Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Shigella ile Epitel Hücre Enfeksiyonu Analizleri

2.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66426

⸱

9 Şubat 2024

 ,  , 
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Division of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Mevcut protokol, in vitro epitel hücre dizileri kullanılarak Shigella aderansı, invazyonu ve hücre içi replikasyonunu sorgulamak için enfeksiyon testlerini açıklamaktadır.

Özet

İnsan tarafından uyarlanmış enterik bakteriyel patojen Shigella, her yıl milyonlarca enfeksiyona neden olur, pediatrik hastalar arasında uzun vadeli büyüme etkileri yaratır ve dünya çapında ishal ölümlerinin önde gelen nedenidir. Enfeksiyon, patojenin gastrointestinal sistemden geçmesi ve kolonu kaplayan epitel hücrelerini enfekte etmesi sonucu sulu veya kanlı ishale neden olur. Antibiyotik direncindeki şaşırtıcı artışlar ve onaylanmış aşıların mevcut eksikliği nedeniyle, standartlaştırılmış araştırma protokolleri bu zorlu patojeni incelemek için kritik öneme sahiptir. Burada, kolonik epitel hücrelerinde bakteriyel aderans, invazyon ve hücre içi replikasyonun in vitro analizlerini kullanarak Shigella'nın moleküler patogenezini incelemek için metodolojiler sunulmaktadır. Enfeksiyon analizlerinden önce, Shigella kolonilerinin virülans fenotipi, Kongo kırmızı boyasının agar plakalarına alınmasıyla doğrulandı. Takviye edilmiş laboratuvar ortamı, in vivo koşulları taklit etmek için bakteri kültürü sırasında da düşünülebilir. Bakteri hücreleri daha sonra, enfeksiyonun her aşamasını analiz etmek için adaptasyonlarla belirlenmiş bir enfeksiyon çokluğunda doku kültürü plakalarındaki kolon epitel hücrelerini enfekte etmek için standart bir protokolde kullanılır. Aderans testleri için, Shigella hücreleri, epitel hücreleriyle bakteriyel teması teşvik etmek için azaltılmış ortam seviyeleri ile inkübe edilir. Hem invazyon hem de hücre içi replikasyon deneyleri için, hücre dışı bakterileri ortadan kaldırmak ve invazyonun değerlendirilmesini ve / veya hücre içi replikasyon oranlarının ölçülmesini sağlamak için çeşitli zaman aralıklarında gentamisin uygulanır. Tüm enfeksiyon protokolleri, enfekte epitel hücre lizatlarını seri olarak seyrelterek ve Kongo kırmızı agar plakaları üzerindeki enfekte titrelere göre bakteri kolonisi oluşturan birimleri kaplayarak yapışık, istila edilmiş ve/veya hücre içi bakterileri numaralandırır. Birlikte, bu protokoller, bu patojeni başarılı bir şekilde incelemek için epitel hücrelerinin Shigella enfeksiyonunun her aşaması için bağımsız karakterizasyon ve karşılaştırmalar sağlar.

Giriş

Enterik bakteriyel patojenlerin neden olduğu ishalli hastalıklar önemli bir küresel sağlık yüküdür. 2016 yılında, ishalli hastalıklar dünya çapında 1,3 milyon ölümden sorumluydu vebeş yaşından küçük çocuklarda dördüncü önde gelen ölüm nedeniydi 1,2. Gram-negatif, enterik bakteriyel patojen Shigella, dünya çapında ishal ölümlerinin önemli bir nedeni olan shigellozun etken maddesidir3. Shigellosis her yıl düşük ve orta gelirli ülkelerdeki çocuklarda önemli morbidite ve mortaliteye neden olurken, 4,5 yüksek gelirli ülkelerdeki enfeksiyonlar kreş, gıda kaynaklı ve su kaynaklı salgınlarlabağlantılıdır 6,7,8,9. Etkisiz aşı geliştirme10 ve artan antimikrobiyal direnç (AMR) oranları11,12, büyük ölçekli Shigella salgınlarının yönetimini karmaşıklaştırmıştır. Son Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri verileri, Amerika Birleşik Devletleri'ndeki Shigella enfeksiyonlarının yaklaşık %46'sının 2020'de ilaç direnci gösterdiğinigösteriyor 13,14, Dünya Sağlık Örgütü ise Shigella'yı acilen yeni tedavilere ihtiyaç duyulan AMR öncelikli bir patojen olarak ilan etti15.

