Yöntem makalesi

Adeno ile İlişkili Viral Vektörlerin Tek Adımlı ve Yarı Otomatik Heparin Afinite Kromatografisi Protokolü ile İzolasyonu

5.7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/66550

⸱

5 Nisan 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CNC-UC - Center for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra, 2CIBB - Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology, University of Coimbra, 3IIIUC - Institute for Interdisciplinary Research, University of Coimbra, 4ViraVector - Viral Vectors for Gene Transfer Core Facility, University of Coimbra, 5FFUC - Faculty of Pharmacy, University of Coimbra, 6MICC-CNC - Microscopy Imaging Center of Coimbra - CNC, University of Coimbra

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu el yazması, optimize edilmiş bir heparin bazlı afinite kromatografisi yöntemi kullanılarak adeno ile ilişkili viral vektörlerin üretilmesi ve saflaştırılması için ayrıntılı bir protokolü açıklamaktadır. Ultrasantrifüjleme ihtiyacını ortadan kaldıran basit, ölçeklenebilir ve uygun maliyetli bir yaklaşım sunar. Elde edilen vektörler, klinik öncesi çalışmalarda değerlerini kanıtlayan yüksek saflık ve biyolojik aktivite sergiler.

Özet

Adeno-ilişkili virüs (AAV), in vivo gen iletimi için giderek daha değerli bir vektör haline gelmiştir ve şu anda insan klinik denemelerinden geçmektedir. Bununla birlikte, AAV'leri saflaştırmak için yaygın olarak kullanılan yöntemler, sezyum klorür veya iyodiksanol yoğunluk gradyan ultrasantrifüjlemeyi kullanır. Avantajlarına rağmen, bu yöntemler zaman alıcıdır, sınırlı ölçeklenebilirliğe sahiptir ve genellikle düşük saflıkta vektörlerle sonuçlanır. Bu kısıtlamaların üstesinden gelmek için araştırmacılar dikkatlerini kromatografi tekniklerine çeviriyorlar. Burada, AAV'lerin saflaştırılması için evrensel bir yakalama adımı olarak hizmet eden optimize edilmiş bir heparin bazlı afinite kromatografisi protokolü sunuyoruz.

Bu yöntem, heparan sülfat proteoglikanları için AAV serotip 2'nin (AAV2) içsel afinitesine dayanır. Spesifik olarak, protokol, istenen AAV kapsid proteinlerini AAV2'ninkilerle kodlayan plazmitlerin birlikte transfeksiyonunu gerektirir ve her iki ebeveyn serotipinin özelliklerini birleştiren mozaik AAV vektörleri verir. Kısaca üretici hücrelerin parçalanmasından sonra, AAV partikülleri içeren bir karışım, standart bir hızlı protein sıvı kromatografisi (FPLC) sistemi kullanılarak optimize edilmiş tek aşamalı heparin afinite kromatografisi protokolünü takiben doğrudan saflaştırılır. Saflaştırılmış AAV partikülleri daha sonra konsantre edilir ve saflık ve biyolojik aktivite açısından kapsamlı karakterizasyona tabi tutulur. Bu protokol, ultrasantrifüjleme ve gradyanlara ihtiyaç duymadan gerçekleştirilebilen, temiz ve yüksek viral titreler sağlayan basitleştirilmiş ve ölçeklenebilir bir yaklaşım sunar.

Giriş

Adeno-ilişkili virüs (AAV) vektörü, mevcut gen terapisi çalışmalarında en umut verici taşıyıcı sistemlerden biri olarak yolunu fethediyor. İlk olarak 1965'tetanımlanan 1 AAV, tek sarmallı bir DNA genomunu barındıran, yaklaşık 25 nm çapında bir ikosahedral protein kapsidine sahip küçük, zarfsız bir virüstür. AAV'ler, litik döngülerini tamamlamak için herpes simpleks virüsü veya daha sıklıkla adenovirüs gibi yardımcı bir virüsle ko-enfeksiyona benzersiz bağımlılıkları nedeniyle Parvoviridae ailesine ve Dependoparvovirus cinsine aittir 2,3.

AAV'lerin 4.7 kilobaz genomu, karakteristik T-şekilli firketeuçları 4 oluşturan iki ters çevrilmiş terminal tekrarı (ITR'ler) ile çevrili iki açık okuma çerçevesinden (ORF) oluşur. ITR'ler, AAV paketleme, çoğaltma ve entegrasyon için kritik olan tek cis-etkili elemanlardır, bu nedenle rekombinant AAV (rAAV) vektörlerinde tutulan tek AAV dizileridir. Bu sistemde, vektör üretimi için gerekli genler, ilgilenilen genin viral kapsid 5,6 içinde paketlenmesine izin vererek, trans halinde ayrı ayrı sağlanır.

Her viral gen, alternatif birleştirme ve başlangıç kodonları yoluyla farklı proteinleri kodlar. Rep ORF içinde, viral DNA 7,8'in replikasyonu, bölgeye özgü entegrasyonu ve kapsüllenmesinde çok önemli roller oynayan dört yapısal olmayan protein (Rep40, Rep52, Rep68 ve Rep78) kodlanmıştır. Cap ORF, N-terminallerinde (VP1, VP2 ve VP3) birbirinden farklı üç yapısal proteinin ekspresyonu için bir şablon görevi görür ve bunlar 1:1:10 4,9 oranında 60 mer'lik bir viral kapsid oluşturmak üzere bir araya gelir. Ek olarak, geleneksel olmayan bir CUG başlangıç kodonu ile Cap geninde iç içe geçmiş alternatif bir ORF, bir montaj aktive edici proteini (AAP) kodlar. Bu nükleer proteinin yeni sentezlenen kapsid proteinleri VP1-3 ile etkileşime girdiği ve kapsid montajını teşvik ettiğigösterilmiştir 10,11.

Kapsidin amino asit dizisindeki farklılıklar, doğal olarak oluşan 11 AAV serotipini ve insanlardan ve insan olmayan primat dokularından izole edilen 100'den fazla varyantı açıklar 7,12,13. Yapısal olarak değişken bölgelerin konformasyonundaki varyasyonlar, farklı suşlardan kapsidlerin farklı antijenik özelliklerini ve reseptör bağlama özgüllüklerini yönetir. Bu, farklı memeli organları arasında farklı doku tropizmleri ve transdüksiyon verimlilikleri ile sonuçlanır14.

rAAV'lerin erken üretim yöntemleri, yardımcı amaçlar için adenovirüs enfeksiyonuna dayanıyordu 15,16,17,18,19. Verimli olmasına ve genellikle büyük ölçekte üretilmesi kolay olmasına rağmen, bu enfeksiyondan çeşitli problemler ortaya çıkar. Saflaştırma ve inaktivasyon için ısıyla denatüre edici bir adımdan sonra bile, adenoviral partiküller AAV preparatlarında hala mevcut olabilir ve bu da istenmeyen bir güvenlik sorunu oluşturur20. Ayrıca, denatüre adenoviral proteinlerin varlığı klinik kullanım için kabul edilemez. Diğer üretim stratejileri, Rep / Cap ve transgeni hedef hücrelere21 veya bakulovirüs-böcek hücre sistemine22 getirmek için tasarlanmış rekombinant herpes simpleks virüs suşlarından yararlanır. Bu sistemler ölçeklenebilirlik ve GMP uyumluluğu açısından avantajlar sunsa da yine de benzer sorunlarla karşı karşıyadır.

rAAV üretimi için üçlü transfeksiyon yöntemi, bu sorunların kolayca üstesinden gelmek için yaygın olarak benimsenmiştir. Kısaca, rAAV düzeneği, aşağıdakileri kodlayan üç plazmid ile hücrelerin geçici transfeksiyonuna dayanır: 1) vahşi tip AAV2 genomundan (pITR) ITR'ler arasında paketlenmiş transgen ekspresyon kaseti; 2) replikasyon ve virion montajı (pAAV-RC) için gerekli Rep / Cap dizileri; ve 3) minimal adenoviral proteinler (E1A, E1B, E4 ve E2A) ile birlikte yardımcı etki için gerekli olan adenovirüs virüsü ile ilişkili RNA'lar (pHelper)6,20,23. Plazmid transfeksiyon yöntemleri, klinik öncesi çalışmalarda rAAV üretimi için basitlik ve esneklik sağlarken, bu prosedürlerin büyük ölçekli üretime uygulandığında ölçeklenebilirlik ve tekrarlanabilirlik açısından sınırlamaları vardır. Alternatif bir yaklaşım olarak, rAAV üretimi, vektör yapılarıyla kombinasyon halinde AAV Rep / Cap genlerini veya Rep / Cap'i kararlı bir şekilde ifade eden AAV üretici hücre hatlarının (hem yapışık hem de süspansiyon büyümesinin) kullanılması yoluyla elde edilebilir. Bu sistemlerde, adenoviral yardımcı genler plazmit transfeksiyonu yoluyla tanıtılır. Bu strateji, hücre kültürü sürecinin ölçeklenebilirliğini geliştirse de, teknik olarak karmaşık ve zaman alıcıdır 21,24,25.

Her iki durumda da, üretici hücreler daha sonra parçalanır ve bir veya daha fazla saflaştırma aşamasına tabi tutulur. Şu anda, rAAV'leri saflaştırmak için temel yöntemler, sezyum klorür (CsCl) veya iyodiksanol ultra yüksek hızlı yoğunluklu gradyan santrifüjlemesinin kullanımını ve ardından kromatografi teknikleri ile takip edilip edilmediğini içermektedir26. Viral çökeltme için orijinal saflaştırma şeması, amonyum sülfat kullandı, ardından bir CsCl gradyanı boyunca iki veya üç tur ultrasantrifüjleme yapıldı. Bu işlemin ana avantajları, tüm serotiplerin saflaştırılması ve farklı yoğunluklarına göre dolu partikülleri boş kapsidlerden fiziksel olarak ayırma yeteneğini içerir. Bununla birlikte, bu yöntem ayrıntılı, zaman alıcıdır ve sınırlı ölçeklenebilirliğe sahiptir, bu da genellikle düşük verim ve düşük numune kalitesi ile sonuçlanır 27,28,29,30. Ayrıca, CsCl'nin memeliler üzerinde uygulayabileceği toksik etkiler nedeniyle in vivo çalışmalardan önce fizyolojik bir tampona karşı diyaliz sıklıkla gereklidir.

İodiksanol, rAAV vektörlerini saflaştırmak için alternatif bir izo-ozmotik gradyan ortamı olarak da kullanılmıştır ve hem güvenlik hem de vektör gücü açısından CsCl'ye göre avantajları vardır. Bununla birlikte, CsCl gibi, iyodiksanol yöntemi de hücre kültürü lizatının yükleme kapasitesi (ve dolayısıyla rAAV saflaştırmasının ölçeklenebilirliği) ile ilgili bazı dezavantajlar sunar ve zaman alıcı ve pahalı bir yöntem olmaya devam etmektedir30,31.

Bu kısıtlamaların üstesinden gelmek için araştırmacılar dikkatlerini kromatografi tekniklerine çevirdiler. Bu bağlamda, afinite, hidrofobik veya iyon değişim kromatografisi yöntemlerini içeren çeşitli saflaştırma yaklaşımları geliştirilmiştir. Bu yöntemler, doğal reseptörleri de dahil olmak üzere belirli bir serotipin biyokimyasal özelliklerine veya viral partikülün32 yük özelliklerine dayanır. Örneğin, AAV2, AAV3, AAV6 ve AAV13'ün tercihen heparan sülfat proteoglikanlarına (HSPG) bağlandığının keşfi, afinite kromatografisi saflaştırmasında yakından ilişkili heparinin kullanılması olasılığını ortaya çıkardı. Bununla birlikte, HSPG'ye bağlanma bölgeleri serotipler arasında farklılık gösterebilir, AAV bağlanmasına ve hedef hücrelerin farklı şekillerde enfeksiyonuna aracılık eder 2,33,34,35,36. Öte yandan, AAV1, AAV5 ve AAV6, N-bağlı sialik aside (SA) bağlanırken, AAV4, O-bağlı SA 2,14,34'ü kullanır. Aynı mantığı takiben, SA37 açısından yüksek oranda zenginleştirilmiş bir memeli proteini olan müsinin kullanımına dayalı olarak rAAV5'in saflaştırılması için tek aşamalı bir afinite kromatografi protokolü de geliştirilmiştir. Heparin bazlı teknikler gibi, bu saflaştırma da üretilen spesifik serotipe bağlıdır. Heparin ve müsin dışında, A20 monoklonal antikoru ve deve tek alanlı antikorlar (AVB Sepharose ve POROS CaptureSelect) gibi afinite kromatografisi için başka ligandlar da araştırılmıştır22,23,38,39,40,41. Daha önce var olan saflaştırma yöntemlerini geliştirmeye yönelik diğer yenilikçi stratejiler, spesifik bağlanma epitoplarını sunmak için rAAV kapsidinde küçük modifikasyonların uygulanmasını içerir. Örneğin, heksa-histidin etiketli veya biyotinile rAAV'ler, bu epitopları (sırasıyla nikel nitrilotriasetik asit ve avidin reçineleri) hedefleyen ligandlar kullanılarak saflaştırılabilir42,43,44.

