Tek çekirdekli yeni nesil dizileme analizlerini desteklemek için kriyoprezervasyonlu indüklenmiş pluripotent kök hücre türevli stromal/endotel ve kan hücresi tiplerinden yüksek kaliteli çekirdeklerin çıkarılması için bir protokol açıklıyoruz. Yüksek kaliteli, sağlam çekirdekler üretmek, multiomik deneyler için zorunludur, ancak bazı laboratuvarlar için sahaya giriş için bir engel olabilir.
Yöntem makalesi
Dondurularak Saklanmış İn Vitro Kaynaklı Kan Hücrelerinden Nükleer İzolasyon
Bu makalede
Özet
Özet
İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) tabanlı modeller, kan gelişimini anlamak için mükemmel platformlardır ve iPSC'den türetilen kan hücreleri, klinik test reaktifleri ve transfüzyon hücre terapötikleri olarak translasyonel faydaya sahiptir. Tek çekirdekli RNA dizilimi (snRNAseq) ve Transpozaz Erişilebilir Kromatin dizilimi için Test (snATACseq) dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere multiomik analizin ortaya çıkışı ve genişlemesi, hücre gelişimi anlayışımızda devrim yaratma potansiyeli sunar. Bu, in vitro hematopoietik modeller kullanan gelişimsel biyolojiyi içerir. Bununla birlikte, bozulmamış çekirdekleri kültürlenmiş veya birincil hücrelerden izole etmek teknik olarak zor olabilir. Farklı hücre tipleri genellikle hücresel sertliğe ve içeriğe bağlı olarak özel nükleer preparatlar gerektirir. Bu teknik zorluklar veri kalitesini sınırlayabilir ve multiomik çalışmaları sürdürmek isteyen araştırmacılar için bir engel teşkil edebilir. Hücre toplama ve/veya işleme ile ilgili sınırlamalar nedeniyle numune kriyoprezervasyonu genellikle gereklidir ve donmuş numuneler, bozulmamış nükleer izolasyon için ek teknik zorluklar ortaya çıkarabilir. Bu yazıda, tek çekirdekli multiomik iş akışlarında kullanılmak üzere in vitro hematopoietik gelişimin farklı aşamalarında iPSC'den türetilmiş hücrelerden yüksek kaliteli çekirdekleri izole etmek için ayrıntılı bir yöntem sunuyoruz. Yöntem geliştirmeyi, iPSC'den türetilen yapışık stromal/endotelyal hücrelerden ve yapışık olmayan hematopoietik progenitör hücrelerden çekirdeklerin izolasyonu üzerine odakladık, çünkü bunlar yapısal ve hücresel kimlik açısından çok farklı hücre tiplerini temsil eder. Açıklanan sorun giderme adımları, nükleer topaklanmayı ve döküntüleri sınırlayarak, sonraki analizler için çekirdeklerin yeterli miktar ve kalitede geri kazanılmasına izin verdi. Benzer yöntemler, çekirdekleri diğer kriyoprezervasyonlu hücre tiplerinden izole etmek için uyarlanabilir.
Giriş
Hematopoez nispeten iyi karakterize edilmiş bir gelişimsel sistemdir, ancak in vitro olarak kan hücresi oluşumunu özetleyememe, ilgili faktörlerin eksik bir şekilde anlaşıldığını gösterir. İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) tabanlı hematopoez modelleri, temel gelişimsel faktörlerin ve ilgili biyolojinin aydınlatılmasına yardımcı olabilir. iPSC sistemi ayrıca kan bozukluklarını incelemek için mükemmel bir model sunar ve iPSC bazlı kan hücreleri, translasyonel ve terapötik olarak ilgili reaktifler 1,2,3,4 üretmek için geliştirilmiştir. Tek hücreli çalışmalar, hematopoez5 sırasında üretilen hücre tipleri de dahil olmak üzere iPSC tabanlı gelişimsel biyolojiyi araştırmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Hücre alt popülasyonları6 arasındaki ilişkileri çıkaramayan toplu RNA dizilimi ile karşılaştırıldığında, tek hücreli modaliteler, hücre heterojenliğinin değerlendirilmesine izin verir ve hücre gelişiminin tanımlanmasını ve karakterizasyonunukolaylaştırabilir 6,7.