Shigella enfeksiyonları, kontamine yiyecek veya suyun yutulması üzerine fekal-oral yolla veya doğrudan insan teması yoluyla kolayca bulaşır. Shigella, hastalığa neden olmak için yeterli 10-100 bakteri dozu ile verimli, insana uyarlanmış bir patojen olarak gelişmiştir16. İnce bağırsak geçişi sırasında Shigella, yüksek sıcaklık ve safra gibi çevresel sinyallere maruz kalır17. Bu sinyallerin saptanması, bakterilerin insan kolonunu enfekte etme yeteneğini artıran virülans faktörlerini ifade etmek için transkripsiyonel değişiklikleri indükler 17,18,19. Shigella, apikal yüzeyden kolon epitelini istila etmez, bunun yerine folikülle ilişkili epitel20,21,22 içindeki özel antijen sunan mikro kıvrım hücrelerine (M hücreleri) alımını takiben epitel tabakası boyunca geçiş yapar. Transsitozu takiben, Shigella hücreleri yerleşik makrofajlar tarafından fagosite edilir. Shigella hızla fagozomdan kaçar ve makrofaj hücre ölümünü tetikleyerek proinflamatuar sitokinlerin salınmasına neden olur 5,23,24. Shigella daha sonra bazolateral taraftan kolon epitel hücrelerini istila eder, makropinositik vakuolün parçalanması ve sitoplazmada replikatif bir niş oluşturur 5,25. Pro-inflamatuar sitokinler, özellikle interlökin-8 (IL-8), polimorfonükleer nötrofil lökositleri (PMN'ler) enfeksiyon bölgesine toplar, bu da epitelyal sıkı bağlantıları zayıflatır ve bazolateral enfeksiyonu şiddetlendirmek için epitel astarının bakteriyel infiltrasyonunu sağlar5. PMN'ler, enfeksiyonu kontrol altına almak için enfekte epitel astarını tahrip eder, bu da basiller (kanlı) dizanteri5'in karakteristik semptomlarına neden olur. İnvazyon ve hücre içi replikasyon mekanizmaları kapsamlı bir şekilde karakterize edilmiş olsa da, yeni araştırmalar Shigella enfeksiyonunda gastrointestinal (GI) geçiş sırasında virülans regülasyonu17, aderans19, bariyer geçirgenliği26 yoluyla gelişmiş bazolateral erişim ve yetersiz beslenen çocuklarda asemptomatik taşıma27 dahil olmak üzere önemli yeni kavramları göstermektedir.

Shigella spp.'nin ishal hastalığına neden olma yeteneği insanlar ve insan olmayan primatlarla sınırlıdır (NHP)28. Zebra balığı 29, fareler30, kobaylar31, tavşanlar21,32,33 ve domuzlar34,35 için Shigella bağırsak enfeksiyonu modelleri geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bu model sistemlerin hiçbiri, insan enfeksiyonu sırasında gözlemlenen hastalık özelliklerini doğru bir şekilde kopyalayamaz36. Shigella patogenezini incelemek için NHP shigellosis modelleri oluşturulmuş olsa da, bu model sistemlerin uygulanması pahalıdır ve insanların enfeksiyöz dozundan dokuz kat daha yüksek olan yapay olarak yüksek enfeksiyöz dozlar gerektirir 37,38,39,40,41,42. Bu nedenle, Shigella'nın insan konakçıların enfeksiyonu için dikkate değer adaptasyonu, Shigella patogenezinin doğru bir şekilde sorgulanması için fizyolojik olarak ilgili modelleri yeniden oluşturmak için insan kaynaklı hücre kültürlerinin kullanılmasını gerektirir.

Burada, HT-29 kolonik epitel hücrelerinde Shigella'nın yapışması, invazyonu ve replikasyon oranlarını ölçmek için ayrıntılı prosedürler açıklanmaktadır. Bu standartlaştırılmış protokoller kullanılarak, bakteriyel virülans genlerinin ve çevresel sinyallerin Shigella enfeksiyonunun her adımını etkilediği moleküler mekanizmalar, dinamik konakçı-patojen etkileşimi ilişkisini daha iyi anlamak için sorgulanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Reaktiflerin ve malzemelerin hazırlanması

NOT: Tüm hacimler, iki adet 6 oyuklu plaka kullanan bir tahlil ile tutarlıdır.