rAAV'lerin istenen özelliklerini genişletme çabasıyla, araştırmacılar kapsidlerini karıştırarak viryonları çapraz giydirdiler. Bu, kapsid geninin üretim sırasında eşmolar veya farklı oranlarda iki farklı AAV serotipinden sağlanmasıyla gerçekleştirilir ve farklı serotiplerden 34,45,46,47,48,49,50 kapsid alt birimlerinin bir karışımından oluşan bir kapsid yapısına yol açar . Önceki çalışmalar, AAV2'den AAV1 (1:1 oranı) ve AAV2'den AAV9 (1:1 oranı) ile birlikte eksprese edilen kapsid proteinlerinin, sırasıyla mozaik rAAV1/2 ve rAAV2/9 vektörlerinin üretilmesine yol açtığına dair fiziksel kanıtlar sunmaktadır 45,46,48. Mozaik rAAV'lerin üretilmesinin önemli bir yararı, rAAV üretimi sırasında yararlı olan diğer özellikleri korurken, transgen ekspresyonu ve tropizmde sinerjik iyileşmeler ile sonuçlanan, farklı AAV serotiplerinden avantajlı özellikleri entegre etme kapasitesidir. İlginç bir şekilde, bazı mozaik varyantları, her iki ebeveyn virüsünden farklı yeni özellikler bile sergiler 46,47,49. AAV2'nin heparin bağlama yeteneğinden yararlanarak, mozaik rAAV vektörleri, AAV2'nin yönlendirilmiş evrim ve/veya rasyonel tasarım tarafından üretilen diğer doğal veya yeni AAV kapsidleri ile karıştırılmasıyla potansiyel olarak üretilebilir ve saflaştırılabilir. Bununla birlikte, önceki çalışmalar, mozaik vektörlerini birleştirmeye çalışırken kapsid alt birim uyumluluğunun önemini vurgulamıştır. Örneğin, Rabinowitz ve meslektaşları, AAV1, AAV2 ve AAV3'ün transkapsidasyonunun mozaik kapsidlerin verimli bir şekilde birlikte birleştirilmesine yol açmasına rağmen, bu serotiplerin AAV4 ile çapraz giyinmesinin kararlı virionların oluşumunu engellediğini gösterdi 34,45,47. Ek olarak, AAV1, AAV2 ve AAV3, bu kapsidleri farklı oranlarda karıştırırken elde edilen azalmış viral titreler göz önüne alındığında, AAV5 ile düşük uyumluluk gösterdi. İlginç bir şekilde, mozaik rAAV2/5, ebeveyn AAV5 gibi müsin bağlama yeteneğini korurken, heparin bağlama özelliklerinin azaldığını gösterdi. Bununla birlikte, 3: 1 oranında rAAV3 / 5, heparin ve müsine ikili bağlanmayı korumuştur. Genel olarak, gelişmiş transdüksiyon, spesifik tropizm veya düşük immünojenisiteye sahip yeni mozaik rAAV'lerin üretilmesi, kapsid montajı ve reseptör etkileşimleri hakkındaki anlayışımızdan büyük ölçüde yararlanabilir ve spesifik kombinasyonlar hala kapsamlı araştırma ve optimizasyon gerektirir.

Bu çalışmada, optimize edilmiş bir heparin afinite kromatografisi yöntemi kullanarak rAAV'lerin üretimi ve saflaştırılması için adım adım bir protokol açıklanmaktadır. rAAV'ler geçici transfeksiyon ile üretilir ve hızlı bir protein sıvı kromatografisi (FPLC) sistemi kullanılarak saflaştırılır. Seçilen saflaştırılmış fraksiyonların konsantrasyonundan sonra, elde edilen viral stoklar, in vitro ve in vivo olarak titre, saflık, içsel fiziksel özellikler ve biyolojik aktivite açısından karakterize edilir. Kavramın bir kanıtı olarak, mozaik rAAV1/2 ve rAAV2/9 vektörlerinin oluşturulması için bu protokolün iyileştirmelerini ve uygulanabilirliğini gösteriyoruz. Her bir serotipin seçimi, çarpıcı bir şekilde farklı tropizmlerine dayanıyordu ve potansiyel olarak benzersiz özelliklerini mozaik versiyonlara da kazandırıyordu. Merkezi sinir sistemi (CNS) için genel olarak ılımlı bir tropizme sahip AAV serotip 1, nöronları ve gliaları (daha az ölçüde) dönüştürme yeteneğine sahiptir ve in vivo 2,7,8 anterograd ve retrograd yönlerde aksonal taşımaya uğrar. Ek olarak, AAV serotip 9, hem yenidoğan hem de yetişkin farelerde kan-beyin bariyerini geçme ve CNS'yi hedefleme konusundaki doğal yeteneği nedeniyle seçilmiştir 51,52. Son olarak, afinite kromatografisine33 izin veren heparine bağlanma yeteneği göz önüne alındığında AAV serotip 2 seçildi. Saflaştırılmış rAAV1/2 ve rAAV2/9 partikülleri, her iki ebeveyn AAV serotipinin özelliklerini birleştirir ve bu nedenle CNS 45,46,48,49'un transdüksiyonu için uygun vektörler oluşturur.

Protokol

NOT: Protokolü özetleyen bir resim için Şekil 1'e bakın. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, aletler ve reaktifler hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın. Hücreleri ve virüsleri içeren tüm çalışmalar, hücre hatlarının bakımı için düzenli olarak kullanılanlardan ayrılmış, özel biyogüvenlik kabinlerinde ve inkübatörlerde yapılmalıdır. Kültürlenmiş hücreler ve virüslerle temas eden ekipman ve reaktifler steril olmalıdır. Tehlikeli reaktiflerin ve virüslerle kontamine olmuş malzemelerin imhasının, malzeme güvenlik bilgi formlarına ve her kurumun çevre sağlığı ve güvenliği ofisi tarafından sağlanan ulusal yasa ve yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmesi esastır. Nisan 2019 itibariyle, rekombinant veya sentetik nükleik asit moleküllerini içeren araştırmalar için NIH yönergeleri, tüm AAV serotiplerinin yanı sıra rekombinant veya sentetik AAV yapılarını Risk Grubu 1 ajanları (sağlıklı yetişkin insanlarda hastalıkla ilişkili olmayan) olarak sınıflandırır. Bu sınıflandırma, transgenin potansiyel olarak tümörijenik bir gen ürününü veya bir toksini kodlamadığı ve yapıların bir yardımcı virüs olmadan üretildiği durumlarda geçerlidir.

Hayvanları içeren tüm deneyler, 2013 yılında Portekiz yasasına (113/2013 sayılı Kanun Hükmünde Kararname) aktarılan laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımına ilişkin Avrupa Birliği Topluluğu direktifine (2010/63/EU) uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Ek olarak, hayvan prosedürleri, Tıp Fakültesi Hayvan Refahı Sorumlu Kuruluşu ve Coimbra Üniversitesi lisanslı hayvan tesisi Sinirbilim ve Hücre Biyolojisi Merkezi tarafından onaylandı. Araştırmacılar, deneyleri gerçekleştirmek için Portekizli yetkililerden (Direcção Geral de Alimentação e Veterinária, Lizbon, Portekiz) yeterli eğitim (FELASA sertifikalı kurs) ve sertifika aldılar.

1. Plazmid yapıları

  1. Aşağıdaki plazmitlerin önemli DNA miktarlarını izole etmek ve saflaştırmak için maxiprep endotoksin içermeyen bir kitin üreticisinin talimatlarını izleyin: i) pITR: ilgilenilen transfer vektörü; ii) pAAV-RC plazmidi: AAV2 Rep ve Cap dizileriniiçeren pRV1 36; iii) pAAV-RC plazmidi: AAV1 Rep ve Cap dizileriniiçeren pH21 36; iv) pAAV-RC plazmidi: AAV2 Rep ve AAV9 Cap dizilerini içeren pAAV2/9n; v) pHelper: pFdelta6, Adenovirüs yardımcı plazmid36.
  2. Önerilen enzimatik kısıtlamaları gerçekleştirerek oluşturulan plazmitlerin bütünlüğünü tarayın36. ITR'lerinkararsız bir kısmı içinde iki kez kesen bir kısıtlama endonükleazı olan SmaI ile sindirim yoluyla pITR plazmitlerinin bütünlüğünü izleyin 53,54.
    NOT: ITR'ler oldukça kararsız ve delesyonlara duyarlı olduğundan, bu bölgelerdeki rekombinasyonu en aza indirmek için SURE 2 süper yetkin hücrelerin kullanılması önerilir.

2. Hücre kültürü

  1. Kültür insan embriyonik böbreği 293, Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) yüksek glikozunda SV40 büyük T antijeni (HEK293T) hücre hattını stabil bir şekilde eksprese eder, %10 fetal sığır serumu ve %1 penisilin-streptomisin ile desteklenir, 37 ° C'de,% 5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir atmosfer altında, sonraki adımlar için bir başlangıç noktası olarak.
  2. % 0.05 tripsin-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) eklemeden önce hücreleri yıkamak için steril 1x Fosfat Tamponlu Salin (PBS), pH 7.05 kullanarak hücreleri alt kültürleyin.
    NOT: Aşırı sayıda geçiş geçirmiş hücreleri kullanmaktan kaçının (en fazla 20). Mikoplazma kontaminasyonu için hücre kültürlerini düzenli olarak test edin.

3. Geçici transfeksiyon ile rAAV üretimi

  1. 1. Gün: Hücre kaplaması
    1. Her viral üretim için, HEK293T hücreleri, transfeksiyondan bir gün önce, 22 mL takviye edilmiş kültür ortamında tabak başına 10.5 × 106 hücre yoğunluğunda 10 işlenmiş kültür kabına (15 cm çapında) plakalayın ve hücreler% 70 -% 80 birleşene ve transfeksiyona hazır olana kadar 24 saat inkübe edin.
  2. 2. Gün: Polietilenimin (PEI) kullanarak hücre transfeksiyonu
    1. Her viral üretim için (10.5 tabağa eşdeğer), bir mikrosantrifüj tüpünde aşağıdaki transfeksiyon karışımını ayarlayın: 54.6 μg pITR; 45.675 μg pRV1; 45.675 μg pH21 veya pAAV2/9n; 109.2 μg pFdelta6. Hafifçe vurarak karıştırın.
    2. Karışımı, 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde 4.557 mL takviye edilmemiş DMEM'e ekleyin. Hafifçe vurarak karıştırın.
    3. 1 mg / mL'de (pH 7.4) 1.365 mL steril PEI çözeltisi ekleyin, damla damla. Hafifçe vurarak karıştırın. DNA-PEI komplekslerinin oluşumuna izin vermek için oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
    4. Bu karışımı 231 mL önceden ısıtılmış takviye edilmiş DMEM'e ekleyin. Her yemeğin tüm kültür ortamını bu transfeksiyon karışımının 22 mL ile değiştirin. Hücreleri 48 saat inkübe edin.
      NOT: Hücre ayrılmasını önlemek için bu adım dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmelidir.
  3. 4. Gün: Hücre hasadı
    1. pITR bir floresan raportörü kodladığında, transfekte edilmiş hücreleri bir floresan mikroskobu altında görselleştirin.
    2. Her bir tabaktan ortamı 50 mL'lik santrifüj tüplerine toplayın ve 10 dakika boyunca 800 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
      NOT: Bu adım isteğe bağlıdır ve çok yüksek bir birleşme nedeniyle ayrılmış olabilecek transfekte edilmiş hücreleri kurtarmayı amaçlar.
    3. Her plakaya 10 mL önceden ısıtılmış PBS ekleyin. Hücreleri bir hücre sıyırıcı ile nazikçe çıkarın ve süspansiyonu adım 3.3.2'den itibaren 50 mL'lik santrifüj tüplerine toplayın.
    4. Ekstra 10 mL PBS ile bir seferde 5 bulaşık yıkayın ve süspansiyonu adım 3.3.3'ten itibaren 50 mL santrifüj tüplerine aktarın. Hücreleri 10 dakika boyunca 800 × g'da pelet haline getirin ve süpernatanı atın.
    5. Hücre peletlerini -80 °C'de dondurun.
      NOT: Hücre peletleri birkaç ay saklanabilir (duraklama noktası).

