Method Article

CMOS Entegre Yüksek Yoğunluklu Mikroelektrot Dizisi Üzerinde Multimodal Büyük Ölçekli Nöronal Topluluk Dinamiğinin Kaydedilmesi ve Analizi

DOI:

10.3791/66473

⸱

March 8th, 2024

 ,  ,  ,  , 
1Group of "Biohybrid Neuroelectronics (BIONICS)", German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 2Faculty of Medicine Carl Gustav Carus, Technical University Dresden, 3Dresden Center for Intelligent Materials (DCIM), Technical University Dresden

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, özellikle hipokampal, koku soğanı devreleri ve insan nöronal ağlarında, büyük ölçekli nöronal toplulukların hesaplama dinamiklerini araştırmak için HD-MEA'yı kullanıyoruz. Hesaplama araçlarıyla birlikte uzay-zamansal aktiviteyi yakalamak, nöronal topluluk karmaşıklığı hakkında içgörüler sağlar. Yöntem, beyin fonksiyonlarının anlaşılmasını geliştirir, potansiyel olarak biyobelirteçleri ve nörolojik bozukluklar için tedavileri tanımlar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Büyük ölçekli nöronal ağlar ve bunların karmaşık dağıtılmış mikro devreleri, uzay-zamansal nöronal aktivite kalıplarından ortaya çıkan algı, biliş ve davranış oluşturmak için gereklidir. Birbirine bağlı nöronal toplulukların fonksiyonel gruplarından ortaya çıkan bu dinamik kalıplar, çok ölçekli nöral bilginin işlenmesi ve kodlanması için hassas hesaplamaları kolaylaştırır ve böylece daha yüksek beyin fonksiyonlarını yönlendirir. Bu karmaşıklığın altında yatan nöral dinamiklerin hesaplama ilkelerini araştırmak ve biyolojik süreçlerin sağlık ve hastalıktaki çok ölçekli etkisini araştırmak için, büyük ölçekli eşzamanlı kayıtlar araçsal hale geldi. Burada, nöral dinamiğin iki modalitesini incelemek için yüksek yoğunluklu bir mikroelektrot dizisi (HD-MEA) kullanılır - ex-vivo fare beyin dilimlerinden hipokampal ve koku ampul devreleri ve insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) in vitro hücre kültürlerinden nöronal ağlar. 4096 mikroelektrotlu HD-MEA platformu, yüksek uzay-zamansal çözünürlükte aynı anda binlerce nöronal topluluktan hücre dışı ateşleme modellerinin non-invaziv, çok bölgeli, etiketsiz kayıtlarını sağlar. Bu yaklaşım, tek/çok birimli spiking aktivite modelleri ve yerel alan potansiyel salınımları dahil olmak üzere çeşitli elektrofizyolojik ağ çapında özelliklerin karakterizasyonuna izin verir. Bu çok boyutlu nöral verileri incelemek için makine öğrenimi algoritmaları, otomatik olay algılama ve sınıflandırma, grafik teorisi ve diğer gelişmiş analizleri içeren çeşitli hesaplama araçları geliştirdik. Bu hesaplama boru hatlarını bu platformla destekleyerek, hücre montajlarından ağlara kadar büyük, çok ölçekli ve çok modlu dinamikleri incelemek için bir metodoloji sağlıyoruz. Bu, sağlık ve hastalıktaki karmaşık beyin fonksiyonları ve bilişsel süreçler hakkındaki anlayışımızı potansiyel olarak ilerletebilir. Açık bilime bağlılık ve büyük ölçekli hesaplamalı nöral dinamiklere ilişkin içgörüler, beyinden ilham alan modellemeyi, nöromorfik hesaplamayı ve nöral öğrenme algoritmalarını geliştirebilir. Ayrıca, bozulmuş büyük ölçekli nöral hesaplamaların altında yatan mekanizmaları ve bunların birbirine bağlı mikro devre dinamiklerini anlamak, spesifik biyobelirteçlerin tanımlanmasına yol açarak nörolojik bozukluklar için daha doğru teşhis araçlarının ve hedefe yönelik tedavilerin önünü açabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genellikle hücre düzenekleri olarak adlandırılan nöronal topluluklar, nöral kodlamada çok önemlidir ve çok ölçekli nöral bilgiyi işlemek için karmaşık hesaplamaları kolaylaştırır 1,2,3. Bu topluluklar, geniş nöronal ağların ve bunların nüanslı mikro devrelerinin oluşumunu destekler4. Bu tür ağlar ve salınım kalıpları, algı ve biliş dahil olmak üzere gelişmiş beyin fonksiyonlarını yönlendirir. Kapsamlı araştırmalar belirli nöronal tipleri ve sinaptik yolları araştırmış olsa da, nöronların işbirliği içinde hücre düzeneklerini nasıl oluşturduğuna ve devreler ve ağlar arasında uzay-zamansal bilgi işlemeyi nasıl etkilediğine dair daha derin bir anlayış belirsizliğini koruyor5.

Akut, ex-vivo beyin dilimleri, bozulmamış nöral devreleri incelemek için çok önemli elektrofizyolojik araçlardır ve nöral fonksiyon, sinaptik iletim ve bağlanabilirliğin salınımlı aktivite modellerini araştırmak için kontrollü bir ortam sunar, farmakolojik testler ve hastalık modellemesindeetkileri vardır 6,7,8. Bu çalışma protokolü iki temel beyin devresini vurgulamaktadır - öğrenme ve hafıza süreçlerinde yer alan hipokampal-kortikal (HC) 9,10 ve koku ayrımcılığından sorumlu koku soğanı (OB) 11,12,13. Bu iki bölgede, memeli beyinlerinde yaşam boyunca yetişkin nörojenezi tarafından sürekli olarak yeni fonksiyonel nöronlar üretilir14. Her iki devre de, mevcut sinir ağının yeniden yapılandırılmasına katılan ve gerektiğinde alternatif bilgi işleme stratejilerini kolaylaştıran çok boyutlu dinamik sinirsel aktivite kalıpları ve doğal plastisite gösterir 15,16.

Akut, ex-vivo beyin dilimi modelleri, beyin işlevselliğini araştırmak ve mikrodevre düzeyinde hastalık mekanizmalarını anlamak için vazgeçilmezdir. Bununla birlikte, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) türetilen in vitro hücre kültürleri, hayvan deneylerinden elde edilen bulguları potansiyel insan klinik tedavisine sorunsuz bir şekilde bağlayarak umut verici bir translasyonel araştırma yolu sunar17,18. Bu insan merkezli in vitro tahliller, farmakolojik toksisiteyi değerlendirmek, hassas ilaç taramasını sağlamak ve yenilikçi hücre bazlı terapötik stratejilere yönelik araştırmaları ilerletmek için güvenilir bir platform görevi görür19,20. iPSC nöronal modelinin önemli rolünü kabul ederek, bu protokol çalışmasının üçüncü modülünü, türetilmiş ağlarının fonksiyonel özelliklerini kapsamlı bir şekilde araştırmak ve ilişkili hücre kültürü protokollerine ince ayar yapmak için ayırdık.

Bu elektrojenik nöral modüller, kalsiyum (Ca2 + görüntüleme), yama kelepçe kayıtları ve düşük yoğunluklu mikroelektrot dizileri (LD-MEA) gibi teknikler kullanılarak yaygın olarak incelenmiştir. Ca2+ görüntüleme, tek hücreli aktivite haritalaması sunarken, düşük zamansal çözünürlüğü ve uzun süreli kayıtlardaki zorluklar nedeniyle engellenen hücre etiketleme tabanlı bir yöntemdir. LD-MEA'lar uzamsal hassasiyetten yoksunken, invaziv tek bölgeli bir teknik olan ve zahmetli olan yama klempi genellikle düşük bir başarı oranısağlar 21,22,23. Bu zorlukların üstesinden gelmek ve ağ çapında aktiviteyi etkili bir şekilde araştırmak için, büyük ölçekli eşzamanlı nöral kayıtlar, beyin karmaşıklığının altında yatan nöral dinamiklerin hesaplama ilkelerini ve bunların sağlık ve hastalık üzerindeki etkilerini anlamak için çok önemli bir yaklaşım olarak ortaya çıkmıştır24,25.

Bu JoVE protokolünde, daha önce grubumuz ve diğer meslektaşlarımız tarafından bildirilen ex-vivo fare beyni akut dilimlerinden hipokampal ve koku soğanı devreleri (Şekil 1A-C) ve in vitro insan iPSC türevi nöronal ağlar (Şekil 1D-E) dahil olmak üzere çeşitli beyin modalitelerinde uzay-zamansal nöronal aktiviteyi yakalamak için yüksek yoğunluklu MEA'ya (HD-MEA) dayalı büyük ölçekli bir nöral kayıt yöntemi gösteriyoruz26,27,28,29,30,31,32,33,34,35. Tamamlayıcı metal oksit yarı iletken (CMOS) teknolojisi üzerine inşa edilen HD-MEA, 7 mm2 dizi boyutu36'da milisaniyenin altında kayıtlara izin veren çip üzerinde devre ve amplifikasyona sahiptir. Bu non-invaziv yaklaşım, yüksek uzay-zamansal çözünürlükte 4096 mikroelektrot kullanarak aynı anda binlerce nöronal topluluktan çok bölgeli, etiketsiz hücre dışı ateşleme modellerini yakalar ve yerel alan potansiyellerinin (LFP'ler) ve çok birimli spiking aktivitesinin (MUA) karmaşık dinamiklerini ortaya çıkarır26,29.

