Yetişkin Zebra Balıklarında Vücut Hasarını ve İlişkili Mortaliteyi En Aza İndiren Bir İntraperitoneal Enjeksiyon Tekniği

Zebra balığı (Danio rerio), insan hastalıklarını incelemek için deneysel bir model olarak dikkat çekmiştir, çünkü bu hayvan, insanlara yüksek gen ve organ homolojisi, dış döllenme, genetik manipülasyon kolaylığı ve erken olgunluğa kadar vücut şeffaflığını kapsar ve bu da sayısız görüntüleme uygulamasını kolaylaştırır¹. Zebra balığı embriyoları ve larvaları için ilaçları doğrudan suya verme sürecinin aksine, yetişkin zebra balıklarına ilaç vermek daha karmaşık ve zorlu bir çaba sunar².

Yetişkin balıklarda bileşikler, suya doğrudan uygulama gibi pasif ilaç verme teknikleriyle veya gavaging² gibi oral ilaç verme yöntemleriyle verilebilir. Diğer yaklaşımlar arasında balık yeminin bileşiklerle kaplanması ve ardından balıkların³ beslenmesi ve retro-orbital veya intraperitoneal enjeksiyonlar ^4,5 dahil olmak üzere önceden belirlenmiş bir konsantrasyonda suda çözünmeyen ilaçların doğrudan uygulanması yer alır. İntraperitoneal uygulama, belirgin farmakokinetik avantajları nedeniyle hastalık modellerinin in vivo çalışmaları için tercih edilir⁶. Bu yöntem, periton boşluğu içinde yüksek bir ilaç konsantrasyonu ve uzun bir yarı ömür sağlayarak ilaç dağıtımı için etkili bir yol sunar ^7,8. Yaklaşım, optimal ilaç emilimini ve dağıtımını sağlamak için araştırma ortamlarında yaygın olarak kullanılmaktadır ⁹. Enjeksiyon bazlı yöntemler tek doğum için etkili olsa da, uzun süreli ve tekrarlanan enjeksiyonlar genellikle vücut hasarına ve kronik enfeksiyona yol açar².

Şu anda, erişkin zerbafish'te iki IP enjeksiyonu yöntemi vardır ^4,10. Bununla birlikte, her iki yöntemin de doksorubisin gibi toksik bileşikler verirken sınırlamaları vardır, bu da vücut şeklinde ciddi hasara ve balık ölümlerine yol açar. Yan etkiler, verilerin yorumlanmasını önemli ölçüde karmaşıklaştırabilir. Bu zorluklar kapsamlı eğitim¹⁰ ile ele alınabilse de, yan etkileri en aza indiren yeni bir IP enjeksiyon yöntemine açık bir ihtiyaç vardır.

Burada amacımız, doksorubisin'in yetişkin zebra balıklarına etkili bir şekilde verilmesi için optimize edilmiş yeni bir IP enjeksiyon yöntemi geliştirmek ve en aza indirilmiş vücut hasarı ve buna bağlı mortalite ile güvenilir doksorubisin kaynaklı kardiyomiyopati (DIC) modellerinin oluşturulmasını kolaylaştırmaktır.

Gerçekleştirilen tüm prosedürler, 'Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nda (National Academies Press, 2011) belirtilen standartlara bağlı kalarak Mayo Clinic Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Çalışmadaki tüm zebra balıkları Yabani Hint Karyotipi (WIK) suşuna aittir. Reaktiflerin ve çalışma için kullanılan ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Doksorubisin stok çözeltisinin hazırlanması ve saklanması

1. Doksorubisin stoğunu ticari bir kaynaktan temin edin.
   NOT: Doksorubisin ışığa duyarlıdır, bu nedenle toz halinde alın ve ışığa maruz kalmasını önlemek için opak kaplarda saklayın. Dox tozu hazırlama için tüm adımları bir kimyasal başlık içinde gerçekleştirin.
2. Dox tozunu damıtılmış suda tamamen çözün ve nihai konsantrasyonu 5 mg/mL olan bir stok çözeltisi hazırlayın.
3. Stoğu 1,5 mL'lik tüplere bölerek ayırın.
4. Tüpleri ışığa maruz kalmaktan korumak için alüminyum folyoya sarın.
5. Aliquot Dox solüsyonunu kısa süreli depolama için 4 °C'de (<1 ay) veya uzun süreli depolama için -20 °C'de^{saklayın 10}.