  1. TSB ortamı: 15 g Triptik Soya Suyu (TSB, Malzeme Tablosuna bakınız) ortamına ve otoklava 0,5 L deiyonize (DI) su ekleyin. Oda sıcaklığında saklayın.
  2. Safra tuzları ortamı (TSB + BS): % 0.4 (a / h) safra tuzları içeren TSB'yi hazırlamak için, 15 mL otoklavlanmış TSB içinde 0.06 g safra tuzunu (BS, Malzeme Tablosuna bakınız) yeniden süspanse edin. Filtre, 0,22 μm PES filtresi kullanarak sterilize edilir.
    NOT: Safra tuzları, 1:1 sodyum kolat ve sodyum deoksikolat karışımından oluşur. Kullanmadan hemen önce yeni ortam hazırlayın.
  3. DMEM +% 10 (h / h) FBS: 45 mL Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'una (DMEM) 5 mL fetal sığır serumu (FBS) ekleyin. 4 °C'de saklayın.
  4. DMEM + gentamisin: 50 mL'lik bir tüpe 50 mL DMEM ve 50 μL 50 mg/mL gentamisin ekleyin (bkz.
    NOT: Her deneyden önce taze alikot yapın ve 37 °C'lik bir su banyosunda ısıtın.
  5. PBS +% 1 (h / h) Triton X-100: 150 μL Triton X-100 ila 15 mL Fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin.
    NOT: Her deneyden önce taze alikot yapın ve 37 °C'lik bir su banyosunda ısıtın.
  6. TSB + Kongo kırmızı gösterge plakaları: 1 L'lik bir şişeye 15 g TSB, 7,5 g seçkin agar ve 0,125 g Kongo kırmızı boyası ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin. 0,5 L DI su ve otoklav ekleyin. Ayrı steril Petri kaplarına (100 mm x 15 mm) 10-20 mL ortam dökün ve katılaşmasına izin verin.
    DİKKAT: Kongo kırmızısı kanserojendir ve üreme toksinidir. Kongo kırmızısının işlenmesinin uygun kişisel koruyucu ekipman kullanılarak yapıldığından emin olun. Daha fazla bilgi için ürün güvenlik bilgi formuna bakın.
    NOT: 0,5 L Kongo kırmızı malzemesinden yaklaşık 20 plaka yapılmıştır. Plakalar 2-3 gün önceden hazırlanabilir ve kullanıma kadar oda sıcaklığında ters çevrilmiş halde bırakılabilir. Uzun süreli saklama için, ters çevrilmiş plakaları 3 aya kadar 4 °C'de plastik kılıflara yerleştirin.
  7. DMEM +% 10 (h / h) FBS ve% 5 (h / h) dimetil sülfoksit (DMSO): 50 mL'lik bir tüpe 42.5 mL DMEM, 5 mL FBS ve 2.5 mL DMSO ekleyin. 4 °C'de saklayın.

2. Bakterilerin hazırlanması

NOT: Tüm Shigella laboratuvar yetiştirme ve depolama protokolleri Payne, S. M.43'ten uyarlanmıştır.

DİKKAT: Shigella spp. Risk Grubu 2 patojenleridir44. Tüm laboratuvar çalışmalarını, Shigella spp.'nin düşük bulaşıcı dozu nedeniyle kazara maruziyetleri sınırlamak için alınan ek güvenlik önlemleri ile bir BSL-2 ortamında gerçekleştirin.

  1. Shigella'nın donmuş stoklardan büyümesi
    1. Steril bir aplikatör kullanarak kriyojenik flakondan az miktarda donmuş kültürü bir TSB + Kongo kırmızı agar plakasına aktarın.
    2. Bir aşılama döngüsünü alevle sterilize edin ve soğumaya bırakın. İnokulumu plakanın bir çeyreği boyunca ileri geri hareket ettirin. Halkayı alevlendirin, soğumaya bırakın, ardından ilk kadrandan plakanın ikinci çeyreğine doğru çizin. Aşılamayı plakanın üçüncü ve dördüncü kadranlarına sürmek için tekrarlayın.
      NOT: Alternatif olarak, her kadran arasında yeni bir steril aplikatör kullanarak aşılamayı çizgileyin.
    3. Plakayı ters çevirin ve gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
      NOT: Kongo kırmızı-pozitif (CR+) fenotipi45'in gözlemlenmesi için gerekli olan Shigella virülans faktörlerinin ekspresyonu için ≥37 °C sıcaklıklarda inkübasyon gereklidir. Avirulent koloniler beyaz bir görünüme sahip olacak ve istilacı olmayacaktır.
    4. Plakayı parafin filmle kapatın ve 4 °C'de buzdolabında saklayın.
      NOT: Bakteri kolonileri agar plakalarında 1-2 hafta canlı kalacaktır.
  2. Shigella'nın sıvı kültürde bir gecede büyümesi
    1. 3 mL TSB ortamını steril 14 mL kültür tüplerine alın.
    2. Steril bir aplikatör kullanarak tek, iyi izole edilmiş kırmızı (CR +) bir koloni seçin ve sıvı ortamda yeniden süspanse edin.
    3. Kültürleri gece boyunca (16-18 saat) 37 ° C'de dakikada 250 devirde (rpm) çalkalayarak inkübe edin.

