Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Summary

Bu çalışma, Alzheimer hastalığı (AD) olan otuz üç bireyin tek çekirdekli transkriptomlarını analiz etti ve glial hücrelerde cinsiyete özgü DEG’leri ortaya çıkardı. Fonksiyonel zenginleştirme analizi sinaptik, nöral ve hormonla ilişkili yolakları vurguladı. Anahtar genler, yani NLGN4Y ve düzenleyicileri tanımlandı ve cinsiyete özgü AD için potansiyel terapötik adaylar önerildi.

Abstract

Alzheimer hastalığında (AD) son zamanlarda cinsiyete özgü birçok biyobelirteç ortaya çıkmıştır; Bununla birlikte, serebral glial hücreler nadiren bildirilmiştir. Bu çalışma, GEO veritabanındaki otuz üç AD bireyinin frontal korteksinden 220.095 tek çekirdekli transkriptomu analiz etti. Cinsiyete özgü Diferansiyel Olarak İfade Edilen Genler (DEG’ler), astrositlerde 243, mikroglialarda 1.154 ve oligodendrositlerde 572 dahil olmak üzere glial hücrelerde tanımlanmıştır. Gen Ontolojisi (GO) fonksiyonel açıklama analizleri ve Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) yolak zenginleştirme analizleri, sinaptik, nöral ve hormonla ilgili yolaklarda fonksiyonel konsantrasyonu ortaya çıkardı. Protein-protein etkileşim ağı (PPI), astrositlerde MT3, CALM2, DLG2, KCND2, PAKACB, CAMK2D ve NLGN4Y’yi, mikroglia’da TREM2, FOS, APOE, APP ve NLGN4Y’yi ve oligodendrositlerde GRIN2A, ITPR2, GNAS ve NLGN4Y’yi anahtar genler olarak tanımladı. NLGN4Y, üç glia tarafından paylaşılan tek gendi ve AD’nin cinsiyet özgüllüğü için biyobelirteç olarak tanımlandı. Gen transkripsiyon faktörü (TF)-miRNA düzenleyici ağı, NLGN4Y ve hedef TCM’leri için anahtar düzenleyicileri tanımladı. Ecklonia kurome Okam (Kunbu) ve Herba Ephedrae (Mahuang) tanımlandı ve aktif bileşenlerin AD üzerindeki etkileri gösterildi. Son olarak, Kunbu ve Mahuang’ın zenginleştirme analizi, AD’nin cinsiyet özgüllüğü için terapötik adaylar olarak hareket edebileceklerini düşündürmektedir.

Introduction

Alzheimer hastalığı (AH), görülme sıklığı yüksek küresel bir hastalıktır ve demansın %60-80’ini oluşturur¹. Yüksek insidansına rağmen, AH’nin mekanik patogenezi net olarak tanımlanmamıştır ve şimdiye kadar etkili bir terapötik yoktur². AD’deki ana patolojiler nöronal atrofi ve başta mikrotübül ilişkili protein Tau ve β-amiloid (Aβ) olmak üzere patolojik döküntü birikimi olarak ^{tanımlandı3,4}. AD’nin patogenezi anormal otofaji, oksidatif stres, mitokondriyal disfonksiyon, inflamasyon ve enerji metabolizması bozukluğu ile ilişkilidir⁵. Prevalans araştırmaları, Alzheimer hastalarının üçte ikisinin kadın olduğunu kanıtlamıştır⁶. Alzheimer’da etiyoloji, klinik bulgular, korunma ve tedavide cinsiyete özgü farklılıklar vardır. Bu nedenle, AH’de cinsiyete özgü farklılıklara neden olan biyolojik mekanizmayı ortaya çıkarmak ve geleneksel Çin tıbbını (TCM) hedeflemek, AH’nin patogenezini anlamak ve doğru tedavi stratejisine daha fazla rehberlik etmek için potansiyel olarak daha kapsamlı bir teorik çerçeve sağlayabilir.

Nöroglial hücreler, özellikle mikroglia, astrositler ve oligodendrositler, potansiyel olarak AD patogenezine katkıda bulunur. AD’de, mikroglia aktive edilir ve genetik olarak değiştirilir, bu da inflamatuar yanıta, fagositoza ve Aβ klerensine^{katkıda bulunur 7,8}; astrosit genetik olarak değiştirilmiştir, bu da sinaptik aktiviteyi, iyon homeostazını ve enerji ve lipid metabolizmasını etkiler⁹; Oligodendrosit, nöronal kayba, nörofibriler yumaklara ve beyaz cevher lezyonlarına katkıda bulunan cinsiyet özgüllüğü ile genetik olarak değiştirilir^10,11.

