Burada, Sipunculus nudus'un fibrinojenolitik ajanlarını hızlı bir şekilde ayırmak ve görüntülemek için bir fibrinojen-poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) protokolü sunuyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Fibrinojen-Poliakrilamid Jel Elektroforezi ile Sipunculus nudus'ta Aktif Fibrinojenolitik Ajanların Hızlı Ayrılması ve Görüntülenmesi
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Fibrinojeni doğrudan çözebilen fibrinojenolitik ajanlar, anti-koagülasyon tedavisinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Genel olarak, yeni fibrinogenolitik ajanların tanımlanması, önce her bir bileşenin ayrılmasını ve ardından fibrinogenolitik aktivitelerinin kontrol edilmesini gerektirir. Şu anda, ayırma aşamasında çoğunlukla poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ve kromatografi kullanılmaktadır. Bu arada, fibrinojen plaka tahlili ve PAGE bazlı reaksiyon ürünleri genellikle fibrinojenolitik aktivitelerini göstermek için benimsenir. Bununla birlikte, bu iki aşamanın uzay-zamansal ayrımı nedeniyle, aktif fibrinojenolitik ajanları aynı jel ile ayırmak ve görüntülemek mümkün değildir. Fibrinojenolitik ajan tanımlamasının ayırma ve görüntüleme süreçlerini basitleştirmek için, bu çalışmada yer fıstığı kurtlarının (Sipunculus nudus) fibrinojenolitik ajanlarını hızlı bir şekilde ayırmak ve görüntülemek için yeni bir fibrinojen-PAGE yöntemi oluşturduk. Bu yöntem, fibrinojen-PAGE hazırlama, elektroforez, renatürasyon, inkübasyon, boyama ve renk gidermeyi içerir. Proteinin fibrinojenolitik aktivitesi ve moleküler ağırlığı aynı anda tespit edilebilir. Bu yönteme göre, fıstık kurduhomojenatın birden fazla aktif fibrinojenolitik ajanını 6 saat içinde başarıyla tespit ettik. Ayrıca, bu fibrinojen-PAGE yöntemi zaman ve maliyet dostudur. Ayrıca, bu yöntem diğer organizmaların fibrinojenolitik ajanlarını incelemek için kullanılabilir.
Giriş
Son yıllarda, trombotik hastalıkların devam eden artışı nedeniyle, trombotik hastalıklar yeni ve önemli bir küresel sağlık sorunu haline gelmiştir1. Şu anda, antitrombotik ilaçlar üç gruba ayrılır: anti-trombosit agregasyon ilaçları, antikoagülanlar ve trombolitik ilaçlar. Bunlar arasında, ürokinaz (İngiltere), doku plazminojen aktivatörü (tPA), vb. gibi trombolitik ilaçlar, trombüs2'yi hidrolize edebilen klinik olarak kullanılan tek ilaçlardır. Bu arada, yeni trombolitik ajanların tanımlanması ile daha güvenli ve etkili trombolitik ilaçlar geliştirilmektedir3.
Bununla birlikte, yeni trombolitik ajanların tanımlanması zaman alıcı ve emek yoğundur, bu da esas olarak ayırma/saflaştırma ve karakterizasyon/kontrol aşamalarını içerir. Birincisi, her bir bileşeni ayırmak ve ikincisi, fibrino (geno) litik aktivitelerini göstermektir 4,5. Önceki çalışmalarda, fıstık kurdundan (Sipunculus nudus) afinite kromatografisi ve fibrin (ojen) plaka testi 6,7,8 ile yeni bir fibrino (geno) litik enzimi (sFE) başarılı bir şekilde izole etmiş olmamıza rağmen, bu işlemler çok zaman ve emek alıcıdır. İlk olarak, fıstık kurdu homojenatlarının fibrino(geno)litik aktiviteye sahip olup olmadığının fibrin(ojen) plaka yöntemi ve SAYFA9'a dayalı reaksiyon ürünleri ile belirlenmesi gerekmektedir. Daha sonra, ayırma ve saflaştırma için iyon değişim kromatografisi, jel filtrasyon kromatografisi, afinite kromatografisi ve diğer yöntemler gibi bir dizi kromatografi gerçekleştirilmelidir10,11. Daha sonra, ayrılan her bir bileşenin fibrinojenolitik aktivitesini kontrol etmek için fibrin plaka testi tekrar gerçekleştirilir. Son olarak, aktif fibrinojenolitik ajanların12 moleküler ağırlığını belirlemek için doğal PAGE ve sodyum dodesil sülfat (SDS)-PAGE gerçekleştirilir. Bu nedenle, aktif fibrinojenolitik ajanların hızlı bir şekilde ayrılması ve görüntülenmesi kritik öneme sahiptir.