3. HT-29 ökaryotik hücrelerin hazırlanması

NOT: Tüm hacimler, iki adet 6 oyuklu plaka kullanan bir tahlil ile tutarlıdır. HT-29 hücre hatları, Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu'ndan (ATCC) elde edildi. HT-29 bakım protokolleri, ATCC tavsiyelerinden46 uyarlanmıştır. Tüm ortamlar kullanımdan önce 37 °C'de bir su banyosunda önceden ısıtılmalıdır. Tüm HT-29 bakım protokolleri bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir. pH'ta dramatik değişikliklerden kaçınmak için ortamdaki HT-29 hücrelerini karıştırırken/çalışırken kabarcık üretmekten kaçının.

  1. HT-29 hücrelerinin donmuş stoktan çözülmesi
    1. HT-29 hücrelerinin şişesini 37 ° C'lik bir su banyosunda çözdürün.
      NOT: Kirlenmeyi önlemek için kapağın tamamen suyun üzerinde kaldığından emin olun. Çözdürme işlemi 2 dakikadan az sürmelidir.
    2. Kültür tamamen çözüldükten hemen sonra şişeyi sudan çıkarın ve% 70 etanol ile dekontamine edin. Bu noktadan itibaren tüm adımların aseptik teknikler kullanılarak gerçekleştirildiğinden emin olun.
    3. Şişenin tüm içeriğini 9 mL DMEM +% 10 FBS içeren 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 125 x g'da santrifüjleyin.
    4. Süpernatanı bir atık kabına boşaltın ve peleti 10 mL sıcak DMEM +% 10 FBS içinde yeniden süspanse edin. Süspanse hücreleri, 10 mL sıcak DMEM +% 10 FBS (toplam hacim 20 mL) içeren 75cm2'lik bir doku kültürü şişesine (T75) aktarın.
    5. Hücreleri% 90 birleşmeye ulaşana kadar (yaklaşık 6-7 gün) hücreleri% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin.
      NOT: Birleşme görsel yaklaşımla tahmin edilir.
  2. HT-29 hücrelerinin tohumlanması
    1. 37 °C su banyosunda 20 mL PBS ve 50 mL DMEM +% 10 FBS'yi önceden ısıtın ve 3 mL% 0.25 (a / h) Tripsin-EDTA'yı oda sıcaklığına önceden ısıtın.


        1. figure-protocol-1


        1. figure-protocol-2


    2. figure-protocol-3






























Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Aderans, invazyon ve hücre içi replikasyon testleri, S. flexneri 2457T vahşi tip (WT) ile Shigella virülansını negatif olarak düzenlediği varsayılan bir mutant olan S. flexneri ΔVF (ΔVF) karşılaştırılarak gerçekleştirildi. Shigella, virülansıdüzenlemek için bir sinyal olarak safra tuzlarını kullandığından 17,18,47, TSB ortamında bakteri alt kültüründen sonra deneyler yapıldı ve TSB% 0.4 (a / h) safra tuzları ile desteklendi18.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokol, bağırsak epitel hücrelerinin Shigella aderansı, invazyonu ve hücre içi replikasyonunu incelemek için üç standart testi açıklar. Bu yöntemler, konakçı hücreler içindeki çeşitli bakteriyel patojenlerin invazyonunu ve hücre içi replikasyonunu incelemek için kullanılan klasik gentamisin testlerinin yalnızca değiştirilmiş versiyonları olsa da 49,50,51, Shigella'yı incelerken özel hususlar uygulanmalıdır...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.