Bu çalışmada üstün bir teknik olarak tek çekirdekli RNA dizileme (snRNA-seq) kullanılmıştır. Tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-dizilimi) ile karşılaştırıldığında, snRNA-dizimi, örneklem zenginliği, hücre tipi bütünlüğü ve veri güvenilirliği açısından avantajlar sunar ^12,13. SnRNA-seq, AD’ye odaklanan ve glial hücrelerin rolünü araştıran çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır 14,15,16. Bu araştırma alanlarındaki geniş kabulü, AD’deki glial hücrelerin transkripsiyonel özellikleri hakkında değerli bilgiler sağlamadaki etkinliğini vurgulamaktadır. Araştırmacılar, snRNA-seq’in avantajlarından yararlanarak, GLAL hücrelerin AD patolojisine katılımı ile ilgili önemli bilgileri ortaya çıkarabildiler ve potansiyel terapötik hedefleri belirleyebildiler. AD’de cinsiyete özgü nöroglial transkripsiyonel özellikleri ve AD’nin cinsiyet özgüllüğü için potansiyel TCM’leri araştırmak için, bu çalışma, NCBI GEO genel veri tabanından AD hastalarının frontal korteksinden snRNA-seq verilerini analiz etti. Cinsiyete özgü diferansiyel olarak ifade edilen genler (DEG’ler), Gen Ontolojisi (GO), Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG), Protein-protein etkileşimi (PPI) ağı ve gen-TF-miRNA ağı, temel biyobelirteçleri ve potansiyel patogenezi ortaya çıkarmak için daha fazla analiz edilir. Son olarak, potansiyel TCM’ler önerildi ve aktif bileşenleri Coremine Medical, TCMIP ve TCMSP veri tabanlarında arama yapılarak tablolarla gösterildi.

Protocol

Analizin 2’den 9’a kadar olan adımları R yazılımı kullanılarak uygulandı (Ek Şekil 1 ve Ek Dosya 1’e bakınız), geri kalan adımlar ise çevrimiçi platformlarda yürütüldü. Bu protokolde kullanılan veri tabanlarının ayrıntıları (web bağlantıları ile birlikte) Materyal Tablosunda verilmiştir.

1. Veri toplama

1. Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi’nde halka açık Gene Expression Omnibus (GEO) veritabanına erişin.
2. Arama kutusunda Alzheimer hastalığı adlı GEO verilerini arayın.
3. Sağ tarafta En İyi Organizmaları Homo sapiens olarak seçin.
   NOT: Arama sonuçları, Homo sapiens’teki Alzheimer hastalığına ilişkin verilerdi.
4. Aranan bilgileri filtreledikten sonra, her bir tek çekirdek örneği için features.tsv, barcode.tsv ve matrix.mtx’i kapsayan GSE167490 ve GSE183068 veri dosyalarını indirin. Veri setleri, frontal korteksten kaynaklanan 34 AD örneğinden oluşmakta olup, 17 erkek örnek ve 17 kadın örnek eşit dağılım göstermiştir (Ek Tablo 1).

2. Örnek birleştirme

1. Veri yollarını ve örnek adlarını bilgisayarda uygun şekilde yapılandırın. İndirilen 34 örneği içe aktarın ve işlev adlarını kullanarak örneklere cinsiyete özgü adlar atayın.
2. Parametreleri min.cells = 3 ve min.features = 200 olarak belirterek, fonksiyon listesini ve Read10X’i kullanarak tüm örnekler için toplu işleme tarzında Seurat nesneleri oluşturun.
3. Birleştirme işlemi sırasında hücre barkodlarını korumak üzere örnek kimliklerini hücre barkodlarına önek olarak eklemek için RenameCells işlevini kullanın. Bu, her hücrenin benzersiz kimliğini korumasını ve birleşmeden sonra orijinal örnek kaynağına kadar izlenebilmesini sağladı.