iPSC'lerden hematopoietik hücrelerin oluşumu, heojenik endotel hücreleri oluşturmak için ilkel çizgi, mezoderm ve endotel durumları boyunca sıralı farklılaşma gerektirir. Heojenik endotel hücreleri, hematopoietik kök ve progenitör hücrelerin doğrudan öncüleridir8. Bu hücre tipleri oldukça farklı morfolojik ve hücresel özelliklere sahiptir. İn vitro türevli hematopoietik hücre modellerinin epigenetik manzarası ve gelişimsel dinamikleri hakkında sınırlı bir anlayış vardır, ancak bu, iPSC sisteminin tam terapötik potansiyelini ortaya çıkarmak için gerekli bir bilgidir. Çoğu durumda, yalnızca tek hücre analiz yöntemleri, hücre popülasyonlarının, transkripsiyonel aktivitelerin, kromatin manzaralarının ve heterojen hücre preparatları arasındaki gelişimi yöneten düzenleyici mekanizmaların tanımlanmasına izin verir.
Tek hücreli RNA dizilimi (scRNAseq) ve tek çekirdekli RNA dizilimi (snRNAseq) olmak üzere iki metodoloji, bireysel hücre düzeyindetranskripsiyonel içgörüleri ortaya çıkarabilir 9. Veri geçerliliğini ve güvenilirliğini belirleyen temel faktörlerden biri, katı kalite kriterlerini karşılayan numunelere duyulan tavizsiz ihtiyaçtır. Bunlar, hücre/nükleer yoğunluk, optimum canlılık ve minimum topaklanma için kesin gereksinimleri içerir. Tek çekirdeklerin hazırlanması teknik olarak zor olabilir. Daha önce dondurularak saklanmış hücrelerin kullanımıyla ilgili ek zorluklar olabilir.
Standart scRNAseq yaklaşımlarında dört önemli potansiyel sınırlamaya dikkat çekiyoruz. İlk olarak, hücre süspansiyonları oluşturmak için standart protokoller, kriyoprezervasyon sonrası alınanlardan ziyade genellikle taze hücrelerden veya dokulardan elde edilen preparatlara atıfta bulunur10. Bu, potansiyel olarak değerli kaynakların kullanımını kısıtlayabilir. İkincisi, çeşitli hücre tiplerinin ayrışma etkinliği değişkendir. Örneğin, birçok bağışıklık hücresi tipi göreceli olarak kolaylıkla ayrışır. Buna karşılık, normalde hücre dışı matriks ve bazal membrana gömülü olan stromal hücreler, fibroblastlar ve endotel hücreleri, çekirdek izolasyonunu karmaşıklaştırabilen benzersiz hücre özelliklerine sahiptir11,12. Bu özellikler, daha hassas hücre popülasyonlarının yapısal bütünlüğünü tehlikeye atabilecek agresif ayrışma protokolleri gerektirebilir. Üçüncüsü, bazı hücreler (örneğin megakaryositler) çapı 100 μm'yi aşabilir ve mevcut birkaç ticari tek hücreli platform için zorluklar yaratabilir13. Ek olarak, yanlış kullanım, enzimatik hidroliz ve mekanik ayrışmayı içeren hücre izolasyonunun ilk adımları sırasında hücresel hasara ve stres tepkilerine yol açabilir ve bu da gen ekspresyon profillerinietkileyebilir 11,14.
Bu ve diğer nedenlerden dolayı, tek hücre yöntemlerine göre tek çekirdekli bir yaklaşım tercih edilebilir bir alternatif olabilir15. Nükleer zarın hücre zarına kıyasla üstün stabilitesi göz önüne alındığında, nükleer zarf, doku kriyoprezervasyonundan sonra bile bozulmadan kalabilir16. Bu, nükleer ekstraksiyonu kolaylaştırabilir ve yeni nesil dizileme modaliteleri için uygun numune türlerinin çeşitliliğini artırabilir. İkincisi, çekirdekler mekanik bozulmalara karşı yüksek direnç sergiler ve ayrışma sırasında daha az transkripsiyonel kayma gösterme eğilimindedir14. Bu nedenle, çekirdekler daha fazla RNA stabilitesi ve daha tekrarlanabilir transkripsiyonel profiller sağlayabilir. Tek çekirdekli yöntemlerin dikkate değer üçüncü bir avantajı, hücre boyutu kısıtlamalarının olmaması ve kardiyomiyositler veya megakaryositler gibi daha büyük hücreler için uygulanabilirliğidir12. Dördüncüsü, çekirdekler, gen ekspresyonu, erişilebilir kromatin bölgeleri ve diğer parametrelerin17 entegre analizinden genişletilmiş içgörüler sunan multiomik analizler için uygun substratlar olarak hizmet eder ve hücre heterojenliği, gelişimi ve fonksiyonel durumlarının daha derin anlaşılmasını sağlar18.
