Shigella ile Epitel Hücre Enfeksiyonu Analizleri

Enterik bakteriyel patojenlerin neden olduğu ishalli hastalıklar önemli bir küresel sağlık yüküdür. 2016 yılında, ishalli hastalıklar dünya çapında 1,3 milyon ölümden sorumluydu ve^beş yaşından küçük çocuklarda dördüncü önde gelen ölüm nedeniydi ^1,2. Gram-negatif, enterik bakteriyel patojen Shigella, dünya çapında ishal ölümlerinin önemli bir nedeni olan shigellozun etken maddesidir³. Shigellosis her yıl düşük ve orta gelirli ülkelerdeki çocuklarda önemli morbidite ve mortaliteye neden olurken, ^4,5 yüksek gelirli ülkelerdeki enfeksiyonlar kreş, gıda kaynaklı ve su kaynaklı salgınlarla^{bağlantılıdır} 6,7,8,9. Etkisiz aşı geliştirme¹⁰ ve artan antimikrobiyal direnç (AMR) ^{oranları11,12}, büyük ölçekli Shigella salgınlarının yönetimini karmaşıklaştırmıştır. Son Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri verileri, Amerika Birleşik Devletleri'ndeki Shigella enfeksiyonlarının yaklaşık %46'sının 2020'de ilaç direnci gösterdiğini^{gösteriyor 13,14}, Dünya Sağlık Örgütü ise Shigella'yı acilen yeni tedavilere ihtiyaç duyulan AMR öncelikli bir patojen olarak ilan etti¹⁵.

Shigella enfeksiyonları, kontamine yiyecek veya suyun yutulması üzerine fekal-oral yolla veya doğrudan insan teması yoluyla kolayca bulaşır. Shigella, hastalığa neden olmak için yeterli 10-100 bakteri dozu ile verimli, insana uyarlanmış bir patojen olarak gelişmiştir¹⁶. İnce bağırsak geçişi sırasında Shigella, yüksek sıcaklık ve safra gibi çevresel sinyallere maruz kalır¹⁷. Bu sinyallerin saptanması, bakterilerin insan kolonunu enfekte etme yeteneğini artıran virülans faktörlerini ifade etmek için transkripsiyonel değişiklikleri indükler 17,18,19. Shigella, apikal yüzeyden kolon epitelini istila etmez, bunun yerine folikülle ilişkili epitel^20,21,22 içindeki özel antijen sunan mikro kıvrım hücrelerine (M hücreleri) alımını takiben epitel tabakası boyunca geçiş yapar. Transsitozu takiben, Shigella hücreleri yerleşik makrofajlar tarafından fagosite edilir. Shigella hızla fagozomdan kaçar ve makrofaj hücre ölümünü tetikleyerek proinflamatuar sitokinlerin salınmasına neden olur ^5,23,24. Shigella daha sonra bazolateral taraftan kolon epitel hücrelerini istila eder, makropinositik vakuolün parçalanması ve sitoplazmada replikatif bir niş oluşturur ^5,25. Pro-inflamatuar sitokinler, özellikle interlökin-8 (IL-8), polimorfonükleer nötrofil lökositleri (PMN'ler) enfeksiyon bölgesine toplar, bu da epitelyal sıkı bağlantıları zayıflatır ve bazolateral enfeksiyonu şiddetlendirmek için epitel astarının bakteriyel infiltrasyonunu sağlar⁵. PMN'ler, enfeksiyonu kontrol altına almak için enfekte epitel astarını tahrip eder, bu da basiller (kanlı) dizanteri^5'in karakteristik semptomlarına neden olur. İnvazyon ve hücre içi replikasyon mekanizmaları kapsamlı bir şekilde karakterize edilmiş olsa da, yeni araştırmalar Shigella enfeksiyonunda gastrointestinal (GI) geçiş sırasında virülans regülasyonu¹⁷, aderans¹⁹, bariyer geçirgenliği²⁶ yoluyla gelişmiş bazolateral erişim ve yetersiz beslenen çocuklarda asemptomatik taşıma²⁷ dahil olmak üzere önemli yeni kavramları göstermektedir.