3. Kalite kontrol (QC)

1. Her hücre için mitokondriyal gen oranlarını, eritrosit gen oranlarını ve ribozom gen oranlarını hesaplamak için PercentFeatureSet işlevini kullanın.
2. Bu hesaplanan oranları, bu bilgileri doğrudan her hücrenin meta verilerine eklemek için [[ ]] operatörünü kullanarak meta verilerde saklayın.
3. Parametreleri nFeature_RNA > 200, nFeature_RNA < 10000, nCount_RNA < 60000, percent.mt < 10, yüzde.rb < 5 ve yüzde olarak belirterek hücre filtrasyonu yapmak için alt küme işlevini kullanın. HB < 75.
4. GSM5106107 analizden hariç tutun.

4. Toplu etki kontrolü

1. Veri işlemeyi gerçekleştirin.
   1. NormalizeData işlevini kullanarak verileri normalleştirin.
   2. FindVariableFeatures işlevini kullanarak veri kümesindeki ilk 2000 değişken özelliğini belirleyin.
   3. RunPCA kullanarak veriler üzerinde temel bileşen analizi (PCA)¹⁷ gerçekleştirin ve 50 temel bileşeni koruyun.
   4. Sonraki analiz için en uygun ölçümlendirme sayısını belirlemek için ElbowPlot işlevini kullanarak bir dirsek grafiği oluşturun. İlk 50 boyutu düşünün.
   5. Tüm özelliklerin karşılaştırılabilir bir ölçekte olduğundan emin olmak için ScaleData kullanarak verileri ölçeklendirin.
   6. 30 boyuta göre FindNeighbors’ı kullanarak en yakın komşuları belirleyin.
   7. Verilerin boyutsallığını 30 boyuta indirmek için RunUMAP kullanarak UMAP algoritmasını uygulayın.
2. Azaltma parametresi umap olarak ve group.by parametresi orig.ident olarak ayarlanmış olarak DimPlot işlevini kullanarak işlenen verileri görselleştirin.
   NOT: Bu adım, orijinal hücre kimliklerine göre gruplandırılmış, küçültülmüş UMAP alanındaki verileri görselleştiren bir çizim oluşturabilir. UMAP grafikleri incelendiğinde, toplu etkinin varlığı olduğu ortaya çıktı. Hücrelerin parti veya deneysel kökenlerine göre farklı kümelenmesi veya ayrılması, deneysel partilerin gen ekspresyon profillerini etkilediğini düşündürdü.

5. Veri entegrasyonu

1. SCTransform işlevini kullanarak verileri normalleştirin ve standartlaştırın.
2. Kalan 33 tek çekirdekli veriyi entegre etmek için uyum algoritmasını¹⁸ uygulayın. Entegrasyon için SCT tahlilini kullanın ve maksimum uyum yinelemesi sayısını 20 olarak ayarlayın.
3. Verilerdeki farklı kümeleri tanımlamak için 0,07 olarak ayarlanmış bir çözünürlük parametresiyle FindClusters işlevini kullanın.
4. Verilerin boyutsallığını daha da azaltmak ve kümeleri daha düşük boyutlu bir alanda görselleştirmek için belirli sayıda boyutla (dims = 30) RunUMAP işlevini kullanın.

6. Hücre tipi ek açıklaması

1. Mevcut literatürün kapsamlı bir incelemesi yoluyla hücrelerin işaretleyici genlerini (Ek Tablo 2) toplayın.
2. Hücresel küme heterojenliğinin tanımlanmasını takiben, her bir küme hücresinin tipini, spesifik olarak ifade edilen işaretleyici genlere göre sınıflandırın.
3. Oligodendrosit renk kodu #DB7093, uyarıcı nöronun #FF69B4, astrositin #1874CD, mikroglia ile #63B8FF, oligodendrosit öncü hücresinin #DB7093, inhibitör nöronun #FFC0CB ve endotel hücresinin #FF69B4 ile vurgulandığı ggplot2 paketini kullanarak UMAP görselleştirmesi ile çeşitli hücresel tipleri sunun.
4. Cinsiyete göre tabakalandırılmış her hücre tipinin oranlarını hesaplayın.

7. Glial hücre veri ekstraksiyonu

1. Alt küme işlevini kullanarak entegre toplu verilerden astrosit verilerini çıkarın.
2. Alt küme işlevini kullanarak entegre toplu verilerden mikroglia verilerini çıkarın.
3. Alt küme işlevini kullanarak entegre toplu verilerden oligodendrosit verilerini ayıklayın.