Teşekkürler

Yazarlara verilen destek arasında Massachusetts General Hospital Pediatri Bölümü, Araştırma Geçici Destek Fonu İcra Komitesi (ISF) ödülü 2022A009041, Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü hibe R21AI146405 ve Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü Harvard'daki Beslenme Obezite Araştırma Merkezi (NORCH) 2P30DK040561-26. Fon sağlayıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.22 μ m PES filtreMillipore-SigmaSCGP0052550 mL'ye kadar ortamı sterilize etmek için steril, polietersülfon filtre
14 mL kültür tüpleriCorning35205917 mm x 100 mm kapaklı polipropilen test tüpleri
50 mL konik tüplerCorning43082950 mL şeffaf polipropilen konik tabanlı santrifüj tüpleri, sızdırmaz kapaklı
6 oyuklu doku kültürü plakalarıCorning3516Plakalar optimal hücre bağlantısı için işlenir
Safra tuzlarıSigma-AldrichB87561:1 kolatın deoksikolat oranı
Kongo kırmızı boyasıSigma-AldrichC6277Benzidin bazlı anyonik diazo boya, %>85 saflıkta
Kontes hücre sayma odası slaydıInvitrogenC10283Kontes Otomatik Hücre Sayacı
Dimetil sülfoksit (DMSO)ile birlikte kullanılmak üzereSigma-AldrichD8418A oldukça polar bir organik reaktif
Dulbecco' s Modifiye Eagle Medium (DMEM)Gibco10569-010DMEM, yüksek glikoz, sodyum piruvat, GlutaMAX ve Fenol ile desteklenmiştir Kırmızı
Fetal Sığır Serumu (FBS)Sigma-AldrichF4135Isı ile aktive edilmiş, steril
GentamisinSigma-AldrichG3632Stok konsantrasyonu 50 mg / mL'dir
HT-29 hücre hattıATCCHTB-38Adenokarsinom hücre hattı; kolorektal in Menşei
Parafin filmiBemisPM999Laboratuvar sızdırmazlık filmi
Petri kaplarıThermo Fisher ScientificFB0875713100 mm x 15 mm Katı ortamlar için petri kapları
Fosfat tamponlu salin (PBS)Thermo Fisher Scientific100100491x konsantrasyon; pH 7.4
AgarInvitrogen 30391023seçinBakteriyel kaplama ortamı yapmak için kırmızı deniz yosunu hücre duvarlarından ekstrakte edilen bir polisakkarit karışımı
T75 şişeleriCorning430641UDoku kültürü şişeleri
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Yaygın bir iyonik olmayan yüzey aktif madde ve emülgatör;
Tripan mavisi lekeInvitrogenT10282Ölü doku kültürü hücrelerini tespit etmek için bir boya; sadece canlı hücreler boyayı dışlayabilir
Tripsin-EDTAGibco25200-056Hücre hattı bakımı ve pasajı için hücre ayrışması için reaktif
Triptik Soya Suyu (TSB)Sigma-AldrichT8907Bakteri üreme ortamı