4. rAAV ekstraksiyonu ve FPLC saflaştırması

  1. 5. Gün: Hücre lizat hazırlığı
    1. Hücre peletlerini oda sıcaklığında çözdürün. 10 tabaktan toplanan hücreleri, 150 mM sodyum klorür (NaCl) ve 20 mM Tris, pH 8.0 içeren steril bir tamponun 100 mL'sinde ultra saf (tip I) suda yeniden süspanse edin. Homojen bir süspansiyon elde etmek için süspansiyonu yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
    2. Hücre lizizini indüklemek için ultra saf suya 12.5 mL taze hazırlanmış steril% 10 sodyum deoksikolat çözeltisi ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
      NOT: Sodyum deoksikolatı ve onunla temas eden malzemeleri, malzeme güvenlik bilgi formuna ve kurumun çevre sağlığı ve güvenliği ofisi tarafından sağlanan yönergelere uygun olarak atın. Bu pudrayı tutarken bir yüz maskesi takmanız da önerilir. Karıştırdıktan sonra, çözelti oldukça viskoz hale gelir.
    3. Önceki karışıma 27 μL benzonaz nükleaz ekleyin. Numune artık viskoz olmayana kadar yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın. 37 ° C'de 1 saat inkübe edin ve her 10 dakikada bir girdap gerçekleştirin.
      NOT: Bu endonükleaz, herhangi bir proteolitik aktivite sergilemeden tüm DNA ve RNA formlarını verimli bir şekilde parçalayabilir.
    4. Karışımı 25 ° C'de 60 dakika boyunca 3.000 × g'da santrifüjleyerek hücresel kalıntıları temizleyin. Süpernatanı 0.45 μm steril poliviniliden diflorür (PVDF) şırınga filtresi ile filtreleyin ve yeni bir steril kaba aktarın.
      NOT: Bu önemli adım, hücresel kalıntıların çoğunun uzaklaştırılmasını sağlar, böylece kromatografi kolonlarının tıkanmasını önler. Analiz için bu karışımın küçük bir kısmını saklayın (isteğe bağlı adım).
  2. 5. Gün (devam): rAAV'lerin heparin kolonu saflaştırılması
    NOT: Numune uygulaması, sistemin bir parçası olarak bir numune pompası veya 50 mL veya 150 mL süper döngü kullanılarak gerçekleştirilebilir. Daha düşük sıcaklıklarda daha fazla hava çözündüğünden, FPLC sisteminde kullanılmadan önce tamponların ve çözeltilerin (genellikle 4 ° C'de saklanır) oda sıcaklığına alışması için yeterli zaman tanımak önemlidir.
    1. İsteğe bağlı: Sistem uzun süre saklandıysa, sistemi ve tüm girişleri manuel talimatlar veya önceden tanımlanmış bir yerinde sistem temizleme (sistem CIP) yöntemi kullanarak yeni hazırlanmış depolama solüsyonu (%20 etanol) ile doldurun.
    2. Sıvı akış yolunu, manuel talimatları veya önceden tanımlanmış bir sistem CIP yöntemini kullanarak steril ultra saf su ile tamamen yıkayın.
    3. 1 mL'lik önceden paketlenmiş bir heparin sütunu bağlayın, basınç alarmını ayarlayın ve 1 mL/dk'lık bir akış hızında beş sütun hacmi (CV) ultra saf su ile yıkayın.
    4. Tampon tepsisindeki çözeltileri ultra saf sudan tampon A'ya (ultra saf suda 100 mM NaCl ve 20 mM Tris, pH 8 steril çözelti) A girişine (sistem pompası A) ve B girişi (sistem pompası B) için tampon B'ye (ultra saf suda 500 mM NaCl ve 20 mM Tris, pH 8 steril çözelti) geçirin. Sistemde bir numune pompası varsa, numune giriş valfinin tampon girişini tampon A'ya yerleştirin.
    5. Sistem pompası B'yi tampon B ile yıkayın ve sıvı akış yolunun geri kalanını tampon A ile doldurun.
      NOT: Gerekirse, sütunu akış yolundan ayırın ve daha sonra yeniden bağlayın.
    6. Numune giriş valfinden bir numune giriş hortumu, örneğin S1, adım 4.1.4'te elde edilen viral preparatın bulunduğu kabın içine yerleştirin. (hücre lizat hazırlığından). Numune girişi S1'den numune çözeltisi ile enjeksiyon valfine giden akış yolunu hazırlayın. Alternatif olarak, 50 mL'lik bir şırınga kullanarak 50 mL veya 150 mL'lik bir süper döngüyü rAAV'ler içeren numune ile doldurun.
    7. Sütunu, 1 mL / dak hızında tampon B'nin% 12,5'ini kullanarak toplam beş CV hacmiyle dengeleyin.
    8. Numune pompasını ( tüm numuneyi hava sensörü kullanarak enjekte etmeyi seçin) veya 0,5 mL/dk'da süper döngüyü kullanarak numunenin toplam hacmini kolona uygulayın ve yeni bir steril kapta çıkış portunu kullanarak akışı toplayın.
      NOT: Aşırı basıncı önlemek için akış kontrolü özelliği etkinleştirildiğinde, kolonun tıkanması durumunda akış otomatik olarak azalacaktır. Akış hızı 0,5 mL/dk'nın önemli ölçüde altına düşerse, numune uygulamasını durdurun, 2-5 CV tampon A ile yıkama yapın ve ardından numune uygulamasına devam edin.
    9. Sütunu 1 mL / dak'da 20 CV tampon A ile yıkayın ve çıkış portunu kullanarak akışı toplayın.
    10. Numuneyi aşağıdaki şema ile 1 mL/dk'da elute edin: i) beş CV için tampon B'nin %50'si hedefi olan doğrusal gradyan; ii) Beş CV sırasında tampon B'nin %90'ı hedefi olan adım; iii) beş CV sırasında B arabelleğinin %100'ü hedefiyle adım atın.
    11. Ayrıştırılan numuneyi bir fraksiyon toplayıcı ve düşük retansiyonlu mikrosantrifüj tüpleri (2 mL) kullanarak 1 mL'lik fraksiyonlar halinde toplayın ve -20 °C'de saklayın.
      NOT: rAAV fraksiyonları birkaç hafta saklanabilir (duraklama noktası).
    12. Beş CV için sütunu 1 mL / dk'da %12.5 tampon B ile yeniden dengeleyin.
    13. Girişleri tampon çözeltilerinden ultra saf suya geçirin ve sütunu beş CV için 1 mL / dk'da yıkayın.
    14. Girişleri ultra saf sudan %20 etanole geçirin ve sütunu beş CV için 1 mL/dk'da yıkayın. Kolonu ayırın ve 4 °C'de saklayın.
      NOT: Aynı rAAV serotipi ve transgeni kullanılıyorsa, sütunlar başka herhangi bir önemli temizleme ve sanitasyon prosedürü olmadan birkaç kez yeniden kullanılabilir.
    15. Manuel talimatlar veya önceden tanımlanmış bir sistem CIP yöntemi kullanarak sıvı akış yolunu %20 etanol ile tamamen yıkayın.

5. Saflaştırılmış rAAV'lerin konsantrasyonu

  1. 6. Gün: Konsantrasyon adımı 1
    1. 100 kDa moleküler ağırlık kesme özelliğine sahip 15 mL'lik bir santrifüj filtre ünitesi kullanarak rAAV'leri konsantre edin. rAAV'leri (FPLC fraksiyonları 7 ila 16) içeren istenen fraksiyonları 15 mL santrifüj filtre ünitesine yükleyin ve oda sıcaklığında 2,000 dakika boyunca 2 × g'da santrifüjleyin. Filtre ünitesindeki konsantre hacmin yaklaşık 500 μL olduğundan emin olun. Konsantre hacim büyük ölçüde 500 μL'yi aşarsa, istenen hacme ulaşana kadar santrifüjleme adımlarını 1 dakikalık aralıklarla tekrarlayın.
  2. 6. Gün (devam): Tampon değişimi
    1. rAAV'leri içeren santrifüj filtre ünitesine 1 mL steril PBS ekleyin. Filtreyi yıkamak için dikkatlice yukarı ve aşağı pipetleyin. 500 μL'lik nihai hacme ulaşılana kadar 1 dakikalık aralıklarla 2.000 × g'da santrifüjleyin.
  3. 6. Gün (devam): Konsantrasyon adımı 2
    1. Önceki adımda elde edilen 500 μL konsantre rAAV'leri, 100 kDa moleküler ağırlık kesme özelliğine sahip 0,5 mL'lik bir santrifüj filtre ünitesine aktarın ve 1 dakika boyunca 6.000 × g'da santrifüjleyin. Gerekirse, 100 μL'den daha az bir nihai hacme ulaşılana kadar santrifüjleme adımını tekrarlayın.
  4. 6. Gün (devam): Kurtarma
    1. Konsantre rAAV'yi geri kazanmak için, filtre cihazını yeni bir mikrosantrifüj toplama tüpüne baş aşağı yerleştirin. Tüpü, kapağı merkeze bakacak şekilde bir mikrosantrifüje yerleştirin ve konsantre rAAV'leri cihazdan mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için akış odası içinde uzun süreli bir dönüş gerçekleştirin. Alternatif olarak, 2 dakika boyunca 1.000 × g'da santrifüjleyin.
    2. Steril Pluronic F-68 %0.001 ile takviye edin (isteğe bağlı).
      NOT: Pluronic F-68, seyreltme hazırlama, şırınga yükleme ve dağıtım ekipmanı55,56 sırasında kullanılan malzemelerin (plastikler) yüzeyleriyle etkileşimlerini önleyerek rAAV kayıplarını azaltabilen, Gıda ve İlaç Dairesi tarafından insan kullanımı için onaylanmış iyonik olmayan bir yüzey aktif maddedir.
    3. rAAV'leri düşük retansiyonlu mikrosantrifüj tüplerine alın ve -80 °C'de (duraklama noktası) saklayın.

6. Saflaştırılmış rAAV'lerin miktarının belirlenmesi

  1. 6. Gün (devam): Ticari bir kit kullanarak ve üreticinin talimatlarını izleyerek gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) ile viral genomlar/μL (vg/μL) cinsinden eksprese edilen rAAV preparatlarının titresini belirleyin.
    1. rAAV partikül çözeltisini DNase I ile 37 °C'de 20 dakika inkübe edin.
      NOT: Bu prosedür, konakçı hücrelerden türetilen serbest genomik DNA ve plazmit DNA'nın sindirimini teşvik eder, böylece yalnızca bozulmamış rAAV parçacıkları içindeki nükleik asit dizisinin korunmasını sağlar.
    2. DNase I'i 95 °C'de 10 dakika süreyle ısıtın.
    3. Lizis Tamponu ekleyin ve rAAV partiküllerinin proteinlerinin ısıyla denatürasyonunu teşvik etmek için 70 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
    4. RT-qPCR'ye geçmeden önce elde edilen rAAV genom çözeltisini seyreltme tamponu içinde seyreltin. Kit ile birlikte verilen pozitif kontrolün seri olarak seyreltilmiş bir dizi standardını (2 × 107 vg/μL ila 2 × 102 vg/μL) hazırlayın.
    5. 12.5 μL Taq II karışımı, 0.5 μL seyreltilmiş primer karışımı, 7 μL su ve 5 μL seyreltilmiş rAAV DNA (bilinmeyen AAV örneği ve adım 6.1.4.'teki standartlar) içeren bir reaksiyon karışımı gerçekleştirin.
    6. RT-qPCR'yi aşağıdaki protokolü kullanarak gerçek zamanlı bir PCR tespit sisteminde gerçekleştirin: 2 dakika boyunca 95 ° C'de 1 döngü (ilk denatürasyon) ve 5 saniye boyunca 95 ° C'de 40 döngü (denatürasyon) ve 30 saniye boyunca 60 ° C (tavlama, uzatma ve plaka okuma), ardından bir eriyik eğrisi analizi.
    7. rAAV numune hazırlamadan kaynaklanan seyreltme faktörünü göz önünde bulundurarak standart eğriden (doğrusal regresyon çizgisi) mutlak numune konsantrasyonunu hesaplayın.
      NOT: Viral genom sayısının nicelleştirilmesi, AAV2'nin ITR dizisinin (kit tarafından sağlanan primerlerin hedef dizisi) amplifikasyonu yoluyla elde edilir.

7. SDS-PAGE, Coomassie mavisi boyama ve batı lekesi

  1. 6x numune tamponu (0.5 M Tris-HCl/%0.4 sodyum dodesil sülfat (SDS) pH 6.8, %30 gliserol, %10 SDS, 0.6 M dithiothreitol (DTT), %0.012 bromofenol mavisi) ekleyerek ve numuneleri 95 °C'de 5 dakika inkübe ederek her numuneden 40 μL (her FPLC fraksiyonu; akış; kolon öncesi numuneler ve toplam 2.3 ×10 10 vg nihai konsantre ürün) denatüre edin.
  2. Denatüre edilmiş numuneleri (48 μL) bir SDS-poliakrilamid jele (%4 istifleme ve %10 çözünen jel) yükleyin ve bir protein merdivenine bitişik olarak 70 dakika boyunca 100 V'ta elektroforetik ayırma işlemini gerçekleştirin.
  3. Protein analizi
    NOT: Coomassie mavisi boyama veya western lekeleme yapılabilir.
    1. Coomassie mavisi boyama
      1. Protein bantlarını görselleştirmek için jeli %50 metanol ve %10 asetik asit buzul içinde çözünmüş %0.25 Coomassie blue G250 çözeltisi ile 10 dakika boyayın.
      2. Düşük arka plana sahip şeffaf bantlar görünür hale gelene kadar% 25 metanol ve% 5 asetik asit buzul içeren bir çözelti ile birkaç kez yıkayarak jel leke giderme işlemini gerçekleştirin.
      3. Uygun bir görüntüleme sistemi kullanarak görüntü yakalayın.
    2. Batı lekesi
      1. Proteinleri standart protokollere göre bir PVDF membranına aktarın.
      2. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca TBS-T (Tris-tamponlu tuzlu su içinde% 0.1 Tween 20) ile seyreltilmiş% 5 yağsız sütte inkübasyon yoluyla membranı bloke edin.
      3. 4 ° C'de gece inkübasyonu için aşağıdaki birincil antikorları (bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş) kullanın: fare monoklonal anti-AAV, VP1, VP2, VP3 antikoru (B1, 1: 1.000) veya fare monoklonal anti-AAV, VP1, VP2 antikoru (A69, 1: 1.000).
      4. Membranları TBS-T'de 3 x 15 dakika yıkayın ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca alkalin fosfataza bağlı keçi anti-fare ikincil antikoru (1: 10.000) ile inkübe edin.
      5. Membranları TBS-T'de 3 x 15 dakika yıkayın. Gelişmiş kemifloresan substrat (ECF) ekleyin ve kemifloresan görüntüleme ile protein bantlarını görselleştirin.

8. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM)

  1. Bir rAAV numunesinin bir damlasının üzerine Formvar-karbon kaplı 200 gözenekli bir ızgarayı baş aşağı yerleştirin ve 1 dakika oturmasına izin verin.
  2. Izgaraları bir damla su ile yıkayın ve fazla sıvıyı filtre kağıdı ile kurulayın.
  3. Viral partikülleri sabitlemek ve kontrast oluşturmak için ızgaraları 1 dakika boyunca% 1 uranil asetat çözeltisi (pH 7) ile negatif olarak boyayın.
  4. Izgaraları bir damla su ile yıkayın ve fazla sıvıyı filtre kağıdı ile kurulayın.
  5. Numuneleri bir transmisyon elektron mikroskobunda inceleyin.
    NOT: Yüksek tuz konsantrasyonları, rAAV'lerin ızgaraya bağlanmasını doğrudan etkileyebilir ve kristal benzeri yapıların görselleştirilmesine yol açabilir.

9. Ardışık ultraviyole görünür ışık absorpsiyonu, statik ışık saçılımı ve dinamik ışık saçılımı analizi

  1. 96 oyuklu bir kantifikasyon plakasına, tampon boşluğu olarak kullanılmak üzere 2 μL bir rAAV numunesi ve 2 μL PBS yükleyin (bunu iki kez gerçekleştirin).
  2. İstemci analiz yazılımında AAV Quant uygulamasını kullanın, numunelerin adlarını plakanın doğru konumuna yerleştirin, AAV serotipini seçin ve İleri'ye tıklayın.
  3. 96 kuyulu kantifikasyon plakasını özel ekipmana yükleyin ve veri toplama için plaka okumaya devam edin.

