Yetişkin zebra balıklarında yeni bir intraperitoneal (IP) enjeksiyon yöntemi tanımlanmıştır. Doksorubisin gibi toksik bileşiklerle çalışırken, bu prosedür daha önce bildirilen iki IP yönteminden daha etkilidir. Teknik, zebra balığı modelinde sınırlı deneyime sahip araştırmacılar tarafından kolayca benimsenecek şekilde tasarlanmıştır.
Yöntem makalesi
Yetişkin Zebra Balıklarında Vücut Hasarını ve İlişkili Mortaliteyi En Aza İndiren Bir İntraperitoneal Enjeksiyon Tekniği
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Genetik olarak erişilebilir olan yetişkin zebra balığı (Danio rerio), kardiyomiyopati gibi insan bozukluklarını incelemek için değerli bir omurgalı modeli olarak kullanılmaktadır. İntraperitoneal (IP) enjeksiyon, terapötik etkileri test etmek veya doksorubisin kaynaklı kardiyomiyopati (DIC) gibi hastalık modelleri oluşturmak için vücuda bileşikler veren önemli bir yöntemdir. Şu anda, iki IP enjeksiyonu yöntemi vardır. Her iki yöntemin de doksorubisin gibi toksik bileşiklerle çalışırken sınırlamaları vardır, bu da vücut şeklinde ciddi hasar ve balık ölümü olarak ortaya çıkan yan etkilere neden olur. Bu eksiklikler kapsamlı araştırmacı eğitimi ile giderilebilirken, minimum yan etkiye sahip yeni bir IP enjeksiyon yöntemi arzu edilir. Burada, toksik bileşikleri işleyebilen benzersiz bir IP enjeksiyon yöntemi rapor edilmektedir. Sürekli olarak azalan kardiyak fonksiyon, önemli balık ölümüne neden olmadan sonuçlanabilir. Bu teknik, yetişkin zebra balığı konusunda minimum deneyime sahip araştırmacılar tarafından kolayca öğrenilebilir.
Giriş
Zebra balığı (Danio rerio), insan hastalıklarını incelemek için deneysel bir model olarak dikkat çekmiştir, çünkü bu hayvan, insanlara yüksek gen ve organ homolojisi, dış döllenme, genetik manipülasyon kolaylığı ve erken olgunluğa kadar vücut şeffaflığını kapsar ve bu da sayısız görüntüleme uygulamasını kolaylaştırır1. Zebra balığı embriyoları ve larvaları için ilaçları doğrudan suya verme sürecinin aksine, yetişkin zebra balıklarına ilaç vermek daha karmaşık ve zorlu bir çaba sunar2.
Yetişkin balıklarda bileşikler, suya doğrudan uygulama gibi pasif ilaç verme teknikleriyle veya gavaging2 gibi oral ilaç verme yöntemleriyle verilebilir. Diğer yaklaşımlar arasında balık yeminin bileşiklerle kaplanması ve ardından balıkların3 beslenmesi ve retro-orbital veya intraperitoneal enjeksiyonlar 4,5 dahil olmak üzere önceden belirlenmiş bir konsantrasyonda suda çözünmeyen ilaçların doğrudan uygulanması yer alır. İntraperitoneal uygulama, belirgin farmakokinetik avantajları nedeniyle hastalık modellerinin in vivo çalışmaları için tercih edilir6. Bu yöntem, periton boşluğu içinde yüksek bir ilaç konsantrasyonu ve uzun bir yarı ömür sağlayarak ilaç dağıtımı için etkili bir yol sunar 7,8. Yaklaşım, optimal ilaç emilimini ve dağıtımını sağlamak için araştırma ortamlarında yaygın olarak kullanılmaktadır 9. Enjeksiyon bazlı yöntemler tek doğum için etkili olsa da, uzun süreli ve tekrarlanan enjeksiyonlar genellikle vücut hasarına ve kronik enfeksiyona yol açar2.
