İnceltilmiş kafatası penceresi ve sıvı perküsyonu içeren tekrarlayan hafif travmatik beyin hasarının modifiye edilmiş fare modeli

Özet

Bu protokol, kapalı kafa travması (CHI) yöntemiyle indüklenen tekrarlayan hafif travmatik beyin hasarının (rmTBI) modifiye edilmiş bir fare modelini sunar. Yaklaşım, meninkslere maruz kalmanın yaygın olarak neden olduğu iltihabı azaltmak için inceltilmiş bir kafatası penceresi ve sıvı perküsyonunun yanı sıra kemirgenlerde rmTBI modellemesinde gelişmiş tekrarlanabilirlik ve doğruluk içerir.

Özet

Hafif travmatik beyin hasarı klinik olarak oldukça heterojen bir nörolojik bozukluktur. Hafif TBH sonrası nöropatoloji mekanizmalarını incelemek ve terapötikleri test etmek için iyi tanımlanmış patolojilere sahip yüksek oranda tekrarlanabilir travmatik beyin hasarı (TBH) hayvan modellerine acilen ihtiyaç vardır. TBH'nin tüm sekellerini hayvan modellerinde çoğaltmanın zor olduğu kanıtlanmıştır. Bu nedenle, TBH hastalarında görülen çeşitli yönleri ve ciddiyetleri hesaba katmak için TBH'nin birden fazla hayvan modelinin mevcudiyeti gereklidir. CHI, rmTBI'nin kemirgen modellerini üretmek için en yaygın yöntemlerden biridir. Bununla birlikte, bu yöntem, kullanılan darbe yöntemi, kafatası kemiğinin kalınlığı ve şekli, hayvan apnesi ve kullanılan kafa desteği ve immobilizasyon türü dahil olmak üzere birçok faktöre karşı hassastır. Bu protokolün amacı, CHI ile ilişkili rmTBI'nin kesin bir fare modelini üretmek için inceltilmiş kafatası penceresi ve sıvı perküsyon yaralanması (FPI) yöntemlerinin bir kombinasyonunu göstermektir. Bu protokolün birincil amacı, kafatası kemiği kalınlığı, şekli ve kafa desteği dahil olmak üzere CHI ve FPI modellemesinin doğruluğunu ve tutarlılığını etkileyebilecek faktörleri en aza indirmektir. İnceltilmiş bir kafatası penceresi yöntemi kullanılarak, kraniyotomi ve FPI'ye bağlı potansiyel iltihaplanma en aza indirilir ve hafif TBH'li hastalarda gözlenen klinik özellikleri kopyalayan gelişmiş bir fare modeli elde edilir. Hematoksilen ve eozin (HE) boyama kullanılarak yapılan davranış ve histolojik analizden elde edilen sonuçlar, rmTBI'nin beynin hem davranışında hem de brüt morfolojisinde değişiklikler üreten kümülatif bir yaralanmaya yol açabileceğini düşündürmektedir. Genel olarak, modifiye edilmiş CHI ile ilişkili rmTBI, araştırmacıların rmTBI'daki fokal ve diffüz patofizyolojik değişikliklere katkıda bulunan altta yatan mekanizmaları keşfetmeleri için yararlı bir araç sunar.

Giriş

Beyin sarsıntısı ve alt beyin sarsıntısı dahil olmak üzere hafif TBH, tüm TBH vakalarının çoğunluğunu oluşturur (tüm TBH'lerin %>80'i)¹. Hafif TBH genellikle düşmelerden, trafik kazalarından, şiddet eylemlerinden, temas sporlarından (örneğin, futbol, boks, hokey) ve askeri mücadeleden kaynaklanır ^2,3. Hafif TBH, hastanın yaşamı boyunca nörodavranışsal işlevleri etkileyen ve nörodejeneratif hastalık riskini artıran nörobiyolojik olaylara yol açabilir ^4,5,6. Hayvan modelleri, hafif TBH'nin tanı ve tedavisini daha da geliştirme umuduyla hafif TBH'yi incelemek için verimli ve kontrollü bir yol sağlar. Hafif TBI için kontrollü kortikal etki (CCI), ağırlık düşüşü (WD), sıvı perküsyon yaralanması (FPI) ve blast-TBI modelleri ^7,8 gibi çeşitli modeller geliştirilmiştir. Tek bir deneysel model, TBH'nin neden olduğu patolojinin tüm karmaşıklığını taklit edemez ^9,10. Bu modellerin heterojenliği, hafif TBH hastaları ile ilişkili çeşitli özellikleri ele almak ve karşılık gelen hücresel ve moleküler mekanizmaları araştırmak için avantajlıdır. Bununla birlikte, TBH'nin her bir hayvan modelinin, hafif hayvan TBH'si ve bunların klinik önemi ile ilgili mevcut bilgilerimizi sınırlayan sınırlamaları³ vardır.

WD ve CCI modelleri, serebral doku kaybı, akut subdural hematom, aksonal yaralanma, beyin sarsıntısı, kan-beyin bariyeri disfonksiyonu ve hatta TBI ^3,11,12'yi takiben koma gibi klinik durumları çoğaltmak için kullanılır. WD modeli, dura mater veya kafatasına serbestçe düşen ağırlıklarla vurarak beyin hasarına neden olmayı içerir. Ağırlıklı bir nesnenin sağlam bir kafatası üzerindeki etkisi, karışık odak/yaygın yaralanmaları çoğaltabilir; Bununla birlikte, bu yöntem, yaralanma bölgesinin zayıf doğruluğu ve tekrarlanabilirliği, geri tepme yaralanması ve kafatası kırıklarına bağlı daha yüksek mortalite oranı ile ilişkilidir ^3,11,12. CCI modeli, açıkta kalan dura materini doğrudan etkilemek için hava tahrikli metal uygulanmasını içerir. WD modeliyle karşılaştırıldığında, CCI modeli daha doğru ve tekrarlanabilirdir, ancak çarpma ucunun¹¹ küçük çapı nedeniyle yaygın yaralanmaya neden olmaz. FPI modellemesi sırasında, beyin dokusu perküsyon ile kısa bir süre yer değiştirir ve deforme olur. FPI, karışık fokal / diffüz yaralanmaya neden olabilir ve TBH'den sonra intrakraniyal kanama, beyin şişmesi ve ilerleyici gri madde hasarını çoğaltabilir. Bununla birlikte, FPI, beyin sapı hasarı ve uzamış apne nedeniyle yüksek bir mortalite oranına sahiptir ^3,12. Konvansiyonel WD, CCI ve FPI modellerinde yer alan kraniyotomi, kortikal kontüzyon, hemorajik lezyonlar, kan-beyin bariyerinin hasarı, immün hücre infiltrasyonu, glial hücre aktivasyonu, uzamış modelleme süresi ve olası ölümcül sonuçlara yol açabilir ^3,12.