10. İn vitro transdüksiyon testleri

  1. rAAV'lerin iletim verimliliğini hızlı bir şekilde analiz etmek için farklı hücre hatları kullanılabilir.
    1. HEK293T hücreleri 24 oyuklu plakalarda (137.500 hücre / kuyu yoğunluğunda) ve bir fare nöroblastoma-2A (Neuro2a) hücre hattında 24 oyuklu plakalarda (50.000 hücre / kuyu) veya 8 oyuklu odacıklı slaytta (27.000 hücre / kuyu), yukarıda açıklandığı gibi% 10 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş DMEM yüksek glikoz kullanarak. Hücrelerin gece boyunca 37 °C'de %5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir atmosferde yapışmasına izin verin.
    2. Her oyuktan şartlandırılmış ortamı toplayın (24 oyuklu plakalardan 250 μL ve 8 oyuklu hazneli slayttan 50 μL) ve daha sonra kullanmak üzere 4 °C'de saklayın.
    3. Her bir oyuğa aşağıdaki rAAV preparatlarını ekleyin ve hücreleri% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de 24 saat inkübe edin.
      1. FPLC ile toplanan fraksiyonlar F2-F16'nın 50 μL'sini ekleyin ve 24 oyuklu plakalarda kaplanmış HEK293T hücrelere akın.
      2. 50 μL PBS içinde seyreltilmiş konsantre rAAV'lerin toplam 5.5 × 109 vg'sini 24 oyuklu plakalarda kaplanmış Neuro2a hücrelerine ekleyin (hücrelere 50 μL PBS ekleyerek negatif bir kontrol kuyusu ekleyin).
      3. 25 μL PBS içinde seyreltilmiş konsantre rAAV'lerin toplam 2.75 ×10 9 vg'sini 8 oyuklu bir odacıklı slaytta kaplanmış Neuro2a hücrelerine ekleyin (hücrelere 50 μL PBS ekleyerek negatif kontrol koşulunu dahil edin).
    4. Önceden depolanmış şartlandırılmış ortamı (adım 10.1.2) her bir oyuğa ekleyin ve 24 saat inkübe edin.
    5. Ortamı atın ve hücreleri PBS ile 2 kez yıkayın.
    6. Her bir oyuğa PBS'de %4 sükroz ile desteklenmiş, önceden 37 °C'ye ısıtılmış %4'lük bir paraformaldehit (PFA) çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
    7. 2 kez PBS ile yıkayın ve görüntüleme yapılana kadar (duraklama noktası) 4 °C'de saklayın.
    8. 10x/0.30 objektif ile donatılmış ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu veya 40x/1.4 Oil DIC objektif ile donatılmış ters konfokal mikroskopta görüntüler elde edin.
  2. İn vivo ortamın daha alakalı ve yansıtıcı bir modeline sahip olmak için, birincil nöronal kültürleri aşağıdaki gibi kullanın:
    1. Daha önce Santos ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi kortikal nöronların birincil kültürlerini hazırlayın.57. Kısaca, 12 oyuklu plakalarda 200.000 hücre / mL tohumlayın ve bunları in vitro 16 gününe kadar kültürde tutun.
    2. Her kuyucuktan (100 μL) şartlandırılmış ortamı toplayın ve daha sonra kullanmak üzere 4 ° C'de saklayın.
    3. Test edilecek rAAV'leri her bir oyuğa ekleyin: 25 μL PBS içinde seyreltilmiş konsantre rAAV'lerin toplam 2.75 × 109 vg'ı (negatif kontrolü dahil edin: 25 μL PBS). % 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de 24 saat inkübe edin.
    4. Önceden depolanmış şartlandırılmış ortamı ekleyin ve 24 saat inkübe edin.
    5. Ortamı her bir kuyucuğa atın ve 2x'i PBS ile yıkayın.
    6. Hücreleri, adım 10.1.6'da açıklandığı gibi PBS'de% 4 PFA /% 4 sükroz ile sabitleyin. PBS ile 2 kez yıkayın.
    7. Her bir oyuğu Alexa Fluor 633 ile konjuge edilmiş 5 μg / mL buğday tohumu aglütinini (WGA) ile oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin (isteğe bağlı adım: bunun yerine immünositokimya yapın). PBS ile 2 kez yıkayın.
    8. PBS'de% 0.25 Triton X-100'de oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. PBS ile yıkayın.
    9. 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. PBS ile 2 kez yıkayın.
    10. 40x/0.95 objektif ile donatılmış ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu veya 40x/1.4 Oil DIC objektif ile donatılmış ters konfokal mikroskopta görüntüler elde edin.

11. İn vivo deneyler

NOT: Hayvanlar, 12 saatlik bir aydınlık/karanlık döngüsünde tutulan, sıcaklık kontrollü bir odaya yerleştirildi. Yiyecek ve su ad libitum olarak sağlandı. Hayvanların çektiği acıyı en aza indirmek için tüm çabalar gösterildi.

  1. Beyincikte stereotaksik enjeksiyon
    1. 9 haftalık C57BL / 6 hayvanlarını, bir buharlaştırıcıya bağlı bir odada oksijen (0.8 L / dak) varlığında% 2 izofluran soluyarak uyuşturun.
    2. Anestezi uygulanmış hayvanı stereotaksik cihaza (35 ° C ısıtılmış bir ped üzerinde) yerleştirin ve izofluran maskesini hayvanın burnuna yerleştirin. İzofluran seviyesini% 1.3-1.7'ye düşürün.
      NOT: Devam etmeden önce hayvanın doğru şekilde uyuşturulduğundan emin olun (her iki arka bacakta fleksiyon refleksinin kaybı).
    3. Korneaların kurumasını önlemek için kayganlaştırıcı göz merhemi uygulayın ve hayvana onaylanmış bir analjezik enjekte edin.
      NOT: Sonraki tüm adımlar steril koşullarda gerçekleştirilmelidir.
    4. Hayvanın kafasının kürkünü tıraş ettikten ve cerrahi alanı dezenfekte ettikten sonra, kafatasını açığa çıkarın ve 10 μL'lik bir Hamilton şırıngaya bağlı 30 G'lik künt uçlu bir enjeksiyon iğnesinin ucunu doğrudan bregma üzerine yerleştirin (stereotaksik koordinatların hesaplanması için bregma'yı sıfır olarak kullanın).
    5. İğneyi istenen koordinata getirin ve kafatasında iğnenin gireceği yerde bir delik açın.
      NOT: Bu çalışma çerçevesinde, beyincikte merkezi olarak tek bir enjeksiyon yapıldı.
    6. Otomatik bir enjektör kullanarak 0.5 μL/dk'lık bir infüzyon hızında, PBS içinde seyreltilmiş toplam 8 ×10 9 vg içeren 4 μL'lik bir rAAV çözeltisi enjekte edin. Yetişkin bir C57BL/6 farenin beyincikinde merkezi olarak tek bir enjeksiyon gerçekleştirmek için bregmadan hesaplanan aşağıdaki koordinatları kullanın: antero-posterior: -6,5 mm; yanal: 0 mm; ventral: -2.9 mm.
      NOT: Bu koordinatlar, kullanılan hayvanların fare türüne, cinsiyetine ve yaşına göre değişebilir.
    7. Geri akışı en aza indirmek ve viral vektör difüzyonuna izin vermek için, infüzyon tamamlandıktan sonra, şırınga iğnesini bu koordinatlarda 3 dakika bırakın, ardından yavaşça 0,3 mm geri çekin ve fare beyninden tamamen çıkarılmadan önce 2 dakika daha yerinde kalmasına izin verin.
    8. Kesiği kapatın ve bir dezenfektan madde ile temizleyin (ör. % 10 povidon-iyot).
    9. Hayvanları ev kafeslerine geri göndermeden önce anesteziden kurtulmalarına izin verin.
  2. Doku toplama ve hazırlama
    NOT: Bu deneyde, transdüksiyon seviyeleri enjeksiyondan 12 hafta sonra gözlenmiştir, ancak aynı prosedür enjeksiyondan 4 hafta sonra değerlendirilebilir.
    1. Aşırı dozda ksilazin / ketamin (8/160 mg / kg vücut ağırlığı) intraperitoneal uygulamasıyla hayvanları terminal olarak anesteziyin.
    2. Hayvanları buz gibi soğuk PBS ile 6 dakika boyunca 2.5 mL / dk oranında transkardiyal olarak perfüze edin, ardından aynı oranda 10 dakika boyunca taze hazırlanmış buz gibi% 4 PFA çözeltisi ile perfüzyon yapın.
    3. Eksize edilen beyinleri gece boyunca oda sıcaklığında %4 PFA'da eksize edin ve ardından kriyoproteksiyon için %25'lik bir sükroz/PBS solüsyonuna aktarın. Beyinler battıktan sonra (yaklaşık 48 saat sonra), onları -80 °C'de saklayın.
    4. -21 ° C'de bir kriyostat kullanarak 30 μm kalınlığında seri sagital kesitler kesin. Her hayvan için,% 0.05 sodyum azid ile desteklenmiş PBS'de serbest yüzen bölümler olarak anatomik serilerde bir beyin yarım küresinin 96 sagital bölümünü toplayın. Daha fazla işleme kadar 4 °C'de saklayın.
  3. Standart floresan immünohistokimyası
    1. Hayvan başına birbirinden 240 μm mesafede sekiz sagital bölüm seçin.
    2. Serbest yüzen bölümleri blokaj/geçirgenleştirme solüsyonunda (PBS'de %10 normal keçi serumu (NGS) içeren %0.1 Triton X-100) içinde oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
    3. Bölümleri gece boyunca 4 ° C'de tavuk poliklonal anti-GFP primer antikoru (1: 1,000) ile inkübe edin.
    4. PBS'de 3 x 15 dakika yıkayın ve bölümleri Alexa Fluor 488 florofora (1:200) konjuge edilmiş ikincil antikor keçi poliklonal anti-tavuk antikoru ile oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
    5. PBS'de 3 x 15 dakika yıkayın. DAPI ile oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
    6. PBS'de 3 x 15 dakika yıkayın. Bölümleri jelatin kaplı slaytlara yerleştirin ve floresan montaj ortamı ile lamel yapın.
    7. 20x/0.8 objektif ile donatılmış bir slayt tarayıcı floresan mikroskobunda görüntüler elde edin.

Sonuçlar

Bu çalışmada, aynı anda heparin afinite kromatografisi saflaştırması (AAV2) için uygun olan ve aynı anda CNS'yi (örneğin AAV1 ve AAV9) hedefleme ve dönüştürme potansiyeline sahip mozaik rAAV'lerin (Şekil 1'de özetlenmiştir) üretimi, saflaştırılması ve karakterizasyonu için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bunu başarmak için, mozaik rAAV1/2 ve rAAV2/9 vektörlerini geliştirmek için doğal AAV serotipleri 1, 2 ve 9'dan kapsidler kullanıldı.

Başlamadan önce, plazmid preparatları yapısal bütünlük açısından tarandı. Klonlama parçalarının doğru yerleştirilmesini doğrulamak için gerekli sindirime ek olarak, potansiyel ITR delesyonlarını/eklemelerini tespit etmek için pITR plazmitlerini tutarlı bir şekilde taramak önemlidir. Örnek olarak, bir pITR plazmitinin farklı klonlarındaki ITR'lerin bütünlüğü, restriksiyon enzimi SmaI ile plazmit sindiriminden sonra izlendi (Ek Şekil S1).

Her iki mozaik vektör türü de, standart transfeksiyon yöntemlerine6 göre, ilgili AAV kapsid plazmitlerinin 1:1 oranında birlikte transfeksiyonu ile üretildi. Kısaca, HEK293T hücreler i) ITR (pITR) dizileri arasında paketlenmiş ilgilenilen transgeni içeren bir plazmit, ii) AAV2 ve AAV1 veya AAV9'un vahşi tip AAV genomu Rep ve Cap ORF'lerini içeren bir plazmit (pAAV-RC plazmitleri) ve iii) adenoviral proteinleri (E1A, E1B, E4 ve E2A) ve ayrıca yardımcı işlevler için gerekli olan adenovirüs virüsü ile ilişkili RNA'ları kodlayan bir plazmit (pHelper) ile transfekte edildi. Kırk sekiz saat sonra, hücreler 6,36 hasat edildi ve rAAV'ler, bir FPLC sistemi kullanılarak afinite kromatografisi ile hücre homojenatından saflaştırıldı. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, kolon dengelemesinden (dengeleme adımı) sonra, rAAV'leri içeren hücre lizatı kolona uygulandı (numune yükleme). rAAV2'nin heparin33 için doğal afinitesi nedeniyle, rAAV'ler kolonun reçinesine bağlanırken, diğer bileşenler çalışan tamponda gerçekleştirildi ve UV monitörü tarafından tespit edildi (akış geçişi), bu da absorbansta bir artışa neden oldu. Kolon daha sonra yıkandı (yıkama aşaması) ve rAAV'ler son olarak NaCl konsantrasyonunun artmasıyla (elüsyon aşaması) ayrıştırıldı. Ayrıştırılan virüsler UV monitörü tarafından tespit edildi ve 1 mL'lik fraksiyonlar halinde toplandı.

rAAV1/2 ve rAAV2/9'un temsili bir elüsyon tepe profili, sırasıyla Şekil 2B ve Ek Şekil S2A'da gösterilmiştir ve farklı viral gruplar sürekli olarak F7 fraksiyonundan F16'ya kadar tek bir tepe noktası sunar. Tepe yüksekliği, rAAV üretimleri arasında değişkendir ve daha yüksek tepeler genellikle daha yüksek rAAV verimlerine yol açar. Üretilen rAAV1/2 ve rAAV2/9'un her bir fraksiyonu daha sonra viral titreleri değerlendirmek için RT-qPCR ile karakterize edildi (Şekil 2C ve Ek Şekil S2B).