Kaynaklar

  1. Karambizi, N. U., McMahan, C. S., Blue, C. N., Temesvari, L. A. Global estimated Disability-Adjusted Life-Years (DALYs) of diarrheal diseases: A systematic analysis of data from 28 years of the global burden of disease study. PloS one. 16 (10), e0259077(2021).
  2. WHO. WHO methods and data sources for country-level causes of death 2000-2016. World Health Organization. , Geneva. (2018).
  3. Kotloff, K. L. Shigella infection in children and adults: a formidable foe. Lancet Glob Health. 5 (12), e1166-e1167 (2017).
  4. Kotloff, K. L., et al. Burden and aetiology of diarrhoeal disease in infants and young children in developing countries (the Global Enteric Multicenter Study, GEMS): A prospective, case-control study. Lancet. 382 (9888), 209-222 (2013).
  5. Schroeder, G. N., Hilbi, H. Molecular pathogenesis of Shigella spp.: Controlling host cell signaling, invasion, and death by type III secretion. Clin Microbiol Rev. 21 (1), 134-156 (2008).
  6. Arvelo, W., et al. Transmission risk factors and treatment of pediatric shigellosis during a large daycare center-associated outbreak of multidrug resistant shigella sonnei: Implications for the management of shigellosis outbreaks among children. Pediatr Infect Dis J. 28 (11), 976-980 (2009).
  7. Kozyreva, V. K., et al. Recent outbreaks of Shigellosis in California caused by two distinct populations of Shigella sonnei with either increased virulence or fluoroquinolone resistance. mSphere. 1 (6), 1-18 (2016).
  8. Bowen, A., et al. Importation and domestic transmission of Shigella sonnei resistant to ciprofloxacin - United States, May 2014-February 2015. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 64 (12), 318-320 (2015).
  9. Tansarli, G. S., et al. Genomic reconstruction and directed interventions in a multidrug-resistant Shigellosis outbreak in Seattle, WA, USA: a genomic surveillance study. Lancet. 3099 (22), 1-11 (2023).
  10. Barry, E. M., et al. Progress and pitfalls in Shigella vaccine research. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (4), 245-255 (2013).
  11. Increase in Extensively Drug-Resistant Shigellosis in the United States. CDC Health Alert Network. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://emergency.cdc.gov/han/2023/han00486.asp?ACSTrackingID=USCDC_511-DM100260&ACSTrackingLabel=HAN%20486%20-%20General%20Public&deliveryName=USCDC_511-DM100260 (2023).
  12. Shiferaw, B., et al. Antimicrobial susceptibility patterns of Shigella isolates in Foodborne Diseases Active Surveillance Network (FoodNet) sites, 2000-2010. Clin Infect Dis. 54, S458-S463 (2012).
  13. Centers for Disease Control and Prevention. COVID-19: U.S. Impact on Antimicrobial Resistance, Special Report 2022. Atlanta, GA: U.S. Department of Health and Human Services. CDC. , (2022).
  14. Centers for Disease Control and Prevention. Antibiotic resistance threats in the United States, 2019. CDC. 10 (1), Atlanta, Georgia. (2019).
  15. WHO. Prioritization of pathogens to guide discovery, research and development of new antibiotics for drug-resistant bacterial infections, including tuberculosis. WHO. , Geneva. (2017).
  16. DuPont, H. L., Levine, M. M., Hornick, R. B., Formal, S. B. Inoculum size in shigellosis and implications for expected mode of transmission. J Infect Dis. 159 (6), 1126-1128 (1989).
  17. Nickerson, K. P., et al. Analysis of Shigella flexneri resistance, biofilm formation, and transcriptional profile in response to bile salts. Infect Immun. 85 (6), 1-18 (2017).
  18. Faherty, C. S., Redman, J. C., Rasko, D. A. Shigella flexneri effectors OspE1 and OspE2 mediate induced adherence to the colonic epithelium following bile salts exposure. Mol Microbiol. 85 (1), 107-121 (2012).
  19. Chanin, R. B., et al. Shigella flexneri adherence factor expression in in vivo-like conditions. mSphere. 4 (6), e00751(2019).
  20. Baranov, V., Hammarström, S. Carcinoembryonic antigen (CEA) and CEA-related cell adhesion molecule 1 (CEACAM1), apically expressed on human colonic M cells, are potential receptors for microbial adhesion. Histochem Cell Biol. 121 (2), 83-89 (2004).
  21. Wassef, J. S., Keren, D. F., Mailloux, J. L. Role of M cells in initial antigen uptake and in ulcer formation in the rabbit intestinal loop model of shigellosis. Infect Immun. 57 (3), 858-863 (1989).