Şu anda, erişkin zerbafish'te iki IP enjeksiyonu yöntemi vardır 4,10. Bununla birlikte, her iki yöntemin de doksorubisin gibi toksik bileşikler verirken sınırlamaları vardır, bu da vücut şeklinde ciddi hasara ve balık ölümlerine yol açar. Yan etkiler, verilerin yorumlanmasını önemli ölçüde karmaşıklaştırabilir. Bu zorluklar kapsamlı eğitim10 ile ele alınabilse de, yan etkileri en aza indiren yeni bir IP enjeksiyon yöntemine açık bir ihtiyaç vardır.
Burada amacımız, doksorubisin'in yetişkin zebra balıklarına etkili bir şekilde verilmesi için optimize edilmiş yeni bir IP enjeksiyon yöntemi geliştirmek ve en aza indirilmiş vücut hasarı ve buna bağlı mortalite ile güvenilir doksorubisin kaynaklı kardiyomiyopati (DIC) modellerinin oluşturulmasını kolaylaştırmaktır.
Protokol
Gerçekleştirilen tüm prosedürler, 'Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nda (National Academies Press, 2011) belirtilen standartlara bağlı kalarak Mayo Clinic Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Çalışmadaki tüm zebra balıkları Yabani Hint Karyotipi (WIK) suşuna aittir. Reaktiflerin ve çalışma için kullanılan ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Doksorubisin stok çözeltisinin hazırlanması ve saklanması
- Doksorubisin stoğunu ticari bir kaynaktan temin edin.
NOT: Doksorubisin ışığa duyarlıdır, bu nedenle toz halinde alın ve ışığa maruz kalmasını önlemek için opak kaplarda saklayın. Dox tozu hazırlama için tüm adımları bir kimyasal başlık içinde gerçekleştirin. - Dox tozunu damıtılmış suda tamamen çözün ve nihai konsantrasyonu 5 mg/mL olan bir stok çözeltisi hazırlayın.
- Stoğu 1,5 mL'lik tüplere bölerek ayırın.
- Tüpleri ışığa maruz kalmaktan korumak için alüminyum folyoya sarın.
- Aliquot Dox solüsyonunu kısa süreli depolama için 4 °C'de (<1 ay) veya uzun süreli depolama için -20 °C'desaklayın 10.
2. Balıkların vücut ağırlıklarına göre gruplandırılması
- Sonraki enjeksiyon için BW farkı% 10'dan az olan balıkları birlikte gruplandırın.
NOT: Bu aşamada emekten tasarruf etmek için, 'dan daha az BW varyansına sahip balıklar aynı boyutta olarak kategorize edilir. - Enjeksiyondan önce balığın 24 saat oruç tutmasına izin verin.
- Balıkları 0.16 mg / mL tricain içeren embriyo suyu kullanarak 1 dakika boyunca uyuşturun.
- Balıkları tricaine ile sudan çıkarın ve fazla suyu çıkarmak için balık gövdesinin her iki tarafını temiz filtre kağıdı ile ovalayın.
- Her balığın BW'sini ölçün ve kaydedin, ardından balığı derhal taze sistem suyuyla dolu bir geri kazanım tankına geri koyun.
NOT: Balıklara 3 aylık olduktan sonra Dox enjeksiyonu yapılmıştır. Bu çalışmada araştırmacılar 3 aylık ila 10 aylık balıkları kullandılar. Olgun WIK türü zebra balığının BW'leri 0,2 g ila 0,5 g arasında değişebilir. 5 dakikadan fazla süren uzun süreli anestezi ve ardından Dox enjeksiyonu, yüksek balık ölümlerine yol açtı.
3. Enjeksiyon için iğne ve istasyonun hazırlanması
- Hedeflenen 20 μg/g dozu elde etmek için ortalama vücut ağırlığına dayalı olarak her balık için gereken Dox stok çözeltisinin enjeksiyon hacmini (örn. 5 mg/mL) belirleyin.
- Enjeksiyon hacmini hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın:
- Enjeksiyon için 1. adımda hesaplanan Dox çözeltisini seyreltmek için 1x Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ekleyin ve toplam 5 μL hacme ulaşın.