Hafif TBH, 13 ila 15² aralığında bir GCS (Glasgow koma ölçeği, GCS) skoru ile karakterizedir. Hafif TBH fokal veya yaygın olabilir ve hücresel homeostazın bozulması, eksitotoksisite, glikoz tükenmesi, mitokondriyal disfonksiyon, kan akışı bozukluğu ve aksonal hasar gibi akut yaralanmaların yanı sıra aksonal hasar, nöroinflamasyon ve gliozis dahil olmak üzere subakut yaralanmalarla ilişkilidir ^2,3. TBH'nin karmaşık patofizyolojisini tanımlamada önemli ilerlemeye rağmen, hafif TBH / rmTBH'nin altta yatan mekanizmaları belirsizliğini korumaktadır ve daha fazla araştırma gerektirmektedir⁹. CHI'nin en yaygın TBI¹² türü olduğu göz önüne alındığında, bu protokol, inceltilmiş bir kafatası penceresinde¹³ etki gerçekleştirmek için modifiye edilmiş bir FPI cihazı kullanarak rmTBI'nin daha hassas bir şekilde kontrol edilen bir fare modeli oluşturmak için yeni bir yaklaşım sunar. Bu yaklaşım, kraniyotomi kaynaklı yaralanmalardan, değişken kafatası kalınlığından ve şekil kaynaklı yanlışlıklardan ve geri tepme yaralanmalarından kaçınarak, WD, CCI ve FPI modelleriyle ilişkili ana dezavantajların üstesinden gelmeyi amaçlamaktadır. İnceltilmiş kafatası penceresine FPI etkisi uygulamak, rmTBI'yi takiben serebral damar hasarını değerlendirmek için uygundur ve bazı modellerde yüksek mortalite oranlarını en aza indirmeye yardımcı olur, bu da TBH hastalarının klinik özelliklerine daha yakın bir benzerlik sağlar.

Protokol

Bu protokolde yer alan tüm prosedürler, Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi onayı (Zhejiang Normal Üniversitesi, İzin Numarası, dw2019005) ve ARRIVE ve NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Teknik özellikler Malzeme Tablosunda bulunabilir.

1. Hayvan taşıma prosedürü

1. 22-24 °C sıcaklık, %40-%60 arasında değişen nem, 12 saatlik aydınlık/karanlık döngüsü ile kontrollü bir ortamda fareleri barındırır ve suya ve standart fare yemeğine ad libitum erişim sağlar. Bu deneyin amacı için, 25 ICR erkek faresi (25-30 g, 8 haftalık) kullanıldı.
2. Fareleri rastgele olarak kontrol grubuna (n = 12) veya rmTBI grubuna (n = 13) tahsis edin. Sahte farelerin rmTBI uygulanan farelere karşı olası saldırganlığını önlemek için, onları farklı kafeslere ayırın.
3. Deneye başlamadan önce farelere kafes ortamlarına alışmaları için en az 1 hafta süre verin. Bu alışma dönemi, farelerin çevrelerine aşina olmalarını sağlar ve çalışma sırasında stres veya kaygının fizyolojik veya davranışsal tepkiler üzerindeki potansiyel etkilerini en aza indirir.

2. TBI cihazının hazırlanması

1. Değiştirilmiş bir FPI cihazı kullanarak farelerde rmTBI modelini üretin (bkz. Şekil 1A) ¹³. FPI cihazını kullanmadan önce, silindir ile boru arasındaki ve üç konektör ile boru arasındaki bağlantılara özellikle dikkat ederek tüm bağlantılarda sızıntı veya çatlama belirtileri olup olmadığını dikkatlice inceleyin. Darbe basınçlarını doğru bir şekilde belirlemek için, sıvı perküsyon yaralanma cihazı¹³ üzerindeki çarpma noktasına bir basınç dönüştürücü monte edildi.
2. Pistonun silindir içinde düzgün bir şekilde hareket ettiğinden ve darbelerin etkili bir şekilde gerçekleştirilebildiğinden emin olmak için FPI cihazını dikkatli bir şekilde inceleyin (Şekil 1B). Sistemde hava kabarcığı olmadığını doğrulayın. Hava kabarcıkları tespit edilirse, 50 mL'lik bir şırınga kullanarak sisteme dikkatlice damıtılmış su ekleyin ve silindir çubuğunu yakındaki 3 bir konektörden ve/veya şırıngadan hızlı bir şekilde iterek hava kabarcıklarını dışarı atın.
   NOT: FPI sistemi, silindir ve bağlı boru içindeki damıtılmış sudan oluşur. Sonuçların doğruluğunu ve güvenilirliğini sağlamak için çalıştırmadan önce cihazı kalibre etmek çok önemlidir.

3. İnceltilmiş kafatası hazırlığı

NOT: Hayvan cerrahisi ve inceltilmiş kafatası hazırlığı, diğer fareler göz önünde bulundurularak yapılmamalıdır. İnceltilmiş kafatası penceresi, bir FPI prosedürünü takiben serebral damar hasarını değerlendirmek için kullanışlıdır.

