Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

CD4 T Hücresinin Nükseden-Düzelen Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelitteki Rolü

870 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66553

⸱

19 Ocak 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Basic Medicine, Ningxia Medical University, 2Preparation Center, General Hospital of Ningxia Medical University, 3Institute of Neurological Diseases, First People's Hospital of Shizuishan, 4Department of Neurology, Xianyang Hospital of Yan’an University, 5Department of Pharmacy, People’s Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region, 6Department of Pharmacy, General Hospital of Ningxia Medical University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Farelerde deneysel bir otoimmün ensefalomiyelit (EAE) modeli, CD4 T hücrelerinin EAE'nin başlangıç ve nüksetmesindeki rolünü aktivasyon fazı ve immün etki fonksiyonu perspektifinden araştırmak için kullanıldı.

Özet

Multipl skleroz (MS), immün hücrelerin infiltrasyonu ve merkezi sinir sisteminde (MSS) demiyelinizasyon ile karakterize otoimmün bir hastalıktır. Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), MS'i incelemek için prototipik bir hayvan modeli olarak hizmet eder. Bu çalışmada, EAE'nin başlaması ve nüksetmesinde CD4 T hücrelerinin rolünü, aktivasyon fazı ve immün yanıta odaklanarak araştırmayı amaçladık. EAE fare modelini oluşturmak için dişi fareler, tam Freund adjuvanı (CFA) ile emülsifiye edilmiş miyelin oligodendrosit glikoproteini (MOG)35-55 ile aşılandı. Klinik skorlar günlük olarak değerlendirildi ve sonuçlar, EAE grubundaki farelerin klasik bir nükseden-düzelme paterni sergilediğini gösterdi. Hematoksilen-eozin (H&E) ve luxol hızlı mavi (LFB) boyama analizi, EAE farelerinde CNS'de inflamatuar hücrelerin önemli ölçüde infiltrasyonunu ve demiyelinizasyonu ortaya çıkardı. Aktivasyon fazı ile ilgili olarak, hem CD4 + CD69 + efektör T (Teff) hücreleri hem de CD4 + CD44 + CD62L- efektör bellek T (Tem) hücreleri EAE'nin başlamasına katkıda bulunabilir, ancak nüks aşamasına muhtemelen CD4 + CD44 + CD62L-Tem hücreleri hakimdir. Ek olarak, bağışıklık fonksiyonu açısından, yardımcı T (Th)1 hücreleri öncelikle EAE'nin başlatılmasında rol oynar. Bununla birlikte, hem Th1 hem de Th17 hücreleri nüks aşamasına katkıda bulunur ve düzenleyici T (Treg) hücrelerinin immünosüpresif fonksiyonu EAE patolojik süreci sırasında inhibe edilmiştir.