NOT: Her balık grubu için BW'lerine göre toplu çözelti kullanın ve deney süresince enjeksiyon için çözelti sıkıntısı olmamasını sağlamak için her gruba 3 balık daha ekleyin. - Tüpü hafifçe vurun ve ardından çözeltiyi oda sıcaklığında 10 saniye boyunca toplamak için en yüksek hızda kısa bir süre mikrosantrifüj edin.
- Hazırlanan çözeltiyi buzun üzerine yerleştirin ve ışığa maruz kalmaktan koruyun.
- Diseksiyon mikroskobunun altına süngerli 100 mm'lik temiz bir Petri kabı yerleştirin, ardından odağı ayarlayın.
NOT: Sünger 4 cm uzunluğunda bir oluk içerir. Süngerin elastik olarak geri çekilmesi balığa destek sağlayacak ve balık gövdesini yerinde tutacaktır. Sünger tekrar kullanılabilir. - 10 μL'lik bir mikro şırıngayı 34 G eğimli bir iğne ile donatın.
- Şırıngadaki kabarcıkları ortadan kaldırmak ve olası tıkanıklıkları gidermek için iğneyi 1x HBSS tamponu ile yıkayın.
- Enjeksiyon için 4. adımda hazırlanan çözeltinin 5 μL'sini ölçün.
4. IP Dox enjeksiyon prosedürü
- Bilinç kaybı durumuna neden olmak için yetişkin balığı 0.16 mg / mL trikain ile 1 dakika suya koyun.
- Balıkları, karın yukarı bakacak şekilde gömülü süngerin oluğuna yerleştirin (Şekil 1A).
- İğneyi, göğüs yüzgecinin orta noktasından başlayarak kalp boşluğunun arka tarafına doğru 0°'ye yakın bir açıyla yerleştirin (Şekil 1B).
NOT: İşlem sırasında kalp ile herhangi bir temastan kaçının. - İğneyi kuyruğa doğru yönlendirin ve gümüş derinin altına girin.
NOT: İğneyi, herhangi bir çizilme veya delinmeyi önlemek için dikkatli olarak gümüş tenin yakınına yerleştirin. - Tüm operasyon boyunca karın boşluğu içindeki iğne ucunu izleyin (Şekil 1C).
NOT: Karaciğere, bağırsaklara, yüzme kesesine ve diğer organlara zarar vermekten kaçının. İğnenin bağırsağın sonuna, kloakal foramenin yakınına ulaştığından emin olun. - 5 μL Dox solüsyonunu kademeli ve eşit bir şekilde dağıtın, ardından herhangi bir sızıntıyı önlemek için iğneyi orijinal yol boyunca yavaşça geri çekin (Şekil 1D).
- Dox solüsyonunun kırmızı renklenmesini gözlemleyerek karın boşluğunu Dox varlığı açısından izleyin (Şekil 1E).
- Balığın iyileşmesine yardımcı olmak için enjekte edilen balığı hızlı bir şekilde taze sistem suyuyla dolu temiz bir geçiş tankına taşıyın.
NOT: Enjeksiyonlar arasında iğneyi 1x HBSS tamponu ile bir kez yıkayın.
5. Enjeksiyon sonrası balık yönetimi
- Enjeksiyondan sonra balığı sirkülasyon ile sisteme geri koyun.
- İyileşmelerini kolaylaştırmak için enjekte edilen tüm balıkları 24 saat daha hızlı tutun.
- İlk hafta boyunca balıkları yakından takip edin. Diğer balıklara bulaşmasını önlemek için ölen balığı mümkün olan en kısa sürede çıkarın.
NOT: İlk 24 saat içinde balık ölümleri muhtemelen enjeksiyondan veya uzun süreli anesteziden kaynaklanan fiziksel yaralanmalardan kaynaklanmaktadır. Bir hayatta kalma eğrisi oluşturmak için balık sayılarını kaydedin. - Enjeksiyondan 56 gün sonra Dox enjekte edilen balığı fenotiplemek için ekokardiyografi yapın11.
NOT: HBSS çözeltisi enjekte edilen ilgili kontrol grubu için koşullarda ve prosedürlerde tekdüzelik sağlayın.