1. Deney operatörüne tüm hayvan taşıma prosedürleri sırasında steril bir önlük ve maske takması talimatını vererek hayvan merkezinin gereksinimlerine uyun.
2. %70 etanol sprey kullanarak deneye başlamadan önce laboratuvar tezgahını, FPI cihazını, anestezik boruyu ve bitişik tezgah boşluğunu sterilize edin.
3. Ameliyattan önce hem sahte hem de rmTBI gruplarındaki fareleri tartın ve ağırlıklarını deneyden 1 hafta önce kaydedilenlerle karşılaştırın. Kaba kürk manto, ishal, kilo kaybı veya uyuşukluk gibi kötü sağlık sergileyen herhangi bir fareyi çalışmadan çıkarın. Ek olarak, tekrarlanan darbelere tahammül edebilmelerini sağlamak için 20 g'dan daha hafif olan fareleri hariç tutun. Bu önlemler, hayvan refahının korunmasında ve güvenilir deneysel sonuçların sağlanmasında çok önemlidir.
4. Fareleri bir indüksiyon odasında 3-4 dakika boyunca% 4 -% 5 izofluran (1 L / dak akış hızında% 100 oksijende) ile uyuşturun. Ameliyat boyunca yağlamayı sürdürmek için hayvanın gözlerine oftalmik bir kayganlaştırıcı ( Malzeme Tablosuna bakınız) uygulayın. Ağrıyı hafifletmek için, anesteziden 20 dakika önce kulakları arasındaki orta noktada ve daha sonra her 6 saatte bir 24 saat boyunca deri altından (0.05 mg / kg) buprenorfin uygulayın. Ayrıca, anestezinin sonunda, her hayvana tek bir deri altı 5 mg / kg karprofen dozu uygulayın.
5. Fare sağ ve pedal çekme reflekslerini kaybettikten sonra kafayı dezenfekte edin. Cerrahi makas kullanarak farenin kafasındaki kürkü kesin ve kalan kürkü çıkarmak için bir tıraş makinesi kullanın. Saç derisini,% 75 etanol fırçaları ile serpiştirilmiş% 2 klorheksidin üç ardışık uygulama ile dezenfekte edin.
6. Uygun hijyeni sağlamak için hayvanın ve çevresinin altına tek kullanımlık steril bir cerrahi ped yerleştirin. Cerrahi bölgeyi tamamen ortaya çıkarmak için farenin kafa derisinin orta hattı boyunca ince küçük bir cerrahi makas kullanarak 1,5 cm'lik bir kesi yapın (Şekil 2A).
7. Geleneksel bir stereotaksik çerçevede terminal olmayan kulak çubukları kullanarak fareyi sabitleyin (bkz. Fare kafasının konumunu, araştırılacak belirli hedef alana göre stereotaksik bir çerçevede düz bir seviyede veya hafif eğimli bir açıda ayarlayın. Daha sonra iltihaplanmayı önlemek için cerrahi bölgedeki kürkü temizleyin.
8. Geleneksel bir izotermal ısıtma yastığı kullanarak farenin vücut sıcaklığını 37 °C'de tutun (bkz. Malzeme Tablosu).
9. Cerrahi ve darbe göbeği (dişi Luer Kilidi) kurulum işlemi sırasında, kalibre edilmiş bir buharlaştırıcı tarafından düzenlenen sürekli% 2'lik bir izofluran konsantrasyonu sağlayan bir burun konisi ile fare anestezisini (ayak parmağı veya kuyruk sıkışmasına yanıt vermeden) koruyun.
10. İnceltilmiş kafatası penceresinin etrafındaki cerrahi alanı, tuzlu suyla ıslatılmış steril bir pamuklu çubuk kullanarak dikkatlice temizleyin.
11. Düz uçlu bir mikro matkap ucu (bkz. Malzeme Tablosu, Şekil 2B) ve bir mikrocerrahi bıçak kullanarak sağ frontal motor kortekste yaklaşık 2,5 mm çapında ve 20 μm kalınlığında inceltilmiş bir kafatası penceresi oluşturun. Cerrahi bölgeyi bregmanın 1.5 mm önünde ve orta hattın 1.3-2.0 mm yanında konumlandırın (Şekil 2C).
    1. İnceltilmiş kafatası penceresinin oluşturulması sırasında mikro matkabın kafatasına nüfuz etmesini önlemek için, mikro matkapla taşlama yaparken kafatasını aralıklı olarak tuzlu su ile nemlendirin.
    2. İnceltilmiş kafatasını ince bir şırınga iğnesinin düzleştirilmiş ucuyla nazikçe incelterek ve yumuşaklığını değerlendirerek kafatasının kalınlığını onaylayın. Kafatasının kalınlığını belirlemek için maruz kalan kortikal mikro damarların netliğini görsel olarak tahmin edin.
    3. Kafatasının kalınlığını doğrulamak için, inceltilmiş alana steril salin uygulayın ve geleneksel bir diseksiyon mikroskobu kullanarak görsel olarak inceleyin (bkz. Malzeme Tablosu). Bu teknik, kafatasının yeterince inceltildiğinden emin olmaya yardımcı olabilir.
       NOT: Kurumayı önlemek için tüm inceltilmiş kafatası hazırlığı ve rmTBI modelleme prosedürü boyunca fare gözünü yağlayın. Kafatasının 15 μm'den daha az inceltilmesi, hafif kortikal travma riski taşır ve bu da hafif kortikal iltihaplanma ile sonuçlanabilir¹⁴.
12. İnceltilmiş kafatası bölgesine ayarlanmış bir dişi Luer Kilidi ( Şekil 2.2D'de gösterildiği gibi 19G iğne göbeğinden oluşturulan 2 mm iç çap) takın. Luer Lock'u tutkal ve diş çimentosu ile sabitleyin (Şekil 2E).
    NOT: Dişi Luer kilidini inceltilmiş kafatası penceresinin etrafındaki alana sabitlemek için yapıştırıcı kullanırken, kafatası bölgesini iyice kurutmak ve yapıştırıcının pencerenin kendisine girmesini önlemek çok önemlidir. Pencere içindeki yapıştırıcı, FPI'nin darbe kuvvetini önemli ölçüde azaltabilir.

4. CHI ile ilişkili rmTBI modelleme prosedürü

1. Daha önce açıklandığı gibi modifiye edilmiş bir FPI cihazı ile yanal sıvı perküsyon yöntemini kullanarak rmTBI'yi tanıtın^13,15.
2. İnceltilmiş kafatası penceresi ve darbe göbeği prosedürlerini tamamladıktan sonra, fareyi stereotaksik cihazdan çarpma tertibatı platformuna aktarın.
3. Anestezinin perküsyon sonrası hayvan düzeltme refleks süresi ve yaralanma şiddeti üzerindeki potansiyel etkileri göz önüne alındığında ^9,16, palpebral ve pençe çekilme reflekslerini değerlendirerek anestezi derinliğini izleyin (Şekil 2F).
4. İnceltilmiş kafatası penceresine yapıştırılan dişi Luer Kilidini, FPI cihaz hortumunun ucundaki erkek Luer Kilidine bağlayın (Şekil 2G).
   NOT: rmTBI modellemesinde, farelerde izofluran ile indüklenen anestezi, apne indüksiyonu ve perküsyon ile bilinç kaybı nedeniyle uzatıldı.
5. Modifiye edilmiş cihazla iki hafif TBI (48 saat aralıkla) tanıtın. İnceltilmiş kafatası pencere ameliyatını tamamladıktan ve Luer Lock'u taktıktan hemen sonra ilk FPI etkisini uygulayın. FPI etkisini yalnızca fare her seferinde bir pençe tutamına geri çekilme refleksinin geri döndüğünü gösterdiğinde uygulayın (Şekil 2H). Derin anestezi uygulanmış farelerde FPI etkisi uygulamak, uzun süreli apne ve ölüme neden olabilir.
   1. FPI etkisini uygulamak için, sarkacı cihaz üzerindeki iletki boyunca belirtilen dereceye kadar kaldırın ve yazılım kontrolünü^13,15 kullanarak sarkacı serbest bırakın. Etki, kemirgen çalışmalarında kullanılan yerleşik protokolleri izleyerek 2.0 ± 0.1 atm'lik bir perküsyon yoğunluğuna ulaşmalıdır 10,17,18. Etki 1.9-2.1 atm arasında kaydedilmediyse veya FPI sırasında kafatası kırığı meydana geldiyse hayvanları daha ileri testlerden hariç tutun.
   2. Sahte fareler için, bunları cihaza sabitleyin, ancak darbeyi vermeyin.
6. Çarpmanın ardından, Luer Lock bağlantısını hemen ayırın ve fareleri geri kazanım için izotermal bir ısıtma yastığına aktarın. Fare uyanıklığını ve bilincini geri kazandıktan sonra, dişi Luer kilidini çıkarmadan onu ev kafesine geri koyun. İkinci FPI etkisini aynı şekilde 48 saat sonra uygulayın.
7. RmTBI'dan sonra dişi Luer kilidini ve diş çimentosunu dikkatlice çıkarın. Doku yapıştırıcısı kullanarak kafa derisini dikin ve yapıştırma işlemini kolaylaştırmak için kafa derisini sıkıştırmak için düz forseps kullanın (bkz . Şekil 2I).
8. Enflamasyonu, enfeksiyonu önlemek ve ameliyat sonrası ağrı ve rahatsızlığı hafifletmek için, yaraya 1: 1 oranında eritromisin ve sodyum diklofenak merhem karışımı uygulayın ( Malzeme Tablosuna bakınız). Fareleri geri kazanım için izotermal bir ısıtma yastığına aktarın.
9. Fare stereotaksik aparattan çıkarıldığında ve FPI için çarpma platformuna yanal olarak yerleştirildiğinde başlayan ve fare bağımsız olarak dik durabilene kadar devam eden doğrultma refleksinin süresini kaydedin.
10. Fare uyanıklığını ve bilincini geri kazandıktan sonra, onu ev kafesine geri koyun. Fareler tipik olarak tamamen bilinçlidir ve yaralanmadan sonraki 1,5 saat içinde yürüyebilirler.
11. TBI modellemesini takip eden günlerde, fareleri solunum paternleri, burun ve ağız çevresinde mukus varlığı ve kızarıklık, şişme, eksüdalar veya yara bölgesinin yeniden açılması gibi çeşitli belirtiler açısından gözlemleyin. Yukarıdaki anormal semptomlardan bir veya daha fazlasına sahip hayvanları çalışmadan çıkarın.
    NOT: AAV-GCaMP6'ların ön mikroenjeksiyonu, iki fotonlu lazer tarama mikroskobu¹⁵ kullanılarak inceltilmiş kafatası penceresinden yaralı kortekste altta yatan nöronal Ca2+ homeostazının ve uyarılabilirliğin gözlemlenmesine izin verir.