Ayrıştırılan malzemenin saflığını karakterize etmek için, her fraksiyonun ve ilgili akışın 40 μL'si SDS-poliakrilamid jel elektroforezi ile incelenmiştir (rAAV1/2 için Şekil 2D ve rAAV2/9 için Ek Şekil S2C ). Coomassie mavisi boyama, F7-F16 fraksiyonlarında, daha önce Van Vliet ve meslektaşları14 tarafından tarif edildiği gibi, uygun oranlarda 1: 1: 10 AAV'lerin VP1 (87 kDa), VP2 (72 kDa) ve VP3 (62 kDa) kapsid proteinlerine karşılık gelen moleküler ağırlıklara sahip üç ana bant ortaya çıkardı. Her iki durumda da ve UV absorbansı, RT-qPCR ve jel bant yoğunluğuna bağlı olarak, mozaik rAAV'lerin çoğunun F7 ve F8 fraksiyonlarında bulunduğu ve F9-F16 fraksiyonlarında kademeli olarak azalmaya başladığı açıktır. Üç viral kapsid proteinine ek olarak, F8-F16 fraksiyonlarında yaklaşık 17 kDa boyutunda başka bir protein (veya proteinler) tespit edildi/tespit edildi.

Bu birlikte saflaştırıcı protein(ler)i ortadan kaldırmak için, F7-16 fraksiyonları daha sonra 100 KDa santrifüj filtre üniteleri kullanılarak filtrelenmiş ve konsantre edilmiştir ve nihai rAAV titresi RT-qPCR ile belirlenmiştir (rAAV1/2 için Şekil 3A,B'de gösterildiği gibi). Bir rAAV üretiminin nihai verimi, pITR'nin uzunluğuna ve karmaşıklığına, ITR dizilerinin bütünlüğüne, hücre kültürü koşullarına (örneğin, hücre geçişlerinin sayısı) ve transfeksiyon verimliliğinebağlıdır 24,58,59,60,61. Bununla birlikte, son titre, 0.5 mL santrifüj filtre üniteleri (konsantrasyon aşaması 2) kullanılarak rAAV preparatının çoklu santrifüjlemeleri gerçekleştirilerek ayarlanabilir. Bu protokolü takiben, 50 ila 100 μL aralığındaki bir nihai hacim için, konsantrasyonlar genellikle 2 ila 109 × 5 ila 1010 vg/μL × 10 10 vg/μL arasında oluşur (referans alınan titrasyon kiti kullanılarak gerçekleştirilen miktar tayini).

Nihai rAAV preparatlarının saflığı daha sonra 'luk bir SDS-poliakrilamid jel üzerinde değerlendirildi. Şekil 3C'de gösterildiği gibi, rAAV1/2 preparatı için rAAV'lerin kapsid proteinlerini temsil eden sadece üç bant gözlendi ve saptanabilir birlikte saflaştırıcı protein tanımlanmadı. Bu sonuçlar rAAV2/9 için elde edilenlerle tutarlıydı (Ek Şekil S2C). rAAV1/2 ve rAAV2/9 vektörlerinin kimliğini doğrulamak ve saflığını daha da karakterize etmek için, viral fraksiyonlar ve konsantre stoklar, spesifik antikorlar B1 (Ek Şekil S3A ve Ek Şekil S4A) ve A69 (Ek Şekil S3B ve Ek Şekil S4B) ile western blot ile analiz edildi. Antikor B1, çoğu AAV serotipinin62 tüm VP proteinleri için ortak olan bir C-terminal epitopunu tanırken, klon A69 sadece VP1 ve VP263'ün epitoplarını tanır. Bununla birlikte, B1 ve A69 etiketlemesi üzerine VP3'ten (<62 kDa) daha düşük moleküler ağırlığa sahip bazı soluk bantlar da tespit edilebilir.

Yapısal morfolojiyi karakterize etmek ve rAAV'lerin saflığını daha fazla değerlendirmek için, viral partiküller doğrudan TEM ile görselleştirildi. Bu teknik, boş ve dolu rAAV partiküllerinin miktarının belirlenmesine ve ayrıca birnumunedeki kontaminasyonun değerlendirilmesine izin verdiği için viral numunelerde numune bütünlüğünü ve saflığını değerlendirmek için standart prosedür olmuştur 29,64,65,66,67. Şekil 3D'de gösterildiği gibi, ~ 25 nm çapında büyük miktarlarda rAAV parçacıkları temiz bir arka plan üzerinde gözlemlenebilir. Elektron yoğun bir merkeze sahip boş parçacıklar (siyah ok) ve dolu vektörler (beyaz ok) da numune alanı boyunca gözlemlenebilir.

Ayrıca, ultraviyole-görünür (UV-Vis) spektroskopisi, statik ışık saçılımı (SLS) ve dinamik ışık saçılımını (DLS) birleştiren bir platform olan Stunner'ı kullanarak saflaştırılmış rAAV'lerin kalite kontrolünü gerçekleştirdik68. Her numune için, toplam protein miktarı, ssDNA'nın yanı sıra emici safsızlıklar ve arka plan bulanıklığı UV-Vis spektroskopisi ile ölçüldü (Şekil 3E ve Ek Şekil S5A). Daha sonra rAAV kapsidlerinin ışık saçılma davranışını değerlendirmek için SLS ve DLS uygulandı. AAV'lerin ortalama çapının 25 nm olduğu göz önüne alındığında, 15-45 nm çap aralığındaki parçacıkların sağlam olduğu kabul edilir. Daha büyük parçacıklar tipik olarak viral agregatları temsil eder ve daha küçük olan her şey, birleştirilmemiş kapsid proteinleri68 dahil olmak üzere büyük olasılıkla küçük parçacıkları içerir. rAAV1/2 için, 30 nm'de (Şekil 3F), agrega yoğunluğunun %0'ı ve küçük parçacık yoğunluğunun %0'ı ile bozulmamış kapsid parçacıklarına karşılık gelen tek bir tepe gözlendi. rAAV2/9 hazırlığı için, x'lik bir kapsid yoğunluğunu temsil eden 30 nm'de bir tepe de tespit edildi (Ek Şekil S5B). Küçük parçacık yoğunluğu %0 olmasına rağmen, bu numune için, ortalama çapı 620 nm olan büyük agregalardan (,9) en büyük katkı ile "'lik bir toplam yoğunluk ölçüldü (gri renkle gösterilmiştir) (Ek Şekil S5B). UV-Vis spektroskopisinin SLS ve DLS bilgileri ile kombinasyonu sayesinde Stunner, Şekil 3G ve Ek Şekil S5C'de gösterilen iki viral preparat için genel toplam kapsid titresi, tam kapsid titresi, serbest ve agrega proteinin yanı sıra serbest ve agrega ssDNA'yı ortaya çıkardı (her şekil açıklamasında belirtilen spesifik değerler).

Paralel olarak, geliştirilen mozaik AAV vektörlerinin biyolojik aktivitesini değerlendirmek için, HEK293T hücreler, rAAV1/2 veya rAAV2/9 preparatının FPLC ile elde edilen her bir fraksiyonundan (F2-F16) 50 μL ile enfekte edildi. rAAV1/2 vektörü, bir CMV promotörü (pAAV-CMV-ssGFP) kontrolü altında tek iplikli bir yeşil floresan proteini (GFP) kodladığından ve rAAV2/9 vektörü, CMV promotörü (pAAV-CMV-scGFP53) kontrolü altında kendi kendini tamamlayan bir GFP'yi kodladığından, enfeksiyondan 48 saat sonra bu hücrelerde doğrudan GFP floresansı incelendi (Ek Şekil S6 ve Ek Şekil S7). RT-qPCR, Coomassie blue ve western blot için önceki gözlemlerle tutarlı olarak, en yüksek enfektivite seviyesi viral fraksiyonlar F7 ve F8 için elde edildi ve F9 ila F16 fraksiyonlarında kademeli olarak azaldı.

Ultrafiltrasyon ve konsantrasyon adımlarından sonra rAAV'lerin biyolojik aktivitesinin korunup korunmadığını doğrulamak için, hem 24 oyuklu plakalarda hem de 8 oyuklu odacıklı bir slaytta kaplanmış Neuro2A hücreleri, CMV promotörü (pAAV-CMV-scGFP53) kontrolü altında scGFP'yi kodlayan konsantre rAAV1/2 vektörü ile enfekte edildi. Brightfield ve floresan görüntüler enfeksiyondan 48 saat sonra elde edildi (daha yüksek çözünürlüklü görüntüler için Şekil 4A,B).

Üretilen rAAV'lerin enfeksiyöz kapasitesini daha ilgili ve yansıtıcı bir hücre modelinde keşfetmeyi amaçlayan, korteksten yarı yoğun primer nöronal kültürler 12 oyuklu bir plaka üzerine tohumlandı ve daha önce kullanılan rAAV1/2 - CMV-scGFP ile enfekte edildi. Enfeksiyondan kırk sekiz saat sonra, hücreler sabitlendi ve Alexa Fluor 633 ile konjuge edilmiş DAPI ve WGA ile etiketlendi, Sabit hücreleri etiketlemek için yaygın olarak kullanılan bir lektin. Şekil 4C,D'de gösterilen görüntüler bir Zeiss Axio Observer Z1 ile ve bir Zeiss konfokal LSM 710 ile elde edilmiştir. Bu şekillerde doğrudan GFP floresansı ile gösterildiği gibi, konsantre mozaik virüsler nöronal hücreler için gen transfer özelliklerini korurlar.

Mozaik rAAV'leri in vitro saflık, fiziksel özellikler ve işlevsellik açısından karakterize ettikten sonra, daha sonra C57BL/6 farelerinin beyincikini dönüştürmek için saflaştırılmış rAAV1/2 mozaik vektörlerini kullanma olasılığını değerlendirdik. Bunun için 9 haftalık farelere stereotaksik enjeksiyon yapıldı ve 12 hafta sonra GFP ekspresyonu değerlendirildi. Beklendiği gibi, PBS enjekte edilen hayvanlar, GFP immüno-etiketlemesi üzerine floresan göstermedi. Sinapsin 1 promotörü (rAAV1/2 - Syn-ssGFP) kontrolü altında GFP'yi kodlayan rAAV1/2 vektörleri enjekte edilen farelerden alınan epifloresan görüntüleri, rAAV1/2 vektörlerinin serebellumun çeşitli bölgelerini, yani derin serebellar çekirdek (DCN) bölgesini ve ayrıca serebellumun farklı lobüllerini başarıyla transdüksiyona tabi tuttuğunu ortaya koymuştur (Şekil 5). Bu sonuçlar, memeli beynindeki transgenin uzun süreli ekspresyonunu (12 hafta) göstermektedir.

rAAV üretim iş akışı: Hücre kaplama, transfeksiyon, saflaştırma ve analiz yöntemlerinin diyagramı.
Şekil 1: rAAV üretim ve saflaştırma protokolünün şematik gösterimi. rAAV'ler, polietilenimin (PEI) kullanılarak HEK293T hücrelerinin geçici transfeksiyonu ile üretilir. Daha sonra, hücreler toplanır ve parçalanır ve rAAV'ler, afinite kromatografisi yoluyla hücre homojenatından saflaştırılır. rAAV'leri içeren toplanan fraksiyonlar daha sonra konsantre edilir ve nihai viral stoklar titre, saflık, morfolojik özellikler ve biyolojik aktivite açısından karakterize edilir. Kısaltmalar: rAAV = rekombinant adeno-ilişkili virüs; PEI = polietilenimin; RT-qPCR = gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu; SDS-PAGE = sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