Giriş

Multipl skleroz (MS), merkezi sinir sisteminin (MSS) immün hücrelerle infiltrasyonu ve demiyelinizasyon ile karakterize otoimmün bir hastalıktır 1,2. Yakın zamanda yapılan bir çalışma, gençleri etkileyen en yaygın sakatlayıcı hastalık olduğunu ve insidansının dünya çapında sürekli arttığını göstermiştir3. Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), insan MS4'ün enflamatuar fazının birçok yönünü simüle eden MS için prototipik bir hayvan modelidir. İmmün fonksiyonlar açısından bakıldığında, henüz antijenlerle karşılaşmamış olan başlangıç CD4 T hücreleri, yardımcı T(Th) 0 hücreleri olarak adlandırılır. Bu hücreler çeşitli işlevler sergilemek için olgunlaşma ve aktivasyon işlemlerinden geçerler. CD4 T hücreleri, Th1, Th2, düzenleyici T (Treg), foliküler yardımcı T (Tfh), Th17, Th9 ve Th22 hücreleri5 dahil olmak üzere spesifik işlevlerine göre birkaç alt kümeye ayrılabilir. Th1 ve Th17 hücre alt tiplerinin EAE6'nın önemli patogenez faktörleri olduğu yaygın bir kanıdır. Th1 hücreleri interferon γ (IFN-γ) salgılayabilir ve Th17 hücreleri interlökin (IL)-17 ve mikroglial hücreler ve astrositler gibi diğer bağışıklık hücrelerini aktive edebilen diğer inflamatuar faktörleri salgılar. Bu hücreler, IL-18, IL-12, IL-23 ve IL-1β gibi inflamatuar sitokinler7 üretir, bu da Th1 / Th17 hücrelerinin bağışıklık tepkisini daha fazla indükleyerek ilerleyici demiyelinizasyon ve aksonal hasara neden olabilir. Aktivasyon fazı perspektifinden bakıldığında, CD4 T hücreleri, naif, efektör ve bellek T hücreleri8 dahil olmak üzere farklı hücre alt kümelerine ve farklılaşmış durumlara dönüşmek için önceden belirlenmiş bir kadere sahiptir. İlk CD4 T hücreleri çoğalır ve farklı ortamlarda farklı işlevlere sahip çeşitli efektör alt kümelerine farklılaşır9. Efektör hücrelerin çoğu kısa ömürlüdür ve küçük bir T hücresi popülasyonu, aynı antijenlerle tekrar karşılaştığında hızlı efektör işlevler sergileyen ve konakçıya oldukça güçlü ve uzun süreli koruma sağlayan bellek T hücrelerine dönüşür10,11.

Mevcut araştırmalar, CD4 T hücrelerinin EAE'nin gelişiminde önemli bir rol oynadığını öne sürse de, aktivasyon fazlarına ve immün etki fonksiyonlarına göre sınıflandırılan farklı CD4 T hücresi alt kümelerinin EAE'nin başlamasına ve nüksetmesine nasıl katkıda bulunduğu hala belirsizdir. Bu çalışmada, miyelin oligodendrosit glikoprotein (MOG)35-55 peptidini immünize ederek C57BL6/J farelerde EAE modeli oluşturuldu ve CD4 T hücrelerinin aktivasyon fazı ve immün fonksiyonuna odaklanarak EAE'nin başlaması ve nüksetmesi araştırıldı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışma için altı ila sekiz haftalık toplam 18 dişi C57BL / 6J faresi rastgele bir kontrol grubuna (n = 6) ve bir EAE grubuna (n = 12) ayrıldı. Fareler, Ningxia Tıp Üniversitesi'nin deney hayvanı merkezinden satın alındı. Fareler, 12 saatlik aydınlık / karanlık döngüsüne ve tatlı su ve yiyeceğe ücretsiz erişime sahip, sıcaklık ve nem kontrollü bir odaya yerleştirildi. Çalışma başlamadan önce Ningxia Tıp Üniversitesi Deney Hayvanları Etik Kurulu'ndan etik onay alındı.