8. Glial cinsiyete özgü diferansiyel olarak ifade edilen genlerin (DEG’ler) yakalanması

1. FindMarkers fonksiyonunu kullanarak astrositlerin cinsiyete özgü DEG’lerini tanımlayın (ident.1 = erkek, ident.2 = dişi, group.by = group.sum, assay = RNA) eşik değerlerle: p-değeri 30. Yukarı regüle edilmiş DEG’leri Yukarı, aşağı regülasyonlu DEG’leri Aşağı ve geri kalanını Kararlı olarak etiketleyin.
   1. X ekseni iki koşul arasındaki yüzde farkını temsil eden (pct.1 – pct.2) ve y ekseni avg_log2FC gösteren ggplot fonksiyonunu kullanarak DEG’leri görselleştirin. Yukarı regüle edilmiş genler PaleVioletRed rengi, aşağı regüle edilmiş genler Pink ile ve kararlı genler DodgerBlue3 ile vurgulandı.
2. FindMarkers fonksiyonunu (ident.1 = erkek, ident.2 = dişi, group.by = group.sum, assay = RNA) kullanarak mikroglia’nın cinsiyete özgü DEG’lerini eşik değerlerle tanımlayın: p-değeri 1. Yukarı regüle edilmiş DEG’leri Yukarı, aşağı regülasyonlu DEG’leri Aşağı ve geri kalanını Kararlı olarak etiketleyin.
   1. X ekseni iki koşul arasındaki yüzde farkını temsil eden (pct.1 – pct.2) ve y ekseni avg_log2FC gösteren ggplot fonksiyonunu kullanarak DEG’leri görselleştirin. Yukarı regüle edilmiş genler OrangeRed rengi, aşağı regüle edilmiş genler LightSalmon ile ve kararlı genler SteelBlue1 kullanılarak vurgulandı.
3. FindMarkers fonksiyonunu kullanarak oligodendrositin cinsiyete özgü DEG’lerini tanımlayın (ident.1 = erkek, ident.2 = dişi, group.by = group.sum, assay = RNA) eşik değerlerle: p-değeri 10. Yukarı regüle edilmiş DEG’leri Yukarı, aşağı regülasyonlu DEG’leri Aşağı ve geri kalanını Kararlı olarak etiketleyin.
   1. x ekseni iki koşul arasındaki yüzde farkını temsil eden (pct.1 – pct.2) ve y ekseni avg_log2FC gösteren ggplot fonksiyonunu kullanarak DEG’leri görselleştirin. Yukarı regüle edilmiş genler DeepPink rengi, aşağı regüle edilmiş genler HotPink ile ve kararlı genler DeepSkyBlue3 ile vurgulandı.

9. Cinsiyete özgü DEG’lerin fonksiyonel zenginleştirme analizleri

1. Zenginleştirme işlevini kullanarak her glial hücre tipi için cinsiyete özgü DEG’ler üzerinde Gen ontolojisi (GO) zenginleştirme analizi gerçekleştirin. Aşağıdaki parametreleri ayarlayın: OrgDb = org. Hs.eg.db, keyType = SYMBOL, ont = ALL, pAdjustMethod = BH, pvalueCutoff = 0,01 ve qvalueCutoff = 0,05.
2. Fonksiyon bitr’sini kullanarak gen sembollerini karşılık gelen gen kimliklerine dönüştürün. Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) zenginleştirme analizini, enrichKEGG fonksiyonunu kullanarak her glial hücre tipi için cinsiyete özgü DEG’ler üzerinde gerçekleştirin. Ayarları şu şekilde yapın: organism = has, keyType = kegg, pAdjustMethod = BH, pvalueCutoff = 0,01 ve qvalueCutoff = 0,05.

10. Go ve kegg yollarındaki glial DEG’lerin frekans istatistikleri, her glial cinsiyete özgü DEG’lerin venn diyagramları ve PPI ağ yapısı

1. Bir frekans histogramı kullanarak GO ve KEGG yollarındaki glial cinsiyete özgü DEG’lerin frekansını hesaplayın.
2. PPI ağlarını oluşturmak için STRING veritabanına erişin.
3. Çoklu proteinleri seçin. Arama kutusunda İsim Listesi’ni arayın. “Organizmalar”ı Homo sapiens olarak ayarlayın.
4. Aramadan elde edilen proteinlerin listesini gözden geçirin. Devam etmek için Devam’a tıklayın.
5. İndirme seçeneğini seçerek, tercihen daha yüksek çözünürlüklü PNG formatında PPI ağlarını dışa aktarın.
6. Venn diyagramlarını kullanarak en önemli cinsiyete özgü genler için ortak ifade dağılımını görselleştirin.
7. Venn diyagramı analizine dayalı olarak çalışmada paylaşılan gen(ler)i anahtar gen(ler) olarak tanımlayın.