UV absorbans grafiği, protein analiz jeli ve elüsyon sonuçları ile kromatografi proses diyagramı.
Şekil 2: FPLC saflaştırma protokolü ve rAAV1/2'nin temsili elüsyon profili. (A) rAAV saflaştırma işleminin farklı aşamalarını gösteren tam bir kromatogram profilinin şematik gösterimi. Bir kolon dengeleme adımından sonra numune uygulanır. Kolon daha sonra yıkanır ve elüsyon artan NaCl konsantrasyonları ile gerçekleştirilir. Ayrıştırılan virüslerin bağlanmamış materyali (akış) ve 1 mL fraksiyonları analiz için toplanır. 280 nm'deki absorbans mAU cinsinden ifade edilir ve x ekseni mL cinsinden hacmi gösterir. (B) Karşılık gelen kesir sayıları (F2-F16) ve atık (kırmızı ile gösterilmiştir) ile bir rAAV1/2 elüsyon tepe noktasını (siyah renkte) gösteren büyütülmüş kısmi kromatogram. Verilen tampon B konsantrasyonu ve iletkenlik (mS/cm olarak ifade edilir) ayrıca sırasıyla yeşil ve mor renkle gösterilir. (C) Afinite saflaştırması (F2-F16) ve akış sırasında toplanan her fraksiyonun RT-qPCR'si. vg/μL cinsinden titre, logaritmik bir ölçekte temsil edilir. (D) Toplanan viral fraksiyonların SDS-PAGE analizi. Elüsyon adımından (F2-F16) her fraksiyonun eşit hacimleri (40 μL) ve ilgili akış, 'luk bir SDS-poliakrilamid jel üzerine yüklendi ve çözüldü. Protein bantları Coomassie mavisi boyama ile görselleştirildi. AAV kapsid proteinleri VP1, VP2 ve VP3'e karşılık gelen bantlar belirtilmiştir. Standart protein boyutu merdiveni (L) olarak belirlenmiştir ve karşılık gelen moleküler ağırlıklar da belirtilmiştir. Kısaltmalar: rAAV = rekombinant adeno-ilişkili virüs; RT-qPCR = gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu; SDS-PAGE = sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Amplifikasyon, standart eğri, protein jeli, transmisyon elektron mikroskobu, absorbans spektrumu, yoğunluk, titre analizi.
Şekil 3: Konsantre rAAV1/2 vektörlerinin karakterizasyonu. (A) Konsantre bir rAAV1/2 numunesinin (mavi renkte), 2 × 107 vg/μL'den 2 × 102 vg/μL'ye (siyah renkte) seri olarak seyreltilmiş standartların amplifikasyon eğrileri ve RT-qPCR sırasında elde edilen şablonsuz kontrol (yeşil renkte). (B) Bir rAAV numunesinin titresinin vg/μL cinsinden belirlenmesi için standart eğri (doğrusal regresyon).) Konsantre viral partiküllerin SDS-PAGE analizi. Konsantre stokun toplam 2.3 ×10 10 vg'ı jel üzerinde toplandı. (D) Çapı ~25-30 nm olan rAAV1/2 parçacıklarının transmisyon elektron mikroskobu görüntüsü. Elektron yoğun bir merkeze sahip boş parçacıklar (siyah oklarla kanıtlanmıştır) tam kapsidlerden (beyaz oklarla kanıtlanmıştır) ayırt edilebilir. Ölçek çubuğu = 100 nm. (E) Stunner (siyah renkte) ile ölçülen bir rAAV1/2 preparatının absorbans spektrumu. Proteinlerin (mavi), ssDNA'nın (yeşil), diğer UV emici bileşiklerin veya safsızlıkların (mor renkte) ve arka plan bulanıklığının (gri renkte) katkısı da gösterilmiştir. (F) Stunner tarafından ölçülen, 30 nm'de tek bir tepe noktası ile rAAV1/2'nin DLS yoğunluk dağılımı. Eğrinin altındaki alan 15 ila 45 nm (gölgeli yeşil) arasında ölçülerek% 100'lük bir kapsid saçılma yoğunluğu belirlendi. (G) Toplam kapsid titresi 1.19 × 1014 cp / mL (koyu mavi) ve 1.73 ×10 13 vg / mL (koyu yeşil) tam kapsid titresi sergileyen bir rAAV1/2 vektör preparatının sersemletici analizi. 7.16 ×10 12 cp / mL eşdeğeri (açık mavi) serbest ve toplanmış bir protein ve ayrıca 1.04 ×10 12 vg / mL eşdeğeri (açık yeşil) serbest ve birleştirilmiş bir ssDNA da ölçüldü. Kısaltmalar: rAAV = rekombinant adeno-ilişkili virüs; RT-qPCR = gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu; SDS-PAGE = sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi; ssDNA = tek sarmallı DNA; DLS = dinamik ışık saçılımı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Hücrelerin floresan mikroskobu: GFP ekspresyonu, DAPI boyama, viral vektör transdüksiyon sonuçları.
Şekil 4: Konsantre bir rAAV1/2 örneğinin in vitro enfektivite değerlendirmesi. (A) Nöro2A hücreleri, negatif kontrol olarak rAAV1 / 2 - CMV-scGFP ile enfekte edildi veya eşdeğer bir hacimde PBS ile inkübe edildi. Hücrelerin parlak alan ve floresan görüntüleri, enfeksiyondan 48 saat sonra görüntülendi. Görüntüler bir Zeiss Axio Observer Z1'de (10x objektif) elde edildi. Ölçek çubukları = 100 μm. (B) rAAV1/2 - CMV-scGFP ile enfeksiyondan 48 saat sonra Neuro2A hücrelerinin ayrıntılı görüntüleri. Görüntüler bir Zeiss LSM 710'da (40x objektif) elde edildi. Ölçek çubukları = 20 μm. (C) rAAV1/2 - CMV-scGFP ile enfekte olmuş veya eşdeğer hacimde PBS ile inkübe edilmiş, negatif kontrol görevi gören yarı yoğun primer nöronal kültürler. Hücreler bir nükleer leke (mavi renkte DAPI) ve bir zar lekesi (beyaz renkte WGA) ile etiketlendi. Görüntüler bir Zeiss Axio Observer Z1'de (40x objektif) elde edildi. Ölçek çubukları = 20 μm. (D) rAAV1/2 - CMV-scGFP ile enfeksiyondan 48 saat sonra yarı yoğun primer nöronal kültürlerin ayrıntılı görüntüleri. Görüntüler bir Zeiss LSM 710'da (40x objektif) elde edildi. Ölçek çubukları = 20 μm. Kısaltmalar: rAAV = rekombinant adeno-ilişkili virüs; CMV = sitomegalovirüs; scGFP = kendi kendini tamamlayan yeşil floresan proteini; PBS = fosfat tamponlu salin; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; WGA = buğday tohumu aglütininin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Beyin bölümlerinin floresan mikroskobu; DAPI, GFP boyama, birleştirilmiş görüntüler ifade kalıplarını gösterir.
Şekil 5: Bir intraparankimal enjeksiyonu takiben rAAV1/2'nin in vivo transdüksiyon verimliliği. Beyincikte merkezi bir rAAV1/2 - Syn-ssGFP enjeksiyonu üzerine serebellum boyunca yaygın GFP ekspresyonunu (yeşil renkte) gösteren temsili immünofloresan görüntüleri. Çekirdekler DAPI (mavi renkte) ile boyandı. Ölçek çubukları = 500 μm. Kısaltmalar: rAAV = rekombinant adeno-ilişkili virüs; Syn = Sinapsin 1; ssGFP = tek iplikli yeşil floresan proteini; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; PBS = fosfat tamponlu tuzlu su. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S1: SmaI ile sindirilen bir rAAV vektör plazmidinin agaroz jel analizi. Bir pITR'nin altı klonu (C1-C6), her ters çevrilmiş terminal tekrarı içinde iki kez kesen SmaI kısıtlama enzimi (şerit 2, 4, 6, 8, 10 ve 12) ile sindirildi. Bu durumda, bu pITR'nin tam bir sindiriminin iki bant (3.796 bp ve 3.013 bp) oluşturması beklenir. Başarılı preparatlarda (C1, C3, C4 ve C5) kısmi sindirimden kaynaklanan 6809 bp'lik bir bant hala görülebilir (toplamın ~%5'i). ITR rekombinasyonu ile yapılan preparasyonlarda, oranlar tersine çevrilir (C2) veya sindirim gerçekleşmemiştir (C6). İlgili sindirilmemiş klonlar da sunulmaktadır (şerit 3, 5, 7, 9, 11, 13). Kısaltmalar: rAAV = rekombinant adeno-ilişkili virüs; ITR = ters çevrilmiş terminal tekrarı. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S2: heparin bazlı afinite kromatografisi ile rAAV2/9 saflaştırması. (A) NaCl konsantrasyonundaki bir artışı takiben tek bir tepe (siyah renkte) sergileyen rAAV2/9'un elüsyon profili. Toplanan fraksiyonlar, grafiğin altında kırmızı ile gösterilen sayılarla (2-16) gösterilir, 280 nm'deki absorbans mAU cinsinden ifade edilir, iletkenlik mS/cm olarak ifade edilir ve x ekseni mL cinsinden hacmi gösterir. (B) havuzlanmış her fraksiyon (F2-F16) ve akış için RT-qPCR ile ölçülen rAAV titreleri. Değerler logaritmik bir ölçekte temsil edilir. (C) SDS-PAGE ve Coomassie mavisi boyama ile saflık testi. Her fraksiyonun (F2-F16) eşit hacimleri (40 μL) ve ilgili akış, 'luk bir SDS-PAGE'de yüklendi ve çözüldü. Konsantre stok RT-qPCR ile ölçüldü ve 2.3 × 1010 vg, 40 μL PBS içinde seyreltildi ve jel üzerinde toplandı. Protein bantları Coomassie mavisi boyama ile görselleştirildi. AAV kapsid proteinleri (VP1, VP2 ve VP3) endikedir. Standart protein boyutu merdiveni (L) ile gösterilir ve karşılık gelen moleküler ağırlıklar da gösterilir. Kısaltmalar: rAAV = rekombinant adeno-ilişkili virüs; RT-qPCR = gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu; SDS-PAGE = sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S3: FPLC ile saflaştırılmış rAAV1/2 vektörlerinin Western blot analizi. (A) Toplanan fraksiyonlar ve konsantre rAAV1/2 vektörleri bir SDS-PAGE jeli üzerinde çözüldü ve VP1, VP2 ve VP3 kapsid proteinlerini tanıyan fare monoklonal anti-AAV antikoru (B1) ile incelendi. (B) Toplanan fraksiyonlar ve konsantre rAAV1/2 vektörleri bir SDS-PAGE jeli üzerinde çözüldü ve VP1 ve VP2 kapsid proteinlerini tanıyan fare monoklonal anti-AAV antikoru (A69) ile incelendi. Kısaltmalar: rAAV = rekombinant adeno-ilişkili virüs; FPLC = hızlı protein sıvı kromatografisi; SDS-PAGE = sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi; L = standart protein boyutu merdiveni. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S4: FPLC ile saflaştırılmış rAAV2/9 vektörlerinin Western blot analizi. (A) Toplanan fraksiyonlar ve konsantre rAAV2/9 vektörleri bir SDS-PAGE jeli üzerinde çözüldü ve VP1, VP2 ve VP3 kapsid proteinlerini tanıyan fare monoklonal anti-AAV antikoru (B1) ile incelendi. (B) Toplanan fraksiyonlar ve konsantre rAAV2/9 vektörleri bir SDS-PAGE jeli üzerinde çözüldü ve VP1 ve VP2 kapsid proteinlerini tanıyan fare monoklonal anti-AAV antikoru (A69) ile incelendi. Kısaltmalar: rAAV = rekombinant adeno-ilişkili virüs; FPLC = hızlı protein sıvı kromatografisi; SDS-PAGE = sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi; L = standart protein boyutu merdiveni. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S5: sersemletici ile rAAV2/9 vektör ölçümü ve karakterizasyonu. (A) Stunner tarafından ölçülen bir rAAV2/9 vektörünün absorbans spektrumu (siyah). Proteinlerin (mavi), ssDNA'nın (yeşil), diğer UV emici bileşiklerin veya safsızlıkların (mor) ve arka plan bulanıklığının (gri) katkısı da tasvir edilmiştir. (B) Eğrinin altındaki alanın 15 ila 45 nm (gölgeli yeşil) arasında ölçülmesiyle belirlendiği üzere, x'lik bir kapsid saçılma yoğunluğuna karşılık gelen 30 nm'de ana bir tepe ile rAAV2/9'un DLS yoğunluk dağılımı. Ortalama çapı 620 nm olan büyük agregaların (.9) ana katkısıyla toplam "'lik bir agrega yoğunluğu (gri gölgeli) de ölçülmüştür. (C) Toplam 2.18 ×10 14 cp / mL (koyu mavi) kapsid titresi ve 2.35 ×10 13 vg / mL (koyu yeşil) tam kapsid titresi sergileyen bir rAAV2/9 vektör preparatının sersemletici analizi. Bu preparatta 2.92 ×10 13 cp / mL eşdeğeri (açık mavi) serbest ve agrega edilmiş bir protein ve ayrıca 3.14 ×10 12 vg / mL eşdeğeri (açık yeşil) serbest ve agrega edilmiş bir ssDNA da ölçülmüştür. Kısaltmalar: rAAV = rekombinant adeno-ilişkili virüs; ssDNA = tek sarmallı DNA; DLS = dinamik ışık saçılımı. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S6: rAAV1/2'nin saflaştırılmış fraksiyonlarının in vitro transdüksiyon verimliliği ve canlılığı. HEK293T hücreleri, ssGFP'yi kodlayan bir rAAV1/2 vektörünün (rAAV1/2 - CMV-ssGFP) 50 μL FPLC fraksiyonları ile transdüksiyondan 48 saat sonra GFP (doğrudan floresan) eksprese eder. Ölçek çubukları = 100 μm. Kısaltmalar: rAAV = rekombinant adeno-ilişkili virüs; FPLC = hızlı protein sıvı kromatografisi; ssGFP = tek iplikli yeşil floresan proteini. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S7: rAAV2/9'un saflaştırılmış fraksiyonlarının in vitro transdüksiyon verimliliği ve canlılığı. HEK293T hücreler, CMV promotörün kontrolü altında her bir FPLC fraksiyonunun (F2-F16) 50 μL'si veya scGFP'yi kodlayan bir rAAV2/9 vektörünün akışı ile enfekte edildi. GFP eksprese eden hücreler enfeksiyondan 48 saat sonra görüntülendi. Ölçek çubukları = 100 μm. Kısaltmalar: rAAV = rekombinant adeno-ilişkili virüs; FPLC = hızlı protein sıvı kromatografisi; scGFP = kendi kendini tamamlayan yeşil floresan proteini; CMV = sitomegalovirüs. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Hızla genişleyen AAV vektör araç seti, farklı uygulama yolları aracılığıyla çok çeşitli hücre tipleri için en umut verici gen dağıtım sistemlerinden biri haline gelmiştir. Bu çalışmada, mozaik rAAV vektörlerinin üretimi, saflaştırılması ve karakterizasyonu için preklinik çalışmalarda değerlerini kanıtlayabilecek gelişmiş bir protokol geliştirmeyi amaçladık. Bu amaçla, rAAV1/2 ve rAAV2/9 mozaik vektörlerinin oluşturulması burada açıklanmıştır, ancak prosedür standart rAAV2 vektörlerini saflaştırmak için de uygulanabilir (veriler gösterilmemiştir).

Mozaik rAAV'ler, bir transfeksiyon reaktifi olarak PEI kullanılarak optimize edilmiş bir transfeksiyon yöntemi izlenerek üretildi. Erken evre preklinik çalışmalarda önemli avantajlar sağlayan daha fazla esnekliği ve hızı nedeniyle geçici bir transfeksiyon yöntemi seçilmiştir. Belirli bir transgen ve serotip doğrulandıktan sonra, üretim sistemi, bir enfeksiyon süreci tarafından sağlanan ek genlerle birlikte, spesifik Rep / Cap genlerinin bir alt kümesini ifade eden kararlı bir transfekte hücre hattı oluşturarak daha iyi ölçeklenebilirlik ve maliyet etkinliği elde etmek için ince ayar yapılabilir24. Kalsiyum-fosfat transfeksiyonu ile karşılaştırıldığında, PEI çeşitli avantajlar sunar. Daha geniş bir pH aralığında etkili bir şekilde çalışan stabil ve uygun maliyetli bir transfeksiyon reaktifidir. Ek olarak, transfeksiyondan sonra hücre ortamını değiştirme gereksinimini ortadan kaldırarak hem maliyette hem de iş yükünde önemli bir azalma sağlar69.