2. Balıkların vücut ağırlıklarına göre gruplandırılması

1. Sonraki enjeksiyon için BW farkı% 10'dan az olan balıkları birlikte gruplandırın.
   NOT: Bu aşamada emekten tasarruf etmek için, 'dan daha az BW varyansına sahip balıklar aynı boyutta olarak kategorize edilir.
2. Enjeksiyondan önce balığın 24 saat oruç tutmasına izin verin.
3. Balıkları 0.16 mg / mL tricain içeren embriyo suyu kullanarak 1 dakika boyunca uyuşturun.
4. Balıkları tricaine ile sudan çıkarın ve fazla suyu çıkarmak için balık gövdesinin her iki tarafını temiz filtre kağıdı ile ovalayın.
5. Her balığın BW'sini ölçün ve kaydedin, ardından balığı derhal taze sistem suyuyla dolu bir geri kazanım tankına geri koyun.
   NOT: Balıklara 3 aylık olduktan sonra Dox enjeksiyonu yapılmıştır. Bu çalışmada araştırmacılar 3 aylık ila 10 aylık balıkları kullandılar. Olgun WIK türü zebra balığının BW'leri 0,2 g ila 0,5 g arasında değişebilir. 5 dakikadan fazla süren uzun süreli anestezi ve ardından Dox enjeksiyonu, yüksek balık ölümlerine yol açtı.

3. Enjeksiyon için iğne ve istasyonun hazırlanması

1. Hedeflenen 20 μg/g dozu elde etmek için ortalama vücut ağırlığına dayalı olarak her balık için gereken Dox stok çözeltisinin enjeksiyon hacmini (örn. 5 mg/mL) belirleyin.
2. Enjeksiyon hacmini hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın:
   
3. Enjeksiyon için 1. adımda hesaplanan Dox çözeltisini seyreltmek için 1x Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ekleyin ve toplam 5 μL hacme ulaşın.
   NOT: Her balık grubu için BW'lerine göre toplu çözelti kullanın ve deney süresince enjeksiyon için çözelti sıkıntısı olmamasını sağlamak için her gruba 3 balık daha ekleyin.
4. Tüpü hafifçe vurun ve ardından çözeltiyi oda sıcaklığında 10 saniye boyunca toplamak için en yüksek hızda kısa bir süre mikrosantrifüj edin.
5. Hazırlanan çözeltiyi buzun üzerine yerleştirin ve ışığa maruz kalmaktan koruyun.
6. Diseksiyon mikroskobunun altına süngerli 100 mm'lik temiz bir Petri kabı yerleştirin, ardından odağı ayarlayın.
   NOT: Sünger 4 cm uzunluğunda bir oluk içerir. Süngerin elastik olarak geri çekilmesi balığa destek sağlayacak ve balık gövdesini yerinde tutacaktır. Sünger tekrar kullanılabilir.
7. 10 μL'lik bir mikro şırıngayı 34 G eğimli bir iğne ile donatın.
8. Şırıngadaki kabarcıkları ortadan kaldırmak ve olası tıkanıklıkları gidermek için iğneyi 1x HBSS tamponu ile yıkayın.
9. Enjeksiyon için 4. adımda hazırlanan çözeltinin 5 μL'sini ölçün.

4. IP Dox enjeksiyon prosedürü

1. Bilinç kaybı durumuna neden olmak için yetişkin balığı 0.16 mg / mL trikain ile 1 dakika suya koyun.
2. Balıkları, karın yukarı bakacak şekilde gömülü süngerin oluğuna yerleştirin (Şekil 1A).
3. İğneyi, göğüs yüzgecinin orta noktasından başlayarak kalp boşluğunun arka tarafına doğru 0°'ye yakın bir açıyla yerleştirin (Şekil 1B).
   NOT: İşlem sırasında kalp ile herhangi bir temastan kaçının.
4. İğneyi kuyruğa doğru yönlendirin ve gümüş derinin altına girin.
   NOT: İğneyi, herhangi bir çizilme veya delinmeyi önlemek için dikkatli olarak gümüş tenin yakınına yerleştirin.
5. Tüm operasyon boyunca karın boşluğu içindeki iğne ucunu izleyin (Şekil 1C).
   NOT: Karaciğere, bağırsaklara, yüzme kesesine ve diğer organlara zarar vermekten kaçının. İğnenin bağırsağın sonuna, kloakal foramenin yakınına ulaştığından emin olun.
6. 5 μL Dox solüsyonunu kademeli ve eşit bir şekilde dağıtın, ardından herhangi bir sızıntıyı önlemek için iğneyi orijinal yol boyunca yavaşça geri çekin (Şekil 1D).
7. Dox solüsyonunun kırmızı renklenmesini gözlemleyerek karın boşluğunu Dox varlığı açısından izleyin (Şekil 1E).
8. Balığın iyileşmesine yardımcı olmak için enjekte edilen balığı hızlı bir şekilde taze sistem suyuyla dolu temiz bir geçiş tankına taşıyın.
   NOT: Enjeksiyonlar arasında iğneyi 1x HBSS tamponu ile bir kez yıkayın.