Multiomik yaklaşımlar, hematopoietik gelişim sırasında iPSC'lerin profilini çıkararak, normal veya patolojik hastalık modellerinde gelişimsel süreçleri tanımlamaya yardımcı olabilir. iPSC'den türetilen hücrelerin birincil hücreler veya dokularla karşılaştırılması, iPSC modelinin in vivo biyolojiye uygunluğunun bir değerlendirmesini sağlayabilir, iPSC modelinin iyileştirilmesini ve yeni hücre popülasyonlarının ve kan oluşumunu yönlendiren faktörlerin keşfedilmesini kolaylaştırabilir.
Her ne kadar birçok grup nükleer izolasyon ve bunun sonucunda ortaya çıkan yeni nesil dizileme analizinde başarılı bir şekilde gezinmiş olsa da, yüksek kaliteli çekirdekleri izole etmek, tek çekirdek tabanlı analizler yapmakla ilgilenen bazı laboratuvarların önünde bir engel olmaya devam etmektedir. Bu el yazması, daha önce dondurularak rezerve edilmiş iPSC'den türetilmiş hücrelerden kaliteli çekirdekleri izole etmek için bir protokolü detaylandırmaktadır. Yapışık stromal/endotelyal hücrelere ve yapışık olmayan hematopoietik progenitör hücrelere odaklandık, çünkü bunlar, yeni nesil dizileme veya diğer deneyler için uygun olan yüksek kaliteli çekirdeklerin geri kazanımını artırmak için özel modifikasyonlar ve sorun giderme gerektiren yapı ve içerik açısından çok farklı hücre tiplerini temsil eder.
Protokol
1. Hücrelerin dondurularak saklanması
- 1 mL başına >1 x 106 izole iPSC türevi hücreyi 1 mL% 90 FBS ve% 10 DMSO'da dondurun. Donma hızını azaltmak ve canlı hücre geri kazanımını optimize etmek için kriyoviyalleri -80°C'de bir dondurma kabına koyun (Malzeme Tablosu). Kültür koşullarına ve hücre kimliğine bağlı olarak değişebilen önemli hücre kaybını tahmin edin.
- 24 saat içinde -80 °C'den sıvı nitrojen deposuna geçin.
2. Hücrelerin çözülmesi
- Sıvı nitrojen deposundan kriyovial alın ve 37 ° C'lik bir su banyosunda 2 dakika çözdürün. Küçük buz kristalleri hala görünürken su banyosundan çıkarın.
- Hücreleri kriyoviyalden boş bir 15 mL'lik tüpe aktarın ve dikkatlice karıştırırken yavaşça 10 mL önceden ısıtılmış ortam (RPMI 1640 +% 10 FBS) ekleyin. 25 ° C'de 3 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı aspire edin ve% 2 FBS ve 1 mM CaCl2 (Malzeme Tablosu) ile desteklenmiş 1 mL DPBS'de sulandırın. 1000 μL'lik bir mikropipet ile 3x pipetleyerek dikkatlice karıştırın. 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın.
3. Ölü hücrelerin uzaklaştırılması
- 1 mL hücre süspansiyonuna 50 μL ölü hücre temizleme kokteyli (Malzeme Tablosu) ekleyin. Hücre karışımına 50 μL Biotin seçim kokteyli ekleyin. Oda sıcaklığında 3 dakika inkübe edin. Bu adımlar, hücre süspansiyonu içinde bulunan Annexin V + ölü hücrelerini biotin ile etiketler.
- 30 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde girdap, biyotin ile etiketlenmiş istenmeyen hücre tiplerinin tükenmesi için tasarlanmış dekstran boncuklar (Malzeme Tablosu). Hücre süspansiyonuna 100 μL dekstran boncuk ekleyin ve 1000 μL'lik bir mikropipet (Malzeme Tablosu) ile 2x yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyerek karıştırın.
- Hücre süspansiyonuna %2 FBS ve 1 mM CaCl2 içeren 1,3 mL DPBS ekleyin ve 1000 μL'lik bir mikropipet ile 2 kez yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyerek karıştırın. Tüpü mıknatısın içine yerleştirin (Malzeme Tablosu) ve oda sıcaklığında 3 dakika inkübe edin.