CsCl veya iyodiksanol gradyanları tarafından getirilen bazı sınırlamaları aşmak amacıyla, üretilen rAAV'ler hasat edildi ve afinite kromatografisi ile saflaştırıldı. Bu strateji, ultrasantrifüjleme ve gradyanlara ihtiyaç duymadan gerçekleştirilebilen, temiz ve yüksek viral titreler sağlayan basitleştirilmiş ve ölçeklenebilir bir yaklaşım sunar. Gerçekten de, bir FPLC sistemi kullanan kromatografi teknikleri, daha yüksek yatak yüksekliğine sahip bir kolonda daha fazla reçine hacmi paketlenerek otomatikleştirilebilir ve ölçeklendirilebilir. Burada açıklanan protokol, 5 mL HiTrap Heparin HP kolonlarını içerecek şekilde kolayca uyarlanabilir (veriler gösterilmemiştir). Ek olarak, heparin kolonları birkaç kez tekrar kullanılabilir, böylece bu yöntemin maliyet etkinliğine katkıda bulunur.

Saflaştırılmış rAAV'ler daha sonra titre, saflık, morfolojik özellikler ve biyolojik aktivite açısından karakterize edildi. İlginç bir şekilde, Coomassie mavi boyamasında, üç tipik viral kapsid proteinine ek olarak F8-F16 fraksiyonlarında yaklaşık 17 kDa'lık bir bant tespit edildi. Bununla birlikte, bu bant, rAAV'lerin konsantrasyon adımından sonra artık mevcut değildir. Ayrıca, B1 ve A69 etiketlemesi üzerine VP3'ten (<62 kDa) daha düşük moleküler ağırlığa sahip bazı soluk bantlar da tespit edilebilir, bu da bunların VP1, VP2 ve VP3 kapsid proteinlerinin70 fragmanları olabileceğini düşündürür. Başka bir olasılık da, bunların aslında ferritin veya AAV kapsid proteinleri ile benzer protein parmak izlerini paylaşan ve daha önce önerildiği gibi AAV biyolojisinde yer alabilen polipeptitlere sahip diğer hücresel proteinler gibi diğer birlikte saflaştırıcı proteinler olmasıdır 26,71,72.

TEM ve sersemletici analizi, farklı üretimlerde değişken seviyelerde boş parçacıkların varlığını da ortaya çıkardı. Benzer şekilde, daha önce yapılan diğer çalışmalar, transfeksiyon veya enfeksiyon yöntemleriyle hazırlanan rAAV'ler için değişken ve yüksek seviyelerde (%>65) boş kapsid oluştuğunu bildirmiştir24,73. rAAV üretiminin arkasındaki mekanizma, yeni sentezlenen VP proteinlerinden boş kapsidlerin hızlı oluşumu ile başlar, ardından Rep proteinlerininaracılık ettiği önceden oluşturulmuş kapsidlere genom paketlemesinin yavaş bir hız sınırlayıcı adımı ile başlar 74,75. Bu nedenle, boş ve dolu kapsidlerin oranı, ilgilenilen transgenin boyutuna ve dizisine ve hücre kültürü koşullarına bağlı olarak değişebilse de, rAAV üretimlerinde boş kapsidler üretilir58,73. Boş kapsidler, ilgilenilen genomdan yoksun oldukları için terapötik bir etki sağlayamadıkları ve ayrıca doğuştan gelen veya adaptif bir bağışıklık tepkisini potansiyel olarak artırabildikleri için bazı endişelere yol açmaktadır. Bununla birlikte, bazı raporlar, oranlarını ayarlayarak, boş AAV kapsidlerinin, AAV'ye özgü nötralize edici antikorlar için oldukça etkili tuzaklar olarak hizmet edebileceğini ve bu nedenle iletim verimlilikleriniartırabileceğini göstermiştir 60,76,77. Boş kapsidlerin varlığı kritik derecede zararlıysa ve boş parçacıkların tam vektörlere kıyasla biraz daha az anyonik karakteri göz önüne alındığında, potansiyel bir çözüm, anyon değişim kromatografisi teknikleri64 kullanılarak ikinci bir parlatma saflaştırma aşamasının yürütülmesini içerebilir.

Bu çalışma aynı zamanda, üretilen mozaik rAAV'lerin sadece in vitro nöronal kültürleri değil, aynı zamanda rAAV1/2'nin intrakraniyal enjeksiyonu üzerine CNS'yi de verimli bir şekilde dönüştürebildiğine dair ikna edici kanıtlar sunmaktadır. Genel olarak, bu sonuçlar, açıklanan üretim ve saflaştırma protokolünün, oldukça saf ve biyolojik olarak aktif rAAV'leri 6 gün içinde kullanıma hazır hale getirdiğini ve kendisini klinik öncesi çalışmalarda rAAV'lerin üretilmesi için çok yönlü ve uygun maliyetli bir yöntem olarak sunduğunu göstermektedir.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Coimbra Klinik ve Biyomedikal Araştırma Enstitüsü (iCBR) ve Yenilikçi Biyotıp ve Biyoteknoloji Merkezi'nden (CIBB) Dr. Mónica Zuzarte tarafından rAAV'lerin TEM analizine ilişkin olarak sağlanan işbirliği, içgörüler ve teknik yardım için minnettarız. Coimbra Üniversitesi Sinirbilim ve Hücre Biyolojisi Merkezi'nden (CNC-UC) ve Coimbra Üniversitesi Disiplinlerarası Araştırma Enstitüsü'nden (IIIUC) Dr. Dominique Fernandes'e, birincil nöronal kültür deneylerine ilişkin paha biçilmez teknik yardımı ve içgörüleri için teşekkürlerimizi sunarız. Bu çalışma için gerekli olan pRV1, pH21 ve pFdelta6 plazmitleri, Aberdeen Üniversitesi Yaşam Bilimleri ve Tıp Fakültesi Tıp Bilimleri Fakültesi'nden Dr. Christina McClure tarafından cömertçe sağlandı ve bunun için minnettarız. Bu çalışma, Centro 2020 Bölgesel Operasyonel Programı aracılığıyla Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu (ERDF) tarafından finanse edilmiştir; COMPETE 2020 - Rekabet Edebilirlik ve Uluslararasılaşma için Operasyonel Program ve FCT - Fundação para a Ciência e a Tecnologia aracılığıyla Portekiz ulusal fonları aracılığıyla, UIDB/04539/2020, UIDP/04539/2020, LA/P/0058/2020, ViraVector (CENTRO-01-0145-FEDER-022095), Imagene (PTDC/BBB-NAN/0932/2014 | POCI-01-0145-FEDER-016807), ReSet - IDT-COP (CENTRO-01-0247-FEDER-070162), Sars-CoV-2 ile Mücadele (CENTRO-01-01D2-FEDER-000002), BDforMJD (CENTRO-01-0145-FEDER-181240), ModelPolyQ2.0 (CENTRO-01-0145-FEDER-181258), MJDEDIT (CENTRO-01-0145-FEDER-181266); Amerikan Portekiz Biyomedikal Araştırma Fonu (APBRF) ve Richard Chin ve Lily Lock Machado-Joseph Hastalığı Araştırma Fonu, ARDAT tarafından AB ve EFPIA tarafından desteklenen IMI2 JU Hibe anlaşması No 945473 kapsamında; GeneT- Teaming Projesi 101059981 Avrupa Birliği'nin Ufuk Avrupa programı tarafından desteklenmektedir. M.M.L. 2021.05776.BD tarafından desteklendi; C.H., 2021.06939.BD tarafından desteklendi; A.C.S. 2020.07721.BD tarafından desteklendi; ve D.D.L. 2020.09668.BD tarafından desteklenmiştir. Şekil 1 , BioRender.com kullanılarak oluşturulmuştur.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 10 povidon-iyotMedlineMDS093943
12 oyuklu plakalarThermo Scientific11889684
24 oyuklu plakalarVWR734-2325
4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)InvitrogenD1306
96 kuyulu Sersemletici plakaZincirsiz Laboratuvarlar701-2025rAAV numunelerinin ardışık ultraviyole görünür ışık absorpsiyonu, statik ışık saçılımı ve dinamik ışık saçılımı analizi için 96 oyuklu kantifikasyon plakası
AAVpro Titrasyon Kiti (Gerçek Zamanlı PCR için) Ver.2Takara6233RT-qPCR kullanarak AAV titresini belirlemek için. Bu kit, DNase I, Lizis Tamponu, Seyreltme Tamponu, pozitif kontrol, Taq II karışımı, astar ileri, astar geri, su
Asetik asit buzulFisher Chemical A/ 0360 / PB17
& AUML içerir; Cytiva29018224FPLC sistemi, sürüm 6.3 
Alkalin fosfataz bağlantılı keçi anti-fareInvitrogen31328
Amicon ultra-0.5 santrifüj filtre ünitesiMerck MilliporeUFC5100
Amicon ultra-15 santrifüj filtre ünitesiMerck Millipore UFC9100
BenzonazNükleaz Merck MilliporeE1014
Bromofenol mavisiSigma-AldrichB0126
CFX96 Gerçek Zamanlı PCR tespit sistemiBiorad184-5096
ChemiDoc Dokunmatik Görüntüleme SistemiBio-Rad Laboratuvarları1708370
Tavuk poliklonal anti-GFP primer antikoruAbcamab13970
Coomassie Blue G250Fisher ChemicalC/P541/46
Dithiothreitol (DTT)Fisher Biyoreaktifleri
DMEMSigma-AldrichD5796
Western Blotting için ECF SubstratıCytivaRPN5785
FastDigest SmaIThermo ScientificFD0663
FEI-Tecnai G2 Spirit BiotwinFEIBiotwinTransmisyon elektron mikroskobu
Fetal sığır serumuBiowestS1810
Floresan montaj ortamıDakoS3023
Formvar-karbon kaplı 200 gözenekli ızgara  TAAB Laboratuvar EkipmanlarıF077/025
Gaz tahliye cihazıRWDR546W
GliserolFisher BioReagents10021083
Keçi poliklonal anti-tavuk antikoru, Alexa Fluor 488InvitrogenA-11039
Hamilton iğnesi 30G, Küçük Hub RN İğnesi, 25 mm, PST3Hamilton7803-07
Hamilton şırınga (10 & mikro; L)Hamilton7653-01
HEK293TAmerikan Tipi Kültür KoleksiyonuCRL-11268
HiTrap Heparin HP 1 x 5 mLCytiva17040701Önceden paketlenmiş heparin sütunu
HiTrap Heparin HP 5 x 1 mLCytiva17040601Önceden paketlenmiş heparin sütunu
Immobilon-P PVDF MembranMerck MilliporeIPVH00010
İzofluranBraun469860
Ketamin Dechra PharmaceuticalsN/ANimatek
Düşük retansiyonlu mikrosantrifüj tüpleri (2 mL)Fisher Scientific11906965
Lunatic & Sersemletici İstemci yazılımıUnchained LabsN/Aİstemci analiz yazılımı sürümü 8.0.1.235. rAAV örneklerinin ardışık ultraviyole görünür ışık absorpsiyonu, statik ışık saçılımı ve dinamik ışık saçılımı analizi için yazılım
MetanolFisher ChemicalM/4000/FP21
Fare monoklonal anti-AAV, VP1, VP2 antikoru (A69)American Research Products03-61057
Fare monoklonal anti-AAV, VP1, VP2, VP3 antikoru (B1)American Research Products03-61058
Neuro2aAmerikan Tipi Kültür KoleksiyonuCCL-131
Normal keçi serumuGibco16210064
NucleoBond Xtra Maxi EFMacherey-Nagel12738422
NZYColour Protein Marker IINZYtechMB09002
pAAV-CMV-scGFPAddgene32396Addgene plazmid # 32396; http://n2t.net/addgene:32396; RRID:Addgene_32396
pAAV-CMV-ssGFPAddgene105530Addgene plazmid # 105530; http://n2t.net/addgene:105530; RRID:Addgene_105530
pAAV2/9nAddgene112865Addgene plazmidi # 112865; http://n2t.net/addgene:112865; RRID:Addgene_112865
ParaformaldehitAcros Organics10342243
PBSFisher BioReagentsBP2438
Penisilin-streptomisinGibco15140-122
Pluronic F-68 İyonik Olmayan Yüzey Aktif Madde (100x)Gibco24040032
Polietilenimin MAX, MW 40.000Polibilimler Avrupa24765
R500 Serisi Kompakt Küçük Hayvan Anestezi Makinesi - IsofluraneRWDN/A
Numune Giriş Vanası V9-ISCytiva29027746
Numune pompası P9-SCytiva29027745
Sodyum azidSigma-AldrichS2002
Sodyum klorürFisher Scientific10428420
Sodyum deoksikolatSigma-AldrichD6750
Sodyum dodesil sülfat (SDS)Fisher BiyoreaktifleriBP166
Steril PVDF şırınga filtresiFisher Scientific15191499
Sersemletici PlatformUnchained Labs700-2002rAAV örneklerinin ardışık ultraviyole görünür ışık absorpsiyonu, statik ışık saçılımı ve dinamik ışık saçılımı analizi için ekipman
Superloop 150 mLCytiva18-1023-85
Superloop 50 mLCytiva18-1113-82
SURE 2 süper yetkin hücreStratagene, Agilent TechnologiesHPA200152
İşlenmiş kültür kaplarıCorning734-1711
Tris bazFisher BioReagentsBP152
Tris hidroklorürFisher BioReagentsBP153
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Tripsin-EDTAGibco25200-072
Alexa Fluor 633InvitrogenW21404
XylazineDechra PharmaceuticalsN/ASedaxylan
Zeiss Axio Observer Z1Carl Zeiss Mikroskobu ile konjuge GmbHN/AEC Plan-Neofluar 10x/0.30 objektif ve Plan-Apochromat 40x/0.95 objektif
Zeiss Axio Scan.Z1Carl Zeiss Microscopy GmbHN/APlan-Apochromat 20x/0.8 objektif
Zeiss LSM 710Carl Zeiss Microscopy GmbHN/Aile donatılmış slayt tarayıcı floresan mikroskobuPlan-Apochromat 40x/1.4 Oil DIC objektif
ve mikro;-Slayt 8 kuyulu IbidiIbidi808268 oyuklu odacıklı slayt
UNICORN yazılımı tarafından kontrol edilen KTA saf 25 BP17225 ile donatılmış ters floresan mikroskobu ile donatılmış ters konfokal mikroskop