Sonuçlar
Daha önce, yetişkin zebra balıklarında doksorubisin uygulaması için iki intraperitoneal (IP) yöntem kullanılmıştır 4,10. Kinkel ve ark.4 tarafından tarif edildiği gibi Klasik IP enjeksiyon yöntemi olarak da bilinen yöntem I'de, iğne, karın yukarı bakacak şekilde pelvik yüzgeçler arasındaki orta hatta 45°'lik bir açıyla yerleştirildi. Yöntem II'de veya Ma ve ark.10 tarafından tarif edildiği gibi Alternatif IP enjeksiyon yönteminde, iğne balığın dorsal tarafından sokulmuştur (Şekil 2A(i,ii)). Buna karşılık, yöntem III'ün iki büyük değişikliği var. İlk olarak, enjeksiyonun pozisyonu, karın yukarı bakacak ve iğne göğüs yüzgecinin orta noktasından karın içine doğru yönlendirilecek şekilde değiştirilir. Penetrasyon bölgesi, bu alandaki doğal bir delik tarafından yönlendirilir. İkinci olarak, iğnenin açısı 0°'ye yakın olması gereken şekilde azaltılır (Şekil 2A(iii), Şekil 1).
Üç intraperitoneal enjeksiyon yöntemi arasında karşılaştırma
Üç IP enjeksiyon yöntemini karşılaştırmak için, zebra balığı ile daha önce deneyimi olmayan Araştırmacı I'den elde edilen veriler sunulmuştur. IP enjeksiyonu için yöntem I ve II kullanıldığında, IP enjeksiyonunu takip eden ilk iki hafta içinde önemli balık ölümleri kaydedildi. Yöntem I'de ölüm enjeksiyondan üç gün sonra, yöntem II'de ise enjeksiyondan iki gün sonra meydana geldi. Enjekte edilen balıkların p'i, özellikle enjeksiyon bölgesi çevresinde, IP enjeksiyonundan bir ila iki ay sonra büyük ölçüde azalmış vücut boyutu ve kavisli vücut şekli olarak kendini gösteren görünür vücut hasarı sergilemiştir (Şekil 2A (iv,v)). Mortalitenin ve gözlenen hasarın, enjeksiyon işlemi sırasında enjeksiyon iğnesinin açılış ucundan sızabilen ve enjeksiyon yolu boyunca iç organa zarar verebilen doksorubisin12'nin toksisitesine atfedilebileceği düşünüldü. Yöntem I'de, enjeksiyon iğnesinin ucu bağırsağa temas edebilir (Şekil 2A(i)), yöntem II'de ise yüzme kesesine temas edebilir (Şekil 2A(ii)). Yöntem III kullanılarak iğne ucunun herhangi bir iç organa temas etmesinin önlenebileceği varsayılmıştır (Şekil 2A(iii)
Tartışma
Mevcut iki IP enjeksiyon yönteminden 4,10 farklı olarak, yeni IP enjeksiyon yöntemi aşağıdaki farklı özelliklerle karakterize edilir. İlk olarak, benzersiz bir iğne penetrasyon açısı kullanılır (sıfıra yakın); ikincisi, iğne balığa benzersiz bir konumdan, yani bir balığın ventral yüzeyinde enjeksiyonu kolaylaştıracak doğal bir delik yoluyla nüfuz eder; Ve son olarak, iğnenin hareketi önden arkaya doğrudur. Bu ayarlamalar, penetrasyon işlemi sırasında Dox sızıntısının en aza indirilmesinden kaynaklanan organ yaralanmasını etkili bir şekilde azaltır. İğnenin yolu, araştırmacı tarafından sürekli olarak izlenebilen gümüş derinin hemen altındadır. Sonuç olarak, iğnenin ucu ile iç organlar arasındaki doğrudan temas etkili bir şekilde önlenebilir. Enjeksiyondan sonra, enjekte edilen tüm Dox karın boşluğunda kalır ve balık uyanık olduğunda ve ileri doğru yüzmeye başladığında tek çıkış (delinme noktası) kapatılabilir.