- Zenginleştirilmiş canlı hücre süspansiyonunu yeni bir 15 mL konik tüpe dökmek için mıknatısı ve tüpü ters çevirin. 400 x g'da 4°C'de 3 dakika santrifüjleyin. Süpernatantın çoğunu çıkarın ve 1 mL DPBS +% 0.04 BSA'da yeniden süspanse edin. 1000 μL'lik bir mikropipet ile 3x pipetleyerek nazikçe karıştırın.
4. Çekirdeklerin izolasyonu
- Canlı hücre süspansiyonunu 460 x g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin ve ardından süpernatanı aspire ederek hücre peletinin bozulmamasını sağlayın.
- Buz üzerinde soğutulmuş 100 μL taze hazırlanmış 0,5x lizis tamponu ekleyin (Tablo 1) ve 100 μL'lik bir mikropipet ile 10x pipetleyerek hafifçe karıştırın. Buz üzerinde 3 dakika inkübe edin.
- Karıştırmadan tüpe 500 μL soğutulmuş yıkama tamponu (Tablo 2) ekleyin. 600 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
5. Çekirdeklerin yıkanması ve değerlendirilmesi
- Süpernatanı aspire edin ve kalan bozulmamış peleti karıştırmadan çözmek için 500 μL soğutulmuş yıkama tamponu ekleyin. 600 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Çekirdek peletini bozmadan tüm süpernatantıları çıkarın.
- 120 μL soğutulmuş seyreltilmiş çekirdek tamponunda yeniden süspanse edin (Tablo 3). 40 μm'lik bir hücre süzgeci kullanarak hücre süspansiyonunu filtreleyin (Malzeme Tablosu).
- % 0.4 tripan mavisi ile boyayın ve izole edilmiş çekirdeklerin kalitesini 10x mikroskopta görsel olarak değerlendirin (Malzeme Tablosu).
6. İzole edilmiş çekirdeklerin işlenmesi
- Çekirdekleri buz üzerinde tutun. Zamanla nükleer topaklanma meydana gelebileceğinden ve ek filtreleme adımları gerektirebileceğinden, hemen daha fazla işleme geçin.
Sonuçlar
Dondurularak korunmuş iPSC'den türetilmiş yapışık stromal/endotel hücrelerinden ve yapışık olmayan (yüzen) hematopoietik progenitör hücrelerden çekirdekleri çıkarmak için yukarıda belirtilen protokolü kullandık. Nükleer izolasyon prosedürünün ayrıntılı bir şematik gösterimi Şekil 1'de bulunabilir.
Morfolojik inceleme için, izole edilmiş çekirdekler tripan mavisi ile boyandı ve mikroskop altında görüntülendi. Nükleer morfolojik inceleme, işlemeden hemen önce kritik öneme sahiptir, çünkü enkaz veya kümelenmiş çekirdekler, hassas mikroakışkan aletlerdeki tıkanıklıklar nedeniyle kaliteli veri üretimini azaltabilir veya önleyebilir. Konvansiyonel bir kit protokolü kullanılarak hazırlanan bir numuneden izole edilen çekirdeklerin mikroskobik incelemesi, görselleştirilmiş alan başına enkaz ve ≥1 nükleer agreganın varlığını göstermiştir (Şekil 2A-B). Bu numuneler düşük kalite nedeniyle atıldı.
Yüksek kaliteli çekirdekler yuvarlak ve sağlamdır, yöntem optimizasyonundan sonra gözlemlediğimiz gibi çok az topak vardır veya hiç kümelenmez (Şekil 2C-D). Bu örneklerde herhangi bir agrega veya topaklanma gözlemlemedik. Bu çekirdekler, sonraki işleme ve analizi desteklemek için yeterli kalite ve miktardaydı. Benzer sorun giderme ve protokol optimizasyonu, potansiyel olarak diğer dondurularak korunmuş hücre tiplerine kadar uzanabilir.