Kaynaklar

  1. Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. Adenovirus-associated defective virus particles. Science. 149 (3685), 754-756 (1965).
  2. Murlidharan, G., Samulski, R. J., Asokan, A. Biology of adeno-associated viral vectors in the central nervous system. Front Mol Neurosci. 7, 1-9 (2014).
  3. Muzyczka, N. Use of Adeno-Associated Virus as a General Transduction Vector for Mammalian Cells. Viral Expression Vectors. 158, 97-129 (1992).
  4. Goncalves, M. A. F. V Adeno-associated virus: from defective virus to effective vector. Virol J. 2, 43(2005).
  5. Flotte, T. R. Gene therapy progress and prospects: recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors. Gene Ther. 11 (10), 805-810 (2004).
  6. Grieger, J. C., Choi, V. W., Samulski, R. J. Production and characterization of adeno-associated viral vectors. Nat Protoc. 1 (3), 1412-1428 (2006).
  7. Ojala, D. S., Amara, D. P., Schaffer, D. V Adeno-Associated Virus Vectors and Neurological Gene Therapy. Neuroscientist. 21 (1), 84-98 (2014).
  8. Saraiva, J., Nobre, R. J., Pereira de Almeida, L. Gene therapy for the CNS using AAVs: The impact of systemic delivery by AAV9. Journal of Controlled Release. 241, 94-109 (2016).
  9. Agbandje-McKenna, M., Kleinschmidt, J. AAV capsid structure and cell interactions. Methods Mol Biol. 807, 47-92 (2011).
  10. Sonntag, F., Schmidt, K., Kleinschmidt, J. A. A viral assembly factor promotes AAV2 capsid formation in the nucleolus. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (22), 10220-10225 (2010).
  11. Sonntag, F., et al. The assembly-activating protein promotes capsid assembly of different adeno-associated virus serotypes. J Virol. 85 (23), 12686-12697 (2011).
  12. Gao, G., et al. Clades of Adeno-associated viruses are widely disseminated in human tissues. J Virol. 78 (12), 6381-6388 (2004).
  13. Gao, G., Vandenberghe, L. H., Wilson, J. M. New recombinant serotypes of AAV vectors. Curr Gene Ther. 5 (3), 285-297 (2005).
  14. Van Vliet, K. M., Blouin, V., Brument, N., Agbandje-McKenna, M., Snyder, R. O. The role of the adeno-associated virus capsid in gene transfer. Methods Mol Biol. 437, 51-91 (2008).
  15. Clark, K. R., Voulgaropoulou, F., Fraley, D. M., Johnson, P. R. Cell lines for the production of recombinant adeno-associated virus. Hum Gene Ther. 6 (10), 1329-1341 (1995).
  16. Inoue, N., Russell, D. W. Packaging cells based on inducible gene amplification for the production of adeno-associated virus vectors. J Virol. 72 (9), 7024-7031 (1998).
  17. Liu, X., Voulgaropoulou, F., Chen, R., Johnson, P. R., Clark, K. R. Selective Rep-Cap gene amplification as a mechanism for high-titer recombinant AAV production from stable cell lines. Mol Ther. 2 (4), 394-403 (2000).
  18. Mathews, L. C., Gray, J. T., Gallagher, M. R., Snyder, R. O. [23] Recombinant adeno-associated viral vector production using stable packaging and producer cell lines. Methods Enzymol. 346, 393-413 (2002).
  19. Gao, G., et al. Purification of recombinant adeno-associated virus vectors by column chromatography and its performance in vivo. Hum Gene Ther. 11 (15), 2079-2091 (2000).
  20. Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. J Virol. 72 (3), 2224-2232 (1998).
  21. Aponte-Ubillus, J. J., et al. Molecular design for recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector production. Appl Microbiol Biotechnol. 102 (3), 1045-1054 (2018).
  22. Smith, R. H., Levy, J. R., Kotin, R. M. A simplified baculovirus-AAV expression vector system coupled with one-step affinity purification yields high-titer rAAV stocks from insect cells. Mol Ther. 17 (11), 1888-1896 (2009).
  23. Grimm, D., Kern, A., Rittner, K., Kleinschmidt, J. A. Novel tools for production and purification of recombinant adenoassociated virus vectors. Hum Gene Ther. 9 (18), 2745-2760 (1998).
  24. Wright, J. F. Transient transfection methods for clinical adeno-associated viral vector production. Hum Gene Ther. 20 (7), 698-706 (2009).
  25. Yuan, Z., Qiao, C., Hu, P., Li, J., Xiao, X. A versatile adeno-associated virus vector producer cell line method for scalable vector production of different serotypes. Hum Gene Ther. 22 (5), 613-624 (2011).
  26. Strobel, B., Miller, F. D., Rist, W., Lamla, T. Comparative analysis of cesium chloride- and iodixanol-based purification of recombinant adeno-associated viral vectors for preclinical applications. Hum Gene Ther Methods. 26 (4), 147-157 (2015).
  27. Zolotukhin, S., et al. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene Ther. 6 (6), 973-985 (1999).
  28. Anderson, R., Macdonald, I., Corbett, T., Whiteway, A., Prentice, H. G. A method for the preparation of highly purified adeno-associated virus using affinity column chromatography, protease digestion and solvent extraction. J Virol Methods. 85 (1-2), 23-34 (2000).
  29. Okada, T., et al. Scalable purification of adeno-associated virus serotype 1 (AAV1) and AAV8 vectors, using dual ion-exchange adsorptive membranes. Hum Gene Ther. 20 (9), 1013-1021 (2009).
  30. Guo, P., et al. Rapid and simplified purification of recombinant adeno-associated virus. J Virol Methods. 183 (2), 139-146 (2012).
  31. Lock, M., et al. Rapid, simple, and versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale. Hum Gene Ther. 21 (10), 1259-1271 (2010).
  32. Wang, L., Blouin, V., Brument, N., Bello-Roufai, M., Francois, A. Production and Purification of Recombinant Adeno-Associated Vectors. Adeno-Associated Virus: Methods and Protocols. 807, 361-404 (2011).
  33. Summerford, C., Samulski, R. J. Membrane-associated heparan sulfate proteoglycan is a receptor for adeno-associated virus type 2 virions. J Virol. 72 (2), 1438-1445 (1998).
  34. Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. Adeno-associated Virus Serotypes: Vector Toolkit for Human Gene Therapy. Molecular Therapy. 14 (3), 316-327 (2006).
  35. Mietzsch, M., Broecker, F., Reinhardt, A., Seeberger, P. H., Heilbronn, R. Differential adeno-associated virus serotype-specific interaction patterns with synthetic heparins and other glycans. J Virol. 88 (5), 2991-3003 (2014).
  36. McClure, C., Cole, K. L. H., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. JoVE. (57), e3348(2011).
  37. Auricchio, A., O’Connor, E., Hildinger, M., Wilson, J. M. A single-step affinity column for purification of serotype-5 based adeno-associated viral vectors. Mol Ther. 4 (4), 372-374 (2001).
  38. Wang, Q., et al. Identification of an adeno-associated virus binding epitope for AVB sepharose affinity resin. Mol Ther Methods Clin Dev. 2, 15040(2015).
  39. Mietzsch, M., et al. OneBac: platform for scalable and high-titer production of adeno-associated virus serotype 1–12 vectors for gene therapy. Hum Gene Ther. 25 (3), 212-222 (2014).
  40. Mietzsch, M., et al. Characterization of AAV-specific affinity ligands: consequences for vector purification and development strategies. Mol Ther Methods Clin Dev. 19, 362-373 (2020).
  41. Florea, M., et al. High-efficiency purification of divergent AAV serotypes using AAVX affinity chromatography. Mol Ther Methods Clin Dev. 28, 146-159 (2023).
  42. Koerber, J. T., Jang, J. -H., Yu, J. H., Kane, R. S., Schaffer, D. V. Engineering adeno-associated virus for one-Step purification via immobilized metal affinity chromatography. Hum Gene Ther. 18 (4), 367-378 (2007).
  43. Zhang, H. -G., et al. Addition of six-His-tagged peptide to the C terminus of adeno-associated virus VP3 does not affect viral tropism or production. J Virol. 76 (23), 12023-12031 (2002).
  44. Arnold, G. S., Sasser, A. K., Stachler, M. D., Bartlett, J. S. Metabolic biotinylation provides a unique platform for the purification and targeting of multiple AAV vector serotypes. Mol Ther. 14 (1), 97-106 (2006).
  45. Rabinowitz, J. E., et al. Cross-dressing the virion: the transcapsidation of adeno-associated virus serotypes functionally defines subgroups. J Virol. 78 (9), 4421-4432 (2004).
  46. Hauck, B., Chen, L., Xiao, W. Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors. Mol Ther. 7 (3), 419-425 (2003).
  47. Choi, V., McCarty, D., Samulski, R. AAV hybrid serotypes: improved vectors for gene delivery. Curr Gene Ther. 5 (3), 299-310 (2005).
  48. Nonnenmacher, M., van Bakel, H., Hajjar, R. J., Weber, T. High capsid–genome correlation facilitates creation of AAV libraries for directed evolution. Mol Ther. 23 (4), 675-682 (2015).
  49. Kimura, K., et al. A mosaic adeno-associated virus vector as a versatile tool that exhibits high levels of transgene expression and neuron specificity in primate brain. Nat Commun. 14 (1), 4762(2023).
  50. Issa, S. S., Shaimardanova, A. A., Solovyeva, V. V., Rizvanov, A. A. Various AAV serotypes and their applications in gene therapy: an overview. Cells. 12 (5), 785(2023).
  51. Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).
  52. Lopes, M. M., et al. A new protocol for whole-brain biodistribution analysis of AAVs by tissue clearing, light-sheet microscopy and semi-automated spatial quantification. Gene Ther. 29 (12), 665-679 (2022).
  53. Gray, J. T., Zolotukhin, S. Design and construction of functional AAV vectors. Methods Mol Biol. 807, 25-46 (2011).
  54. Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors. Curr Protoc Hum Genet. , Chapter 12, Unit 12.9-12.9.21 (2007).
  55. Bennicelli, J., et al. Reversal of blindness in animal models of leber congenital amaurosis using optimized AAV2-mediated gene transfer. Mol Ther. 16 (3), 458-465 (2008).
  56. Fischer, M. D., Hickey, D. G., Singh, M. S., MacLaren, R. E. Evaluation of an optimized injection system for retinal gene therapy in human patients. Hum Gene Ther Methods. 27 (4), 150-158 (2016).
  57. Santos, S. D., et al. Contactin-associated protein 1 (Caspr1) regulates the traffic and synaptic content of α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA)-type glutamate receptors. J Biol Chem. 287 (9), 6868-6877 (2012).
  58. Sommer, J. M., et al. Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement. Mol Ther. 7 (1), 122-128 (2003).
  59. Dong, B., Nakai, H., Xiao, W. Characterization of genome integrity for oversized recombinant AAV vector. Mol Ther. 18 (1), 87-92 (2010).
  60. Wright, J. F. AAV empty capsids: For better or for worse. Mol Ther. 22 (1), 1-2 (2014).
  61. Asaad, W., et al. AAV genome modification for efficient AAV production. Heliyon. 9 (4), e15071(2023).
  62. Wobus, C. E., et al. Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection. J Virol. 74 (19), 9281-9293 (2000).
  63. Wistuba, A., Kern, A., Weger, S., Grimm, D., Kleinschmidt, J. A. Subcellular compartmentalization of adeno-associated virus type 2 assembly. J Virol. 71 (2), 1341-1352 (1997).
  64. Qu, G., et al. Separation of adeno-associated virus type 2 empty particles from genome containing vectors by anion-exchange column chromatography. J Virol Methods. 140 (1-2), 183-192 (2007).
  65. Brument, N., et al. A versatile and scalable two-step ion-exchange chromatography process for the purification of recombinant adeno-associated virus serotypes-2 and -5. Mol Ther. 6 (5), 678-686 (2002).
  66. Potter, M., et al. A simplified purification protocol for recombinant adeno-associated virus vectors. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14034(2014).
  67. Dobnik, D., et al. Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors. Front Microbiol. 10, 1570(2019).
  68. Yang, Q. -E., et al. Rapid quality control assessment of adeno-associated virus vectors via Stunner. GEN Biotechnology. 1 (3), 300-310 (2022).
  69. Huang, X., et al. AAV2 production with optimized N/P ratio and PEI-mediated transfection results in low toxicity and high titer for in vitro and in vivo applications. J Virol Methods. 193 (2), 270-277 (2013).
  70. Salganik, M., et al. Evidence for pH-dependent protease activity in the adeno-associated virus capsid. J Virol. 86 (21), 11877-11885 (2012).
  71. Dong, B., et al. Proteomics analysis of co-purifying cellular proteins associated with rAAV vectors. PLoS One. 9 (2), e86453(2014).
  72. Grieger, J. C., Soltys, S. M., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated virus vectors using suspension HEK293 cells and continuous harvest of vector from the culture media for GMP FIX and FLT1 clinical vector. Mol Ther. 24 (2), 287-297 (2016).
  73. Wright, J. Product-related impurities in clinical-grade recombinant AAV vectors: characterization and risk assessment. Biomedicines. 2 (1), 80-97 (2014).
  74. Bennett, A., Mietzsch, M., Agbandje-McKenna, M. Understanding capsid assembly and genome packaging for adeno-associated viruses. Future Virol. 12 (6), 283-297 (2017).
  75. Myers, M. W., Carter, B. J. Assembly of adeno-associated virus. Virology. 102 (1), 71-82 (1980).
  76. Mingozzi, F., et al. Overcoming preexisting humoral immunity to AAV using capsid decoys. Sci Transl Med. 5 (194), (2013).
  77. Hoffman, B. E., Herzog, R. W. Covert warfare against the immune system: decoy capsids, stealth genomes, and suppressors. Mol Ther. 21 (9), 1648-1650 (2013).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

AAV Safla t rmaMozaik AAV Vekt rleriH zl Protein S v KromatografisiGe ici Transfeksiyonretici H cre HattSDS PAGE AnaliziTransmisyon Elektron MikroskopisiIn Vivo Gen Transferi

İlgili makaleler