Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İnceltilmiş kafatası penceresi ve sıvı perküsyonu içeren tekrarlayan hafif travmatik beyin hasarının modifiye edilmiş fare modeli

1.8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66440

⸱

19 Nisan 2024

 ,  ,  ,  , 
1College of Physical Education and Health Sciences, Zhejiang Normal University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Düzeltme bildirimi

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Özet

Bu protokol, kapalı kafa travması (CHI) yöntemiyle indüklenen tekrarlayan hafif travmatik beyin hasarının (rmTBI) modifiye edilmiş bir fare modelini sunar. Yaklaşım, meninkslere maruz kalmanın yaygın olarak neden olduğu iltihabı azaltmak için inceltilmiş bir kafatası penceresi ve sıvı perküsyonunun yanı sıra kemirgenlerde rmTBI modellemesinde gelişmiş tekrarlanabilirlik ve doğruluk içerir.

Özet

Hafif travmatik beyin hasarı klinik olarak oldukça heterojen bir nörolojik bozukluktur. Hafif TBH sonrası nöropatoloji mekanizmalarını incelemek ve terapötikleri test etmek için iyi tanımlanmış patolojilere sahip yüksek oranda tekrarlanabilir travmatik beyin hasarı (TBH) hayvan modellerine acilen ihtiyaç vardır. TBH'nin tüm sekellerini hayvan modellerinde çoğaltmanın zor olduğu kanıtlanmıştır. Bu nedenle, TBH hastalarında görülen çeşitli yönleri ve ciddiyetleri hesaba katmak için TBH'nin birden fazla hayvan modelinin mevcudiyeti gereklidir. CHI, rmTBI'nin kemirgen modellerini üretmek için en yaygın yöntemlerden biridir. Bununla birlikte, bu yöntem, kullanılan darbe yöntemi, kafatası kemiğinin kalınlığı ve şekli, hayvan apnesi ve kullanılan kafa desteği ve immobilizasyon türü dahil olmak üzere birçok faktöre karşı hassastır. Bu protokolün amacı, CHI ile ilişkili rmTBI'nin kesin bir fare modelini üretmek için inceltilmiş kafatası penceresi ve sıvı perküsyon yaralanması (FPI) yöntemlerinin bir kombinasyonunu göstermektir. Bu protokolün birincil amacı, kafatası kemiği kalınlığı, şekli ve kafa desteği dahil olmak üzere CHI ve FPI modellemesinin doğruluğunu ve tutarlılığını etkileyebilecek faktörleri en aza indirmektir. İnceltilmiş bir kafatası penceresi yöntemi kullanılarak, kraniyotomi ve FPI'ye bağlı potansiyel iltihaplanma en aza indirilir ve hafif TBH'li hastalarda gözlenen klinik özellikleri kopyalayan gelişmiş bir fare modeli elde edilir. Hematoksilen ve eozin (HE) boyama kullanılarak yapılan davranış ve histolojik analizden elde edilen sonuçlar, rmTBI'nin beynin hem davranışında hem de brüt morfolojisinde değişiklikler üreten kümülatif bir yaralanmaya yol açabileceğini düşündürmektedir. Genel olarak, modifiye edilmiş CHI ile ilişkili rmTBI, araştırmacıların rmTBI'daki fokal ve diffüz patofizyolojik değişikliklere katkıda bulunan altta yatan mekanizmaları keşfetmeleri için yararlı bir araç sunar.

Giriş

Beyin sarsıntısı ve alt beyin sarsıntısı dahil olmak üzere hafif TBH, tüm TBH vakalarının çoğunluğunu oluşturur (tüm TBH'lerin %>80'i)1. Hafif TBH genellikle düşmelerden, trafik kazalarından, şiddet eylemlerinden, temas sporlarından (örneğin, futbol, boks, hokey) ve askeri mücadeleden kaynaklanır 2,3. Hafif TBH, hastanın yaşamı boyunca nörodavranışsal işlevleri etkileyen ve nörodejeneratif hastalık riskini artıran nörobiyolojik olaylara yol açabilir 4,5,6. Hayvan modelleri, hafif TBH'nin tanı ve tedavisini daha da geliştirme umuduyla hafif TBH'yi incelemek için verimli ve kontrollü bir yol sağlar. Hafif TBI için kontrollü kortikal etki (CCI), ağırlık düşüşü (WD), sıvı perküsyon yaralanması (FPI) ve blast-TBI modelleri 7,8 gibi çeşitli modeller geliştirilmiştir. Tek bir deneysel model, TBH'nin neden olduğu patolojinin tüm karmaşıklığını taklit edemez 9,10. Bu modellerin heterojenliği, hafif TBH hastaları ile ilişkili çeşitli özellikleri ele almak ve karşılık gelen hücresel ve moleküler mekanizmaları araştırmak için avantajlıdır. Bununla birlikte, TBH'nin her bir hayvan modelinin, hafif hayvan TBH'si ve bunların klinik önemi ile ilgili mevcut bilgilerimizi sınırlayan sınırlamaları3 vardır.

