zayıf bir demir şelatörü olarak işlev gördüğü ve demir iyonları ile bağlanmanın Calcein...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Amonyum demir (II) sülfat hekzahidrat	Sigma-Aldrich	215406	diğer bilge FAS
Calcein	Sigma-Aldrich	C0875
Deferiprone	Sigma-Aldrich	379409
Dulbecco &prime olarak bilinir; s Fosfat Tamponlu Tuzlu	Sigma-Aldrich	D5652	magnezyum ve kalsiyum içermeyen
Greiner CELLSTAR 96 kuyulu plakalar	Sigma-Aldrich	M0812	herhangi bir optik olarak şeffaf 96 kuyulu plaka çalışacaktır