Şekil 1: Dondurularak saklanmış hücrelerden çekirdek ekstraksiyonunu gösteren diyagram. Dondurularak saklanmış hücrelerden nükleer izolasyonda yer alan adımları detaylandıran görsel tasvir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Dondurularak saklanmış insan iPSC'den türetilmiş hücrelerden izole edilen çekirdekler. Tripan mavisi ile boyanmış yapışık stromal/endotel hücrelerinden izole edilen çekirdekler, aşağı akış analizlerini engelleyen önemli kalıntılar, (A) küçük parçacıklar ve (B) nükleer agregatlar (büyük parçacık) gösterir. Burada sunulan teknik modifikasyonlar gerçekleştirildikten sonra, (C) dondurularak korunmuş insan iPSC'den türetilmiş hematopoietik progenitör hücrelerden veya (D) stromal/endotel hücre popülasyonlarından, aşağı akış analizlerini desteklemek için yeterli miktarlarda yüksek kaliteli çekirdekler izole edildi. Referans olarak, bu yapışık olmayan hematopoietik progenitör hücreler,4'te tarif edildiği gibi hematopoietik farklılaşmanın 9 + 8. gününde ve yapışık stromal/endotel hücreleri, hematopoietik farklılaşmanın 9 + 7. gününde toplandı. Nükleer morfolojinin hücre tipleri arasında farklılık gösterebileceğini unutmayın. Ölçek çubuğu: 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Tampon Hazırlama | |||
| 0.5X Lizis tamponu | Stok | Son | 2 mL |
| 1X Lizis Tamponu | 1 katı | 0,5 kat | 1 mL |
| Lizis Seyreltme Tamponu | 1 mL | ||
| Lizis Tamponu | Stok | Son | 2 mL |
| BSA | 10% | 1% | 200 μL |
| Sayısallık | 5% | 0.01% | 4 μL |
| DTT (Türkçe) | 1000 milyon | 1 milyon | 2 μL |
| MgCl2 | 1 AYLIK | 3 milyon | 6 μl |
| NaCl (Sıvı Miktarı) | 5 AYLIK | 10 milyon | 4 μL |
| Nonidet P40 İkamesi | 10% | 0.10% | 20 μL |
| Nükleaz İçermeyen Su | 1.67 mL | ||
| RNaz inhibitörü | 40 U/μl | 1 U/μl | 50 μl |
| Tris-HCl (pH 7.4) | 1 AYLIK | 10 milyon | 20 μL |
| Ara-20 | 10% | 0.10% | 20 μL |
| Lizis Seyreltme Tamponu | Stok | Son | 2 ml |
| BSA | 10% | 1% | 200 μl |
| DTT (Türkçe) | 1000 milyon | 1 milyon | 2 μL |
| MgCl2 | 1 AYLIK | 3 milyon | 6 μL |
| NaCl (Sıvı Miktarı) | 5 AYLIK | 10 milyon | 4 μL |
| Nükleaz İçermeyen Su | 1.72 mL | ||
| RNaz inhibitörü | 40 U/μl | 1 U/μl | 50 μl |
| Tris-HCl (pH 7.4) | 1 AYLIK | 10 milyon | 20 μl |
Tablo 1: 0.5x Lizis tamponunun hazırlanması. Bu çözüm, adım 4.2'deki çekirdek izolasyon prosedürü için tasarlanmıştır. Lizis tamponu ve lizis seyreltme tamponu, 0.5x lizis tamponu hazırlamak için karıştırılır. Her deneyden hemen önce taze tampon hazırlamak ve buz üzerinde tutmak zorunludur. Bazı hücre tipleri için sorun gidermenin, bozulmamış çekirdek izolasyonunu kolaylaştırmak için 1x, 0.5x veya daha düşük lizis tamponu seyreltmelerini içerebileceğini unutmayın.
| Tampon Hazırlama | |||
| Yıkama Tamponu | Stok | Son | 4 mL |
| BSA | 10% | 1% | 400 μL |
| DTT (Türkçe) | 1000 milyon | 1 milyon | 4 μL |
| MgCl2 | 1 AYLIK | 3 milyon | 12 μL |
| NaCl (Sıvı Miktarı) | 5 AYLIK | 10 milyon | 8 μL |
| Nükleaz İçermeyen Su | 3.40 mL | ||
| RNaz inhibitörü | 40 U/μl | 1 U/μl | 100 μL |
| Tris-HCl (pH 7.4) | 1 AYLIK | 10 milyon | 40 μL |
| Ara-20 | 10% | 0.10% | 40 μL |
Tablo 2: Yıkama tamponunun hazırlanması. Bu çözelti çekirdek izolasyonu sırasında kullanılır. Bu, her deneyden önce taze olarak hazırlanmalı ve buz üzerinde tutulmalıdır.