11. Çok faktörlü düzenleyici ağ yapısı

1. NetworkAnalyst’e erişin.
2. Gen Listesi Girişi’ne tıklayın ve organizmayı H. sapiens (insan) olarak belirtin. Kimlik türünü Resmi Gen Sembolü olarak ayarlayın. Arama alanına gen adını girin ve ardından Yükle ve Devam Et’e tıklayın.
3. Gen-miRNA Etkileşimleri’ni seçin ve miRTarBase v8.0’ı seçin. Tamam’a tıklayarak seçimi onaylayın.
4. TF-gen Etkileşimlerine ilerleyin ve ENCODE veritabanını seçin. Seçimi onaylamak için Tamam’a tıklayın.
5. Ardından, TF-miRNA Düzenleyici Ağı’na gidin ve devam etmek için Tamam’a tıklayın.
6. Son olarak, gen-miRNA etkileşimlerini ve TF-gen etkileşimlerini içeren çok faktörlü düzenleyici ağı oluşturmak için Devam Et’i seçin.

12. Gen ve hedef TCM analizi

1. Coremine Medical online veritabanına erişin.
2. Spesifik gen adını girin ve Keşfet bölümünün altındaki arama kutusuna gen/protein, insan sonekine sahip ilgili geni seçin.
3. İlaçlar bölümünde gezinin ve aranan ilaçlarla ilişkili TCM’leri tanımlayın.
   NOT: İstatistiksel olarak anlamlı ilaçlar mavi ile işaretlenmiştir.
4. Terapötik TCM’ler olarak “önem” değerlerine göre ilk beş TCM’yi belirleyin.

13. Anahtar geni hedeflemede TCM bileşenlerinin araştırma özeti

1. Geleneksel Çin Tıbbı Bütünleştirici Farmakoloji Tabanlı Araştırma Platformu (TCMIP) ve Geleneksel Çin Tıbbı Sistemleri Farmakoloji Veritabanı ve Analiz Platformuna (TCMSP) erişin. İlgili bileşenlerini almak için bitkilerin adlarını arama çubuğuna girin.
2. PubMed veritabanındaki malzemeleri 10 Nisan 2023’e kadar bir süre sınırı ile alın. Kullanılan arama terimleri, arama terimleri olarak TCMSP’deki Molekül Adını ve TCMIP’deki Kimyasal Bileşenleri içeriyordu ve İngilizce olarak yayınlanan makalelerle sınırlıydı.
3. AD’ye etki eden bitkileri ve bunlara karşılık gelen bileşenleri özetleyin ve analiz edin.

14. AD’nin cinsiyet özgüllüğünde TCM’lerin tedavi işlevini hedeflemenin doğrulanması

1. Bitkileri TCMIP’ye aktarın ve ilgili açıklama sayfasına gidin.
2. GO – Biyolojik Süreç, GO – Hücresel Bileşen, GO – Moleküler Fonksiyon ve Reactome Yolu zenginleştirme terimlerini indirmek için Verileri Dışa Aktar işlevini kullanın ve CSV biçimini seçin.
3. Çubuk grafikleri kullanarak her bitki için indirilen zenginleştirme terimlerini görselleştirin.

Representative Results

Discussion

AD^19’un epidemiyolojisi, patolojisi ve klinik bulgularında cinsiyete özgülük tanımlanmıştır. Burada, Alzheimer hastalarında cinsiyete özgü glial genlerden ve ilgili yolaklardan “hormon-sinaps-nöron ekseni”nin potansiyel patolojik mekanizmasını doğruladık. NLGN4Y, üç glia’da paylaşılan tek gendi ve AD’nin cinsiyet özgüllüğü için biyobelirteç olarak seçildi. NLGN4Y’yi düzenleyen TF ve miRNA’lar, cinsiyet farklılıkları ve sinir sisteminin gelişimi ile güçlü bir şekilde bağlantılıydı. Ayrıca, hedef TCM’ler Kunbu ve Mahuang’ın “hormon-sinaps-nöron” eksenini potansiyel olarak etkilediği düşünüldü ve cinsiyet özgüllüğünün düzenlenmesi yoluyla AD için terapötik adaylar olarak hareket ettikleri belirlendi.