WD ve CCI modelleri, serebral doku kaybı, akut subdural hematom, aksonal yaralanma, beyin sarsıntısı, kan-beyin bariyeri disfonksiyonu ve hatta TBI 3,11,12'yi takiben koma gibi klinik durumları çoğaltmak için kullanılır. WD modeli, dura mater veya kafatasına serbestçe düşen ağırlıklarla vurarak beyin hasarına neden olmayı içerir. Ağırlıklı bir nesnenin sağlam bir kafatası üzerindeki etkisi, karışık odak/yaygın yaralanmaları çoğaltabilir; Bununla birlikte, bu yöntem, yaralanma bölgesinin zayıf doğruluğu ve tekrarlanabilirliği, geri tepme yaralanması ve kafatası kırıklarına bağlı daha yüksek mortalite oranı ile ilişkilidir 3,11,12. CCI modeli, açıkta kalan dura materini doğrudan etkilemek için hava tahrikli metal uygulanmasını içerir. WD modeliyle karşılaştırıldığında, CCI modeli daha doğru ve tekrarlanabilirdir, ancak çarpma ucunun11 küçük çapı nedeniyle yaygın yaralanmaya neden olmaz. FPI modellemesi sırasında, beyin dokusu perküsyon ile kısa bir süre yer değiştirir ve deforme olur. FPI, karışık fokal / diffüz yaralanmaya neden olabilir ve TBH'den sonra intrakraniyal kanama, beyin şişmesi ve ilerleyici gri madde hasarını çoğaltabilir. Bununla birlikte, FPI, beyin sapı hasarı ve uzamış apne nedeniyle yüksek bir mortalite oranına sahiptir 3,12. Konvansiyonel WD, CCI ve FPI modellerinde yer alan kraniyotomi, kortikal kontüzyon, hemorajik lezyonlar, kan-beyin bariyerinin hasarı, immün hücre infiltrasyonu, glial hücre aktivasyonu, uzamış modelleme süresi ve olası ölümcül sonuçlara yol açabilir 3,12.

Hafif TBH, 13 ila 152 aralığında bir GCS (Glasgow koma ölçeği, GCS) skoru ile karakterizedir. Hafif TBH fokal veya yaygın olabilir ve hücresel homeostazın bozulması, eksitotoksisite, glikoz tükenmesi, mitokondriyal disfonksiyon, kan akışı bozukluğu ve aksonal hasar gibi akut yaralanmaların yanı sıra aksonal hasar, nöroinflamasyon ve gliozis dahil olmak üzere subakut yaralanmalarla ilişkilidir 2,3. TBH'nin karmaşık patofizyolojisini tanımlamada önemli ilerlemeye rağmen, hafif TBH / rmTBH'nin altta yatan mekanizmaları belirsizliğini korumaktadır ve daha fazla araştırma gerektirmektedir9. CHI'nin en yaygın TBI12 türü olduğu göz önüne alındığında, bu protokol, inceltilmiş bir kafatası penceresinde13 etki gerçekleştirmek için modifiye edilmiş bir FPI cihazı kullanarak rmTBI'nin daha hassas bir şekilde kontrol edilen bir fare modeli oluşturmak için yeni bir yaklaşım sunar. Bu yaklaşım, kraniyotomi kaynaklı yaralanmalardan, değişken kafatası kalınlığından ve şekil kaynaklı yanlışlıklardan ve geri tepme yaralanmalarından kaçınarak, WD, CCI ve FPI modelleriyle ilişkili ana dezavantajların üstesinden gelmeyi amaçlamaktadır. İnceltilmiş kafatası penceresine FPI etkisi uygulamak, rmTBI'yi takiben serebral damar hasarını değerlendirmek için uygundur ve bazı modellerde yüksek mortalite oranlarını en aza indirmeye yardımcı olur, bu da TBH hastalarının klinik özelliklerine daha yakın bir benzerlik sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokolde yer alan tüm prosedürler, Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi onayı (Zhejiang Normal Üniversitesi, İzin Numarası, dw2019005) ve ARRIVE ve NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Teknik özellikler Malzeme Tablosunda bulunabilir.