  22. Sansonetti, P. J., Arondel, J., Cantey, J. R., Prévost, M. C., Huerre, M. Infection of rabbit Peyer's patches by Shigella flexneri: Effect of adhesive or invasive bacterial phenotypes on follicle-associated epithelium. Infect Immun. 64 (7), 2752-2764 (1996).
  23. Sansonetti, P. J., et al. Caspase-1 activation of IL-1beta and IL-18 are essential for Shigella flexneri-induced inflammation. Immunity. 12 (5), 581-590 (2000).
  24. Zychlinsky, A., Fitting, C., Cavaillon, J. M., Sansonetti, P. J. Interleukin 1 is released by murine macrophages during apoptosis induced by Shigella flexneri. J Clin Invest. 94 (3), 1328-1332 (1994).
  25. Sansonetti, P. J., Ryter, A., Clerc, P., Maurelli, A. T., Mounier, J. Multiplication of Shigella flexneri within HeLa cells: lysis of the phagocytic vacuole and plasmid-mediated contact hemolysis. Infect Immun. 51 (2), 461-469 (1986).
  26. Maldonado-Contreras, A., et al. Shigella depends on SepA to destabilize the intestinal epithelial integrity via cofilin activation. Gut Microbes. 8 (6), 544-560 (2017).
  27. Collard, J. -M., et al. High prevalence of small intestine bacteria overgrowth and asymptomatic carriage of enteric pathogens in stunted children in Antananarivo, Madagascar. PLoS Negl Trop Dis. 16 (5), e0009849(2022).
  28. Mattock, E., Blocker, A. J. How do the virulence factors of shigella work together to cause disease. Front Cell Infect Microbiol. 7, 1-24 (2017).
  29. Mostowy, S., et al. The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri interaction with phagocytes and bacterial autophagy. PLoS Pathog. 9 (9), e1003588(2013).
  30. Martinez-Becerra, F. J., et al. Parenteral immunization with IpaB/IpaD protects mice against lethal pulmonary infection by Shigella. Vaccine. 31 (24), 2667-2672 (2013).
  31. Shim, D. -H., et al. New animal model of shigellosis in the Guinea pig: its usefulness for protective efficacy studies. J Immunol. 178 (4), Baltimore, Md. 2476-2482 (2007).
  32. Marteyn, B., et al. Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo. Nature. 465 (7296), 355-358 (2010).
  33. West, N. P., et al. Optimization of virulence functions through glucosylation of Shigella LPS. Science. 307 (5713), 1313-1317 (2005).
  34. Maurelli, A. T., et al. Shigella infection as observed in the experimentally inoculated domestic pig, Sus scrofa domestica. Microbial Pathog. 25 (4), 189-196 (1998).
  35. Jeong, K. -I., Zhang, Q., Nunnari, J., Tzipori, S. A piglet model of acute gastroenteritis induced by Shigella dysenteriae Type 1. J Infect Dis. 201 (6), 903-911 (2010).
  36. Kim, Y. -J., Yeo, S. -G., Park, J. -H., Ko, H. -J. Shigella vaccine development: prospective animal models and current status. Curr Pharm Biotechnol. 14 (10), 903-912 (2013).
  37. Kent, T. H., Formal, S. B., LaBrec, E. H., Sprinz, H., Maenza, R. M. Gastric shigellosis in rhesus monkeys. Am J Pathol. 51 (2), 259-267 (1967).
  38. Shipley, S. T., et al. A challenge model for Shigella dysenteriae 1 in cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis). Comp Med. 60 (1), 54-61 (2010).
  39. Higgins, R., Sauvageau, R., Bonin, P. Shigella flexneri Type 2 Infection in captive nonhuman primates. Can Vet J. 26 (12), 402-403 (1985).
  40. Oaks, E. V., Hale, T. L., Formal, S. B. Serum immune response to Shigella protein antigens in rhesus monkeys and humans infected with Shigella spp. Infect Immun. 53 (1), 57-63 (1986).
  41. Formal, S. B., et al. Protection of monkeys against experimental shigellosis with a living attenuated oral polyvalent dysentery vaccine. J Bacteriol. 92 (1), 17-22 (1966).
  42. Levine, M. M., Kotloff, K. L., Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B. Clinical trials of Shigella vaccines: two steps forward and one step back on a long, hard road. Nat Rev Microbiol. 5 (7), 540-553 (2007).
  43. Payne, S. M. Laboratory cultivation and storage of Shigella. Curr Protoc Microbiol. 55 (1), 93(2019).
  44. NIH Guidelines. NIH guidelines for research involving recombinant or synthetic nucleic acid molecules. NIH Guidelines. 2, 142(2019).
  45. Maurelli, A. T., Blackmon, B., Curtiss, R. Loss of pigmentation in Shigella flexneri 2a is correlated with loss of virulence and virulence-associated plasmid. Infect Immun. 43 (1), 397-401 (1984).
  46. HT-29 cell line product sheet. ATCC. , Available from: https://www.atcc.org/products/htb-38 1-6 (2023).