Bu metodoloji tarafından üretilen verilerin genişliği göz önüne alındığında, sofistike bir analitik çerçeve gereklidir, ancak zorluklar ortaya çıkarmaktadır37. Otomatik olay algılama, sınıflandırma, grafik teorisi, makine öğrenimi ve diğer gelişmiş teknikleri kapsayan hesaplama araçları geliştirdik (Şekil 1F)26,29,38,39. HD-MEA'yı bu analitik araçlarla entegre ederek, çeşitli nöral modaliteler arasında bireysel hücre gruplarından daha geniş sinir ağlarına kadar karmaşık dinamikleri araştırmak için bütünsel bir yaklaşım tasarlanmıştır. Bu birleşik yaklaşım, normal beyin fonksiyonlarındaki hesaplama dinamiklerini kavrayışımızı derinleştirir ve patolojik durumlarda mevcut olan anomaliler hakkında fikir verir28. Ayrıca, bu yaklaşımdan elde edilen içgörüler, beyinden ilham alan modelleme, nöromorfik hesaplama ve sinirsel öğrenme algoritmalarındaki ilerlemeleri hızlandırabilir. Sonuç olarak, bu yöntem, sinir ağı bozulmalarının arkasındaki temel mekanizmaları ortaya çıkarmada, potansiyel olarak biyobelirteçleri tanımlamada ve nörolojik durumlar için kesin teşhis araçlarının ve hedefe yönelik tedavilerin oluşturulmasına rehberlik etmede umut vaat ediyor.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm deneyler geçerli Avrupa ve ulusal yönetmeliklere (Tierschutzgesetz) uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel otorite tarafından onaylanmıştır (Landesdirektion Sachsen; 25-5131/476/14).

1. HD-MEA'da hipokampal-kortikal ve koku soğanı devrelerinden ex-vivo beyin dilimleri

  1. Deneysel kesme ve kayıt çözümlerinin hazırlanması (Şekil 2A)
    1. Deney gününde, 0.5 L yüksek sükroz kesme çözeltisi ve 1 L yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) kayıt çözeltisi hazırlayın (Tablo 1A, B).
      1. Tüm katı kimyasalları kuru hacimsel bir şişeye ekleyin, ardından yolun bir kısmını çift damıtılmış (dd) suyla doldurun.
      2. 1 M stok çözeltilerinden MgCl2 ve CaCl2 ekleyin, ardından kalanını dd su ile doldurun. Görünür katılar ~5 dakika çözünene kadar manyetik bir karıştırıcı ile sürekli karıştırmaya başlayın.
    2. Yüksek sükroz kesme çözeltisi için 350-360 mOsm ve aCSF kayıt çözeltisi için 315-325 mOsm arasındaki ozmolariteyi doğrulamak için bir donma noktası ozmometresi kullanın.
    3. Yüksek sükroz kesme çözeltisi için pH'ı 7.3-7.4 ve aCSF kayıt çözeltisi için 7.25-7.35 arasında doğrulamak için bir pH metre kullanın. %95O2 ve %5CO2 ile sürekli köpürmeye başlayın.
    4. Yüksek sakaroz kesme solüsyonunu dilimlemeden önce en az 30 dakika buz üzerine koyun ve %95O2 ve %5CO2 ile sürekli köpürmeye başlayın.
    5. 10 dakikalık karbojenasyondan sonra, 50 mL'lik bir kabı 30 mL'lik kesme solüsyonu ile doldurun ve dondurucuda (-20 °C) 20-30 dakika veya kısmen donana kadar saklayın.
      NOT: Tüm çözeltiler her deney için taze olarak hazırlanmalıdır. Burada kullanılan dd suyu, oda sıcaklığında (RT) depolanan otoklavlanmış ultra saf sudur. Hazırlanan çözüm miktarı, belirli çalışma sorusuna göre uyarlanmalıdır.
  2. Beyin dilimi çalışma alanlarının hazırlanması (Şekil 2A)
    1. Hayvanı deney odasına getirin.
      NOT: Bu protokolde, daha önce tarif edildiği gibi 8-16 haftalık C57BL/J6 dişi fareler kullanılmıştır 26,29,32. Hayvanın taşındıktan sonra en az 30 dakika alışmasına izin verilmelidir. Deneyle aynı gün uzun mesafeli transferlerden (yani enstitüler arası) kaçınılmalıdır. Hayvanın yaşı, cinsiyeti ve türü, özel çalışma sorusuna göre belirlenmelidir.
    2. Hayvan alışırken ve yüksek sükroz çözeltisi soğurken, gerekli aletleri belirlenen her çalışma alanına yerleştirin (bkz.
    3. Beyin dilimi kurtarma ve bakım çalışma alanını hazırlayın. Dilim geri kazanım haznesini karbojene aCSF kayıt solüsyonu ile doldurun ve hazneyi 32 °C'ye ayarlanmış su banyosuna yerleştirin. Deney boyunca sürekli karbojenasyonu koruyun.
    4. Beyin dilimi hazırlama çalışma alanını hazırlayın. Vibratomu ayarlayın - bıçağı vibratom bıçağı tutucusuna yerleştirin ve vibratomu doğru ayarlara kalibre edin (bıçak hareket hızı: 0,20 mm/sn, yükseklik amplitüdü: 95 μm, bıçak açısı: 45°). Vibratomlu buz tepsisini buzla ve tampon tepsisini yüksek sükroz kesme solüsyonuyla doldurun ve solüsyonu tampon tepsisinde karbojenize etmeye başlayın.
    5. Beyin hazırlığı çalışma alanını hazırlayın. 150 mm'lik cam Petri kabını buzla doldurun ve içine filtre kağıdı olan 90 mm'lik plastik bir kültür kabı yerleştirin. Plastik kültür kabını yüksek sükroz kesme solüsyonu ile doldurun ve karbonojenlemeye başlayın. Soğutulmuş numune plakasına bir damla süper yapıştırıcı ekleyin ve agaroz kalıbını takın.
      NOT: Agaroz küfü, özel bir fare beyin kalıbında suda %3 agaroz ile en az bir gün önceden hazırlanır.
    6. Son olarak, beyin çıkarma çalışma alanını hazırlayın. Alüminyum folyoyu kağıt mendille kaplayın, yüksek sükroz kesme solüsyonu sulu kar içeren 50 mL'lik bir beher alın ve anestezi odasına izofluran ekleyin.
      NOT: Anestezi, hayvan yerleştirilmeden ~ 1 dakika önce anestezi odasına eklenecektir. 30 mL yüksek sükroz kesme çözeltisi sulu karına sahip 50 mL'lik bir beher, dekapitasyondan ~2 dakika önce -20 °C dondurucudan çıkarılacaktır.
  3. Fare beyninin çıkarılması ve dilimlenmesi
    NOT: Beyne oksijenlenme eksikliğini önlemek için tüm bu prosedür mümkün olduğunca çabuk yapılmalıdır. Beynin çıkarılması, dekapitasyondan yüksek sakaroz kesme çözeltisi sulu karına daldırılmasına kadar sadece 1-2 dakika sürmelidir.
    1. Hayvanı uygun dozda izofluran (0.5 mL / 1 L anestezi odası) ile uyuşturun. Bir pençe tutamıyla anestezi derinliğini belirleyin; Devam etmeden önce pençe çekme refleksinin olmadığını onaylayın.
    2. Hayvanı beyin çıkarma çalışma alanındaki kağıt mendile aktarın ve cerrahi makasla başını kesin.
    3. İris makasını beyin sapına yerleştirin ve alt makası kalvarya ile aynı hizada tutun. Koronal sütüre ulaşılana kadar sagital sütür boyunca kesin. İris makasını göz yuvalarına yerleştirin ve metopik dikişi kesin. Calvaria'nın kenarlarını aşağı doğru hareket ettirmek için kavisli forseps kullanın ve tüm beyni açığa çıkarın.
      NOT: Dikişleri keserken beyni delmemek için hem iris makasına hem de forsepslere dikkat edin.
    4. Beyni, kavisli forsepsin kör kenarı ile 30 mL yüksek sükroz kesme çözeltisi sulu karı ile 50 mL'lik behere kaydırın. 1 dakika bekletin.
    5. Beyni, beyin hazırlama çalışma alanında soğutulmuş karbonjene kesme solüsyonu ile 90 mm'lik plastik kültür kabına aktarın. Beyni agaroz kalıbına yerleştirmek için yönlendirin.
    6. Agaroz kalıbının rostral ucuna küçük bir nokta süper yapıştırıcı ekleyin. Beyni spatula ile kalıba yerleştirin. Yatay dilimleme için beynin sırt tarafı aşağı bakacak şekilde yerleştirildiğinden emin olun.
      NOT: Tutkalın kalıptaki yeri, ilgilenilen bölgeye (ROI) bağlı olarak değişecektir. Hipokampal-kortikal (HC) ve koku soğanı (OB) dilimleri için, OB'nin stabilize edildiğinden ve beynin kenarlarının tutkaldan arındırıldığından emin olun. Çok fazla yapıştırıcı dilimleme kalitesini etkileyecek ve vibratom dilimleme sırasında yırtılmalara neden olacaktır.
    7. Numune plakasını tampon tepsisine taşıyın, bıçağı doğru açıyla yerine getirin ve bıçağı beyne mümkün olduğunca yaklaştırmak için tampon tepsisi yüksekliğini artırın.
    8. HC ve OB dokularını 0,20 mm/sn hızla 300 μm aralıklarla dilimleyin, ardından her dilimleme turundan sonra bir cam Pasteur pipeti ile toplayın.
    9. Dilimleri aCSF dolu geri kazanım odasında 32 °C'lik bir su banyosunda 45 dakika, ardından RT'de 1 saat bekletin. Dilimlerin üst üste gelmediğinden ve karbonjene çözeltiye tamamen maruz kaldığından emin olun.
      NOT: Tüm çözeltilerin ve çözeltiyi içerdiği belirtilen odaların sürekli karbojenasyonunu sağladığınızdan emin olun. Tutarlı karbojenasyonu sürdürmek için bir basınç regülatörü kullanılabilir.

2. HD-MEA'da in vitro insan iPSC tabanlı nöronal ağ

NOT: Bu çalışmada kullanılan tüm iPSC nöronları ticari olarak elde edilmiştir (bkz. Bu insan hücreleri, insan periferik kanından veya fibroblastlarından türetilen stabil iPS hücre hatlarından farklılaştı.