5. Morris su labirenti (MWM) testi

NOT: MWM ( Materyal Tablosuna bakınız), TBH'yi takiben farelerde uzamsal öğrenme ve hafıza eksikliklerini değerlendirmek için yaygın olarak tanınan bir yöntemdir.

1. MWM testini yaralanmadan 7 gün sonra (DPI) başlayarak yapın. MWM'nin dairesel havuzu 120 cm çapında ve 50 cm yüksekliğindeydi ve su sıcaklığı 25 °C'de tutuldu. Dairesel havuzu, kuzeydoğu çeyreğinde su yüzeyinin 1 cm altına batırılmış, 6 cm çapında ve 30 cm yüksekliğinde yuvarlak bir platform olan kaçış platformu ile dört çeyreğe ayırın.
2. Farelerin hareket yörüngesini kaydetmek için bir kamerayı doğrudan dairesel havuzun üzerine yerleştirin. Görüntü alma yazılımı tarafından tanınmayı kolaylaştırmak ve gecikme, yüzme mesafesi ve hareket yörüngesi dahil olmak üzere veri kaydı için fareleri sırtlarında siyah bantla işaretleyin.
3. Fareleri, her kadran için bir kez olmak üzere, dört kadranın her birinin iç duvarına bakacak şekilde suya yerleştirin. Fareler platformu bulduktan sonra 10 saniye orada dinlenmelerine izin verin. Bir fare platformu 60 saniye içinde bulamazsa, operatörden fareyi platforma yönlendirmesini, 10 saniye boyunca platformda dinlenmesine izin vermesini ve ardından fareyi dinlenmek için ev kafesine geri koymasını isteyin.
4. Her fare için edinme denemesini günde 4 kez tekrarlayın. Edinme denemelerinin ardından, 12 DPI'da, 60 s'lik bir uzamsal prob deneyi yapın ve farelerin orijinal platform alanını kaç kez geçtiğini ve farenin platformun bulunduğu kadranda kalma süresini kaydedin.
5. Her denemeden sonra, DPI 7'den DPI 11'e kadar 60 s edinme denemesi sırasında vücut sıcaklıklarını korumak ve hipotermiyi önlemek için fareleri bir havluyla hızlı bir şekilde kurulayın veya bir ısıtma lambasının altına yerleştirin.
6. Yukarıda özetlenen deneysel prosedürlerin tamamlanmasından sonra, fareleri 13 DPI'da pentobarbital (45 mg / kg, ip) ile uyuşturun. İzotonik salini transkardiyal olarak perfüze edin, ardından fosfat tamponlu salin (pH 7.2) içinde% 4 paraformaldehit ile perfüzyon yapın. Brüt kortikal ve hipokampal morfoloji değişikliklerini değerlendirmek için geleneksel HE boyama için beyinleri alın. HE boyama protokolünün ayrıntılı bir açıklaması önceki yayınlarda^{bulunabilir 13,15}.
7. Tüm deneyler tamamlandıktan sonra, fare örneği gerekmiyorsa, aşırı dozda pentobarbital (≥100 mg / kg, i.p.) enjeksiyonu ile fareye ötenazi yapın. Mendilleri toplamadan veya karkası atmadan önce, fareyi en az 60 saniye boyunca kalp atışı olmayana kadar izleyin.

Sonuçlar

Bu çalışmada açıklanan protokol, konvansiyonel perküsyon TBI modellemesi sırasında kraniyotomi hazırlığının neden olduğu beyin hasarına bir çözüm sunan, inceltilmiş bir kafatası penceresinden rmTBI'yi indüklemek için bir yöntemi özetlemektedir. Bu modifiye edilmiş sıvı perküsyon prosedürünü modifiye edilmiş cihazla kullanarak, FPI etkisinin gelişmiş hassasiyeti ve tekrarlanabilirliği elde edildi¹³. Modifiye edilmiş çarpma tertibatı, kafatası kraniyotomisi olsun veya olmasın, hem CHI hem de FPI modellemesi için kullanılabilecek çok yönlülüğe sahiptir. Ayrıca, yaralanmanın ciddiyeti, çarpma sarkacının düşme açısı gibi yaralanma parametrelerinin ayarlanması veya piston direğinin uç plakasına değişen sertlikte ek kapalı hücreli etilen-vinil asetat köpük pedleri eklenmesiyle modüle edilir.

Modifiye rmTBI modeli, meningeal maruziyetten ve/veya parankimde doğrudan FPI'den kaynaklanan iltihabı en aza indiren kortikal duralı açığa çıkarmadan fokal ve diffüz patoloji üretmek gibi önemli avantajlar sağlar. Ayrıca, bu model, güvenilir yaralanma sonuçları elde etmek için kafatası kemiği kalınlığı ve şeklindeki değişiklikleri azaltır. Bu nedenle, modifiye edilmiş rmTBI modeli, farklı yaralanma derecelerinde klinik olarak anlamlı sarsıntı sonrası semptomlar (PCS) ile ilişkili nöropatolojik ve davranışsal eksiklikleri simüle etmede etkili ve güvenilirdir. Özellikle, bu model, özellikle hafif TBH ile ilgili mekanizmaları araştırmak için, hayvan TBI modellerinin doğruluğuna ve tekrarlanabilirliğine dayanan TBH patolojik mekanizmalarını araştırmak için yararlıdır.