1. Hayvan taşıma prosedürü

  1. 22-24 °C sıcaklık, %40-%60 arasında değişen nem, 12 saatlik aydınlık/karanlık döngüsü ile kontrollü bir ortamda fareleri barındırır ve suya ve standart fare yemeğine ad libitum erişim sağlar. Bu deneyin amacı için, 25 ICR erkek faresi (25-30 g, 8 haftalık) kullanıldı.
  2. Fareleri rastgele olarak kontrol grubuna (n = 12) veya rmTBI grubuna (n = 13) tahsis edin. Sahte farelerin rmTBI uygulanan farelere karşı olası saldırganlığını önlemek için, onları farklı kafeslere ayırın.
  3. Deneye başlamadan önce farelere kafes ortamlarına alışmaları için en az 1 hafta süre verin. Bu alışma dönemi, farelerin çevrelerine aşina olmalarını sağlar ve çalışma sırasında stres veya kaygının fizyolojik veya davranışsal tepkiler üzerindeki potansiyel etkilerini en aza indirir.

2. TBI cihazının hazırlanması

  1. Değiştirilmiş bir FPI cihazı kullanarak farelerde rmTBI modelini üretin (bkz. Şekil 1A) 13. FPI cihazını kullanmadan önce, silindir ile boru arasındaki ve üç konektör ile boru arasındaki bağlantılara özellikle dikkat ederek tüm bağlantılarda sızıntı veya çatlama belirtileri olup olmadığını dikkatlice inceleyin. Darbe basınçlarını doğru bir şekilde belirlemek için, sıvı perküsyon yaralanma cihazı13 üzerindeki çarpma noktasına bir basınç dönüştürücü monte edildi.
  2. Pistonun silindir içinde düzgün bir şekilde hareket ettiğinden ve darbelerin etkili bir şekilde gerçekleştirilebildiğinden emin olmak için FPI cihazını dikkatli bir şekilde inceleyin (Şekil 1B). Sistemde hava kabarcığı olmadığını doğrulayın. Hava kabarcıkları tespit edilirse, 50 mL'lik bir şırınga kullanarak sisteme dikkatlice damıtılmış su ekleyin ve silindir çubuğunu yakındaki 3 bir konektörden ve/veya şırıngadan hızlı bir şekilde iterek hava kabarcıklarını dışarı atın.
    NOT: FPI sistemi, silindir ve bağlı boru içindeki damıtılmış sudan oluşur. Sonuçların doğruluğunu ve güvenilirliğini sağlamak için çalıştırmadan önce cihazı kalibre etmek çok önemlidir.

3. İnceltilmiş kafatası hazırlığı

NOT: Hayvan cerrahisi ve inceltilmiş kafatası hazırlığı, diğer fareler göz önünde bulundurularak yapılmamalıdır. İnceltilmiş kafatası penceresi, bir FPI prosedürünü takiben serebral damar hasarını değerlendirmek için kullanışlıdır.