1. C57BL / 6 farelerde tekrarlayan remitting EAE'nin geliştirilmesi

  1. Reaktif çözünmesi
    1. 5.4 mg MOG35-55'i (Malzeme Tablosu) 1.8 mL fosfat tamponlu salin (PBS) çözeltisi içinde çözün. 12.6 mg Mycobacterium tuberculosis H37RA (Malzeme Tablosu) tartın ve 1.8 mL tam Freund adjuvan (CFA) çözeltisine ekleyin (Malzeme Tablosu). 360 μL boğmaca toksinini (PTX; Malzeme Tablosu) bir pipet kullanarak 7,2 mL PBS'ye (Malzeme Tablosu).
  2. MOG35-55 ve CFA emülsiyonunun hazırlanması
    1. MOG35-55 çözeltisini ve CFA çözeltisini adım 1.1'de hazırlanan iki adet 5 mL şırınga kullanarak pipetleyin ve bunları bir tee valfi ile bağlayın. Yağda sütlü su emülsiyonu elde edilene kadar 1 saat buz üzerinde sürekli karıştırın.
      NOT: Emülsiyon, suya bırakıldıktan sonra dağılmadan su yüzeyinde yüzerken başarılı bir şekilde hazırlanır.
  3. Fare anestezisi
    1. Anestezi makinesi evaporatörünün ön ucundaki doldurma contası kapağını sökün. Ortadaki sızdırmazlık vidası boyunca yavaşça 20 mL izofluran dökün ve doldurma contası kapağını kilitleyin. Anestezi makinesi buharlaştırıcısından gelen hava akışının anestezi indüksiyon kutusu (Malzeme Tablosu) ile iletildiğinden emin olmak için tee valf anahtarını değiştirin.
    2. Hava pompası güç kaynağını bağlayın, hava pompası anahtarını açın ve oksijen akış ölçerin ön ucundaki hava kaynağı valfini, çıkış gazı akışı 400 mL/dak olacak şekilde döndürün ve ayarlayın. Evaporatörü açın, indüksiyon konsantrasyonunu %3'e ayarlayın ve anestezinin indüksiyon kutusunu doldurmasını bekleyin.
    3. Yaklaşık 1 dakika sonra, fareleri indüksiyon kutusuna koyun, ardından indüksiyon kutusunu kapatın ve farelerin derin uykuda olmasını, kas gevşemesini ve sürekli nefes almasını bekleyin; daha sonra, fareler ideal anestezi durumu olarak belirlenebilir (Malzeme Tablosu).
      NOT: Fareler tamamen uyuşturulana kadar anestezi makinesi buharlaştırıcısından gelen hava akışının anestezi maskesi ile iletildiğinden emin olmak için tee valf anahtarını değiştirin.
  4. Fare bağışıklaması
    1. Adım 1.2'de hazırlanan 200 μL emülsiyonu, farenin sırtındaki dört bölgede, aksillada omurganın her iki tarafında yaklaşık 0.5 cm, aksillada ve kasık düzleminde12 olmak üzere 1 mL'lik bir şırınga kullanılarak deri altına enjekte edin. Her bölgede 50 μL emülsiyon kullanın (Malzeme Tablosu).
  5. PTX enjeksiyonu
    1. Fareleri kuyruğunu yakalayarak kafesten çıkarın ve kafes telinin üzerine yerleştirin. Farelerin kuyruğunu 4. ve 5. parmaklarla tutun ve vücudun ve uzuvların öne doğru eğilimini korumak için yavaşça yukarı çekin. Farelerin başını kavrayın ve orta ve yüzük parmaklarını kullanarak farelerin arkasındaki cildi yakalayın.
    2. Adım 1.4'te aşılamadan 0 saat ve 48 saat sonra, iğneli 1 mL şırınga kullanarak orta karın çizgisinin her iki tarafı boyunca 0.5 cm pozisyonunda 1-2 cm penetrasyon derinliği ile intraperitoneal olarak 200 μL PTX enjekte edin (Malzeme Tablosu).
      NOT: MOG35-55'in aşılanmasından 48 saat sonra PTX enjekte etmeden önce, adım 1.3'te açıklanan prosedürleri kullanarak fareleri uyuşturmak gerekir. Fareler, sternal yaslanmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar ilgilenilmelidir.
    3. Kontrol grubundaki fareler için, aynı yöntemi kullanarak salin ile tedavi edin ve klinik skoru günlük olarak değerlendirin.
      NOT: Fareler, aşağıdaki ölçeğe göre EAE belirtileri açısından değerlendirildi13: 0 = hastalık belirtisi yok, 1 = kuyruğun tam felci, 2 = kısmi arka felç/zayıflık, 3 = tam arka bacak felci, 4 = ön ve arka bacak felci ve 5 = can çekişen durum.