Yer fıstığı kurdu homojenatlarındaki aktif fibrinojenolitik ajanları hızlı bir şekilde ayırmak ve görüntülemek için, PAGE ve fibrinojen plaka yöntemlerinin birleştirilmesiyle yeni bir fibrinojen-PAGE yöntemi geliştirilmiştir, yani fibrinojen ajanlarının substratları fibrinojen doğal PAGE jeline eklenmiştir. Native-PAGE'den sonra, bileşenler moleküler ağırlıklarına göre ayrıldı. Bu arada, her aktif fibrinojenolitik bileşen boyama ile görüntülenebilir. Bu yöntemle, fıstık kurdu homojenatının birden fazla aktif fibrinojenolitik ajanını 6 saat içinde başarıyla tespit ettik. Ayrıca, bu fibrinojen-PAGE yöntemi zaman ve maliyet dostudur. Ayrıca, bu yöntem diğer organizmaların fibrinojenolitik ajanlarını incelemek için kullanılabilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Fıstık kurdu homojenat hazırlama
- Homojenizatöre 50 g fıstık kurdu ve 150 mL tuzlu su çözeltisi ekleyin.
- 24000 rpm'de 60 sn boyunca homojenize edin.
NOT: 3 kez tekrarlayın. - Homojenatı 9710 x g'da 4 °C'de 30 dakika santrifüjleyin.
- Daha fazla çalışma için süpernatanı fıstık kurdu homojenatı olarak toplayın.
2. Fibrinojen-PAGE jel hazırlama
- 0.01 g fibrinojeni 50 mL'lik bir cam behere tartın.
- Behere 1.9 mL DDH2O, 1.3 mL Tris-HCl (1.5 M, pH 8.8) ve 0.05 mL SDS (% 10, a / h) ekleyin; Pipetleme ile iyice karıştırın.
- Beheri 37 °C'de 30 dakika bekletin.
NOT: Bu adım fibrinojeni çözmek içindir. - 1.7 mL akrilamid (% 30, a / h), 0.05 mL amonyum persülfat (APS;% 10, a / h), 0.002 mL TEMED ekleyin; Pipetleme ile iyice karıştırın.
NOT: Bu ayırma jelidir. - Ayırma jelini 10 oyuklu bir jel kalıba dökün.
- Jel kalıba 2 mL DDH2O ekleyin; 30 dakika bekleyin.
- Kalıbı ters çevirerek suyu iyice çıkarın.
- 1.4 mL DDH2O, 0.25 mL Tris-HCl (1.0 M, pH 6.8), 0.02 mL SDS (% 10, w / v), 0.33 mL akrilamid (% 30, w / v), 0.02 mL APS (% 10, w / v), 0.002 mL tetrametiletilendiamin (TEMED) behere ekleyin; Pipetleme ile iyice karıştırın.
NOT: Bu jel yükleniyor. - Yükleme jelini adım 2.5 ile aynı jel kalıba dökün; Tarağı hemen yerleştirin.
NOT: Burada kullanılan fibrinojen-PAGE jeli, ayırıcı jel ve yükleme jeli içeren fibrinojen (%0.2) den oluşmuştur. Fibrinojen konsantrasyonu gerektiği gibi ayarlanabilir.
3. Elektroforez
- Hazırlanan fibrinojen-PAGE jelini tutkal kalıbı ile birlikte elektroforez tankına yerleştirin; tanka 1300 mL elektroforez çözeltisi (1.963 g Tris, 12.22 g glisin, 0.65 g SDS ve 1300 mL DDH2O) dökün; tarağı çıkarın.
- 20 μL sFE ve 20 μL fıstık kurdu homojenatına 5 μL 5x denatüre olmayan yükleme tamponu ekleyin; pipetleyerek iyice karıştırın; bunları hazırlanan fibrinojen-PAGE jeli içine yükleyin.