  1. Deney operatörüne tüm hayvan taşıma prosedürleri sırasında steril bir önlük ve maske takması talimatını vererek hayvan merkezinin gereksinimlerine uyun.
  2. %70 etanol sprey kullanarak deneye başlamadan önce laboratuvar tezgahını, FPI cihazını, anestezik boruyu ve bitişik tezgah boşluğunu sterilize edin.
  3. Ameliyattan önce hem sahte hem de rmTBI gruplarındaki fareleri tartın ve ağırlıklarını deneyden 1 hafta önce kaydedilenlerle karşılaştırın. Kaba kürk manto, ishal, kilo kaybı veya uyuşukluk gibi kötü sağlık sergileyen herhangi bir fareyi çalışmadan çıkarın. Ek olarak, tekrarlanan darbelere tahammül edebilmelerini sağlamak için 20 g'dan daha hafif olan fareleri hariç tutun. Bu önlemler, hayvan refahının korunmasında ve güvenilir deneysel sonuçların sağlanmasında çok önemlidir.
  4. Fareleri bir indüksiyon odasında 3-4 dakika boyunca% 4 -% 5 izofluran (1 L / dak akış hızında% 100 oksijende) ile uyuşturun. Ameliyat boyunca yağlamayı sürdürmek için hayvanın gözlerine oftalmik bir kayganlaştırıcı ( Malzeme Tablosuna bakınız) uygulayın. Ağrıyı hafifletmek için, anesteziden 20 dakika önce kulakları arasındaki orta noktada ve daha sonra her 6 saatte bir 24 saat boyunca deri altından (0.05 mg / kg) buprenorfin uygulayın. Ayrıca, anestezinin sonunda, her hayvana tek bir deri altı 5 mg / kg karprofen dozu uygulayın.
  5. Fare sağ ve pedal çekme reflekslerini kaybettikten sonra kafayı dezenfekte edin. Cerrahi makas kullanarak farenin kafasındaki kürkü kesin ve kalan kürkü çıkarmak için bir tıraş makinesi kullanın. Saç derisini,% 75 etanol fırçaları ile serpiştirilmiş% 2 klorheksidin üç ardışık uygulama ile dezenfekte edin.
  6. Uygun hijyeni sağlamak için hayvanın ve çevresinin altına tek kullanımlık steril bir cerrahi ped yerleştirin. Cerrahi bölgeyi tamamen ortaya çıkarmak için farenin kafa derisinin orta hattı boyunca ince küçük bir cerrahi makas kullanarak 1,5 cm'lik bir kesi yapın (Şekil 2A).
  7. Geleneksel bir stereotaksik çerçevede terminal olmayan kulak çubukları kullanarak fareyi sabitleyin (bkz. Fare kafasının konumunu, araştırılacak belirli hedef alana göre stereotaksik bir çerçevede düz bir seviyede veya hafif eğimli bir açıda ayarlayın. Daha sonra iltihaplanmayı önlemek için cerrahi bölgedeki kürkü temizleyin.
  8. Geleneksel bir izotermal ısıtma yastığı kullanarak farenin vücut sıcaklığını 37 °C'de tutun (bkz. Malzeme Tablosu).
  9. Cerrahi ve darbe göbeği (dişi Luer Kilidi) kurulum işlemi sırasında, kalibre edilmiş bir buharlaştırıcı tarafından düzenlenen sürekli% 2'lik bir izofluran konsantrasyonu sağlayan bir burun konisi ile fare anestezisini (ayak parmağı veya kuyruk sıkışmasına yanıt vermeden) koruyun.
  10. İnceltilmiş kafatası penceresinin etrafındaki cerrahi alanı, tuzlu suyla ıslatılmış steril bir pamuklu çubuk kullanarak dikkatlice temizleyin.
  11. Düz uçlu bir mikro matkap ucu (bkz. Malzeme Tablosu, Şekil 2B) ve bir mikrocerrahi bıçak kullanarak sağ frontal motor kortekste yaklaşık 2,5 mm çapında ve 20 μm kalınlığında inceltilmiş bir kafatası penceresi oluşturun. Cerrahi bölgeyi bregmanın 1.5 mm önünde ve orta hattın 1.3-2.0 mm yanında konumlandırın (Şekil 2C).
    1. İnceltilmiş kafatası penceresinin oluşturulması sırasında mikro matkabın kafatasına nüfuz etmesini önlemek için, mikro matkapla taşlama yaparken kafatasını aralıklı olarak tuzlu su ile nemlendirin.
    2. İnceltilmiş kafatasını ince bir şırınga iğnesinin düzleştirilmiş ucuyla nazikçe incelterek ve yumuşaklığını değerlendirerek kafatasının kalınlığını onaylayın. Kafatasının kalınlığını belirlemek için maruz kalan kortikal mikro damarların netliğini görsel olarak tahmin edin.
    3. Kafatasının kalınlığını doğrulamak için, inceltilmiş alana steril salin uygulayın ve geleneksel bir diseksiyon mikroskobu kullanarak görsel olarak inceleyin (bkz. Malzeme Tablosu). Bu teknik, kafatasının yeterince inceltildiğinden emin olmaya yardımcı olabilir.
      NOT: Kurumayı önlemek için tüm inceltilmiş kafatası hazırlığı ve rmTBI modelleme prosedürü boyunca fare gözünü yağlayın. Kafatasının 15 μm'den daha az inceltilmesi, hafif kortikal travma riski taşır ve bu da hafif kortikal iltihaplanma ile sonuçlanabilir14.
  12. İnceltilmiş kafatası bölgesine ayarlanmış bir dişi Luer Kilidi ( Şekil 2.2D'de gösterildiği gibi 19G iğne göbeğinden oluşturulan 2 mm iç çap) takın. Luer Lock'u tutkal ve diş çimentosu ile sabitleyin (Şekil 2E).
    NOT: Dişi Luer kilidini inceltilmiş kafatası penceresinin etrafındaki alana sabitlemek için yapıştırıcı kullanırken, kafatası bölgesini iyice kurutmak ve yapıştırıcının pencerenin kendisine girmesini önlemek çok önemlidir. Pencere içindeki yapıştırıcı, FPI'nin darbe kuvvetini önemli ölçüde azaltabilir.