Mevcut iki IP enjeksiyon yöntemi 4,10 ile karşılaştırıldığında, yeni IP enjeksiyon yöntemi sürekli olarak en aza indirilmiş vücut hasarı ve gelişmiş sağkalım oranları ile sonuçlanır. Bu ifade, kronik bir zebra balığı DIC modeli oluşturmak için aynı balıkta birden fazla enjeksiyonun fizibilitesi ile daha da vurgulandı. Daha da önemlisi, önceki iki IP enjeksiyon yöntemi 4,10 ile karşılaştırıldığında, yeni yöntem, yetişkin zebra balıklarını ele alma konusunda daha önce deneyimi olmayan araştırmacılar tarafından hızlı bir şekilde yönetilebilir. Güvenilir DIC modelleri, en az 4 farklı araştırmacının elinde ilk veya ikinci denemelerinde başarılı bir şekilde elde edilmiş gibi görünüyor. Enjeksiyonun başarısı, enjeksiyondan sonraki ilk hafta içinde kolayca sonuçlandırılabilir: Balıkların %>80'i, tercihen %100'ü, enjeksiyondan sonra hayatta kalabilmelidir. Tüm balıklar, balıkların çoğunluğunun (% >80) bariz vücut hasarından arınmış olması gereken 56 dpi'ye kadar hayatta kalacaktır. Bu önemli bir gelişmedir, çünkü ilk iki IP yöntemini kullanan güvenilir DIC modeli, yalnızca her turda en az 10 balık bulunan 3'ten fazla uygulama turundan sonra bir araştırmacının elinde stabilize edilebilir. Bu süreç zaman alıcı olabilir, çünkü her uygulama enjeksiyonunun başarısı üzerinde sonuçlandırmak için yaklaşık 2 ay sürdü. Doku travmasını azaltmak sadece balığın refahını iyileştirmekle kalmaz, aynı zamanda çalışmanın sonuçlarını etkileyebilecek kafa karıştırıcı faktörleri de en aza indirir.
Yeni yöntemin başarısını sağlamak için kritik bir adım, penetrasyon açısıdır. Şekil 2'de gösterildiği gibi, penetrasyon açısı 0 ° 'den 45 ° 'ye değiştiğinde, muhtemelen iğnenin ucu ile iç organlar arasındaki temas riskinin artması nedeniyle önemli balık ölümleri kaydedildi.
Yöntemin birincil sınırlaması, yöntemin 3 aydan daha genç balıklara ilaç vermek için kullanılamamasıdır. Küçük vücut boyutları nedeniyle, genç balıklar bir iğnenin girmesiyle ilişkili fiziksel hasardan sonra hayatta kalamazlar. Bununla birlikte, yöntem, 3 aylıktan 4 yaşına kadar olanlar da dahil olmak üzere, BW'leri 0,15 g'dan büyük olduğunda yetişkin balıklarda kullanılabilir.
Bu yeni yöntem, özellikle Dox15,16 gibi potansiyel olarak toksik bileşiklerle uğraşırken, yetişkin zebra balıklarında ilaç dağıtımı için yaygın olarak kullanılacaktır. Toksik olmayan bileşikler söz konusu olduğunda, her üç yöntem de uygulanabilir olmalıdır.
Açıklamalar
Hiç kimse.