  1. İn vitro insan iPSC hücre kültürleri için HD-MEA çiplerinin kaplanması (Şekil 2B)
    1. HD-MEA çipini alım kayıt platformuna yerleştirin, hazneyi PBS ile doldurun ve kaplamadan önce çipi test edin. Brainwave yazılımını başlatın. Yeni Kayıt Oturumu > Dosya'yı seçin. Kayıt parametrelerini 50 Hz Kayıt Frekansına ve 18 kHz/elektrot Örnekleme Frekansına sahip olacak şekilde ayarlayın. Çipi kalibre etmek için Amplifier Ofset'i değiştirin. Sorun giderme ipuçları için Tablo 2'ye bakın.
      NOT: Kayıt frekansı ve örnekleme frekansı parametreleri, veri türüne ve bireysel sistem gereksinimlerine bağlı olacaktır.
    2. HD-MEA'ları sterilize edin ve ön koşullandırın.
      1. Kaputun altında, çipi ve cam halkayı %96 etanol (EtOH) ile nemlendirilmiş mendille silin, ardından her cihazı steril 100 mm x 20 mm Petri kabına yerleştirin ve MEA rezervuarını 20 dakika boyunca %70 EtOH ile doldurun.
      2. EtOH'yi aspire edin ve rezervuarı steril, filtrelenmiş dd-su ile 3 kez yıkayın. 1 mL ön koşullandırma ortamı ekleyin ve gece boyunca 37 °C ve %5CO2'de inkübe edin.
        NOT: HD-MEA yüzeyini daha hidrofilik hale getirmek için ön koşullandırma ortamının tuz bazlı bir çözelti olması gerekir. Bu, önceden hazırlanmış BrainPhys (BP) tam ortamını (>3 aylık olmayan) içerebilir (Tablo 1C).
    3. HD-MEA'ları kaplayın. Ertesi gün, ön koşullandırma ortamını aspire edin. Tüm aktif alanı kaplamak için 1 mL 0.1 mg / mL poli-dl-ornitin (PDLO) ekleyin. Bir inkübatörde gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
    4. Medyayı RT'ye hazırlayın ve ısıtın. Buradaki protokoller, iki ticari kaynaktan gelen işlevsel insan iPSC nöronlarından yararlanır; Bu nedenle, medya bileşenleri her tedarikçi için farklılık gösterir. Bir protokol (Tablo 1C, D) 'de açıklanmıştır.
    5. PDLO'yu aspire edin, dd-su ile 3 kez yıkayın ve cipsleri kaputun altında 10 dakika kurumaya bırakın.
    6. 35 mm x 10 mm'lik bir Petri kabını steril, filtrelenmiş dd-su ile doldurun ve uygun nemi korumak ve sonraki adımlarda tohumlanmış hücrelerin buharlaşmasını önlemek için çipin yanına yerleştirin.
  2. HD-MEA'larda insan iPSC nöronlarının kaplanması ve bakımı (Şekil 2B)
    1. Hücreleri mikrolitre konsantrasyonu başına istenen hücrelere çözün ve seyreltin (yani, HD-MEA'da 50 μL'lik bir düşüşte 50.000 hücre yoğunluğu elde etmek için 1000 hücre / μL) (Tablo 1C).
    2. Hücre süspansiyonunu, yüksek lamininli noktalama ortamı kullanarak çip aktif alanının yüzeyine pipetleyin (Tablo 1D).
    3. 37 °C'de %5CO2 ile 45-60 dakika inkübe edin.
    4. HD-MEA haznesine 2 mL ortamı yavaşça doldurun (Tablo 1C).
    5. RT ortamını kullanarak tohumlama sonrası 1. günde (DIV1) %100 medya değişikliği gerçekleştirin (Tablo 1C). Medyanın %50'sini 3-4 günde bir değiştirin. Deney boyunca HD-MEA'ları %5 CO2 ile 37 °C'de inkübe edin.
      NOT: Hücrelerin yerinden çıkmasını önlemek için hafifçe pipetleyin. Herhangi bir kirlenme için ortamın rengini kontrol edin. Ortam değişiminin aralığı ve miktarı, bireysel çalışma soruları veya hücre ihtiyaçları/spesifikasyonları ile belirlenebilir.
    6. İsteğe bağlı: Sahneyi %>70 EtOH ile temizledikten sonra dik bir diferansiyel girişim kontrastı (DIC) mikroskobu altında DIV4-DIV8 arasındaki hücre kültürü büyümesinin ilerlemesini kontrol edin.

3. HD-MEA'lar ile ex-vivo ve in vitro büyük ölçekli nöral kayıtlar

  1. Beyin dilimi kayıt çalışma alanının hazırlanması (Şekil 2A)
    1. Beyin dilimleri iyileşirken, gerekli araçları belirlenen her çalışma alanına yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakın).
      NOT: Ana sistem kurulumu, beyin dilimi deney gününden çok önce optimize edilmeli ve test edilmelidir. Perfüzyon sisteminin (giriş hatları, pompa çıkış hatları, borular ve topraklama) temiz bir sinyal, artan sinyal-gürültü oranı ve perfüzyon gürültüsü olmaması için kayıt platformunda PBS veya aCSF ve bir HD-MEA ile test edilmesi gerekir.
    2. Doku-çip eşleşmesini geliştirmek için HD-MEA çipini 0,1 mg/mL PDLO ile kaplayın ve 37 °C'de 20 dakika inkübe edin.
    3. Çip inkübasyonu sırasında, yerçekimine dayalı perfüzyon sistemini ve hatlarını kayıt aCSF ile doldurun. Perfüzyon sisteminin sürekli karbojenasyonunu sağlayın. 4,5 mL/dk'lık bir akış hızı ve 37 °C'lik bir sıcaklık ayarlayın.
    4. HD-MEA çipini kayıt platformuna yerleştirin, rezervuarı aCSF ile doldurun, perfüzyon sistemini test edin ve kalan sistem gürültüsünü giderin.
      1. Brainwave yazılımını başlatın. Yeni Kayıt Oturumu > Dosya'yı seçin. Kayıt parametrelerini 1 Hz Kayıt Frekansına ve 14 kHz/elektrot Örnekleme Frekansına sahip olacak şekilde ayarlayın. Çipi kalibre etmek için Amplifier Ofset'i değiştirin. Sorun giderme ipuçları için Tablo 2'ye bakın.
        NOT: Kayıt frekansı ve örnekleme frekansı parametreleri, veri türüne ve bireysel sistem gereksinimlerine bağlı olacaktır.
    5. Bir oda aydınlatma sistemi veya optik masa üzerindeki gölgeli bir kafes aracılığıyla kayıt alanının karanlık olduğundan emin olun.
    6. Görüntü elde etmek için stereomikroskobu HD-MEA çip rezervuarı ve aktif alanla hizalayın.
    7. Dengelemek için ankrajı talaş haznesine yerleştirin.
      NOT: Çapa, oksijenlenmeyi teşvik etmek için minimum tellere sahip özel yapım bir platin arptır; ancak, bazı ticari olanlar mevcuttur.
    8. Uygun perfüzyon tüplerine farmakolojik bileşikler ekleyin.
      NOT: Bu protokolde, daha önce tarif edildiği gibi hem spontan hem de 100 μM 4-aminopiridin (4-AP) farmakolojik olarak indüklenen kayıtlar elde edilmiştir. Farmakolojik bileşikler, spesifik çalışma sorusuna göre uyarlanabilir.
    9. Beyin dilimi hazırlama çalışma alanında, 150 mm'lik bir cam Petri kabına 90 mm'lik yeni bir plastik kültür kabı yerleştirin. aCSF ekleyin ve karbonjene etmeye başlayın.
  2. HD-MEA'ları kullanarak HC ve OB dilimlerinden devre genelinde kayıtlar
    NOT: Dilimde oksijenlenme eksikliğini önlemek için dilim bağlantısı mümkün olduğunca çabuk yapılmalıdır. Birleştirme, mikrodiseke edilmiş dilimin çip aktif alanına ilk yerleştirilmesinden son perfüzyon sisteminin başlatılmasına kadar sadece ~ 1 dakika sürmelidir.
    1. Dilimi bir cam pipetle beyin dilimi kurtarma odasından çıkarın ve sürekli karbojenasyonlu 90 mm'lik plastik bir kültür kabına yerleştirin. Bir mikrodiseksiyon aleti kullanarak, HC veya OB'yi çevreleyen beyin dilimi dokusundan izole edin.
    2. İzole edilmiş HC veya OB akut dilimlerini bir cam pipetle HD-MEA rezervuarına taşıyın. MEA aktif alanındaki dilimi ince bir fırça ile nazikçe hizalayın. HD-MEA çipindeki tüm çözümleri bir aspirasyon sistemi ile iyice emdirin.
    3. Ankrajı forseps kullanarak dilimin üzerine nazikçe yerleştirin.
      NOT: Kaplin kaybını önlemek için ankraj dilim hareketi olmadan yerleştirilmelidir.
    4. Çözeltiyi yavaşça talaş haznesine ekleyin ve perfüzyon sistemini başlatın.
      NOT: Optimum kayıt parametreleri için perfüzyon girişinden ve pompa çıkışından laminer akış sağlayın.
    5. Kayıt alanının oda aydınlatma sistemi aracılığıyla veya optik masa kurulumunda gölgeli bir kafesle yeterince karartıldığından emin olun.
    6. Kayıtlara veya ek farmakolojik modülasyona başlamadan önce dilimin 10 dakika alışmasına izin verin.
    7. Brainwave yazılımını başlatın. Yeni Kayıt Oturumu > Dosya'yı seçin. Kayıt parametrelerini 1 Hz Kayıt Frekansına ve 14 kHz/elektrot Örnekleme Frekansına sahip olacak şekilde ayarlayın. Çipi kalibre etmek için Amplifier Ofset'i değiştirin.
      NOT: Bölüm 3.1.4.1'de daha önce belirtildiği gibi, sistem testlerini gerçekleştirirken aynı kayıt parametrelerini uyguladığınızdan emin olun.
    8. Önceden ayarlanmış deney koşullarıyla alıma başlamak için Kaydet'e basın.
    9. Son kaydın hemen ardından, akut beyin diliminin ışık görüntüsünü yakalayın. Dilimi dilim geri alma odasına geri taşıyın, yongaya bağlı organik malzemeleri bir fırça ile çıkarın ve bir sonraki dilimle devam edin. HD-MEA'ları bölüm 3.4'te açıklandığı gibi temizleyin.
  3. HD-MEA'da insan iPSC kayıt çalışma alanının ve ağ genelinde kayıtların hazırlanması (Şekil 2B)
    NOT: Medyayı kayıttan bir gün önce veya insan iPSC kaydından hemen sonra değiştirin (Tablo 1C). Fonksiyonel nöronların kullanıldığı çalışmalarda, ortam her 4 günde bir değiştirildi ve 4, 8, 16 ve 24 DIV ortamında, iPSC kayıtlarının hemen ardından değiştirildi.
    1. HD-MEA kayıt platformunu %>70 EtOH ile temizleyerek steril bir çalışma ortamı sağlayın.
    2. Kaputun altındaki HD-MEA halkasına referans olarak bir polidimetilsiloksan (PDMS) taban kapağını yavaşça yerleştirin. HD-MEA çipini iPSC kayıt çalışma alanına taşıyın ve HD-MEA çipini alım platformuna takın.
    3. Kayıt alanının bir oda aydınlatma sistemi veya optik bir masa üzerindeki gölgeli bir kafes aracılığıyla yeterince karartıldığından emin olun.
    4. Kayıtlara veya ek farmakolojik modülasyona başlamadan önce HD-MEA çipinin 10 dakika dengelenmesini bekleyin.
    5. Brainwave yazılımını başlatın. Yeni Kayıt Oturumu > Dosya'yı seçin. Kayıt parametrelerini 50 Hz Kayıt Frekansına ve 18 kHz/elektrot Örnekleme Frekansına sahip olacak şekilde ayarlayın. Çipi kalibre etmek için Amplifier Ofset'i değiştirin.
      NOT: Bölüm 2.1.1'de daha önce belirtildiği gibi, kaplama ve kaplamadan önce bir sistem testi gerçekleştirirken, aynı kayıt parametrelerini uyguladığınızdan emin olun.
    6. Deney planının her gününde insan iPSC ağından spontan ateşleme aktivitesini veya farmakolojik olarak indüklenen yanıtları kaydedin (yani, 4, 8, 16, 24 DIV).
      NOT: Sabit sıcaklık ve nemi korumak ve hücrelere herhangi bir sıcaklık şokunu önlemek için çipin >30 dakika boyunca inkübatörün dışında kalmasına izin vermeyin.
    7. Deney boyunca HD-MEA'ları 37 °C'de %5CO2 ile inkübe edin.
    8. Deneyin tamamlanmasının ardından, nöronal ağı çiplere sabitleyin ve daha fazla optik görüntüleme için boyayın veya adım 3.4'te açıklandığı gibi HD-MEA'ları doğrudan temizleyin.
  4. HD-MEA yongalarının temizlenmesi
    1. Deneyden sonra, çözeltiyi uygun atık bertarafına göre atın ve dd-su ile durulayın.
    2. Tercih ettiğiniz deterjanı ekleyin, aktif alanı ve tüm hazneyi bir Q-ucu ile temizleyin ve deterjanı atın. Deterjanla doldurun, 20 dakika inkübe edin, ardından deterjanı atın.
    3. Laboratuvar kalitesinde suyla iyice durulayın. Daha sonra dd-su ile 3-4 kez durulayın.
    4. HD-MEA çipini iyice kurutmak için hava basıncı kullanın.