| Tampon Hazırlama | |||
| Seyreltilmiş Çekirdek Tamponu | Stok | Son | 1 mL |
| DTT (Türkçe) | 1000 milyon | 1 milyon | 1 μL |
| Nükleaz İçermeyen Su | 924 μL | ||
| Çekirdek Tamponu | 20 kat daha fazla | 1 katı | 50 μL |
| RNaz inhibitörü | 40 U/μL | 1 U/μL | 25 μL |
Tablo 3: Seyreltilmiş çekirdek tamponunun hazırlanması. Bu çözüm adım 5.2'de kullanılmıştır. Her deneyden önce taze olarak hazırlanmalı ve buz üzerinde tutulmalıdır.
Tartışma
Protokol içindeki kritik adımlar
Yüksek kaliteli çekirdeklerin izole edilmesi, hızla gelişen mevcut tek çekirdek tabanlı yeni nesil dizileme modalitelerinin başarılı bir şekilde uygulanması için esastır. Bu yaklaşımlarla, özellikle de dondurularak korunmuş örneklerle ilgilenen laboratuvarlar için mevcut engelleri göz önünde bulundurarak, niyetimiz daha önce donmuş hücreler için özel olarak tasarlanmış bir nükleer izolasyon tekniği oluşturmaktı. Dondurularak saklanmış örneklerden çekirdeklerin izole edilmesi, klinik örnekler ve nadir iPSC'den türetilmiş hücre popülasyonları için genellikle gereklidir.
Belirli hücre popülasyonları için lizis tamponu seyreltmesini, lizis süresini ve filtrasyon frekansını uyarlamak önemlidir. Dondurularak saklanmış insan iPSC'den türetilmiş hematopoietik progenitör hücreler gibi özellikle hassas hücre tiplerinin, 1x lizis tamponu ile bir dakikadan daha kısa sürede aşırı parçalandığını gözlemledik. Bu tür bir aşırı liz sadece teknik veya operasyonel bir arıza değildir. Aksine, aşırı parçalanma ve topaklanma, yapışkan nükleer maddelerin sızdığını gösterebilir. Sağlam hücre iskeleti mimarisine ve güçlü hücre-hücre adezyonları oluşturma eğiliminde olan zarlara sahip yapışık stromal ve endotel hücreleri için, kümelenmiş çekirdekleri çıkarmak için çift filtrasyon gerekliydi. Nükleer agregalar, mikroakışkan kanalları tıkayabilir, deneysel bütünlük için somut riskler sunabilir ve potansiyel olarak herhangi bir veri çıkışını engelleyebilir.
Ayrıca, bir ölü hücre çıkarma adımının dahil edilmesinin, topaklanma ve döküntüleri sınırlarken sağlam çekirdeklerin geri kazanımını önemli ölçüde artırdığını bulduk. Deneyin başlangıcında tripan mavisi boyamaya dayalı olarak %>70 canlı hücre içeren numunelerin işlenmesi gerekli olmuştur. Tüm tamponları buz üzerinde tutmak da canlılığın korunmasına yardımcı olabilir.
Tekniğin sınırlamaları
Açıklanan yöntem, kültürlenmiş iPSC'den türetilmiş hücre tiplerinden4 nükleer geri kazanımı optimize etmek için tasarlanmıştır. Benzer sorun giderme prosedürlerinin, diğer dondurularak korunmuş hücre tiplerini içerecek şekilde iPSC ile indüklenen hücrelerin ötesine geçmesi mümkündür, ancak test etmeden tek tek numuneler veya hücre tipleri için özel ihtiyaçları tahmin etmek biraz zordur. Numune veya hücre tipinden bağımsız olarak, %<5 kalan canlı bütün hücrelerle nükleer preparatları hedeflemek, agregasyonu en aza indirmek ve aşırı parçalanmış çekirdekleri azaltmak, deneysel başarı ile doğrudan ilişkili olmalıdır.
Mevcut yöntemlere göre önemi
Translasyonel olarak ilgili iPSC tabanlı farklılaşma sistemleri, çok sayıda hücre tipi ve öncül üretebilir. Bu protokol, nükleer izolasyonu optimize etmek için farklı metodolojik gereksinimlere sahip örnek hücre tipleri olarak iPSC'den türetilmiş yapışık stromal/endotelyal hücrelere ve yapışık olmayan hematopoietik progenitör hücrelere odaklanmaktadır. Bu protokolün, protein içeriğine, zar yapısına ve hücre sertliğine bağlı olarak izolasyon yöntemlerine ince ayar yapmanın gerekli olduğunu kabul ederek, önemli gelişim aşamalarını sorgulamak için diğer iPSC'den türetilmiş hücre tiplerine uyarlanabileceğini ve uygulanabileceğini tahmin ediyoruz. Bununla birlikte, burada açıklanan metodoloji, geniş bir kriyoprezervasyon hücre tipleri yelpazesinden yüksek kaliteli çekirdeklerin geri kazanılmasına izin verebilir.