Shigella spp.'nin ishal hastalığına neden olma yeteneği insanlar ve insan olmayan primatlarla sınırlıdır (NHP)²⁸. Zebra balığı 29, fareler³⁰, kobaylar³¹, tavşanlar^21,32,33 ve domuzlar^34,35 için Shigella bağırsak enfeksiyonu modelleri geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bu model sistemlerin hiçbiri, insan enfeksiyonu sırasında gözlemlenen hastalık özelliklerini doğru bir şekilde kopyalayamaz³⁶. Shigella patogenezini incelemek için NHP shigellosis modelleri oluşturulmuş olsa da, bu model sistemlerin uygulanması pahalıdır ve insanların enfeksiyöz dozundan dokuz kat daha yüksek olan yapay olarak yüksek enfeksiyöz dozlar gerektirir 37,38,39,40,41,42. Bu nedenle, Shigella'nın insan konakçıların enfeksiyonu için dikkate değer adaptasyonu, Shigella patogenezinin doğru bir şekilde sorgulanması için fizyolojik olarak ilgili modelleri yeniden oluşturmak için insan kaynaklı hücre kültürlerinin kullanılmasını gerektirir.

Burada, HT-29 kolonik epitel hücrelerinde Shigella'nın yapışması, invazyonu ve replikasyon oranlarını ölçmek için ayrıntılı prosedürler açıklanmaktadır. Bu standartlaştırılmış protokoller kullanılarak, bakteriyel virülans genlerinin ve çevresel sinyallerin Shigella enfeksiyonunun her adımını etkilediği moleküler mekanizmalar, dinamik konakçı-patojen etkileşimi ilişkisini daha iyi anlamak için sorgulanabilir.

1. Reaktiflerin ve malzemelerin hazırlanması

NOT: Tüm hacimler, iki adet 6 oyuklu plaka kullanan bir tahlil ile tutarlıdır.

1. TSB ortamı: 15 g Triptik Soya Suyu (TSB, Malzeme Tablosuna bakınız) ortamına ve otoklava 0,5 L deiyonize (DI) su ekleyin. Oda sıcaklığında saklayın.
2. Safra tuzları ortamı (TSB + BS): % 0.4 (a / h) safra tuzları içeren TSB'yi hazırlamak için, 15 mL otoklavlanmış TSB içinde 0.06 g safra tuzunu (BS, Malzeme Tablosuna bakınız) yeniden süspanse edin. Filtre, 0,22 μm PES filtresi kullanarak sterilize edilir.
   NOT: Safra tuzları, 1:1 sodyum kolat ve sodyum deoksikolat karışımından oluşur. Kullanmadan hemen önce yeni ortam hazırlayın.
3. DMEM +% 10 (h / h) FBS: 45 mL Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'una (DMEM) 5 mL fetal sığır serumu (FBS) ekleyin. 4 °C'de saklayın.
4. DMEM + gentamisin: 50 mL'lik bir tüpe 50 mL DMEM ve 50 μL 50 mg/mL gentamisin ekleyin (bkz.
   NOT: Her deneyden önce taze alikot yapın ve 37 °C'lik bir su banyosunda ısıtın.
5. PBS +% 1 (h / h) Triton X-100: 150 μL Triton X-100 ila 15 mL Fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin.
   NOT: Her deneyden önce taze alikot yapın ve 37 °C'lik bir su banyosunda ısıtın.
6. TSB + Kongo kırmızı gösterge plakaları: 1 L'lik bir şişeye 15 g TSB, 7,5 g seçkin agar ve 0,125 g Kongo kırmızı boyası ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin. 0,5 L DI su ve otoklav ekleyin. Ayrı steril Petri kaplarına (100 mm x 15 mm) 10-20 mL ortam dökün ve katılaşmasına izin verin.
   DİKKAT: Kongo kırmızısı kanserojendir ve üreme toksinidir. Kongo kırmızısının işlenmesinin uygun kişisel koruyucu ekipman kullanılarak yapıldığından emin olun. Daha fazla bilgi için ürün güvenlik bilgi formuna bakın.
   NOT: 0,5 L Kongo kırmızı malzemesinden yaklaşık 20 plaka yapılmıştır. Plakalar 2-3 gün önceden hazırlanabilir ve kullanıma kadar oda sıcaklığında ters çevrilmiş halde bırakılabilir. Uzun süreli saklama için, ters çevrilmiş plakaları 3 aya kadar 4 °C'de plastik kılıflara yerleştirin.
7. DMEM +% 10 (h / h) FBS ve% 5 (h / h) dimetil sülfoksit (DMSO): 50 mL'lik bir tüpe 42.5 mL DMEM, 5 mL FBS ve 2.5 mL DMSO ekleyin. 4 °C'de saklayın.

2. Bakterilerin hazırlanması

NOT: Tüm Shigella laboratuvar yetiştirme ve depolama protokolleri Payne, S. ^M.43'ten uyarlanmıştır.