4. HD-MEA'lardan büyük ölçekli nöral kayıtların analizi

NOT: Adım 4.1 Brainwave yazılımına özel olsa da, adım 4.2 her kullanıcının ticari olarak temin edilebilen HD-MEA cihaz türüne göre değiştirilebilir.

  1. Ham veri ön işleme ve olay algılama
    1. Brainwave yazılımında kaydedilmiş bir ham veri dosyasını (.brw) açın. LFP Algılama veya Ani Artış Algılama > Analiz'i seçin.
      NOT: LFP Algılama, düşük geçişli 4. dereceden Butterworth filtresi (1-100 Hz) ile IIRfiltrelemesi kullanır. Sabit eşik algoritmaları, 150 μV'luk yüksek bir eşik, -150 μV'lik düşük bir eşik, 70-120 ms arasında bir enerji penceresi, 10 ms'lik bir refrakter periyodu ve 1 s'lik bir maksimum olay süresini içerir. Tek ve MUA Spike Algılama, yüksek geçişli 4. dereceden Butterworth filtresi (300-3500 Hz) ile IIRfiltrelemesi kullanır. Standart sapma faktörü 8, pik yaşam süresi 2 ms ve refrakter periyodu 1 ms olan bir TSSB algoritması uygulanır.
    2. HC ve OB devre kayıtları için, stereomikroskoptan yakalanan yapısal ışık görüntüsünü içe aktarmak için algılanan olay dosyasına (.bxr) Gelişmiş Çalışma Alanı seçeneğini ekleyin. Büyük ölçekli HC devresini incelerken, dentat girus (DG), hilus, Cornu Ammonis 1 (CA1), Cornu Ammonis 3 (CA3), entorinal korteks (EC) ve perirhinal korteks (PC) içeren yapısal katmanlar oluşturun. Büyük ölçekli OB devresini incelerken, koku alma sinir tabakası (ONL), glomerüler tabaka (GL), dış pleksiform tabaka (EPL), mitral hücre tabakası (MCL) ve granül hücre tabakası (GCL) içeren yapısal katmanlar oluşturun. EPL ve MCL'yi, koku alma korteksi (OCx) dahil olmak üzere projeksiyon katmanı (PL) olarak düşünün.
  2. Özel bir Python hesaplama işlem hattıyla veri işleme
    1. Gürültü giderme
      1. Özel olarak yazılmış bir Python betiği 26,29,32 ve h5py 3.6.0 python paketi kullanarak .bxr dosyasını okuyun.
      2. iPSC ağ kayıtlarına ait ani artış trenlerini ve HC ve OB beyin dilimi devre kayıtlarına ait LFP olay trenlerini ayıklayın.
      3. Ortalama olay başına ortalama aktif elektrotların %0,1'inden veya %10'undan az olan toplam aktif elektrot sayısına sahip olayları veya istatistiksel olarak makul bir ateşleme hızı aralığının dışında kalan tespit edilen olayları rastgele olaylar olarak nitelendirin ve bunları kaldırın. Ek olarak, genlik ve olay süresi eşik değerlerini uygulayın.
        NOT: Ateşleme hızı aralığı için 0.1-15 ani yükselme/sn ve 0.1-60 LFP olayı/dk dikkate alınır. Bunlar, analiz edilen veri kümeleri için kullanılan örnek oran eşik değerleridir. Hız, genlik ve süre eşikleri bireysel verilere bağlı olacaktır.
      4. Ortaya çıkan olay treni verilerini, beraberindeki uzamsal-zamansal bilgilerle birlikte .npy dosya biçiminde kaydedin.
    2. Rastergramlar
      1. Filtrelenmiş olay .npy ve .bxr dosyalarını okuyun ve Matplotlib pyplot işlevini (https://matplotlib.org/3.5.3/api/_as_gen/matplotlib.pyplot.html) kullanarak bir raster grafiği oluşturun.
      2. Ek olarak, katman özgüllüğüne sahip beyin dilimi kayıtları için, elektrot kimliklerini adım 4.1.2'de üretilen katmanlara göre sıralayın ve gruplandırın.
    3. Ortalama ateşleme aktivitesi
      1. Her elektrotun ortalama ateşleme hızını (olay sayısı/kayıt süresi) hesaplayarak .bxr dosyasındaki zaman serisi verilerini işleyin.
      2. Satırların ve sütunların HD-MEA 64 x 64 dizisindeki elektrotların koordinatlarını temsil ettiği ve her matris değerinin ortalama ateşleme hızını ifade ettiği bir veri matrisi oluşturun.
      3. Python'da Matplotlib'in imshow'u veya Seaborn'un ısı haritası işlevleri gibi bir çizim kitaplığı kullanın.
      4. Elektrot dizisi boyunca ortalama ateşleme hızlarının uzamsal dağılımını görsel olarak özetleyen bilgilendirici bir ısı haritası oluşturarak burada 'sıcak' renk haritasını kullanın.
    4. Temsili dalga formu izleri
      1. .brw dosyasından zaman serisi verilerini okuyun ve Matplotlib pyplot işlevini kullanarak bir dalga biçimi izlemesi oluşturun. (https://matplotlib.org/3.5.3/api/_as_gen/matplotlib.pyplot.html).
      2. Temsili bir dalga formu izi için istenen elektrot kimliğini, zaman bölmesini ve frekans bandını girin. Bu analizlerde tanımlanan frekans bantları, bant geçiren filtreli δ, θ, β ve γ frekans bantları ile düşük frekanslı LFP salınımlarını (1-100 Hz); keskin dalga dalgalanmaları (SWR) (140-220 Hz); ve yüksek frekanslı tek ve MUA (300-3500 Hz). δ, θ, β ve γ frekans bantları sırasıyla 1-4 Hz, 5-12 Hz, 13-35 Hz ve 35-100 Hz'dir.
    5. Güç spektral yoğunluğu
      1. .brw dosyasından zaman serisi verilerini okuyun ve her bir zaman serisi içindeki salınım aktivitesinin altında yatan baskın frekansları ayırt etmek için periodogramları hesaplayın.
      2. Frekans-zaman dinamiğinin sahte renk spektrogramlarını oluşturun.
        NOT: Spektrumlar, spektral güç yoğunluğunu41 tahmin etmek için kaydedilen LFP'lerin Hızlı Fourier Dönüşümü kullanılarak Welch yöntemi kullanılarak hesaplanır.
      3. Spektral yoğunluk haritası için istenen elektrot kimliğini, zaman bölmesini ve frekans bandını girin. Bu analizlerde tanımlanan frekans bantları, adım 4.2.4'te açıklananları içerir.
    6. İşlevsel bağlantı
      1. Beyin dilimi devre kayıtları için 4.2.6.2-4.2.6.4 adımlarını izleyin.
      2. .brw dosyasından zaman serisi verilerini okuyun ve Pearson korelasyon katsayısını (PCC)42 kullanarak 64 x 64 dizisindeki aktif elektrot çiftleri arasındaki çapraz kovaryansı hesaplayın.
      3. Bir zaman serisinin diğeri üzerindeki etkisini ölçmek için Çok Değişkenli Granger nedenselliğini kullanarak bir vektör otoregresif modelini zaman serisine sığdırın.
      4. İlişkili bağlantılar içindeki yönlü bilgi akışını değerlendirmek için yönlendirilmiş aktarım işlevi (DTF) uygulayın.
        NOT: Çok katmanlı ağda işlevsel bağlantı, ortalamanın üzerindekilere ve tüm çapraz kovaryans değerlerinin43,44 iki standart sapmasına dayalı bir korelasyon değeri eşiği ayarlanarak kurulur.
      5. iPSC kaydı için 4.2.6.6-4.2.6.8 adımlarını izleyin.
      6. .bxr dosyasından spiketrains verilerini okuyun ve spike_train_correlation işlevleri (https://elephant.readthedocs.io/en/v0.7.0/reference/spike_train_correlation.html) kullanarak gruplanmış spike trenlerinin tüm kombinasyonları arasındaki PCC korelasyon katsayılarının 64x64 matrisini hesaplayın.
        NOT: Çok katmanlı ağda işlevsel bağlantı, ortalamanın üzerindekilere ve tüm çapraz kovaryans değerlerinin iki standart sapmasına dayalı bir korelasyon değeri eşiği ayarlanarak kurulur.
      7. Ayrıca, maksimum yayılma hızını (400 mm/sn olarak ayarlanmış)45 aşan potansiyel eşleştirilmiş bağlantıları ortadan kaldırmak için bağlantı matrisinde uzamsal-zamansal filtreler (STF) ve mesafeye bağlı gecikme eşikleri (DdLT) filtreleme prosedürleri uygulayın.
      8. Filtrelenmiş ve normalleştirilmiş çapraz korelasyon histogramı (FNCCH) algoritması45 kullanarak inhibitör bağlantıları tanımlamak için filtreleme ve eşikleme işlemleriyle ortaya çıkan çapraz korelasyon matrislerinden negatif tepe noktalarını çıkarın.
      9. Her bağlantı matrisini dinamik bir grafik (.gexf) dosyasına dönüştürün.
    7. Ağ bağlantısı haritaları
      1. Dinamik grafiğin belirli zaman dilimlerini çizmesi için Gephi programı 9.2 sürümünde (https://gephi.org) açık veri laboratuvarı .
      2. Uzamsal haritalama için düzen penceresinde Coğrafi Düzen uygulayın.
      3. Karşılaştırma için parametre kısıtlamalarını Derece Aralığı ve Kenar Ağırlığı'na yerleştirin.
      4. Daha iyi görselleştirme için Düğüm Rengi, Kenar Boyutu ve Derece Boyutu atayın.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çok modelli uzay-zamansal haritalama ve salınımlı ateşleme özelliklerinin çıkarılması
Dinamik nöronal topluluklardan ortaya çıkan ağ çapında LFP ve spike olaylarını ölçmek için, HC ve OB devrelerinde ve insan iPSC ağlarında senkron büyük ölçekli ateşleme modellerini araştırdık. Adım 3.2'den kaydedilen beyin dilimi devreleri ve adım 3.3'ten kaydedilen iPSC ağları, protokolün 4.1-4.2 adımlarına göre analiz edildi. İlk olarak, kaydedilen tüm veri kümeleri için olay algılama ve gürültü giderme gerçekleştirildi ve devre özelliklerine göre bölgesel olarak çözüldü. Daha sonra, ortalama büyük ölçekli LFP ve ani ateşleme modellerinin topografik sözde renkli uzamsal haritalaması, tespit edilen olayların rastergramları ve filtrelenmiş dalga formlarının temsili 5-s izleri çizildi (Şekil 3 A-I). Büyük ölçekli LFP'nin topografik sözde renk haritalaması ve sivri ateşleme hızı modelleri, HC (Şekil 3A), OB (Şekil 3B) ve insan iPSC nöronal ağının (Şekil 3C) ilgili mikroskopla yakalanan optik görüntüleri üzerine yerleştirildi. Bu, bireysel devre ve ağ tabanlı salınım modellerinin ve yanıtlarının araştırılmasına izin verir. HC ve OB rastergramları, HC devresinin DG, Hilus, CA3, CA1, EC ve PC katmanları ve OB ağının ONL, OCx, GL, PL ve GCL katmanları üzerinde 60 sn'lik bir zaman bölmesi üzerinde sıralanmış algılanan LFP olay sayılarını içerir (Şekil 3D,E). İnsan iPSC rastergramı, 20 sn'lik bir zaman bölmesi boyunca birbirine bağlı kültürlü ağın senkron algılanan ani artış olaylarını görüntüler (Şekil 3G). Daha sonra, büyük ölçekli HD-MEA kayıt bölgelerinden 5s temsili olay izleri, HC'de (yani, CA3'te seçilen elektrot) (Şekil 3G) ve OB'de (yani, GL'de seçilen elektrot) (Şekil 3H) bir dizi kaydedilmiş salınım frekansını ve dizideki seçilmiş dört aktif elektrottan insan iPSC ağındaki çok birimli spike patlama aktivitesini gösterir (Şekil 3I). Bu örnek sinyaller, bant geçiren filtreli δ, θ, β ve γ frekans bantlarına sahip düşük frekanslı LFP salınımları (1-100 Hz) dahil olmak üzere biyosinyal imzalarını gösterir; keskin dalga dalgalanmaları (SWR) (140-220 Hz); ve yüksek frekanslı tek ve MUA (300-3500 Hz). Son olarak, HD-MEA'dan kaydedilen birbirine bağlı HC ve OB devresinde belirli bir salınım bandının güç büyüklüğünü aynı anda ölçmek için güç spektral yoğunluğu (PSD) analizi kullanıldı (Şekil 3J,K).