5. Enjeksiyon sonrası balık yönetimi

1. Enjeksiyondan sonra balığı sirkülasyon ile sisteme geri koyun.
2. İyileşmelerini kolaylaştırmak için enjekte edilen tüm balıkları 24 saat daha hızlı tutun.
3. İlk hafta boyunca balıkları yakından takip edin. Diğer balıklara bulaşmasını önlemek için ölen balığı mümkün olan en kısa sürede çıkarın.
   NOT: İlk 24 saat içinde balık ölümleri muhtemelen enjeksiyondan veya uzun süreli anesteziden kaynaklanan fiziksel yaralanmalardan kaynaklanmaktadır. Bir hayatta kalma eğrisi oluşturmak için balık sayılarını kaydedin.
4. Enjeksiyondan 56 gün sonra Dox enjekte edilen balığı fenotiplemek için ekokardiyografi yapın¹¹.
   NOT: HBSS çözeltisi enjekte edilen ilgili kontrol grubu için koşullarda ve prosedürlerde tekdüzelik sağlayın.

Daha önce, yetişkin zebra balıklarında doksorubisin uygulaması için iki intraperitoneal (IP) yöntem kullanılmıştır 4,10. Kinkel ve ark.4 tarafından tarif edildiği gibi Klasik IP enjeksiyon yöntemi olarak da bilinen yöntem I'de, iğne, karın yukarı bakacak şekilde pelvik yüzgeçler arasındaki orta hatta 45°'lik bir açıyla yerleştirildi. Yöntem II'de veya Ma ve ark.10 tarafından tarif edildiği gibi Alternatif IP enjeksiyon yönteminde, iğne balığın dorsal tarafından sokulmuştur (Şekil 2A(i,ii)). Buna karşılık, yöntem III'ün iki büyük değişikliği var. İlk olarak, enjeksiyonun pozisyonu, karın yukarı bakacak ve iğne göğüs yüzgecinin orta noktasından karın içine doğru yönlendirilecek şekilde değiştirilir. Penetrasyon bölgesi, bu alandaki doğal bir delik tarafından yönlendirilir. İkinci olarak, iğnenin açısı 0°'ye yakın olması gereken şekilde azaltılır (Şekil 2A(iii), Şekil 1).

Üç intraperitoneal enjeksiyon yöntemi arasında karşılaştırma
Üç IP enjeksiyon yöntemini karşılaştırmak için, zebra balığı ile daha önce deneyimi olmayan Araştırmacı I'den elde edilen veriler sunulmuştur. IP enjeksiyonu için yöntem I ve II kullanıldığında, IP enjeksiyonunu takip eden ilk iki hafta içinde önemli balık ölümleri kaydedildi. Yöntem I'de ölüm enjeksiyondan üç gün sonra, yöntem II'de ise enjeksiyondan iki gün sonra meydana geldi. Enjekte edilen balıkların p'i, özellikle enjeksiyon bölgesi çevresinde, IP enjeksiyonundan bir ila iki ay sonra büyük ölçüde azalmış vücut boyutu ve kavisli vücut şekli olarak kendini gösteren görünür vücut hasarı sergilemiştir (Şekil 2A (iv,v)). Mortalitenin ve gözlenen hasarın, enjeksiyon işlemi sırasında enjeksiyon iğnesinin açılış ucundan sızabilen ve enjeksiyon yolu boyunca iç organa zarar verebilen doksorubisin12'nin toksisitesine atfedilebileceği düşünüldü. Yöntem I'de, enjeksiyon iğnesinin ucu bağırsağa temas edebilir (Şekil 2A(i)), yöntem II'de ise yüzme kesesine temas edebilir (Şekil 2A(ii)). Yöntem III kullanılarak iğne ucunun herhangi bir iç organa temas etmesinin önlenebileceği varsayılmıştır (Şekil 2A(iii)

Hiç kimse.