Harmony algoritması, verileri nadir hücrelere entegre ederek, büyük örnekler için bellek kullanımını ve hesaplama hızını optimize ederek ve çeşitli hücresel kaynaklar ve teknoloji platformlarıyla karmaşık deneysel tasarımları barındırarak diğer entegrasyon algoritmalarına göre belirgin avantajlar sağladı¹⁸. Kalite kontrol ve veri entegrasyon bölümleri, analizin doğruluğunu ve güvenilirliğini artırmada kritik bileşenlerdi ve araştırmacıların AD ve diğer nörodejeneratif hastalıkların biyolojisi hakkında daha derin bilgiler toplamasını sağladı. Bu adımların titiz bir şekilde uygulanması, tek çekirdekli RNA dizileme deneylerinden elde edilen sonuçların genel kalitesini ve geçerliliğini elde etmede çok önemlidir.

Bu protokolde yapılan değişikliklerden biri, verileri normalleştirmek ve standartlaştırmak için SCTransform fonksiyonunun kullanılmasıydı²⁰. Bu adım, verilerin karşılaştırılabilir olmasını ve daha fazla analiz için standartlaştırılmasını sağladı. Toplu etkiyi azaltmak için, toplu işlemin düzeltilmesine ve sonuçların doğruluğunun iyileştirilmesine yardımcı olan ek bir veri entegrasyonu adımı atıldı. Numunelerden biri (GSM5106107) diğer numunelere kıyasla olağandışı performans gösterdiğinde sorun giderme işlemi yapıldı ve analizden çıkarıldı.

Bu çalışmanın bir sınırlaması, bulguların daha geniş popülasyona temsil edilebilirliğini sınırlayabilen, kullanılan nispeten küçük örneklem büyüklüğü ile ilgilidir. Ayrıca, birden fazla laboratuvar ve araştırma grubundan elde edilen verilerin kullanılması, sonuçların tekrarlanabilirliğini ve genelleştirilebilirliğini potansiyel olarak sınırlayan doğal heterojenliği ortaya çıkardı. NLGN4Y için temel düzenleyici faktörlerin tanımlanması bir gen-TF-miRNA düzenleyici ağı aracılığıyla sağlanmış olsa da, bu düzenleyici faktörlere atfedilen fonksiyonel rolleri ve altta yatan mekanizmaları belirlemek için daha fazla deneysel doğrulama gerekliydi. Zenginleştirme analizi, Mahuang ve Kunbu’yu cinsiyete özgü AD tedavisi için potansiyel adaylar olarak önerirken, yalnızca biyoinformatik tahminlere güvenmek, etkinliklerini ve güvenliklerini belirlemek için yetersizdi. Bu umut verici ilaçların terapötik etkilerini doğrulamak için ek deneyler ve klinik çalışmalar zorunluydu.

Bu çalışmada tanımlanan yaklaşım, özellikle AD’deki glial hücreler içinde cinsiyete özgü DEG’lerin ayırt edilmesinde, çeşitli araştırma alanları için önemli bir potansiyel sergilemiştir. Bu tür araştırmalar, erkek ve kadın bireyler arasındaki nüanslı patojenik eşitsizlikleri aydınlatmak için umut vaat etmekte ve sonuç olarak cinsiyete özgü terapötik müdahalelerin formülasyonunu kolaylaştırmaktadır. Ayrıca, yöntemin uygulanabilirliği diğer nörodejeneratif koşullara da yayıldı ve cinsiyete özgü DEG’leri tanımlamak ve hastalıkların altında yatan mekanizmaların anlaşılmasını artırmak için fırsatlar sundu.

Sonuç olarak, çalışma, AD hastalarından alınan tek çekirdekli RNA dizileme verilerini analiz etmek için kapsamlı ve sağlam bir protokol sundu ve potansiyel olarak özel terapötik müdahalelerin geliştirilmesinin önünü açtı. Ayrıca, bu çalışmada kullanılan metodoloji, cinsiyete özgü gen ekspresyon modellerini ortaya çıkarmak ve bu karmaşık hastalıkların anlaşılmasını derinleştirmek için fırsatlar sunan diğer nörodejeneratif koşullara genişletilebilir.