DİKKAT: Shigella spp. Risk Grubu 2 patojenleridir⁴⁴. Tüm laboratuvar çalışmalarını, Shigella spp.'nin düşük bulaşıcı dozu nedeniyle kazara maruziyetleri sınırlamak için alınan ek güvenlik önlemleri ile bir BSL-2 ortamında gerçekleştirin.

1. Shigella'nın donmuş stoklardan büyümesi
   1. Steril bir aplikatör kullanarak kriyojenik flakondan az miktarda donmuş kültürü bir TSB + Kongo kırmızı agar plakasına aktarın.
   2. Bir aşılama döngüsünü alevle sterilize edin ve soğumaya bırakın. İnokulumu plakanın bir çeyreği boyunca ileri geri hareket ettirin. Halkayı alevlendirin, soğumaya bırakın, ardından ilk kadrandan plakanın ikinci çeyreğine doğru çizin. Aşılamayı plakanın üçüncü ve dördüncü kadranlarına sürmek için tekrarlayın.
      NOT: Alternatif olarak, her kadran arasında yeni bir steril aplikatör kullanarak aşılamayı çizgileyin.
   3. Plakayı ters çevirin ve gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
      NOT: Kongo kırmızı-pozitif (CR⁺) fenotipi^45'in gözlemlenmesi için gerekli olan Shigella virülans faktörlerinin ekspresyonu için ≥37 °C sıcaklıklarda inkübasyon gereklidir. Avirulent koloniler beyaz bir görünüme sahip olacak ve istilacı olmayacaktır.
   4. Plakayı parafin filmle kapatın ve 4 °C'de buzdolabında saklayın.
      NOT: Bakteri kolonileri agar plakalarında 1-2 hafta canlı kalacaktır.
2. Shigella'nın sıvı kültürde bir gecede büyümesi
   1. 3 mL TSB ortamını steril 14 mL kültür tüplerine alın.
   2. Steril bir aplikatör kullanarak tek, iyi izole edilmiş kırmızı (CR +) bir koloni seçin ve sıvı ortamda yeniden süspanse edin.
   3. Kültürleri gece boyunca (16-18 saat) 37 ° C'de dakikada 250 devirde (rpm) çalkalayarak inkübe edin.

3. HT-29 ökaryotik hücrelerin hazırlanması

NOT: Tüm hacimler, iki adet 6 oyuklu plaka kullanan bir tahlil ile tutarlıdır. HT-29 hücre hatları, Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu'ndan (ATCC) elde edildi. HT-29 bakım protokolleri, ATCC tavsiyelerinden⁴⁶ uyarlanmıştır. Tüm ortamlar kullanımdan önce 37 °C'de bir su banyosunda önceden ısıtılmalıdır. Tüm HT-29 bakım protokolleri bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir. pH'ta dramatik değişikliklerden kaçınmak için ortamdaki HT-29 hücrelerini karıştırırken/çalışırken kabarcık üretmekten kaçının.

1. HT-29 hücrelerinin donmuş stoktan çözülmesi
   1. HT-29 hücrelerinin şişesini 37 ° C'lik bir su banyosunda çözdürün.
      NOT: Kirlenmeyi önlemek için kapağın tamamen suyun üzerinde kaldığından emin olun. Çözdürme işlemi 2 dakikadan az sürmelidir.
   2. Kültür tamamen çözüldükten hemen sonra şişeyi sudan çıkarın ve% 70 etanol ile dekontamine edin. Bu noktadan itibaren tüm adımların aseptik teknikler kullanılarak gerçekleştirildiğinden emin olun.
   3. Şişenin tüm içeriğini 9 mL DMEM +% 10 FBS içeren 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 125 x g'da santrifüjleyin.
   4. Süpernatanı bir atık kabına boşaltın ve peleti 10 mL sıcak DMEM +% 10 FBS içinde yeniden süspanse edin. Süspanse hücreleri, 10 mL sıcak DMEM +% 10 FBS (toplam hacim 20 mL) içeren 75^cm2'lik bir doku kültürü şişesine (T75) aktarın.
   5. Hücreleri% 90 birleşmeye ulaşana kadar (yaklaşık 6-7 gün) hücreleri% 5 CO₂ ile 37 ° C'de inkübe edin.
      NOT: Birleşme görsel yaklaşımla tahmin edilir.
2. HT-29 hücrelerinin tohumlanması
   1. 37 °C su banyosunda 20 mL PBS ve 50 mL DMEM +% 10 FBS'yi önceden ısıtın ve 3 mL% 0.25 (a / h) Tripsin-EDTA'yı oda sıcaklığına önceden ısıtın.
   9. 
      