4. CHI ile ilişkili rmTBI modelleme prosedürü

  1. Daha önce açıklandığı gibi modifiye edilmiş bir FPI cihazı ile yanal sıvı perküsyon yöntemini kullanarak rmTBI'yi tanıtın13,15.
  2. İnceltilmiş kafatası penceresi ve darbe göbeği prosedürlerini tamamladıktan sonra, fareyi stereotaksik cihazdan çarpma tertibatı platformuna aktarın.
  3. Anestezinin perküsyon sonrası hayvan düzeltme refleks süresi ve yaralanma şiddeti üzerindeki potansiyel etkileri göz önüne alındığında 9,16, palpebral ve pençe çekilme reflekslerini değerlendirerek anestezi derinliğini izleyin (Şekil 2F).
  4. İnceltilmiş kafatası penceresine yapıştırılan dişi Luer Kilidini, FPI cihaz hortumunun ucundaki erkek Luer Kilidine bağlayın (Şekil 2G).
    NOT: rmTBI modellemesinde, farelerde izofluran ile indüklenen anestezi, apne indüksiyonu ve perküsyon ile bilinç kaybı nedeniyle uzatıldı.
  5. Modifiye edilmiş cihazla iki hafif TBI (48 saat aralıkla) tanıtın. İnceltilmiş kafatası pencere ameliyatını tamamladıktan ve Luer Lock'u taktıktan hemen sonra ilk FPI etkisini uygulayın. FPI etkisini yalnızca fare her seferinde bir pençe tutamına geri çekilme refleksinin geri döndüğünü gösterdiğinde uygulayın (Şekil 2H). Derin anestezi uygulanmış farelerde FPI etkisi uygulamak, uzun süreli apne ve ölüme neden olabilir.
    1. FPI etkisini uygulamak için, sarkacı cihaz üzerindeki iletki boyunca belirtilen dereceye kadar kaldırın ve yazılım kontrolünü13,15 kullanarak sarkacı serbest bırakın. Etki, kemirgen çalışmalarında kullanılan yerleşik protokolleri izleyerek 2.0 ± 0.1 atm'lik bir perküsyon yoğunluğuna ulaşmalıdır 10,17,18. Etki 1.9-2.1 atm arasında kaydedilmediyse veya FPI sırasında kafatası kırığı meydana geldiyse hayvanları daha ileri testlerden hariç tutun.
    2. Sahte fareler için, bunları cihaza sabitleyin, ancak darbeyi vermeyin.
  6. Çarpmanın ardından, Luer Lock bağlantısını hemen ayırın ve fareleri geri kazanım için izotermal bir ısıtma yastığına aktarın. Fare uyanıklığını ve bilincini geri kazandıktan sonra, dişi Luer kilidini çıkarmadan onu ev kafesine geri koyun. İkinci FPI etkisini aynı şekilde 48 saat sonra uygulayın.
  7. RmTBI'dan sonra dişi Luer kilidini ve diş çimentosunu dikkatlice çıkarın. Doku yapıştırıcısı kullanarak kafa derisini dikin ve yapıştırma işlemini kolaylaştırmak için kafa derisini sıkıştırmak için düz forseps kullanın (bkz . Şekil 2I).
  8. Enflamasyonu, enfeksiyonu önlemek ve ameliyat sonrası ağrı ve rahatsızlığı hafifletmek için, yaraya 1: 1 oranında eritromisin ve sodyum diklofenak merhem karışımı uygulayın ( Malzeme Tablosuna bakınız). Fareleri geri kazanım için izotermal bir ısıtma yastığına aktarın.
  9. Fare stereotaksik aparattan çıkarıldığında ve FPI için çarpma platformuna yanal olarak yerleştirildiğinde başlayan ve fare bağımsız olarak dik durabilene kadar devam eden doğrultma refleksinin süresini kaydedin.
  10. Fare uyanıklığını ve bilincini geri kazandıktan sonra, onu ev kafesine geri koyun. Fareler tipik olarak tamamen bilinçlidir ve yaralanmadan sonraki 1,5 saat içinde yürüyebilirler.
  11. TBI modellemesini takip eden günlerde, fareleri solunum paternleri, burun ve ağız çevresinde mukus varlığı ve kızarıklık, şişme, eksüdalar veya yara bölgesinin yeniden açılması gibi çeşitli belirtiler açısından gözlemleyin. Yukarıdaki anormal semptomlardan bir veya daha fazlasına sahip hayvanları çalışmadan çıkarın.
    NOT: AAV-GCaMP6'ların ön mikroenjeksiyonu, iki fotonlu lazer tarama mikroskobu15 kullanılarak inceltilmiş kafatası penceresinden yaralı kortekste altta yatan nöronal Ca2+ homeostazının ve uyarılabilirliğin gözlemlenmesine izin verir.

5. Morris su labirenti (MWM) testi

NOT: MWM ( Materyal Tablosuna bakınız), TBH'yi takiben farelerde uzamsal öğrenme ve hafıza eksikliklerini değerlendirmek için yaygın olarak tanınan bir yöntemdir.