İnceltilmiş kafatasının altında yer alan fare orta serebral arteri ve kaudal rinal ven^19'un ön yan dalı, kameranın altında net bir görselleştirmeye izin verdi. Her biri yaklaşık 2.0 atm basınçta olan iki rmTBI perküsyonunun ardından, tüm fareler 0 DPI'da subdural hematom sergiledi. İnceltilmiş kafatasının bütünlüğü tehlikeye atılmış gibi görünmese de; bununla birlikte, daha önce bildirildiği gibi, mikrovasküler sistem morfolojisindeki değişikliklerin yanı sıra mikrodamar sayısında bir azalma gözlenmiştir (Şekil 2H)¹⁵. 2 DPI ile hematomlar büyük ölçüde düzeldi. Mortalite, öncelikle fare derin anestezi altındayken alınan darbeden kaynaklanır ve bu da apneyi önemli ölçüde uzatabilir. Palpebral ve pençe çekme refleksleri yoluyla çarpmadan önce anestezi derinliğinin düzenli olarak değerlendirilmesi mortaliteyi önemli ölçüde azaltabilir. Sıvı perküsyonundan sonra ölüm oranlarını etkileyebilecek ek faktörler arasında fare suşu, kafatası sertliği, cinsiyet ve yaş bulunur. Aynı rmTBI protokolünü kullanan önceki bir çalışmada, bir C57BL / 6J faresi¹⁵ ölmüştü. Bu protokolde, tüm prosedürleri tanıtmak için sadece erkek ICR fareleri kullanıldı.

Hem insan hem de hayvan çalışmaları, tekrarlayan beyin sarsıntısı geçiren kafa darbelerinin bile yaygın mikroyapısal beyaz cevher yaralanmalarına^{neden olabileceğini göstermiştir 20,21,22}, bu da daha kötü bilişsel performans ile ilişkilidir^21,22. 7-12 DPI'da rmTBI, MWM paradigması kullanılarak incelenen uzamsal öğrenme ve hafızada bozukluklar üretebilir. Şekil 4, bu değerlendirmeden elde edilen sonuçları göstermektedir.

MWM'deki son satın alma denemesinin analizi, kontrol grubuna kıyasla rmTBI farelerinin batık platforma ulaşma gecikmesinde önemli bir artış (p< 0.05) gösterdi. Prob çalışmasında, orijinal platform kadranında harcanan zaman yüzdesinin analizi, rmTBI grubunda kontrol grubuna göre önemli bir azalma (p<0.01) gösterdi, bu da rmTBI'li farelerde uzamsal referans öğrenme ve hafıza yeteneklerinde bir düşüşe işaret etti.

Burada açıklanan yöntem,^C57BL /6J fareleri kullanılarak daha önceki bir yayında 15 kullanılmıştır. MWM'den ayrı olarak, aşağıda açıklandığı gibi üç ek analiz yapılmıştır.

OFT, ortalama seyahat hızını, kat edilen toplam mesafeyi ve merkez bölgelerde kat edilen mesafenin yüzdesini ölçerek hareket ve keşif yeteneklerini değerlendirmek için kullanıldı. Farelerde hareket, keşif ve kaygıyı değerlendirmek için 6 DPI'da bir Açık Alan testi (OFT) yapın. 40 x 40 x 40 cm ölçülerinde test cihazı, 16 bölgeye ayrılmıştır (her biri 18 x 18 cm ölçülerinde). Fare, cihazın ortasına yerleştirildi ve 5 dakika boyunca serbestçe keşfetmesine izin verildi. Merkez 4 bölgede kat edilen mesafe, toplam kat edilen mesafe, ortalama hareket hızı ve sınır bölgelerinde geçirilen süre kayıt altına alındı. Anksiyete düzeyleri, merkezi bölgelerde kat edilen mesafenin yüzdesine ve 5 dakikalık bir gözlem süresi boyunca sınır bölgelerinde kemirgenlerin geçirdiği süreye göre değerlendirildi. 6 DPI'da, rmTBI farelerin genel lokomotif yetenekleri üzerinde önemli bir etkiye sahip olmayabilir, Şekil 4^15'te gösterildiği gibi önemli bir kaygıya neden olabilir ve keşif davranışını değiştirebilir. Ayrıca, modifiye edilmiş rmTBI modeli, bu protokolde açıklanan bilişsel yetenek testi gibi ek davranışsal testlerle değerlendirilebilen yaygın aksonal yaralanmalara neden olur.

RmTBI'nin, Şekil 5^15'te gösterildiği gibi, farelerde uzamsal çalışmayı ve referans belleğini bozduğu gösterilmiştir. Bu bilişsel işlevler Y-labirent testi kullanılarak değerlendirildi. Test, farelerde kısa süreli çalışma belleği açıklarını ölçmek için 8 DPI'da gerçekleştirildi. Spontan değişim davranışı için: akrilik bir Y-labirent cihazı (20 cm yüksekliğinde, 50 cm uzunluğunda ve altta 10 cm genişliğinde) kullanıldı. Fareyi cihazın ortasına yerleştirip 8 dakika boyunca keşif yapmasına izin verdikten sonra kol girişleri kaydedildi. Spontan değişim davranışı, farenin üçlü setler üzerinde üç kola art arda girmesi olarak tanımlanır. Spontan değişim oranını (%) şu şekilde hesaplayın: (ardışık üçlü setler / toplam kol girişi sayısı eksi 2) x 100. Uzamsal referans belleği için, 8 dakikalık eğitim sırasında Y-labirent cihazının bir kolunu rastgele kapatın. İlk pozlamadan 1 saat sonra, fare üç kolu da açık olarak labirente yeniden sokulur ve 3 dakika boyunca serbestçe keşfetmesine izin verilir. Yeni kolu diğer iki kola karşı keşfetmek için harcanan zaman kaydedilir. Tercih indeksini, roman kolunda geçirilen süreye karşı her üç kolda da geçirilen süre olarak hesaplayın.

Ayrıca, tüm davranış testlerini tamamladıktan sonra beyindeki brüt yapısal lezyonların basit HE boyama (Şekil 6)¹⁵ kullanılarak değerlendirilmesini öneriyoruz. Lezyon bölgesine 1 mm önden lezyonun arka kenarına kadar koronal olarak kesitli kortikal bölge ve tipik hilal şeklindeki bölgede koronal olarak kesitli hipokampal bölge kullanın (Bregma: -1.7 ila -2.2 mm). Bir oküler ızgara (büyütme 400x) kullanarak altı rastgele alandan her slayttaki nöronları saymak ve nöronal sayının ortalamasını almak, görsel alan başına sayısal yoğunluğu (sayısal yoğunluk) sağladı. rmTBI'den etkilenen beyin bölgelerinin değişen derecelerde nöron yaralanmaları sergilediği bulundu¹⁵. Spesifik olarak, motor korteks, bu tür yaralanmaların hipokampustan daha güçlü ve çeşitli bir derecesini gösterdi. HE boyaması, normal nöronlardan piknotik morfolojiye doğru önemli bir kayma gösterdi (Şekil 6A, B, E, F). Ayrıca, ekstraselüler matriksin spesifik olarak lezyon bölgesinde gevşediği gözlendi (Şekil 6F). Gözlenen matris gevşemiş alanların yanı sıra, rmTBI fareleri, dentat girustaki önemli sayıda subgranüler nöronda ve bazı kortikal ve CA1 nöronlarında daha koyu kırmızı bir renk olarak görülen hiperkromik lekelenmede önemli bir artış gösterdi. Şaşırtıcı bir şekilde, bu boyama desenleri eşlik eden herhangi bir sitoplazmik büzülme veya piknotik çekirdek belirtisi göstermedi (Şekil 6C, D, G, H, K⁾¹⁵. Yukarıda bahsedilen davranışsal (WMM testi hariç) ve HE boyama yöntemleri, modifiye edilmiş rmTBI model^15'i tanıtan yakın tarihli bir yayında detaylandırılmıştır.