   10. 1. 1. 
             
          4. 
             
       2. 1. 
             
          5. 
             
3. 2. 
      

Aderans, invazyon ve hücre içi replikasyon testleri, S. flexneri 2457T vahşi tip (WT) ile Shigella virülansını negatif olarak düzenlediği varsayılan bir mutant olan S. flexneri ΔVF (ΔVF) karşılaştırılarak gerçekleştirildi. Shigella, virülansıdüzenlemek için bir sinyal olarak safra tuzlarını kullandığından 17,18,47, TSB ortamında bakteri alt kültüründen sonra deneyler yapıldı ve TSB% 0.4 (a / h) safra tuzları ile desteklendi18. Alt kültür aşaması sırasında safra tuzlarına maruz kalma, kolon enfeksiyonundan önce ince bağırsak geçişini çoğaltmak için bir ön tedavi görevi görür 17,18,47. Şekil 1, ΔVF mutasyonunun S. flexneri'nin HT-29 kolonik epitel hücrelerine yapışma yeteneği üzerindeki etkisini analiz etmektedir. Yapışma yüzdesi y ekseninde çizilir ve standardize edilmiş HT-29 lizizini takiben geri kazanılan bakterilerin giriş bakteri sayısına oranını temsil eder. Beklendiği gibi, hem S. flexneri WT hem de ΔVF suşları, safra tuzları takviyesi olmadan TSB'ye kıyasla safra tuzları takviyesi ile alt kültürlendiğinde yapışmada önemli bir artışa sahipti18. Bununla birlikte, her bir alt kültür koşulunda WT ve ΔVF mutant suşları arasında HT-29 hücrelerine bağlılıkta bir fark yoktu. Bu veriler, ΔVF mutasyonunun, S. flexneri'nin HT-29 epitel hücrelerine ön tedavi ile veya safra tuzları olmadan yapışma yeteneği üzerinde hiçbir etkisi olmadığını göstermektedir.

Şekil 2'de, ΔVF mutasyonunun, S. flexneri'nin HT-29 kolon epitel hücrelerinin içinde safra tuzları ön tedavisi olan veya olmayan istila etme (Şekil 2A) ve replike etme (Şekil 2B) yeteneği üzerindeki etkisi analiz edildi. Geri kazanım yüzdesi y ekseninde çizilir ve standardize edilmiş HT-29 hücre lizizini takiben geri kazanılan bakteri hücrelerinin giriş bakteri sayısına oranını temsil eder. Şekil 2A'da, WT S. flexneri 2457T'nin safra tuzlarına48 ön maruziyetten sonra HT-29 hücrelerini istila etme yeteneğinde önemli bir artış beklenirken, S. flexneri ΔVF mutantı WT suşuna kıyasla safra tuzlarına maruz kaldıktan sonra invazyonda daha küçük bir artış gösterdi. ΔVF mutantı, TSB'de alt kültürlenen WT'ye kıyasla HT-29 hücrelerinin invazyon oranlarını arttırdı, ancak TSB'de safra tuzları ile desteklendiğinde WT ile benzer invazyon oranlarına sahipti (Şekil 2A). Bu sonuçlar, ΔVF mutasyonunun, S. flexneri'nin HT-29 hücrelerini istila etme yeteneğini arttırdığını, bu da ΔVF mutantının invazyon kabiliyetinin safra tuzları alt kültürünü takiben daha da artmasına rağmen, maruziyet öncesi safra tuzlarının etkisini azalttığını göstermektedir.