Açıklamalar
Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Yazarlar, rehberlik ve önerileri için Jason Hatakeyama'ya (10x Genomik) ve Diana Slater'a (Philadelphia Uygulamalı Genomik Merkezi Çocuk Hastanesi) teşekkür eder. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (CST'ye HL156052) tarafından desteklenmiştir.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| <>Hücre Kültürü Reaktifleri< / güçlü > | |||
| Dimetil sülfoksit çözeltisi (DMSO) | Sigma | 673439 | |
| Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu (DPBS) | Corning | 21031CV | |
| Fetal Sığır Serumu (FBS) | GeminiBio | 100106 | |
| RPMI Orta 1640 (1X) | Gibco | 11875093 | |
| Hücreler | |||
| indüklenmiş pluripotent kök hücreler | N/A | N/A | Bu çalışmada kullanılan iPSC'ler, CHOP İnsan Pluripotent Kök Hücre Çekirdek Tesisi |
| Hücre Boyama Reaktifleri | |||
| Tripan Mavisi | Çözeltisi Corning | 25900CI | |
| güçlü > Ölü Hücre Temizleme Reaktifleri< / güçlü > | |||
| Kalsiyum klorür (CaCl 2 < / sub >) | Sigma | C4901 | |
| EasySep Ölü Hücre Giderme (Annexin V) Kiti | Kök Hücre Teknolojileri | 17899 | Bu kit, biotin ile etiketlenmiş istenmeyen hücre tiplerinin tükenmesi için tasarlanmıştır. Kit, Ölü Hücre Giderme (Annexin V) Kokteyli, Biotin Selection Kokteyli ve Dekstran boncukları içerir. Bu kit, Annexin V kullanarak apoptotik hücrelerin hücre zarının dış broşüründeki fosfatidilserini hedefler. İstenmeyen hücreler Annexin V, Biyotinillenmiş antikorlar ve manyetik parçacıklar ile etiketlenir ve bir EasySep mıknatısı kullanılarak sütunlar olmadan ayrılır. İstenilen hücreler basitçe yeni bir tüpe dökülür. |
| < güçlü > Malzemeler< / güçlü> | |||
| 10 ve mikro; l Mikropipet | Koğuşları bilim | 470231606 | |
| 100 ve mikro; l Mikropipet | Koğuşları bilim | 470231598 | |
| 1000 ve mikro; l Genişletilmiş Üniversal | Uç Oxford Lab Ürünleri | OAR-1000XL-SLF | |
| 1000 & l Mikropipet | Koğuşları bilim | 470231602 | |
| 2.0 ml Kriyojenik şişeler | Corning | 431386 | |
| 20 & mikro; l Mikropipet | Koğuşları bilim | 470231608 | |
| 200 ve mikro; l Mikropipet | Koğuşları bilim | 470231600 | |
| 5ml Polistiren Yuvarlak Tabanlı Tüp | Şahin | 352063 | |
| Corning DeckWork 0.1-10 & l Pipet Ucu İstasyonu | Corning | 4143 | |
| Corning DeckWork 1-200 & l Pipet Ucu İstasyonu | Corning | 4144 | |
| Sayma odası | CytoSMART | 699910591 | |
| Flowmi Hücre Süzgeci, 40 & m | Bel-Art | H136800040 | |
| Mıknatıslı | Kök Hücre Teknolojileri | 18000 | |
| NALGENE Cryo 1° C Dondurma Kabı | Nalgene | 51000001 | |
| Çekirdek İzolasyon Reaktifleri | Çekirdek izolasyon reaktifleri Lysis Buffer, Yıkama tamponu ve seyreltilmiş çekirdek tamponu ve lizis seyreltme tamponu. Bu tamponların yapısı Tablo 1, 2 ve 3'te yer almaktadır. Çekirdek izolasyon yöntemimiz, standart kit protokollerinden (örneğin, 10x Genomics Chromium Next GEM Tek Hücreli Çoklu ATAC + Gen İfadesi Kullanıcı Kılavuzu [CG000338]) izolasyonu iyileştirdi. Bu protokol, Chromium Next GEM Tek Hücreli Çoklu ATAC + Gen Ekspresyon Reaktif Paketi, 16 rxns (PN-1000283) dahil olmak üzere çeşitli ticari kitlerle kullanılabilir. | ||
| Ölü Hücre Temizleme kiti | STEMCELL | 17899 | |
| Digitonin | Thermo Fisher Scientific | BN2006 | |
| DL-Dithiothreitol çözeltisi (DTT) | Sigma | 646563 | |
| Flowmi Hücre Süzgeci, 40 & m | Bel-Art | H136800040 | |