Şekil 1: Değiştirilmiş FPI cihazı ve yazılım ekran görüntüsü. (A) Değiştirilmiş FPI cihazı. (B) Ekran görüntüsü, FPI basınç dalga biçimini ve yükselme süresi, düşme süresi ve yarım genişlik süresi gibi gerçek zamanlı darbe basıncı parametrelerinin otomatik ölçümünü ve dışa aktarılmasını görüntüler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: ICR farelerinde rmTBI'nin modifiye edilmiş fare modeli. (A) Cerrahi alanı ortaya çıkarmak için orta hat insizyonu yapılır. (B) Motor korteks üzerinde inceltilmiş bir kafatası penceresi imal edildi. Açıkta kalan kortikal mikro damarların berraklığı, kafatasının kalınlığını belirlemek için kullanılır. (C) Kafatasının kalınlığı, inceltilmiş kafatasının ince bir şırınga iğnesinin düzleştirilmiş ucuyla nazikçe incelenmesi ve yumuşaklığının değerlendirilmesiyle de doğrulanabilir. (D) Dişi Luer Kilidi, inceltilmiş kafatası penceresine yapıştırılmıştı. (E) Takılan dişi Luer Kilidi, diş çimentosu uygulanarak sabitlendi. (F) Anestezi derinliği, palpebral ve pençe çekilme refleksleri kontrol edilerek izlendi. (G) FPI etkisi, bir geri çekilme refleksinin bir pençe tutamına geri dönmesinden sonra verildi. (H) 0 DPI'da inceltilmiş kafatası penceresinin rmTBI sonrası görüntüsü. (I) Kafa derisi doku yapıştırıcısı ile dikildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: ICR farelerinde rmTBI'nin uzamsal referans öğrenme ve hafıza üzerindeki etkileri. (A) 11 DPI'da kaydedilen son edinme denemesi sırasında fareler için gezinme izi, (B) 12 DPI'da kaydedilen sonda denemesindeki uzamsal araştırma rotası ve (C) farelerin son edinme denemesi sırasında platformu bulmak için geçen kaçış süresi. Sonuçlar, rmTBI grubunun gizli platforma ulaşmasının kontrol grubuna göre anlamlı derecede daha uzun sürdüğünü ortaya koydu (p<0.05). (D) Prob denemesi sırasında toplam navigasyon süresine göre orijinal platform kadranında harcanan zaman farelerinin yüzdesi, rmTBI grubunda kontrol grubuna göre önemli ölçüde daha düşüktü (p<0.01). n=8 olur. *p<0.05, **p<0.01 ile eşleşmemiş t-testi ile kontrol karşılaştırması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: RmTBI'nin C57BL / 6J farelerinde hareket, keşif ve anksiyete üzerindeki etkileri. (A) 5 dakikalık OFT sırasında kontrol ve rmTBI fare hareketinin temsili izleri. (B-E) Özetlenmiş veriler, sırasıyla merkez bölgelerde kat edilen mesafeyi, toplam kat edilen mesafeyi, ortalama seyahat hızını ve çevre bölgelerde geçirilen süreyi göstermektedir. Kontrol, n=13; rmTBI, n =12 olur. sayfa <. 01 ve eşlenmemiş t-testi ile kontrol. Bu rakam^15'ten değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: RmTBI'nin C57BL/6J farelerde uzamsal çalışma ve referans belleği üzerindeki etkileri. (A, B) Y labirentinde uzamsal çalışma ve referans bellek değerlendirmeleri sırasında kontrol ve rmTBI fare hareketinin temsili izleri. Y labirenti spontan değişim testi, kemirgen modellerinde kısa süreli belleği değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir¹⁵. (C) Mekansal çalışma değerlendirmesi sırasında kontrol ve rmTBI farelerinin spontan değişim oranlarının özeti. Kemirgenler genellikle daha önce keşfettikleri bir kolu tekrar ziyaret etmek yerine labirentin yeni bir kolunu keşfetmeyi tercih ederler. Her üç kolda da geçirilen süre ile karşılaştırıldığında kemirgenin yeni kolda geçirdiği süreye dayalı olarak bir tercih indeksi hesaplanır ve daha sonra bu indeks analiz edilir. (D) Mekansal çalışma değerlendirmesi sırasında kontrol ve rmTBI farelerinin tercih indeksinin özeti. Kontrol, n=13; rmTBI, n=12 olur. sayfa <. 01 ve eşlenmemiş t-testi ile kontrol. Bu rakam^15'ten değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: C57BL/6J farelerde kontrol ve rmTBI arasında ipsilateral yaralı motor korteks ve hipokampal dentat girus alt bölgesinin HE boyamasının karşılaştırılması. (A, B) Normal motor korteks; ve (C, D) farklı büyütmelerde kontrol farelerinin hipokampal bölgesi. (E, F) Yaralı motor korteks ve (G, H) rmTBI farelerinin hipokampal bölgeleri. Korteks ve CA1'deki hiperkromik nöronlar, ameliyat hazırlığından veya sürekli rmTBI'den biraz etkilenmiş olabilir; bununla birlikte, kontrol farelerindeki normal nöronlarla karşılaştırıldığında, rmTBI farelerinin motor korteksinde hipokromik (muhtemelen orta derecede yaralanmış) ve piknotik (apoptotik nöronlar) nöronlar gözlenmiştir. Bu nöronal apoptoz özellikleri, belirgin vakuolasyonun eşlik ettiği nöronal sitoplazmik ve çekirdek büzülmesini içeriyordu. Özellikle, (E)'deki sınır beyaz çizgisi, lezyonlu ve çevresindeki doku arasındaki sınırı temsil eder. Ek olarak, DG alt bölgesindeki (H) hiperkromik nöronlar muhtemelen yeni üretilen olgunlaşmamış ve olgun granüler nöronlara atıfta bulunmuştur. Aşağıdaki çubuk grafikler, (I) motor korteks ve hipokampal (J) CA1 ve (K) DG alt bölgelerindeki normal ve rmTBI'dan etkilenen nöronların dağılımını göstermektedir. Kontrol, n=13; rmTBI, n=12, ***p<. 001 ve eşleşmemiş t-testi ile kontrol. Bu rakam^15'ten değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