Çok Modlu Ağ Çapında Fonksiyonel Konektom
Eşzamanlı olarak aktif nöronal toplulukların aynı anda ateşleme modellerinden çok katmanlı sinir ağlarının büyük ölçekli bağlantısını çıkarmak için, tespit edilen olaylarda aktif elektrot çiftleri arasındaki çapraz kovaryans, protokolün 4.2.6 adımına göre hesaplandı. Burada, korelasyon katsayısı HC ve OB devresindeki katmanlara göre sıralandı veya iPSC ağında sıralanmadı ve daha sonra simetrik bir matriste saklandı. HC ve OB devrelerinin fonksiyonel konektomları, bir zaman serisinin diğeri üzerindeki etkisini ölçmek ve farklı ağlardaki ilişkili bağlantılar içindeki yönlü bilgi akışını değerlendirmek için Çok Değişkenli Granger nedenselliği ve yönlendirilmiş transfer fonksiyonu (DTF) uygulanarak üretildi. HC (Şekil 4A) ve OB'nin (Şekil 4B) konektom haritalaması ve ağ görselleştirmesi Gephi programı 9.2 versiyonu (https://gephi.org) kullanılarak gerçekleştirildi. HC ve OB beyin dilimi devrelerini karşılaştırmak için fonksiyonel bağlantılara benzer parametre kısıtlamaları yerleştirildi ve tespit edilen LFP olaylarının fonksiyonel bağlantısının 100'ünü gösterdi. Düğümler, katman içi ve katmanlar arası bağlantıları tanımlayan katman ve bağlantı rengini gösteren düğüm rengi ile derece kuvvetine göre ölçeklendirilir. İnsan iPSC ağlarının fonksiyonel konektomları, filtrelenmiş ve normalleştirilmiş çapraz korelasyon histogramı (FNCCH) analizi uygulanarak önemli bağlantıların seçimini geliştirmek ve anlamlı bağlantıların tanımlanmasını iyileştirmek için uzamsal-zamansal filtreler (STF) ve mesafeye bağlı gecikme eşikleri (DdLT) uygulanarak oluşturulmuştur. Gephi kullanılarak gerçekleştirilen tüm HD-MEA çipi (Şekil 4C) görselleştirmesinde insan iPSC ağlarının konektom haritalaması. Düğüm rengi, uyarıcı veya inhibitör girişi gösterir ve bağlantı rengi, bağlantıları tanımlar.