NOT: Karışımı kaynatmayın. sFE, daha önce 6,7,8 olarak tanımlanan bir fibrino(geno)litik enzimdir ve bu çalışmada pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Fıstık kurdu homojenatı tespit edilecek numunedir. SDS-PAGE yükleme tamponu ile karşılaştırıldığında bromofenol mavisi, β-merkaptoetanol ve SDS içermeyen denatüre olmayan yükleme tamponu. Her numune şeridi, proteinin hareketini net bir şekilde tespit etmek için 1x SDS-PAGE yükleme tamponu ile ayrılır. - 30 dakika boyunca 80 V'ta veya 20 dakika boyunca 120 V'ta elektroforez gerçekleştirin.
- Fibrinojen-PAGE jeli tutkal kalıbından çıkarın.
4. Yeniden doğuş
- Fibrinojen-PAGE jeli plastik bir kutuya aktarın.
- Kutuya 100 mL Tris-HCl (0.05 M, pH 7.4) ve 2 mL Triton X-100 ekleyin. 10 dakika boyunca 60-70 rpm'de bir çalkalayıcıya yerleştirin.
- Pipetleme ile yıkama tamponunu çıkarın.
NOT: Üç kez tekrarlayın.
5. Kuluçka
- Plastik kutuya 50 mL Tris-HCl (0.05 M, pH 7.4) ekleyin.
- 37 °C'de 4 saat inkübe edin.
NOT: Kuluçka süresi fibrinojenolitik aktivitenin gücüne göre ayarlanabilir.
6. Boyama
- Pipetleme ile inkübasyon tamponunu çıkarın.
- Kutuya 50 mL Coomassie Brillant Blue Staining solüsyonu ekleyin ve kutuyu 30 dakika boyunca 60-70 rpm'de bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin.
7. Renk giderme
- Pipetleme solüsyonunu pipetleyerek çıkarın.
- Kutuya 50 mL DDH2O ekleyin.
- Kutuyu 30 dakika boyunca 60-70 rpm'de bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin.
NOT: Burada leke giderme solüsyonu olarak DD H2O kullanılmıştır. Çalkalama süresi, fibrinojenolitik aktivitenin gücüne göre ayarlanabilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Elektroforezden sonra, işaretleyicinin tüm bantları net bir şekilde gösterildi. 1x SDS-PAGE yükleme şeritleri yalnızca 10 kDa bantları (bromofenol mavisi) gösterdi. SFE ve fıstık kurdu örnekleri herhangi bir gözlemlenebilir bant göstermedi (Şekil 1). Numunelerin bantları görünmese de, markör ve bromofenol mavisinin performansı elektroforezin başarılı olduğunu gösterdi ve numuneler moleküler ağırlıklarına göre ayrıldı.
Lekelenme nedeniyle jelin tamamı maviye dönmes...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
sFE, ekibimiz tarafından daha önce 3,6,8,13 yılında yer fıstığı kurtlarından izole edilen yeni bir fibrino (geno) litik enzimdir. Bununla birlikte, sFE'nin tanımlama süreçleri, fibrinojenolitik aktivite tespiti, protein bileşenlerinin ayrılması ve aktivite doğrulama aşamalarını içeren zaman ve emek alıcıydı. Basit bir yöntem olarak, fibrinojen plaka testi, numu...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Bu araştırma, Xiamen Şehri Bilim ve Teknoloji Bürosu (No. 3502Z20227197), Fujian Eyaleti Bilim ve Teknoloji Bürosu (No. 2019J01070; No. 2022J01311) ve Quanzhou Bilim ve Teknoloji Planının Üst Düzey Yetenekler İnovasyon ve Girişimcilik Projesi (No. 2022C015R). Fucai Wang (Huaqiao Üniversitesi) ve Lei Tong'a (Huaqiao Üniversitesi) teknik yardımları için teşekkür ederiz.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1 M Tris-HCl (pH 6.8) | Solarbio | T1020 | |
| 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8) | Solarbio | T1010 | |
| %30 Akrilamid/Bis-akrilamid | Biosharp | BL513B | |
| Amonyum persülfat | XiLONG SCIENTIFIC | 7727-54-0 | |
| Beher | PYREX | 2-9425-02 | |
| Santrifüj Tüpü (1.5 mL) | Biosharp | BS-15-M | |
| Sabit Sıcaklık İnkübatörü | JINGHONG | JHS-400 | |
| Coomas Brillant Mavi Lekelenme solüsyonu | Beyotime | P0017F | |
| Elektronik Analitik Terazi | DENVER | TP-213 | |