Teşekkürler
Bu çalışma NIH (HL107304 ve HL081753) ve Mayo Vakfı (Biyomedikal Keşif ve Kardiyovasküler Araştırma Merkezi) tarafından XX'e desteklenmiştir. JL, Central South University Merkez Üniversiteleri için Temel Araştırma Fonları tarafından finanse edilmektedir, No. 56021702. Zebra balığı tesisini yönettikleri için Beninio Gore ve Quentin Stevens'a özel teşekkürler.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 10 & mu; L NanoFil-şırınga | World Precision Instruments, Inc | NANOFIL | enjeksiyon aleti |
| 34 G iğne | World Precision Instruments, Inc | NI34BV-2 | enjeksiyon aleti |
| 60 mm Petri kabı | fisher scientific/fisherbrand | FB0875713A | süngerin yerleştirilmesi |
| Diseksiyon mikroskobu | Nikon | SMZ800 | |
| Doksorubisin hidroklorür | Sigma | D1515-10MG | ilacının enjeksiyonu |
| Ekokardiyografi | GÖRSEL SONICS | Vevo 3100 | kardiyak fonksiyon ölçümü |
| Köpük Sünger | Jaece Industries | L800-D | balığın yerleştirilmesi |
| Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBBS) | Thermo Fisher | 14025076 | Dox |
| Mikrosantrifüj için Araç | southernlabware | MyFuge/C1012 | Dox çözümünü topluyor |
| Hassas Terazi | Torbal | AD60 | Dijital teraziler |
| Tricaine | Argent | MS-222 | Anestezik balık |
| Tüpü | Eppendorf | 1.5 mL | depolama |
| vevo LAB yazılım | FUJIFILM VISUAL SONICS | 5.6.0 | Kalbin ölçülmesi |
Kaynaklar
- Tavares, B., Lopes, S. S. The importance of Zebrafish in biomedical research. Acta Medica Portuguesa. 26 (5), 583-592 (2013).
- Dang, M., Henderson, R. E., Garraway, L. A., Zon, L. I. Long-term drug administration in the adult zebrafish using oral gavage for cancer preclinical studies. Disease Model Mech. 9 (7), 811-820 (2016).
- Sciarra, J. B., Tyler, A., Kolb, A. A gelatin-based diet for oral dosing juvenile to adult zebrafish (Danio rerio). Lab Animal Sci Prof. , https://api.semanticscholar.org/CorpusID:85611302 32-35 (2014).
- Kinkel, M. D., Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E. Intraperitoneal injection into adult zebrafish. J Vis Exp. (42), e2126(2010).
- Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J Vis Exp. (34), e1645(2009).
- Liu, J., et al. Intraperitoneally delivered mesenchymal stem cells alleviate experimental colitis through THBS1-mediated induction of IL-10-competent regulatory B cells. Front Immunol. 13, 853894(2022).
- De Smet, L., Ceelen, W., Remon, J. P., Vervaet, C. Optimization of drug delivery systems for intraperitoneal therapy to extend the residence time of the chemotherapeutic agent. The Scientific World Journal. 2013, 720858(2013).
- Dakwar, G. R., et al. Nanomedicine-based intraperitoneal therapy for the treatment of peritoneal carcinomatosis-Mission possible. Adv Drug Deliv Rev. 108, 13-24 (2017).
- Al Shoyaib, A., Archie, S. R., Karamyan, V. T. Intraperitoneal route of drug administration: should it be used in experimental animal studies. Pharmaceutical Res. 37, 1-17 (2020).
- Ma, X., Ding, Y., Wang, Y., Xu, X. A doxorubicin-induced cardiomyopathy model in adult zebrafish. J Vis Exp. (136), e57567(2018).
- Wang, L. W., et al. Standardized echocardiographic assessment of cardiac function in normal adult zebrafish and heart disease models. Disease Model Mech. 10 (1), 63-76 (2017).
- Christidi, E., Brunham, L. R. Regulated cell death pathways in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Cell Death Dis. 12 (4), 339(2021).
- Zhu, W., Shou, W., Payne, R. M., Caldwell, R., Field, L. J. A mouse model for juvenile doxorubicin-induced cardiac dysfunction. Pediatric Res. 64 (5), 488-494 (2008).
- Podyacheva, E. Y., Kushnareva, E. A., Karpov, A. A., Toropova, Y. G. Analysis of models of doxorubicin-induced cardiomyopathy in rats and mice. A modern view from the perspective of the pathophysiologist and the clinician. Frontiers Pharmacol. 12, 670479(2021).
- Chaoul, V., et al. Assessing drug administration techniques in zebrafish models of neurological disease. Int J Mol Sci. 24 (19), 14898(2023).
- Lu, X., Lu, L., Gao, L., Wang, Y., Wang, W. Calycosin attenuates doxorubicin-induced cardiotoxicity via autophagy regulation in zebrafish models. Biomed Pharmacother. 137, 111375(2021).
Yeniden basım ve izinler