figure-results-1
Şekil 1: Büyük ölçekli HD-MEA'daki deneysel ve hesaplamalı platforma genel bakış. (A) HC, OB ve insan iPSC nöronal devrelerinden ve ağlarından nöral dinamikleri yakalamak için CMOS tabanlı HD-MEA ile gerçekleştirilen çok modlu biyohibrit nöroelektronik platformlarımızın izometrik şematik gösterimi. (B) HC ve OB dilimleri elde etmek için fare beyni dilimleme ve çalışma ortamı için şematik iş akışı. (C) Çıkarılan hücre dışı dalga biçimleri ile üst üste bindirilmiş tüm HC ve OB dilimlerinden aynı anda kaydedilen büyük ölçekli ateşleme modellerinin topografik temsilleri, dilim optik görüntülerine. (D) İnsanlardan elde edilen iPSC nöronal ağının şematik gösterimi. (E) HD-MEA çipi (solda) üzerindeki tüm insan nöronal ağının hücresel c-fos ve somatik / dendritik MAP-2'sini gösteren floresan mikrografları, tüm ortalama ateşleme aktivitesi haritası (sağda) ile eşleşti. (F) HD-MEA'lardaki büyük ölçekli kayıtlardan elde edilen çok boyutlu nöral verileri analiz etmek için gelişmiş veri analizi, bağlantı haritalama ve yapay zeka-makine öğrenimi araçlarını içeren hesaplama çerçevesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Ex-vivo beyin dilimi ve in vitro insan iPSC kültürü hazırlama ve kaydetme çalışma alanları için düzenler. (A) Her çalışma alanında gerekli araç ve gereçleri içeren, HC ve OB dilimlerinin hazırlanması için kurulumu gösteren şematik iş akışı. (B) Gerekli araçlar ve cihazlar da dahil olmak üzere insan iPSC kültürü hazırlığı için şematik gösterim. Malzemelerin tam listesi 1.2.2, 2.1, 2.2, 3.1.1, 3.3 adımlarında ve Malzeme Tablosunda yer almaktadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Ağ dinamiğinin uzay-zamansal kalıplarının haritalanması ve çıkarılması. (A-C) Mikroskop ışığı görüntüsünün üzerine bindirilmiş, beş dakikalık kayıtlar üzerinden hesaplanan ortalama LFP ve ani artış hızı uzamsal haritaları. (D-F) 60 saniyelik bir veri alt örneğinde algılanan, gürültüsü giderilmiş LFP olaylarını ve 20 saniyelik bir veri alt örneğindeki ani artışları gösteren raster grafikler. (G-I) Raster çizim verisi alt örneğinin (raster çizimde kırmızı ile vurgulanan) 5 saniyelik bir segmentinden temsili dalga biçimi izi çıkarma, ham LFP salınım bantları (1-100 Hz) olarak görüntülenir; δ (1-4 Hz), θ (5-12 Hz), β (13-35 Hz) ve γ (35-100 Hz) frekans bantları; SWR (140-220 Hz); ve yüksek frekanslı tek ve MUA spiking (300-3500 Hz). (J,K) Hızlı ve yavaş salınımlı LFP'lerin (1-100 Hz) ve SWR'nin (140-220 Hz) güç spektral yoğunluk haritaları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Çok modlu ağ çapında fonksiyonel konektomların organizasyonu. (A-C) Gephi haritaları, düğümlerin örnek renk çubuğu göstergelerinden birine (aşağıda) karşılık geldiği, bağlantıların (veya kenarların) bağlantı düğümleriyle eşleşecek şekilde gölgelendirildiği düğüm işlevsel bağlantısını gösterir. (A) HC, (B) OB ve (C) iPSC katmanları için örnek göstergeler 64 x 64 dizide görüntülenir. HC ve OB katmanları, görselleştirme amacıyla görünür düğümlerin ve bağlantıların sayısını etkili bir şekilde azaltmak için 100 sn'lik bir zaman bölmesi üzerinde çizilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: iPSC nöronal kültürleri için beyin dilimi hazırlama ve ortam çözümleri. (A) Ex-vivo beyin dilimi hazırlığı için yüksek sükroz kesme çözeltisi. (B) ex-vivo beyin dilimi hazırlama ve kaydetme için aCSF kayıt çözümü. (C-D) İnsan nöronal iPSC Medya Protokolü, burada (C) hücre çözme, HD-MEA çip kaplaması ve kültürlenmiş HD-MEA bakımı için kullanılan BrainPhys tam ortamı ve (D) HD-MEA hücre kaplaması için kullanılan noktalama ortamıdır. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: Yaygın HD-MEA kayıt alma sorunlarını giderme. HD-MEA yongaları, kayıt platformu, sistem gürültüsü ve yazılımla ilgili yaygın sorunların, olası nedenlerinin ve sorun giderme çözümlerinin listesi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Birbirine bağlı nöronal topluluklardan ortaya çıkan uzay-zamansal nöronal aktivitenin karmaşık dinamikleri, sinirbilimde uzun zamandır bir entrika konusu olmuştur. Patch-clamp, standart MEA ve Ca2+ görüntüleme gibi geleneksel metodolojiler, beyin karmaşıklığı hakkında değerli bilgiler sağlamıştır. Bununla birlikte, kapsamlı ağ çapında hesaplama dinamikleriniyakalamada genellikle yetersiz kalırlar 21,22,23. Bu JoVE çalışmasında ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, HD-MEA platformunun teknik protokolü, hücre düzeneklerinden geniş ağlara (yani, akut, ex-vivo fare beyin dilimleri ve in vitro insan iPSC ağları) kadar çeşitli modalitelerde nöral dinamiklerin panoramik bir görünümünü sunarak ileriye doğru önemli bir sıçramayı temsil eder26,29,30,32.

Akut, ex-vivo fare beyin dilimleri, moleküler ve devre düzeyinde araştırmaları kolaylaştıran, nöronal araştırmalarda temel bir araç olmuştur 6,7. Bununla birlikte, doku canlılığını korumanın zorluğu kalıcı bir darboğaz olmuştur. Bu çalışmada açıklanan protokol, HD-MEA platformundaki faydalarından yararlanmak için bu dilimlerin kalitesini ve uzun ömürlülüğünü optimize etmek için kritik değişiklikler getirmektedir. Bu protokol aşağıdakilerin önemini vurgulamaktadır: - i) Daha uzun dilimleme sürelerinden ödün verilmesine rağmen, hassasiyeti ve en aza indirilmiş doku hasarı nedeniyle bir doku kıyıcı yerine vibratom kullanımının tercih edildiği dilim homojenliğinin elde edilmesi. ii) Doku canlılığını korumak için ekstraksiyondan kayda kadar süreç boyunca sürekli karbojenasyonun sağlanması. iii) Sıcaklığın düzenlenmesi ve kayıttan önce yeterli iyileşme süresine izin verilmesi. iv) Beyni stabilize etmek, yırtılmayı önlemek ve tutkal temasını en aza indirmek için bir agaroz blok veya küf kullanmak. v) Ayrışma, gürültü ve kayma gibi sorunlardan kaçınırken dilim sağlığını sağlamak için HD-MEA rezervuarı içinde karbojene aCSF'nin optimum akış hızlarını korumak (Tablo 2).

Hem fare beyni dilimleri hem de insan iPSC preparatları için, elektrot-doku arayüz bağlantısının arttırılması çok önemlidir 30,46,47. Protokolümüz, yapışmayı teşvik edici molekül Poli-dl-ornitin (PDLO) kullanmanın önemini vurgulamaktadır. Bu molekül sadece elektrik sinyallerini algılamak için yüzey alanını genişletmekle kalmaz, aynı zamanda elektriksel iletkenliğide artırır 46. Bunu yaparak, hücresel yapışmayı, büyümeyi ve fonksiyonel ağ özelliklerinin gelişimini destekler. Bu tür bir optimizasyon, HD-MEA platformunun etkinliğini artırmada çok önemli bir rol oynar. Bu da, mikro ölçekli ex-vivo ve in-vitro konektomların ve bunların uzay-zamansal ateşleme dizilerinin doğru ve tutarlı analizini sağlar. Özellikle, PDLO'nun, nöronal kültürlerde spontan ateşleme aktivitesini ve elektriksel uyaranlara duyarlılığı teşvik etmede polietilenimin (PEI) ve poli-l-ornitin (PLO) gibi diğer substratlardan daha iyi performans gösterdiği gösterilmiştir. Ek olarak, PDLO, HD-MEA'da yüzey işlevselleştirmesi için kullanılmıştır ve elektrot-dilim birleştirme arayüzünü geliştirdiği ve hem OB hem de HC dilimlerinde sinyal-gürültü oranını arttırdığıgösterilmiştir 26,29. Özel yapım bir platin ankrajın eklenmesi, elektrot-dilim arayüz bağlantısını daha da güçlendirerek daha yüksek sinyal-gürültü oranına sahip kayıtlara yol açar.

HD-MEA'nın hem ex-vivo fare beyin dilimleri hem de in vitro insan iPSC ağları için kullanılması, kapsamlı, çok ölçekli ve çok modlu dinamikleri keşfetmede usta bir yöntem sunar. Ancak bu yenilikçi yaklaşım, özellikle veri yönetiminde önemli zorlukları beraberinde getirmektedir 48,49,50,51. 18 kHz/elektrot örnekleme frekansında elde edilen tek bir HD-MEA kaydı, şaşırtıcı bir şekilde 155 MB/sn veri üretir. Birden fazla dilimi, çeşitli farmakolojik koşulları veya uzun kayıt sürelerini hesaba katarken veri hacmi hızla artar. Böyle bir bilgi akışı, kolaylaştırılmış işleme için sağlam depolama altyapıları ve gelişmiş hesaplama araçları gerektirir. HD-MEA platformunun binlerce nöronal topluluktan aynı anda veri toplama yeteneği hem bir nimet hem de bir engeldir. Beyin fonksiyonlarının hesaplama dinamikleri hakkında üstün bilgiler sağlar, ancak aynı zamanda rafine bir analitik çerçeve gerektirir. Bu JoVE protokolünde, büyük ölçekli olay algılama, sınıflandırma, grafik teorisi, frekans analizi ve makine öğrenimi dahil olmak üzere hesaplama stratejilerine örnekler sağladık. Bu yöntemler, karmaşık nöral verileri analiz etmenin zorluklarının üstesinden gelmek için gösterilen yoğun çabaların altını çizmektedir. Bununla birlikte, bu çok boyutlu nöral veri kümelerini analiz etmek için daha gelişmiş hesaplama araçlarının geliştirilmesi için hala önemli bir alan var. Uygun araçlar ve metodolojilerle donanmış olan HD-MEA platformunun potansiyeli, hem sağlıklı hem de patolojik koşullarda beyin fonksiyonlarının incelikleri hakkında derin bilgiler sunarak büyütülür.