  1. MWM testini yaralanmadan 7 gün sonra (DPI) başlayarak yapın. MWM'nin dairesel havuzu 120 cm çapında ve 50 cm yüksekliğindeydi ve su sıcaklığı 25 °C'de tutuldu. Dairesel havuzu, kuzeydoğu çeyreğinde su yüzeyinin 1 cm altına batırılmış, 6 cm çapında ve 30 cm yüksekliğinde yuvarlak bir platform olan kaçış platformu ile dört çeyreğe ayırın.
  2. Farelerin hareket yörüngesini kaydetmek için bir kamerayı doğrudan dairesel havuzun üzerine yerleştirin. Görüntü alma yazılımı tarafından tanınmayı kolaylaştırmak ve gecikme, yüzme mesafesi ve hareket yörüngesi dahil olmak üzere veri kaydı için fareleri sırtlarında siyah bantla işaretleyin.
  3. Fareleri, her kadran için bir kez olmak üzere, dört kadranın her birinin iç duvarına bakacak şekilde suya yerleştirin. Fareler platformu bulduktan sonra 10 saniye orada dinlenmelerine izin verin. Bir fare platformu 60 saniye içinde bulamazsa, operatörden fareyi platforma yönlendirmesini, 10 saniye boyunca platformda dinlenmesine izin vermesini ve ardından fareyi dinlenmek için ev kafesine geri koymasını isteyin.
  4. Her fare için edinme denemesini günde 4 kez tekrarlayın. Edinme denemelerinin ardından, 12 DPI'da, 60 s'lik bir uzamsal prob deneyi yapın ve farelerin orijinal platform alanını kaç kez geçtiğini ve farenin platformun bulunduğu kadranda kalma süresini kaydedin.
  5. Her denemeden sonra, DPI 7'den DPI 11'e kadar 60 s edinme denemesi sırasında vücut sıcaklıklarını korumak ve hipotermiyi önlemek için fareleri bir havluyla hızlı bir şekilde kurulayın veya bir ısıtma lambasının altına yerleştirin.
  6. Yukarıda özetlenen deneysel prosedürlerin tamamlanmasından sonra, fareleri 13 DPI'da pentobarbital (45 mg / kg, ip) ile uyuşturun. İzotonik salini transkardiyal olarak perfüze edin, ardından fosfat tamponlu salin (pH 7.2) içinde% 4 paraformaldehit ile perfüzyon yapın. Brüt kortikal ve hipokampal morfoloji değişikliklerini değerlendirmek için geleneksel HE boyama için beyinleri alın. HE boyama protokolünün ayrıntılı bir açıklaması önceki yayınlardabulunabilir 13,15.
  7. Tüm deneyler tamamlandıktan sonra, fare örneği gerekmiyorsa, aşırı dozda pentobarbital (≥100 mg / kg, i.p.) enjeksiyonu ile fareye ötenazi yapın. Mendilleri toplamadan veya karkası atmadan önce, fareyi en az 60 saniye boyunca kalp atışı olmayana kadar izleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu çalışmada açıklanan protokol, konvansiyonel perküsyon TBI modellemesi sırasında kraniyotomi hazırlığının neden olduğu beyin hasarına bir çözüm sunan, inceltilmiş bir kafatası penceresinden rmTBI'yi indüklemek için bir yöntemi özetlemektedir. Bu modifiye edilmiş sıvı perküsyon prosedürünü modifiye edilmiş cihazla kullanarak, FPI etkisinin gelişmiş hassasiyeti ve tekrarlanabilirliği elde edildi13. Modifiye edilmiş çarpma tertibatı, kafatası kraniyotomisi olsun veya olmasın, hem CHI hem de FPI mod...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

TBI, kapalı ve nüfuz eden olmak üzere iki ana tipe atıfta bulunur ve ikincisi kafatasının ve dura materin bozulması ile karakterize edilir. Klinik veriler, CHI'lerin penetran yaralanmalardan daha yaygın olduğunu göstermektedir 1,2. Tek bir hafif TBH'den sonra, çoğu hasta tipik olarak kısa bir süre içinde düzelen PKS semptomları yaşar ve PKS'si uzun süreli sekellere dönüşen hastaların oranı ile ilgili tartışmalar vardır23,24