| Fibrinojen | Solarbio | F8051 | |
| Jel yüklemeli pipet uçları, Toplu Biosharp | BS-200-GTB | ||
| Homojenizatör | AHS | ATS-1500 | |
| Yatay rotasyonlu osilatör | NuoMi | NMSP-600 | |
| Mili-Q Referans | Kırlangıç Z00QSV0CN | ||
| Mini-PROTEAN Tetra Hücresi | BIO-RAD | 165-8000~165-8007 | |
| N, N, N', N'-Tetrametiletilendiamin | Sigma | T9281 | |
| Pipet Ucu (1 mL) | Axygene | T-1000XT-C | |
| Pipet Ucu (10 & mikro; L) | Axygene | T-10XT-C | |
| Pipet Ucu (200 & mikro; L) | Axygene | T-200XT-C | |
| Pipetleyici (1 mL) | Thermo Fisher Scientific | ZY18723 | |
| Pipetleyici (10 & mikro; L) | Thermo Fisher Scientific | ZX98775 | |
| Pipetleyici (200 & mikro; L) | Thermo Fisher Scientific | ZY20280 | |
| Pipetleyici (50 & mikro; L) | Thermo Fisher Scientific | ZY15331 | |
| Soğutmalı Santrifüj | Cence | H1650R | |
| Sodyum dodesil sülfat | Sigma-Aldrich | V900859 | |
| Tris | Solarbio | T8060 | |
| Tris-HCl | Solarbio | T8230 | |
| Triton X-100 | Solarbio | T8200 |
Kaynaklar
- Bikdeli, B., et al. COVID-19 and thrombotic or thromboembolic disease: Implications for prevention, antithrombotic therapy, and follow-up. J Am Coll Cardiol. 75 (23), 2950-2973 (2020).
- Tsivgoulis, G., et al. Thrombolysis for acute ischaemic stroke: current status and future perspectives. Lancet Neurol. 22 (5), 418-429 (2023).
- Tang, M., Hu, C., Lin, H., Yan, H. Fibrinolytic drugs induced hemorrhage: mechanisms and solutions. Blood Coagul Fibrinolysis. 34 (5), 263-271 (2023).
- Lu, M., et al. Purification, characterization, and chemical modification of Bacillus velezensis SN-14 fibrinolytic enzyme. Int J Biol Macromol. 177, 601-609 (2021).
- Abu-Tahon, M. A., Abdel-Majeed, A. M., Ghareib, M., Housseiny, M. M., Abdallah, W. E. Thrombolytic and anticoagulant efficiencies of purified fibrinolytic enzyme produced from Cochliobolus hawaiiensis under solid-state fermentation. Biotechnol Appl Biochem. 70 (6), 1954-1971 (2023).
- Lin, W., Lin, H., Xin, P., Yan, H., Kang, B., Tang, M. A Comprehensive approach to analyze the cell components of cerebral blood clots. J Vis Exp. (197), e65791(2023).
- Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H. Affinity purification of a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus. J Vis Exp. (196), e65631(2023).
- Tang, M., Lin, H., Huang, Y., Xu, R., Cui, X., Yan, H. Plasmin affinity purification method based on agarose gel and plasmin and application thereof. , Available from: https://patents.google.com/patent/CN116103270A/en?oq=CN202310108470 (2023).
- Walton, P. L. An improved fibrin plate method for the assay of plasminogen activators. Clinica Chimica Acta. 13 (5), 680-684 (1966).
- Ngere, J. B., Ebrahimi, K. H., Williams, R., Pires, E., Walsby-Tickle, J., McCullagh, J. S. O. Ion-exchange chromatography coupled to mass spectrometry in life science, environmental, and medical research. Anal Chem. 95 (1), 152-166 (2023).
- Kato, S., Takeuchi, K., Iwaki, M., Miyazaki, K., Honda, K., Hayashi, T. Chitin- and streptavidin-mediated affinity purification systems: A screening platform for enzyme discovery. Angew Chem Int Ed Engl. 62 (31), e202303764(2023).
- Sharma, N., Sharma, R., Rajput, Y. S., Mann, B., Singh, R., Gandhi, K. Separation methods for milk proteins on polyacrylamide gel electrophoresis: Critical analysis and options for better resolution. International Dairy Journal. 114, 104920(2021).
- Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , Available from: https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