Özünde, HD-MEA platformu, tartışılan ayrıntılı protokoller ve hesaplama araçlarıyla entegre edildiğinde, beynin karmaşık işleyişini anlamak için dönüştürücü bir yaklaşım sunar. Büyük ölçekli, çok ölçekli ve çok modlu dinamikleri yakalayarak öğrenme, bellek ve bilgi işleme gibi süreçlere ilişkin paha biçilmez içgörüler sağlar. Ayrıca, in vitro insan iPSC ağlarındaki uygulaması, ilaç taraması ve kişiselleştirilmiş tıpta devrim yaratma potansiyeline sahiptir. Bununla birlikte, bu platform sinirbilim araştırmalarında önemli bir ilerlemeyi temsil etse de, doğasında var olan teknik zorlukları kabul etmek ve ele almak çok önemlidir. Devam eden iyileştirme ve gelişmiş hesaplama araçlarının entegrasyonu ile HD-MEA platformu, hassas teşhis araçları, spesifik biyobelirteçlerin tanımlanması ve nörolojik bozukluklar için hedefe yönelik tedaviler konusunda yeni bir çağı başlatmaya hazırlanıyor.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir rakip veya finansal çıkar beyan etmezler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma kurumsal fonlar (DZNE), Helmholtz Doğrulama Fonu (HVF-0102) bünyesindeki Helmholtz Derneği ve Dresden Uluslararası Biyotıp ve Biyomühendislik Enstitüsü (DIGS-BB) tarafından desteklenmiştir. Ayrıca DZNE-Dresden'deki davranışsal hayvan testleri platformuna (Alexander Garthe, Anne Karasinsky, Sandra Günther ve Jens Bergmann) destekleri için teşekkür ederiz. Şekil 1'in bir kısmının BioRender.com platformu kullanılarak oluşturulduğunu kabul etmek isteriz.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
150 mm Cam Petri Kabıjenerik jenerikBeyin Hazırlama Çalışma Alanı, Beyin Dilimi Kayıt Çalışma Alanı
0.22 μ m Steril Filtre Ünitesi KarışıkMuhtelif
Muhtelif 90 mm Plastik Kültür KabıTPP93100Beyin Hazırlama Çalışma Alanı, Beyin Dilimi Kayıt Çalışma Alanı
AgaroseRoth6351.5Beyin Hazırlama Çalışma
Agaroz KalıbıÖZELÖZELBeyin Hazırlama Çalışma Alanı; Özel tasarlanmış 3D Yazıcı Tasarımı, istek üzerine temin edilebilir:
Alüminyum FolyojenerikjenerikBeyin Ekstraksiyon Çalışma Alanı
Anestezi odasıjenerikjenerik, Beyin Ekstraksiyon Çalışma Alanı; Muhtelif Beher, Yatak takımı vb
Askorbik AsitSigma AldrichA4544-25GÇözelti Hazırlama Çalışma Alanı
Çeşitli BeherlerJenerikJenerikÇözelti Hazırlama Çalışma Alanı; 50 mL
Karışık LuersCole Parmer45511-00Beyin Dilimi Kayıt Çalışma Alanı
Çeşitli Hacimsel şişelerJenerikJenerikÇözelti Hazırlama Çalışma alanı; 500 mL, 1 L
B27 Ek YaşamTeknolojileri17504-044BrainXell Ticari Tedarikçi Protokolü
BDNFPeprotech450-02BrainXell Ticari Tedarikçi Protokolü
UV Lambalı Biyolojik Güvenlik KabiniÇeşitliHD-MEA Kaplama, Kaplama, Bakım Çalışma Alanı
BrainPhys Neuronal Medium STEMCELL Teknolojileri 05790 CDI ve BrainXell Ticari Tedarikçi Protokolü
Brainwave Yazılımı3Brain AGSürüm 4Beyin Dilimi ve İnsan iPSC Kayıt Çalışma
Alanı BrainXell  Glutamaterjik Nöron Testi BrainXell  BX-0300 BrainXell Ticari Tedarikçi Protokolü
CaCl2Sigma Aldrich21115-100MLÇözelti Hazırlama Çalışma Alanı
KarbogenjenerikjenerikTüm Çalışma Alanları; %95/%5 O2 ve CO2 karışımı
Hücre Kültürü İnkübatörü Çeşitli
Çeşitli CMOS tabanlı HD-MEA çipi3Brain AGÖZELBeyin Dilimi ve İnsan iPSC Kayıt Çalışma Alanı
Konik Tüpler, 50 mL, Falcon (Santrifüj Tüpleri) STEMCELL Teknolojileri 38010 CDI Ticari Tedarikçi Protokolü
Timsah Klipsli Topraklama KablolarıJWQIDIB06WGZG17WBeyin Dilimi Kayıt Çalışma Alanı
Kavisli ForsepsFST11052-10Beyin Ekstraksiyon Çalışma Alanı
DMEM/F12 Orta YaşamTeknolojileri  11330-032BrainXell Ticari Tedarikçi Protokolü
Dulbecco' Ca 2 + < / sup> ve Mg < sup>2 + < / sup> içermeyen Fosfat Tamponlu Salin (D-PBS)STEMCELL Teknolojileri 37350 CDI Ticari Tedarikçi Protokolü
Filtre KağıdıMacherey-Nagel531 011Beyin Hazırlama Çalışma Alanı
İnce FırçaLeonhardy773Beyin Dilimi Hazırlama Çalışma Alanı, Beyin Dilimi Kayıt Çalışma Alanı
ForsepsVITLAB67895Beyin Dilimi Kayıt Çalışma Alanı
GDNFPeprotech450-10BrainXell Ticari Tedarikçi Protokolü
GeltrexLife BrainXell Ticari Tedarikçi Protokolü A1413201 Teknolojiler
Cam pastör pipetiRoth4518Beyin Dilimi Hazırlama Çalışma Alanı, Beyin Dilimi Kayıt
GlikozSigma AldrichG7021-1KGÇözelti Hazırlama Çalışma Alanı
GlutaMAXYaşam Teknolojileri35050-061BrainXell Ticari Tedarikçi Protokolü
Yerçekimi tabanlı Perfüzyon SistemiALAVC3-8xGBeyin Dilimi Kayıt Çalışma Alanı
HD-MEA Kayıt platformu3Brain AGÖZELBeyin Dilimi ve İnsan iPSC Kayıt Çalışma Alanı
IsıtıcıWarner InstrumentsTC-324CBeyin Dilimi Kayıt Çalışma Alanı
Hemositometre veya Otomatik Hücre SayacıÇeşitliHD-MEA Kaplama, Kaplama, Bakım Çalışma Alanı
Hipo İğnelerWarner Instruments641489Beyin Dilimi Kayıt Çalışma Alanı
iCell GlutaNeurons Kit, 01279 CDIR1061 ve nbsp;CDI Ticari Tedarikçi Protokolü
Iris ScissorsVantageV95-304Beyin Ekstraksiyon Çalışma Alanı
IsofluranBaxterHDG9623Beyin Ekstraksiyon Çalışma Alanı
KClSigma AldrichP5405-250GÇözelti Hazırlama Çalışma Alanı
Laminin Sigma-Aldrich L2020 CDI Ticari Tedarikçi Protokolü
Sıvı Azot Depolama Ünitesi ÇeşitliÇeşitli HD-MEA Kaplama, Kaplama, Bakım Çalışma Alanı
Manyetik KarıştırıcıJenerikJenerikÇözelti Hazırlama Çalışma Alanı
Metal VidalarThorlabsHW-KIT2/MBeyin Dilimi Kayıt Çalışma Alanı
MgCl2Sigma AldrichM1028-100MLÇözelti Hazırlama Çalışma Alanı
MgSO4Sigma Aldrich63138-250GÇözelti Hazırlama Çalışma Alanı
Mikrodiseksiyon Takım Tutucusu Braun4606108VBeyin Dilimi Hazırlama Çalışma Alanı, Beyin Dilimi Kayıt Çalışma Alanı
Mikrodiseksiyon Aleti İğneBraun 9186166Beyin Dilimi Hazırlama Çalışma Alanı, Beyin Dilimi Kayıt Çalışma Alanı
Modüler StereomikroskopLeicaCUSTOMBeyin Dilimi Kayıt Çalışma Alanı; Özel Özellikler ve Değişiklikler
N2 EkYaşam Teknolojileri17502-048CDI ve BrainXell Ticari Tedarikçi Protokolü
NaClSigma AldrichS3014-1KGÇözümü Hazırlık Çalışma Alanı
NaH2PO4Sigma AldrichS0751-100GÇözelti Hazırlama Çalışma Alanı
NaHCO3Sigma AldrichS5761-500GÇözüm Hazırlama Çalışma Alanı
Neurobazal Medium Yaşam Teknolojileri21103-049BrainXell Ticari Tedarikçi Protokolü
Optik Kafes SistemiThorlabsÇeşitliBeyin Dilimi Kayıt Çalışma Alanı
Breadboard ile Optik TabloThorlabsSDA7590Beyin Dilimi Kayıt Çalışma Alanı
PDLOSigma AldrichP0671HD-MEA Kaplama, Beyin Dilimi Kayıt Çalışma Alanı
Penisilin-streptomisin, 100x Thermo Fisher Bilimsel 15140-122 CDI Ticari Tedarikçi Protokolü
Pipet uçlarıTipONES1120-8810Beyin Dilimi Kayıt Çalışma
Alanı Pipetleyiciler ÇeşitliÇeşitli
Platin AnkrajÖZELÖZELBeyin Dilimi Kayıt Çalışma Alanı
Polietilen Boru ÇeşitliÇeşitli Beyin Dilimi Kayıt Çalışma Alanı
PompaMasterFlex78018-22Beyin Dilimi Kayıt Çalışma Alanı
Tıraş BıçağıApollo10179960Beyin Hazırlama Çalışma Alanı
Referans Elektrot Hücre Kültürü KapağıÖZELÖZELİnsan iPSC Kayıt Çalışma Alanı; Özel tasarlanmış 3D Yazıcı Tasarımı, istek üzerine temin edilebilir
Kauçuk Pipet AmpulüDuran Wheaton Kimble292000205Beyin Dilimi Hazırlama Çalışma Alanı, Beyin Dilimi Kayıt
Çalışma Alanı Serolojik Pipetler, 1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mLÇeşitli
Çeşitli Dilim Geri Kazanım OdasıÖZELÖZELBeyin Dilimi Kurtarma Çalışma Alanı; Özel tasarlanmış 3D Yazıcı Tasarımı, istek üzerine temin edilebilir
SpatulaISOLAB047.06.150Beyin Hazırlama Çalışma Alanı
SucroseSigma Aldrich84100-1KGÇözelti Hazırlama Çalışma Alanı
Süper YapıştırıcıUHU358221Beyin Dilimi Hazırlama Çalışma Alanı
Cerrahi MakasPeters InstrumentsBC 344Beyin Çıkarma Çalışma Alanı
Masa Üstü Santrifüj Çeşitli,Çeşitli,Çeşitli, Çeşitli,
TGF-β 1Peprotech100-21CBrainXell Ticari Tedarikçi Protokolü
Doku KağıdıjenerikjenerikBeyin Ekstraksiyonu Çalışma Alanı
Tripan MaviSTEMCELL Teknolojileri 07050 CDI Ticari Tedarikçi Protokolü
Dik MikroskopOlympusCUSTOMGörüntüleme Çalışma Alanı; Özel özellikler ve modifikasyonlar
VacusipIntegra159010Beyin Dilimi Kayıt Çalışma Alanı
VibratomLeicaVT1200sBeyin Dilimi Hazırlama Çalışma Alanı; İçindekiler: Numune plakası, tampon tepsisi, buz tepsisi, numune plakası tutma aleti, vibratom bıçağı ayarlama aleti
Vibratom BladePersonnaN/ABeyin Dilimi Hazırlama Çalışma Alanı
Su BanyosuLaudaL000595Beyin Dilimi Kurtarma Çalışma Alanı
Alanı , , , ,, . Çalışma Alanı