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Jinhua Belediyesi Temel Sosyal Kalkınma Vakfı (No. 2020-3-071), Zhejiang Koleji Öğrenci İnovasyon ve Girişimcilik Eğitim Programı (No: S202310345087, S202310345088) ve Zhejiang İl Koleji Öğrencileri Bilim ve Teknoloji İnovasyonu Etkinlik Planı Projesi (2023R404044) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, makalenin dil düzenlemesi için Bayan Emma Ouyang'a (Johns Hopkins Üniversitesi, Fen Bilimleri Lisansı, Baltimore, ABD birinci sınıf öğrencisi) teşekkür eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 75 etanol ve nbsp;Shandong XieKang Tıp Teknolojisi Co, Ltd & nbsp;
Buprenorfin hidroklorürTianjin İlaç Araştırma Enstitüsü Pharmaceutical Co., LtdH12020272Solüsyonu, Analjezik
CarprofenShanghai Guchen Biotechnology Co., Ltd53716-49-7Toz, Analjezik
Klorheksidin diglukonatShanghai Macklin Biochemical Co., Ltd.18472-51-0%19 - %21 sulu çözelti, Antimikrobiyal
Diş çimentosu ve solvent kitiShanghai New Century Dental Materials Co., Ltd.20220405, 3 # Toz,eşleşen çözücü
Diseksiyon mikroskobuShenzhen RWD Life Science Inc.77019
Eritromisin merhem Wuhan Mayinglong İlaç Grubu Co., Ltd.220412Antibiyotik
Fiber Optik Soğuk Işık KaynağıShenzhen RWD Yaşam Bilimleri A.Ş.F-150C
Düz uçlu mikro matkap ucu Shenzhen RWD Yaşam Bilimleri A.Ş.HM310082 mm, çelik
FPI cihaz yazılımıJiaxing Bocom Biotech Inc.Biocom Hayvan Beyin Çarpma Cihazı V1.0
ICR fareleriJinhua Laboratuvar Hayvanları Merkezi   Stok # 202309125 Erkek fare, 25-30g, 8 haftalık
IsofluraneShandong Ante Animal Husbandry Technology Co., Ltd. 
İzotermal ısıtma yastığı Wenzhou Repshop Pet Products Co., Ltd. 
Luer Loc hupÖzel 19G iğne göbeği kullanılarak yapılmıştır
Mikro el tipi kafatası matkabıShenzhen RWD Life Science Inc.78001Maks: 38.000rpm
Modifiye FPI cihazıJiaxing Bocom Biotech Inc.
Morris su labirentiShenzhen RWD Yaşam Bilimleri A.Ş.63031Farenin uzamsal öğrenme ve hafıza yeteneklerini değerlendirin
Açık alanShenzhen RWD Yaşam Bilimleri A.Ş.63008Fare lokomoasyonunu ve anksiyetesini değerlendirin
Oftalmik kayganlaştırıcı Suzhou Tianlong İlaç Co., Ltd. 
Sodyum diklofenak merhem Wuhan Mayinglong İlaç Grubu Co., Ltd.221207nonsteroid antienflamatuar ilaç
Küçük hayvan anestezi sistemi-Geliştirilmiş Shenzhen RWD Yaşam Bilimleri A.Ş.R530IP
Akıllı video izleme sistemiPanlab Harvard Apparatus Inc., MA, ABDV3.0Hayvan izleme ve analizi
Stereotaktik çerçeve Shenzhen RWD Yaşam Bilimleri A.Ş.68043
Vetbond Doku Yapıştırıcısı3M, St Paul, MN, ABD202402AXSütür hayvan yara
Y labirentShenzhen RWD Yaşam Bilimleri A.Ş.63005Fare uzamsal çalışma belleğini değerlendirin
220502 içinde yeniden yapılandırılmıştır.2023090501SC230724B