2. Histolojik boyama analizi

  1. Beyin koleksiyonu
    1. Adım 1.3'ü izleyerek fareleri uyuşturun. Fareleri servikal çıkık ile ötenazi yapın ve kalbi tamamen ortaya çıkarmak için göğsü açın. Auricula dextra'yı kesin ve karaciğer gri ve beyaz olana kadar sol ventrikülde iğneli 20 mL'lik bir şırınga kullanarak önceden soğutulmuş bir salin solüsyonu ile yavaşça perfüze edin.
    2. Kuyruk ucu yukarı dönene, vücut sertleşene ve karaciğer sertleşene kadar% 4 paraformaldehit ile yavaşça perfüze edin. Kafanın başını kesin, kafatasını kesin, cımbız kullanarak beyni toplayın ve 24 saat boyunca% 4 paraformaldehit çözeltisinde sabitleyin (Malzeme Tablosu).
  2. Parafin bölümlerinin hazırlanması
    1. Gradyan dehidrasyon: Adım 2.1'deki beyin dokularını art arda 1 saat boyunca %70 etanole, 1 saat boyunca %80 etanole, 1 saat boyunca %95 etanole, 1 saat boyunca susuz etanole daldırın, taze susuz etanol ile değiştirin, 1 saat daldırmaya devam edin (Malzeme Tablosu).
    2. Şeffaflık: Adım 2.2.1'deki beyin dokularını 30 dakika boyunca ksilene daldırın, bunları taze ksilen ile değiştirin ve dokular şeffaf olana kadar daldırmaya devam edin (Malzeme Tablosu).
    3. Gömme: Adım 2.2.2'deki beyin dokularını 1 saat parafine gömün, taze parafin ile değiştirin, 1 saat gömmeye devam edin, küf çıktıktan sonra 6 μm'lik dilimler halinde kesin, slaytı sıcak suya koyun, 37 °C'de kurutun, oda sıcaklığında saklayın (Malzeme Tablosu).
    4. Mum alma: Adım 2.2.3'teki beyin dokularını 20 dakika ksilene daldırın, taze ksilen ile değiştirin, 20 dakika daldırmaya devam edin, 5 dakika susuz etanol içine koyun, taze susuz etanol ile değiştirin, 5 dakika daldırın, 5 dakika boyunca %75 etanol kullanın, musluk suyu ile durulayın (Malzeme Tablosu).
    5. Hematoksilen-eozin (H & E) boyama: Adım 2.2.4'ten itibaren dokuları hematoksilen solüsyonu ile 3-5 dakika boyayın ve ardından musluk suyu ile durulayın. Dokuları bir hematoksilen farklılaşma çözeltisi ile tedavi edin, kısaca ve musluk suyuyla iyice durulayın. Dokuları hematoksilen Scott musluk mavileştirme solüsyonu ile tedavi edin ve musluk suyu ile durulayın. 5 dakika boyunca %85 etanole ve 5 dakika boyunca %95 etanole daldırın ve adımları 5 dakika boyunca eozin boya ile boyayın (Malzeme Tablosu).
    6. Dehidrat: Adım 2.2.5'teki dokuları art arda 5 dakika susuz etanole daldırın, taze susuz etanol ile değiştirin, 5 dakika daldırmaya devam edin, taze susuz etanol ile değiştirin, 5 dakika daldırın, 5 dakika ksilen ile değiştirin, 5 dakika daldırın, nötr sakızla kapatın (Malzeme Tablosu).
    7. Mikroskop kullanarak beyin dokularını gözlemleyin ve görüntü elde etme ve analiz etme (Malzeme Tablosu).