Genel olarak, gece boyunca inkübasyondan sonra 10 kat daha fazla bakteri geri kazanıldı (Şekil 2B), 90 dakikalık inkübasyona (Şekil 2A) kıyasla, sırasıyla hücre içi büyümenin invazyona karşı izlenmesindeki farklılıkları göstermektedir. Enfekte HT-29 hücreleri, bakterilerin hücre içi replikasyonuna izin vermek için 18 saat inkübe edildiğinde (Şekil 2B), safra tuzlarının ön tedavisinin etkisi hem WT hem de ΔVF suşları için azalmıştır. Bununla birlikte, hücre içi replikasyon sırasında safra tuzlarının ön tedavisinin azaltılmış etkisi, ΔVF mutantı için daha dramatikti. Safra tuzlarına önceden maruz kaldıklarında her iki suşun hücre içi replikasyonundaki artış, aynı koşullarda invazyon oranlarındaki artıştan daha küçük olduğundan, safra tuzlarının S. flexneri patogenezindeki erken adımlar üzerinde daha büyük bir etkiye sahip olduğunu varsayıyoruz. ΔVF mutantı, her iki alt kültür koşulunu takiben WT'ye (Şekil 2B) kıyasla HT-29 hücreleri içindeki gece replikasyonundan elde edilen geri kazanım yüzdesinde bir artış gösterdi. Bununla birlikte, ΔVF mutantının geri kazanım yüzdesi, maruziyet öncesi safra tuzlarından bağımsız olarak benzerdi. Bu veri eğilimleri, ΔVF mutantının WT'ye kıyasla HT-29 hücreleri içinde daha verimli bir şekilde çoğaldığını ve safra tuzlarının ön maruziyetinin, WT için gözlemlendiği gibi ΔVF mutantının hücre içi olarak çoğalma yeteneğini etkilemediğini göstermektedir (Şekil 2B). 90 dakikalık invazyon testi sırasında safra tuzlarının maruziyet öncesi koşulundaki mutant ve WT suşları arasındaki fark gözlenmediğinden, silinen VF geni tarafından kodlanan ürünün, HT-29 hücreleri içinde S. flexneri replikasyonunu da düzenleyebileceğini varsayıyoruz. Kombine olarak, her iki analiz de ΔVF mutantının WT'ye göre daha öldürücü olduğunu göstermektedir, bu da VF gen ürününün S. flexneri virülansının negatif bir düzenleyicisi olduğunu göstermektedir.

Şekil 1: Safra tuzları, S. flexneri'nin HT-29 hücrelerine maruziyet öncesi indüklenmiş yapışmasını indükledi. S. flexneri 2457T WT ve ΔVF mutant hücreleri, %0.4 (a/h) safra tuzları (TSB+BS) ortamı ile desteklenmiş TSB veya TSB'de alt kültürlendi. Bakteriler daha sonra HT-29 hücrelerine 100 enfeksiyon çokluğunda (MOI) uygulandı ve yapışmayı incelemek için 3 saat inkübe edildi. İnkübasyondan sonra, enfekte olmuş HT-29 hücreleri yıkandı ve parçalandı ve geri kazanılan bakterilerin seri seyreltmeleri, mL başına koloni oluşturan birimleri (CFU / mL) numaralandırmak için kaplandı. Yapışma yüzdesini belirlemek için yapışan bakteri sayısı, giriş bakteri titrelerine göre çizilir. Veriler, üç teknik kopya (tek tek noktalar) ile bir biyolojik kopyayı temsil eder. Hata çubukları, ortalamanın (SEM) standart hatasını gösterir. İstatistiksel anlamlılık Student t-testi ile belirlendi (*p < 0.05; ***p < 0.001). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Safra tuzları maruziyet öncesi WT S. flexneri invazyonunu ve hücre içi replikasyonu arttırdı. S. flexneri 2457T WT ve ΔVF mutant hücreleri, safra tuzları (TSB+BS) ortamı ile takviye edilmiş TSB veya TSB'de alt kültürlendi. Bakteriler daha sonra 100'lük bir MOI'de HT-29 hücrelerine uygulandı, hücrelere santrifüjlendi ve 37 ° C'de% 5 CO2 ile 45 dakika inkübe edildi. Hücreler PBS ile yıkandı ve hücre içi bakterileri sadece geri kazanmak için DMEM'e gentamisin ilavesiyle hücre dışı bakteriler parçalandı. 90 dakika (A, bakteri istilası) veya 18 saat (B, hücre içi replikasyon) inkübasyonlarından sonra, enfekte olmuş HT-29 hücreleri yıkandı ve parçalandı ve geri kazanılan bakterilerin seri dilüsyonları, mL başına koloni oluşturan birimleri (CFU / mL) numaralandırmak için kaplandı. Hücre içi bakteri sayısı, iyileşme yüzdesini belirlemek için giriş bakteri titrelerine göre çizilir. Veriler, her biri üç teknik kopyaya (tek tek noktalar) sahip bir biyolojik kopyayı temsil eder. Hata çubukları SEM'i gösterir. İstatistiksel anlamlılık Student t-testi ile belirlendi (*p < 0.05). Lütfen (A) ve (B) panelleri arasındaki y ekseni ölçeklerindeki farklılıklara dikkat edin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.