TBI, kapalı ve nüfuz eden olmak üzere iki ana tipe atıfta bulunur ve ikincisi kafatasının ve dura materin bozulması ile karakterize edilir. Klinik veriler, CHI'lerin penetran yaralanmalardan daha yaygın olduğunu göstermektedir ^1,2. Tek bir hafif TBH'den sonra, çoğu hasta tipik olarak kısa bir süre içinde düzelen PKS semptomları yaşar ve PKS'si uzun süreli sekellere dönüşen hastaların oranı ile ilgili tartışmalar vardır^23,24. Sonuç olarak, araştırmacılar, genellikle düşmelerde, trafik kazalarında ve temas sporlarında meydana gelen çoklu sarsıntıların²⁵ kümülatif etkilerini daha iyi anlamak için odaklarını tekrarlayan CHI modellerine kaydırdılar. Bu tekrarlanan etkiler daha şiddetli ve uzun vadeli etkilere yol açabilir ^26,27. Araştırmacılar, tekrarlayan CHI modellerini kullanarak, çoklu sarsıntıların potansiyel katkı veya sinerjik etkilerini keşfedebilir ve PCS'ye katkıda bulunan altta yatan mekanizmaları daha iyi anlayabilirler. Bu tür modeller, tekrarlanan kafa darbelerinin uzun vadeli sonuçlarını hafifletmek için hedefe yönelik terapötik müdahalelerin geliştirilmesini kolaylaştırabilir.

Bazı CHI modelleri hem doğrusal hem de dönme kuvvetlerini birleştirerek hem fokal tek hem de rmTBI'yi simüle etmeye çalışsa da, bu modeller kafatası kırığı, kafatası morfolojisi ve kalınlığı, uzamış hayvan apnesi¹⁰ ve özellikle dönme kafa hareketi dahil edildiğinde mekanik girdi parametrelerindeki değişkenlik gibi faktörlere bağlı olarak geri tepme yaralanmasına ve yaralanma şiddetinde yanlışlıklara neden olabilir⁹. Piston kontrollü darbe ve ağırlık düşürme yöntemleri, CHI^25'in hayvan modellerinde rmTBI'yi indüklemek için yaygın olarak kullanılır. Piston kontrollü darbe, elektromanyetik veya pnömatik tahrikli çarpma tertibatlarının kullanılmasıyla darbe parametrelerinin hassas ve ayarlanabilir bir şekilde ayarlanmasına olanak tanır ve böylece yüksek darbe tekrarlanabilirliği sağlar. Bununla birlikte, ister CCI'da olduğu gibi açıkta kalan korteks üzerine ister kapalı kafatası üzerine olsun, piston kontrollü darbenin kullanılması, çarpma sırasında hayvanın kafasının stereotaksik bir çerçevede sıkı bir şekilde hareketsiz hale getirilmesini gerektirir. Tersine, ağırlık düşürme yöntemleri, kurulumu kolay, basit ve uygun maliyetli malzemeler gerektirir, ancak değiş tokuş, yaralanmanın ciddiyetinde biraz yüksek bir değişkenliktir²⁵.

FPI modeli tipik olarak karışık fokal ve yaygın yaralanmalara neden olur ve değişen şiddetlerde TBH'nin üretilmesine izin verir. Avantajlarına rağmen, FPI modelinin potansiyel sınırlamaları da vardır. CCI modeli gibi, FPI de beyin dokusunda iltihaplanmaya neden olabilecek cerrahi bir prosedür olan kraniotomi gerektirir¹⁷. Dahası, hafif FPI bile sıklıkla duraya değişen derinliklerde nüfuz eder ve bu da verilerin yorumlanmasında karışıklıklara neden olabilir. Bu nedenle, CCI ve FPI modellerinin hafif TBH hastalarında gözlenen klinik özellikleri tekrarlamada sınırlamaları vardır⁹. Bu nedenle, CHI ile ilişkili rmTBI'nin daha kesin bir fare modelini üretmek için kullanılabilecek inceltilmiş kafatası penceresi ve FPI yöntemlerini birleştiren bir protokol sunuyoruz. Bu protokolün amacı, hafif TBH hastalarının klinik özelliklerini yakından yansıtmaktır. Yüksek oranda tekrarlanabilir bir model, hafif TBH'nin patofizyolojisinin altında yatan mekanizmaları araştırmak ve potansiyel terapötik müdahaleleri değerlendirmek için paha biçilmez bir araç olacaktır.

rmTBI ile ilgili araştırma bulgularımız, hafif TBI araştırmaları için inceltilmiş kafatası pencerelerinin kullanıldığı önceki yayınlarla uyumludur^28,29. Örneğin, Ren ve ark. sol parietal ilişkilendirme korteksinde yaklaşık 30 μm kalınlığında inceltilmiş bir kafatası penceresi oluşturdu ve cerrahi bir stereotaksik aletten 1 mm çapında künt bir uç kullanarak pencereye hafifçe bastırarak hafif TBH'yi indükledi²⁹. Çalışmaları, yaralı korteks^29'da hücre ölümü ve reaktif oksidatif türler (ROS) ekspresyonunda kayda değer bir genişleme gösterdi. RmTBI'yi araştırmak için, Nguyen ve ark. parietal ilişkilendirme korteksi^28'de fare inceltilmiş bir kafatası penceresine (20-40 μm kalınlığında) modifiye edilmiş bir çarpma ucu (1.5 mm kalınlığında 3 mm çapında yuvarlak silikon uç) ile üç CCI uyguladı. Uzun süreli görüntüleme için inceltilmiş kafatası alanının şeffaflığını korumak ve sürdürmek için, inceltilmiş kafatası penceresini ince bir siyanoakrilat yapıştırıcı tabakası ile kapladılar. Üç CCI, 3 hafta boyunca haftada bir kez, 4 m/s hız ve 2 mm derinlik darbe parametreleriyle gerçekleştirildi. Üç CCI'nin bir sonucu olarak, fareler belirgin astrogliozis ve mikroglial aktivasyon^{gösterdi 28}. İnceltilmiş kafatası penceresinin hafif TBI / rmTBI için bir model olarak kullanımının nispeten yeni olduğu göz önüne alındığında, yaralanma şiddeti / ilerlemesi ile farklı etki teknikleri arasındaki ilişkiyi incelemek için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır. Örneğin, önceki bir çalışmada, 2 günlük aralıklarla uygulanan iki FPI'den sonra hücre morfolojisinde belirgin değişiklikler gözlemleyebildik¹⁵. Bu arada, diğer çalışmalarda, inceltilmiş kafatası penceresine tek bir hafif kompresyon, belirgin hücre ölümü ve reaktif oksidatif tür ekspresyonu²⁹ ile hafif TBH'yi indükledi ve üç haftalık CCI, sağlam astrogliozis ve mikroglial aktivasyon²⁸ ile sonuçlandı.