| MACS sığır serum albümini (BSA) stok Çözeltisi | Miltenyi Biotec | 130091376 | |
| Magnezyum klorür (MgCl2) | Sigma | 7786303 | |
| Magnezyum Klorür Çözeltisi, 1 M | Sigma | M1028 | |
| Nonidet P40 İkame | Sigma | 74385 | |
| Nükleaz İçermez Su | Thermo Fisher Scientific | AM9937 | |
| Çekirdek Tamponu (20X) | 10X Genomik | 2000153 | |
| Koruyucu RNaz inhibitörü | Sigma | 3335399001 | |
| Sodyum klorür (NaCl) | Sigma | S7653-250G | |
| Sodyum Klorür Çözeltisi, 5 M | Sigma | 59222C | |
| Trizma Hidroklorür Ruhu, pH 7.4 | Sigma | T2194 | |
| Trizma hidroklorür (Tris-HCl) (pH7.4) | Sigma | T3252-500G | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| Diğer ekipman | |||
| Otomatik hücre sayacı | CytoSMART | 699910591 | |
| Mikroskobu | Zeiss | Primostar 3 |
Kaynaklar
- Ito, Y., et al. Turbulence activates platelet biogenesis to enable clinical scale ex vivo production. Cell. 174 (3), 636-648 (2018).
- An, H. H., et al. The use of pluripotent stem cells to generate diagnostic tools for transfusion medicine. Blood. 140 (15), 1723-1734 (2022).
- Zeng, J., Tang, S. Y., Toh, L. L., Wang, S. Generation of "Off-the-Shelf" Natural Killer Cells from Peripheral Blood Cell-Derived Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rep. 9 (6), 1796-1812 (2017).
- Pavani, G., et al. Modeling primitive and definitive erythropoiesis with induced pluripotent stem cells. Blood Adv. , (2024).
- Chen, X., et al. Integrative epigenomic and transcriptomic analysis reveals the requirement of JUNB for hematopoietic fate induction. Nat Comm. 13 (1), 3131(2022).
- Yu, X., Abbas-Aghababazadeh, F., Chen, Y. A., Fridley, B. L. Statistical and bioinformatics analysis of data from bulk and single-cell RNA sequencing experiments. Methods Mol Biol. 2194, 143-175 (2021).
- Jovic, D., et al. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview. Clin Transl Med. 12 (3), e694(2022).
- Choi, K. D., et al. Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (3), 553-567 (2012).
- Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).
- Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nat med. 26 (5), 792-802 (2020).
- Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: Rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. J Am Soc Nephrol. 30 (1), 23-32 (2019).
- Nadelmann, E. R., et al. Isolation of nuclei from mammalian cells and tissues for single-nucleus molecular profiling. Curr Protoc. 1 (5), e132(2021).
- Del-Aguila, J. L., et al. A single-nuclei RNA sequencing study of Mendelian and sporadic AD in the human brain. Alzheimer's Res Ther. 11 (1), 71(2019).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PloS one. 13 (12), e0209648(2018).
- Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. A., Lee, H. O. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues. J Pathol Transl Med. 57 (1), 52-59 (2023).
- Maciejowski, J., Hatch, E. M. Nuclear membrane rupture and its consequences. Ann Rev Cell Dev Biol. 36, 85-114 (2020).
- Fang, R., et al. Comprehensive analysis of single cell ATAC-seq data with SnapATAC. Nat Comm. 12 (1), 1337(2021).
- Baysoy, A., Bai, Z., Satija, R., Fan, R. The technological landscape and applications of single-cell multi-omics. Nat Rev. Mol Cell Biol. 24 (10), 695-713 (2023).
Yeniden basım ve izinler