Kaynaklar

  1. Jiang, J. Y., et al. Traumatic brain injury in china. Lancet Neurol. 18 (3), 286-295 (2019).
  2. Naumenko, Y., Yuryshinetz, I., Zabenko, Y., Pivneva, T. Mild traumatic brain injury as a pathological process. Heliyon. 9 (7), e18342(2023).
  3. Zhao, Q., Zhang, J., Li, H., Li, H., Xie, F. Models of traumatic brain injury-highlights and drawbacks. Front Neurol. 14, 1151660(2023).
  4. Grant, D. A., et al. Repeat mild traumatic brain injury in adolescent rats increases subsequent β-amyloid pathogenesis. J Neurotrauma. 35 (1), 94-104 (2018).
  5. Clark, A. L., et al. Repetitive mtbi is associated with age-related reductions in cerebral blood flow but not cortical thickness. J Cereb Blood Flow Metab. 41 (2), 431-444 (2021).
  6. Mcallister, T., Mccrea, M. Long-term cognitive and neuropsychiatric consequences of repetitive concussion and head-impact exposure. J Athl Train. 52 (3), 309-317 (2017).
  7. Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M. Animal models of traumatic brain injury. Nat Rev Neurosci. 14 (2), 128-142 (2013).
  8. Pham, L., et al. proteomic alterations following repeated mild traumatic brain injury: Novel insights using a clinically relevant rat model. Neurobiol Dis. 148, 105151(2021).
  9. Fehily, B., Fitzgerald, M. Repeated mild traumatic brain injury: Potential mechanisms of damage. Cell Transplant. 26 (7), 1131-1155 (2017).
  10. Ma, X., Aravind, A., Pfister, B. J., Chandra, N., Haorah, J. Animal models of traumatic brain injury and assessment of injury severity. Mol Neurobiol. 56 (8), 5332-5345 (2019).
  11. Freeman-Jones, E., Miller, W. H., Work, L. M., Fullerton, J. L. Polypathologies and animal models of traumatic brain injury. Brain Sci. 13 (12), 1709(2023).
  12. Petersen, A., Soderstrom, M., Saha, B., Sharma, P. Animal models of traumatic brain injury: A review of pathophysiology to biomarkers and treatments. Exp Brain Res. 239 (10), 2939-2950 (2021).
  13. Ouyang, W., et al. Modified device for fluid percussion injury in rodents. J Neurosci Res. 96 (8), 1412-1429 (2018).
  14. Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat Protoc. 5 (2), 201-208 (2010).
  15. Liu, Y., Fan, Z., Wang, J., Dong, X., Ouyang, W. Modified mouse model of repeated mild traumatic brain injury through a thinned-skull window and fluid percussion. J Neurosci Res. 101 (10), 1633-1650 (2023).
  16. Bolton-Hall, A. N., Hubbard, W. B., Saatman, K. E. Experimental designs for repeated mild traumatic brain injury: Challenges and considerations. J Neurotrauma. 36 (8), 1203-1221 (2019).
  17. Aleem, M., Goswami, N., Kumar, M., Manda, K. Low-pressure fluid percussion minimally adds to the sham craniectomy-induced neurobehavioral changes: Implication for experimental traumatic brain injury model. Exp Neurol. 329, 113290(2020).
  18. Katz, P. S., Molina, P. E. A lateral fluid percussion injury model for studying traumatic brain injury in rats. Methods Mol Biol. 1717, 27-36 (2018).
  19. Xiong, B., et al. Precise cerebral vascular atlas in stereotaxic coordinates of whole mouse brain. Front Neuroanat. 11, 128(2017).
  20. Hoogenboom, W. S., et al. Evolving brain and behaviour changes in rats following repetitive subconcussive head impacts. Brain Commun. 5 (6), 316(2023).
  21. Lipton, M. L., et al. Soccer heading is associated with white matter microstructural and cognitive abnormalities. Radiology. 268 (3), 850-857 (2013).
  22. Rubin, T. G., et al. Mri-defined white matter microstructural alteration associated with soccer heading is more extensive in women than men. Radiology. 289 (2), 478-486 (2018).
  23. Mcinnes, K., Friesen, C. L., Mackenzie, D. E., Westwood, D. A., Boe, S. G. Mild traumatic brain injury (mtbi) and chronic cognitive impairment: A scoping review. PLoS One. 12 (4), e0174847(2017).
  24. Marschner, L., et al. Single mild traumatic brain injury results in transiently impaired spatial long-term memory and altered search strategies. Behav Brain Res. 365, 222-230 (2019).
  25. Hoogenboom, W. S., Branch, C. A., Lipton, M. L. Animal models of closed-skull, repetitive mild traumatic brain injury. Pharmacol Ther. 198, 109-122 (2019).
  26. Cunningham, J., Broglio, S. P., O'grady, M., Wilson, F. History of sport-related concussion and long-term clinical cognitive health outcomes in retired athletes: A systematic review. J Athl Train. 55 (2), 132-158 (2020).
  27. Fidan, E., et al. Repetitive mild traumatic brain injury in the developing brain: Effects on long-term functional outcome and neuropathology. J Neurotrauma. 33 (7), 641-651 (2016).
  28. Nguyen, T., et al. Repeated closed-head mild traumatic brain injury-induced inflammation is associated with nociceptive sensitization. J Neuroinflammation. 20 (1), 196(2023).
  29. Ren, H., et al. Enriched endogenous omega-3 fatty acids in mice ameliorate parenchymal cell death after traumatic brain injury. Mol Neurobiol. 54 (5), 3317-3326 (2017).
  30. Lillie, E. M., Urban, J. E., Lynch, S. K., Weaver, A. A., Stitzel, J. D. Evaluation of skull cortical thickness changes with age and sex from computed tomography scans. J Bone Miner Res. 31 (2), 299-307 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Düzeltme


Formal Correction: Erratum: Modified Mouse Model of Repetitive Mild Traumatic Brain Injury Incorporating Thinned-Skull Window and Fluid Percussion
Posted by JoVE Editors on 6/04/2025. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/66440

Daha fazla makale keşfet

Tekrarlayan Beyin HasarıFare TBI ModeliSıvı Perküsyon HasarıKapalı Kafa TravmasıNöropatoloji MekanizmalarıDavranışsal AnalizHistolojik AnalizHematoksilen Eozin Boyama
İnceltilmiş kafatası penceresi ve sıvı perküsyonu içeren tekrarlayan hafif travmatik beyin hasarının modifiye edilmiş fare modeli
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.