Açıklanan yöntemi kullanarak tutarlı bir yaralanma modeli oluşturmak için birkaç adım dikkatli bir şekilde ilerletilmelidir. İnceltilmiş kafatası penceresi operasyonu sırasında, farklı hedef alana dayalı olarak (örneğin, motor kortekse odaklandık), fare kafası bu protokolde horizonal seviyede veya inceltilmiş kafatası penceresinin karşı tarafına doğru hafif bir yanal açıyla stereotaktik bir çerçeveye sabitlenmelidir. Bu özel konumlandırma, motor kortekse karşılık gelen alanda inceltilmiş kafatası penceresinin oluşturulmasını kolaylaştırabilir. Kulak çubuklarını doğru bir şekilde yerleştirmek, bu prosedürün en zorlu yönlerinden biridir ve ustalaşmak zaman ve pratik gerektirebilir. İnceltilmiş kafatası penceresi operasyonunu denemeden veya CHI'yi indüklemeden önce, kafatasının düz olduğundan emin olmak önemlidir. Kafatası doğru konumlandırılmamışsa, kafa buna göre ayarlanmalıdır. Kafatası kemiğinin düzensiz şekli ve kalınlığı nedeniyle, kafatası büyümesi belirli bir kemik³⁰ içinde bile değişkendir, inceltilmiş kafatası penceresi prosedürünü veya CHI'yi gerçekleştirmeden önce kafa pozisyonunu ayarlamak çok önemlidir. Bunun yapılmaması, kafatası kırığı riskini artırır ve bu da CHI'nin doğruluğunu ve güvenilirliğini önemli ölçüde etkileyebilir. İnceltilmiş kafatası penceresi prosedürü hakkında daha kapsamlı rehberlik için, Guang ve ^ark.14 tarafından özetlenen protokole bakın.

TBI modelleme alanı seçimi, araştırma odaklarına göre araştırmacılar arasında farklılık göstermektedir. CHI'deki yaralanmanın gerçek konumundaki önemli değişkenlik göz önüne alındığında, etki bölgesinin bregma ve lambda arasında merkezi olarak bulunduğunu bildiren çoğu çalışmaya rağmen, CHI hayvan modellerinin gözden geçirilmesinde belirtildiği gibi, gelecekteki deneysel çalışmalarda etki konumunun değiştirilmesi önerilir²⁵. Modifiye edilmiş CHI inceltilmiş kafatası yaralanması modelini doğrulamak için, bu protokolde belirtildiği gibi motor korteks ile başlamanızı öneririz. rmTBI, fokal motor korteks yaralanmalarına neden olabilir ve bu protokoldeki OFT gibi lokomotor değerlendirme yaklaşımları kullanılarak kolayca değerlendirilebilir. Bu prosedür sırasında yapılan insizyonun iyileşmesi için zaman gerekir ve bu potansiyel olarak periferik bir bağışıklık tepkisini tetikleyebilir ve sonuçta deneye değişkenlik katabilir. Enflamasyon, enfeksiyon ve ameliyat sonrası ağrı ve rahatsızlık riskini en aza indirmek için, yaraya eritromisin ve sodyum diklofenak kombinasyonu içeren topikal bir merhem uygulamanızı öneririz. Bu yaklaşımın, hayvanlarda cerrahi prosedürlerle ilişkili iltihabı ve ağrıyı azaltmada etkili olduğu gösterilmiştir.

İnceltilmiş kafatası bazlı sıvı perküsyon protokolü, meninkslerin FPI'ye maruz bırakılmasından yaygın olarak kaynaklanan iltihabı azalttığı için kemirgenlerde rmTBI'yi modellemek için umut verici bir yöntemdir. İnceltilmiş kafatası penceresinde yer alan bu teknik, değişen derecelerde klinik olarak anlamlı PCS'yi etkili bir şekilde üretebilir ve rmTBI okuyan araştırmacılar için potansiyel bir alternatif sağlar. Ayrıca, inceltilmiş kafatası penceresi, in vivo¹⁵ kortekste Ca²⁺ homeostazı ve nöronal hipereksitabilitenin gözlemlenmesini kolaylaştırır. Bu tekniği kullanmak, kısa/orta/uzun vadede PKS ilerlemesinin altında yatan mekanizmaları anlamamızı geliştirebilir, böylece gelişimini tahmin etme ve daha etkili terapötik tedaviler geliştirme yeteneğini artırabilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
% 75 etanol ve nbsp;	Shandong XieKang Tıp Teknolojisi Co, Ltd & nbsp;
Buprenorfin hidroklorür	Tianjin İlaç Araştırma Enstitüsü Pharmaceutical Co., Ltd	H12020272	Solüsyonu, Analjezik
Carprofen	Shanghai Guchen Biotechnology Co., Ltd	53716-49-7	Toz, Analjezik
Klorheksidin diglukonat	Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd.	18472-51-0	%19 - %21 sulu çözelti, Antimikrobiyal
Diş çimentosu ve solvent kiti	Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd.	20220405, 3 # Toz,	eşleşen çözücü
Diseksiyon mikroskobu	Shenzhen RWD Life Science Inc.	77019
Eritromisin merhem	Wuhan Mayinglong İlaç Grubu Co., Ltd.	220412	Antibiyotik
Fiber Optik Soğuk Işık Kaynağı	Shenzhen RWD Yaşam Bilimleri A.Ş.	F-150C
Düz uçlu mikro matkap ucu	Shenzhen RWD Yaşam Bilimleri A.Ş.	HM31008	2 mm, çelik
FPI cihaz yazılımı	Jiaxing Bocom Biotech Inc.	Biocom Hayvan Beyin Çarpma Cihazı V1.0
ICR fareleri	Jinhua Laboratuvar Hayvanları Merkezi	Stok # 2023091	25 Erkek fare, 25-30g, 8 haftalık
Isoflurane	Shandong Ante Animal Husbandry Technology Co., Ltd.
İzotermal ısıtma yastığı	Wenzhou Repshop Pet Products Co., Ltd.
Luer Loc hup			Özel 19G iğne göbeği kullanılarak yapılmıştır
Mikro el tipi kafatası matkabı	Shenzhen RWD Life Science Inc.	78001	Maks: 38.000rpm
Modifiye FPI cihazı	Jiaxing Bocom Biotech Inc.
Morris su labirenti	Shenzhen RWD Yaşam Bilimleri A.Ş.	63031	Farenin uzamsal öğrenme ve hafıza yeteneklerini değerlendirin
Açık alan	Shenzhen RWD Yaşam Bilimleri A.Ş.	63008	Fare lokomoasyonunu ve anksiyetesini değerlendirin
Oftalmik kayganlaştırıcı	Suzhou Tianlong İlaç Co., Ltd.
Sodyum diklofenak merhem	Wuhan Mayinglong İlaç Grubu Co., Ltd.	221207	nonsteroid antienflamatuar ilaç
Küçük hayvan anestezi sistemi-Geliştirilmiş	Shenzhen RWD Yaşam Bilimleri A.Ş.	R530IP
Akıllı video izleme sistemi	Panlab Harvard Apparatus Inc., MA, ABD	V3.0	Hayvan izleme ve analizi
Stereotaktik çerçeve	Shenzhen RWD Yaşam Bilimleri A.Ş.	68043
Vetbond Doku Yapıştırıcısı	3M, St Paul, MN, ABD	202402AX	Sütür hayvan yara
Y labirent	Shenzhen RWD Yaşam Bilimleri A.Ş.	63005	Fare uzamsal çalışma belleğini değerlendirin