Materials

<strong>Database</strong>
Coremine Medical database	Jointly developed by Norway, the Chinese Academy of Sciences, the Chinese Academy of Medical Sciences, the National Medical Library of the United States and other institutions		When you explore concepts in CoreMine Medical you access a database that is structured to relate important concepts, ranked by statistical relevance, to your topic. For example, if you type in "Alzheimer disease," in addition to retrieving documents and resources that discuss the disease, you will be able to view networks and lists that show how your query concept is related to other bio-medical concepts. This provides an overview of concepts that relate to your search as well as being an interface for navigating information on these concepts.<br/> Weblink: https://coremine.com/medical/
Gene Expression Omnibus (GEO)	National Center for Biotechnology Information in the United States (NCBI)		GEO is a public functional genomics data repository supporting MIAME-compliant data submissions. Array- and sequence-based data are accepted. Tools are provided to help users query and download experiments and curated gene expression profiles.<br/> Weblink: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
Integrative Pharmacology-based Research Platform of Traditional Chinese Medicine (TCMIP, version: 2.0)	None		Introduction to the Integrated Pharmacology Based Network Computational Research Platform for Traditional Chinese Medicine [TCMIP v2.0], http://www.tcmip.cn/ ) It is an intelligent data mining platform based on the online database of the Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine (ETCM), which integrates medical big data management and pharmacological computing services. It aims to reveal the scientific connotation of traditional Chinese medicine theory and the scientific value of original thinking in traditional Chinese medicine, summarize and pass on the experience of famous doctors, control the quality of traditional Chinese medicine, explain the principles of traditional Chinese medicine action, research and development of new Chinese medicine, especially the discovery and optimization of modern drug combinations, Provide a strong data foundation and analytical tools. Based on TCMIP v1.0, a comprehensive upgrade is implemented, including five major databases and seven functional modules. Through system integration and module integration, a comprehensive analysis of the multi-level correlation of the "disease syndrome prescription" interaction network can be quickly achieved. As an intelligent data mining platform, TCMIP v2.0 will provide a strong data foundation and analysis platform for revealing the scientific connotation of traditional Chinese medicine theory and the scientific value of original thinking in traditional Chinese medicine, summarizing and inheriting the experience of famous doctors, quality control of traditional Chinese medicine, elucidating the principles of traditional Chinese medicine action, research and development of new traditional Chinese medicine drugs, especially modern drug combination discovery and optimization.<br/> Weblink: http://www.tcmip.cn/TCMIP&nbsp;
NetworkAnalyst	None		Networkanalyze is an online visualization analysis platform for gene expression analysis and meta-analysis. It can perform comparative, quantitative, differential and enrichment analysis of gene expression, protein-protein interaction analysis, integration analysis of multiple datasets, and can also draw high-value images such as PCA, protein-protein interaction network diagram, heatmap, volcano diagram, Wayne diagram, etc.<br/> Weblink: https://www.networkanalyst.ca/NetworkAnalyst/
PubMed database	National Center for Biotechnology Information in the United States (NCBI)		The Pubmed database is a biomedical literature database maintained by the National Library of Medicine (NLM) in the United States, aimed at providing the latest medical research results to scientists, doctors, researchers, and students worldwide. This database collects biomedical literature from around the world, including journal articles, papers, books, etc. As of now, the Pubmed database has collected over 30 million articles and is continuously updated every week.<br/> Weblink: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/
R software	Ross Ihaka and Robert Gentleman		R is a language and environment for statistical computing and graphics. It is a GNU project which is similar to the S language and environment which was developed at Bell Laboratories (formerly AT&amp;T, now Lucent Technologies) by John Chambers and colleagues. R can be considered as a different implementation of S. There are<br/> some important differences, but much code written for S runs unaltered under R.<br/> Weblink: https://www.r-project.org/
Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP)	Zhejiang Jiuwei Health Co., Ltd		TCMSP is not only a data repository, but also an analysis platform for users to comprehensively study Traditional Chinese Medicines (TCM): including identification of active components, screening of drug targets and generation of compounds-targets-diseases networks, as well as the detailed drug pharmacokinetic information involving drug-likeness (DL), oral bioavailability (OB), blood-brain barrier (BBB),intestinal epithelial permeability (Caco-2), ALogP,fractional negative surface area (FASA-) and number of &nbsp;H-bond&nbsp;donor/acceptor &nbsp;(Hdon/Hacc). So far, TCMSP has attracted broad attentions and several groups have published more than 10 papers by using our TCMSP database within about one year.<br/> Weblink: https://tcmsp-e.com