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hebb, D. O. The Organization of Behavior; A Neuropsychological Theory. , Wiley. New York. (1949).
  2. Cossart, R., Garel, S. Step by step: cells with multiple functions in cortical circuit assembly. Nat Rev Neurosci. 23, 395-410 (2022).
  3. Carrillo-Reid, L., Yuste, R. Playing the piano with the cortex: role of neuronal ensembles and pattern completion in perception and behavior. Curr Opin Neurobiol. 64, 89-95 (2020).
  4. Buzsáki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nat Neurosci. 7, 446-451 (2004).
  5. Buzsáki, G. Neural Syntax: Cell assemblies, synapsembles, and readers. Neuron. 68 (3), 362-385 (2010).
  6. Huang, Y., Williams, J. C., Johnson, S. M. Brain slice on a chip: opportunities and challenges of applying microfluidic technology to intact tissues. Lab Chip. 12 (12), 2103-2117 (2012).
  7. Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Curr Neuropharmacol. 5 (1), 19-33 (2007).
  8. Bliss, T. V. P., Collingridge, G. L. A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature. 361, 31-39 (1993).
  9. Anderson, P., Morris, R., Amaral, D., Bliss, T., O'Keefe, L. The Hippocampus Book. , Oxford University Press. New York. (2006).
  10. Lisman, J., et al. Viewpoints: how the hippocampus contributes to memory, navigation and cognition. Nat Neurosci. 20, 1434-1447 (2017).
  11. Mori, K., Nagao, H., Yoshihara, Y. The olfactory bulb: Coding and processing of odor molecule information. Science. 286 (5440), 711-715 (1999).
  12. Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: A molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
  13. Bushdid, C., Magnasco, M. O., Vosshall, L. B., Keller, A. Humans can discriminate more than 1 trillion olfactory stimuli. Science. 343 (6177), 1370-1372 (2014).
  14. Kempermann, G. Why new neurons? Possible functions for adult hippocampal neurogenesis. J Neurosci. 23 (3), 635-638 (2003).
  15. Aimone, J. B., Wiles, J., Gage, F. H. Computational influence of adult neurogenesis on memory encoding. Neuron. 61 (2), 187-202 (2009).
  16. Nithianantharajah, J., Hannan, A. J. Enriched environments, experience-dependent plasticity and disorders of the nervous system. Nat Rev Neurosci. 7, 697-709 (2006).
  17. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  18. Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77 (3), 440-456 (2013).
  19. Rajamohan, D., et al. Current status of drug screening and disease modelling in human pluripotent stem cells. Bioessays. 35 (3), 281-298 (2013).
  20. Heilker, R., Traub, S., Reinhardt, P., Schöler, H. R., Sterneckert, J. iPS cell derived neuronal cells for drug discovery. Trends Pharmacol Sci. 35 (10), 510-519 (2014).
  21. Zhao, S. R., Mondéjar-Parreño, G., Li, D., Shen, M., Wu, J. C. Technical applications of microelectrode array and patch clamp recordings on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. J Vis Exp. (186), e64265(2022).
  22. Hamill, O. P., McBride, D. W. Induced membrane hypo/hyper-mechanosensitivity: A limitation of patch-clamp recording. Annu Rev Physiol. 59, 621-631 (1997).
  23. Manz, K. M., Siemann, J. K., McMahon, D. G., Grueter, B. A. Patch-clamp and multi-electrode array electrophysiological analysis in acute mouse brain slices. STAR Protoc. 2 (2), 100442(2021).
  24. Lee, C. H., Park, Y. K., Lee, K. Recent strategies for neural dynamics observation at a larger scale and wider scope. Biosens Bioelectron. 240, 115638(2023).
  25. Urai, A. E., Doiron, B., Leifer, A. M., Churchland, A. K. Large-scale neural recordings call for new insights to link brain and behavior. Nat Neurosci. 25 (1), 11-19 (2022).
  26. Hu, X., Khanzada, S., Klütsch, D., Calegari, F., Amin, H. Implementation of biohybrid olfactory bulb on a high-density CMOS-chip to reveal large-scale spatiotemporal circuit information. Biosens Bioelectron. 198, 113834(2022).
  27. Amin, H., Marinaro, F., Tonelli, D. D. P., Berdondini, L. Developmental excitatory-to-inhibitory GABA-polarity switch is disrupted in 22q11.2 deletion syndrome: A potential target for clinical therapeutics. Sci Rep. 7 (1), 15752(2017).
  28. Amin, H., Nieus, T., Lonardoni, D., Maccione, A., Berdondini, L. High-resolution bioelectrical imaging of Aβ-induced network dysfunction on CMOS-MEAs for neurotoxicity and rescue studies. Sci Rep. 7 (1), 2460(2017).
  29. Emery, B. A., Hu, X., Khanzada, S., Kempermann, G., Amin, H. High-resolution CMOS-based biosensor for assessing hippocampal circuit dynamics in experience-dependent plasticity. Biosens Bioelectron. 237, 115471(2023).
  30. Amin, H., et al. Electrical responses and spontaneous activity of human iPS-derived neuronal networks characterized for 3-month culture with 4096-electrode arrays. Front Neurosci. 10, 121(2016).
  31. Lonardoni, D., et al. Recurrently connected and localized neuronal communities initiate coordinated spontaneous activity in neuronal networks. PLoS Comput Biol. 13 (7), e1005672(2017).
  32. Emery, B. A., et al. Large-scale multimodal recordings on a high-density neurochip: Olfactory bulb and hippocampal networks. 2022 44th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine & Biology Society (EMBC). , Glasgow, Scotland, United Kingdom. 3111-3114 (2022).
  33. Rossi, L., Emery, B. A., Khanzada, S., Hu, X., Amin, H. Pharmacologically and electrically-induced network-wide activation of olfactory bulb with large-scale biosensor. 2023 IEEE BioSensors Conference (BioSensors). , London, United Kingdom. 1-4 (2023).
  34. Emery, B. A., et al. Recording network-based synaptic transmission and LTP in the hippocampal network on a large-scale biosensor. 2023 IEEE BioSensors Conference (BioSensors). , London, United Kingdom. 1-4 (2023).
  35. Hierlemann, A., Frey, U., Hafizovic, S., Heer, F. Growing cells atop microelectronic chips: Interfacing electrogenic cells in vitro with CMOS-based microelectrode arrays). Proceedings of the IEEE. 99 (2), 252-284 (2011).
  36. Berdondini, L., et al. Active pixel sensor array for high spatio-temporal resolution electrophysiological recordings from single cell to large scale neuronal networks. Lab Chip. 9, 2644-2651 (2009).
  37. Siegle, J. H., Hale, G. J., Newman, J. P., Voigts, J. Neural ensemble communities: open-source approaches to hardware for large-scale electrophysiology. Curr Opin Neurobiol. 32, 53-59 (2015).
  38. Amin, H., Maccione, A., Zordan, S., Nieus, T., Berdondini, L. High-density MEAs reveal lognormal firing patterns in neuronal networks for short and long term recordings. 2015 7th International IEEE/EMBS Conference on Neural Engineering (NER). , Montpellier, France. 1000-1003 (2015).
  39. Altuntac, E., et al. Bottom-up neurogenic-inspired computational model. 2023 IEEE BioSensors Conference (BioSensors). , London, United Kingdom. 1-4 (2023).
  40. Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. J Neurosci Methods. 177 (1), 241-249 (2009).
  41. Welch, P. D. The use of fast Fourier transform for the estimation of power spectra: A method based on time averaging over short, modified periodograms. IEEE Transactions on Audio and Electroacoustics. 15 (2), 70-73 (1967).
  42. Eggermont, J. J., Munguia, R., Pienkowski, M., Shaw, G. Comparison of LFP-based and spike-based spectro-temporal receptive fields and cross-correlation in cat primary auditory cortex. PLoS One. 6 (5), e20046(2011).
  43. Damos, P. Using multivariate cross correlations, Granger causality and graphical models to quantify spatiotemporal synchronization and causality between pest populations. BMC Ecol. 16, 33(2016).
  44. Kaminski, M. J., Blinowska, K. J. A new method of the description of the information flow in the brain structures. Biol Cybern. 65, 203-210 (1991).
  45. Pastore, V. P., Massobrio, P., Godjoski, A., Martinoia, S. Identification of excitatory-inhibitory links and network topology in large-scale neuronal assemblies from multi-electrode recordings. PLoS Comput Biol. 14 (8), e1006381(2018).
  46. Amin, H., Dipalo, M., De Angelis, F., Berdondini, L. Biofunctionalized 3D nanopillar arrays fostering cell guidance and promoting synapse stability and neuronal activity in networks. ACS Appl Mater Interfaces. 10 (17), 15207-15215 (2018).
  47. Woeppel, K., Yang, Q., Cui, X. T. Recent advances in neural electrode-tissue interfaces. Curr Opin Biomed Eng. 4, 21-31 (2017).
  48. Steinmetz, N. A., Koch, C., Harris, K. D., Carandini, M. Challenges and opportunities for large-scale electrophysiology with Neuropixels probes. Curr Opin Neurobiol. 50, 92-100 (2018).
  49. Siegle, J. H., Hale, G. J., Newman, J. P., Voigts, J. Neural ensemble communities: open-source approaches to hardware for large-scale electrophysiology. Curr Opin Neurobiol. 32, 53-59 (2015).
  50. Freeman, J. Open source tools for large-scale neuroscience. Curr Opin Neurobiol. 32, 156-163 (2015).
  51. Stevenson, I. H., Kording, K. P. How advances in neural recording affect data analysis. Nat Neurosci. 14 (2), 139-142 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

High Density Microelectrode ArrayNeuronal Ensemble DynamicsSpatiotemporal Neural ActivityExtracellular RecordingsBrain Slice PreparationHippocampal CircuitsOlfactory Bulb CircuitsiPSC Neuronal NetworksLocal Field PotentialsSpike Detection

Related Articles