  47. Sistrunk, J. R., Nickerson, K. P., Chanin, R. B., Rasko, D. A., Faherty, C. S. Survival of the fittest: How bacterial pathogens utilize bile to enhance infection. Clin Microbiol Rev. 29 (4), 819-836 (2016).
  48. Stensrud, K. F., et al. Deoxycholate interacts with IpaD of Shigella flexneri in inducing the recruitment of IpaB to the type III secretion apparatus needle tip. J Biol Chem. 283 (27), 18646-18654 (2008).
  49. Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. J Clin Invest. 52 (7), 1673-1679 (1973).
  50. Elsinghorst, E. A. Measurement of invasion by gentamicin resistance. Methods Enzymo. 236 (1979), 405-420 (1994).
  51. Elsinghorst, E. A., Weitz, J. A. Epithelial cell invasion and adherence directed by the enterotoxigenic Escherichia coli tib locus is associated with a 104-kilodalton outer membrane protein. Infect Immun. 62 (8), 3463-3471 (1994).
  52. Dorman, C. J., McKenna, S., Beloin, C. Regulation of virulence gene expression in Shigella flexneri, a facultative intracellular pathogen. Int J Med Microbiol. 291 (2), 89-96 (2001).
  53. Porter, M. E., Dorman, C. J. Positive regulation of Shigella flexneri virulence genes by integration host factor. J Bacteriol. 179 (21), 6537-6550 (1997).
  54. Maurelli, A. T., Blackmon, B., Curtiss, R. Temperature-dependent expression of virulence genes in Shigella species. Infect Immun. 43 (1), 195-201 (1984).
  55. Schuch, R., Maurelli, A. T. Virulence plasmid instability in Shigella flexneri 2a is induced by virulence gene expression. Infect Immun. 65 (9), 3686-3692 (1997).
  56. Formal, S. B., Hale, T. L., Sansonetti, P. J. Invasive enteric pathogens. Rev Infect Dis. 5, S702-S707 (1983).
  57. Pál, T., Hale, T. L. Plasmid-associated adherence of Shigella flexneri in a HeLa cell model. Infect Immun. 57 (8), 2580-2582 (1989).
  58. Noben, M., et al. Human intestinal epithelium in a dish: Current models for research into gastrointestinal pathophysiology. United European Gastroenterol J. 5 (8), 1073-1081 (2017).
  59. Liévin-Le Moal, V., Servin, A. L. Pathogenesis of human enterovirulent bacteria: lessons from cultured, fully differentiated human colon cancer cell lines. Microbiol Mol Biol Rev R. 77 (3), 380-439 (2013).
  60. Mitchell, D. M., Ball, J. M. Characterization of a spontaneously polarizing HT-29 cell line, HT-29/cl.f8. In Vitro Cell Dev Biol - Anim. 40 (10), 297-302 (2004).
  61. Gagnon, M., Zihler Berner, A., Chervet, N., Chassard, C., Lacroix, C. Comparison of the Caco-2, HT-29 and the mucus-secreting HT29-MTX intestinal cell models to investigate Salmonella adhesion and invasion. J Microbiol Methods. 94 (3), 274-279 (2013).
  62. Koestler, B. J., et al. Human intestinal enteroids as a model system of Shigella pathogenesis. Infect Immun. 87 (4), 00733(2019).
  63. Ranganathan, S., et al. Evaluating Shigella flexneri pathogenesis in the human enteroid model. Infect Immun. 87 (4), (2019).
  64. Nickerson, K. P., et al. A versatile human intestinal organoid-derived epithelial monolayer model for the study of enteric pathogens. Microbiol Spectr. 9 (1), 1-17 (2021).
  65. Perlman, M., Senger, S., Verma, S., Carey, J., Faherty, C. S. A foundational approach to culture and analyze malnourished organoids. Gut Microbes. 15 (2), 2248713(2023).
  66. Pope, L. M., Reed, K. E., Payne, S. M. Increased protein secretion and adherence to HeLa cells by Shigella spp. following growth in the presence of bile salts. Infect Immun. 63 (9), 3642-3648 (1995).
  67. Faherty, C. S., et al. The synthesis of OspD3 (ShET2) in Shigella flexneri is independent of OspC1. Gut Microbes. 7 (6), 486-502 (2016).
  68. Ridlon, J. M., Kang, D. -J., Hylemon, P. B. Bile salt biotransformations by human intestinal bacteria. J Lipid Res. 47 (2), 241-259 (2006).
  69. Köseoğlu, V. K., Hall, C. P., Rodríguez-López, E. M., Agaisse, H. The Autotransporter IcsA promotes Shigella flexneri biofilm formation in the presence of bile salts. Infect Immun. 87 (7), 1-14 (2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Shigella EnfeksiyonuBakteriyel AdheransHücre İçi Replikasyonİnvazyon AnaliziKolonik Epitel HücreleriGentamisin KorumasıKongo Kırmızısı AgarıSeri DilüsyonDoku Kültürü
Shigella ile Epitel Hücre Enfeksiyonu Analizleri
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.