3. LFB boyama analizi

  1. Miyelin kılıfı toplama: Farelerin omurgasını baş terminalinden 2 segment yukarı kuyruk terminaline 2 segment aşağı kesin, omuriliği kuyruk terminaline üfleyin ve omuriliği 24 saat boyunca% 4 paraformaldehit çözeltisine sabitleyin.
    NOT: Miyelin kılıfı, adım 2.1'de aynı farelerden alınmıştır ve kalp perfüzyonu için adımlar 2.1'deki ile aynıdır.
  2. Parafin bölümleri deparafinizasyon ve rehidrasyon: Adım 3.1'deki slaytları art arda 20 dakika ksilene koyun, taze ksilen ile değiştirin, 20 dakika daldırmaya devam edin, 5 dakika susuz etanol, taze susuz etanol ile değiştirin, 5 dakika daldırın, 5 dakika boyunca %75 alkol, musluk suyu ile yıkayın.
  3. Hızlı mavi boyama: luxol hızlı mavi boyama solüsyonu A'yı 60 °C fırına koyun ve 30 dakika önceden ısıtın. Adım 3.2'deki slaytları çözelti A'ya koyun ve dilimlerin kurumasını önlemek için 1 saat boyunca plastik bir zarla örtün, ardından slaytları çıkarın ve hızlı bir şekilde musluk suyuyla yıkayın.
  4. Arka plan farklılaşması: Adım 3.3'teki slaytları 2 saniye boyunca (boya sıcakken) luxol hızlı mavi boyama çözeltisi B'ye koyun ve 15 saniye boyunca farklılaşma için doğrudan luxol hızlı mavi boyama çözeltisi C'ye daldırın, miyelin kılıfı mavi olana ve arka plan neredeyse renksiz olana kadar suyla yıkayın.
  5. Eozin karşı boyama: Adım 3.4'teki slaytları kuruması için 65 °C'de fırına koyun. Piştikten sonra fırından çıkarın ve soğumaya bırakın. Slaytları 1 dakika boyunca %95 etanol ve eozin karşı boyamaya koyun.
  6. Dehidrasyon ve sızdırmazlık: Adım 3.5'teki slaytları art arda 5 dakika susuz etanole koyun, taze susuz etanol ile değiştirin, 5 dakika daldırmaya devam edin, tekrar taze susuz etanol ile değiştirin, 5 dakika daldırmaya devam edin, ksilen 5 dakika, taze ksilen ile değiştirin, 5 dakika daldırın. Numuneleri yıkayın ve kurulayın ve nötr sakızla kapatın.
  7. Mikroskop muayenesi: Dik bir optik mikroskop kullanarak görüntüleri toplayın ve analiz edin (Malzeme Tablosu).

4. Akış sitometrisi analizi

  1. Farelerin karın boşluğunu açın. Cımbız kullanarak dalakları çıkarın ve makas kullanarak buz üzerinde PBS'de 1,5-2,5 cm'lik küçük parçalar halinde kıyın. Dalağı, 2.5 mL'lik bir şırınga pistonu kullanarak% 2 fetal sığır serumu (FBS) içeren 10 mL RPMI-1640'ta öğütün ve tek hücreli süspansiyon elde etmek için 70 μm'lik bir hücre süzgecinden itin (Malzeme Tablosu).
    NOT: Dalaklar, adım 2.1'de aynı farelerden toplandı.
  2. Adım 4.1'de elde edilen süspansiyonu 15 mL'lik tüplere aktarın ve 10 dakika boyunca buz üzerinde 5 mL kırmızı kan hücresi lizis tamponu kullanarak parçalayın. % 2 FBS içeren RPMI-1640 ile yıkayın, 5 dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı atın ve% 2 FBS içeren RPMI-1640 ile hücreleri yeniden süspanse edin.
  3. Hücreleri otomatik hücre sayacı (Malzeme Tablosu) ile sayın ve konsantrasyonu 1 x 106 hücre / mL olarak ayarlayın.
  4. 100 μL hücre süspansiyonunu 1.5 mL'lik tüplere pipetleyin ve spesifik olmayan lekelenmeyi engellemek için 1 μL anti-fare CD16 / 32 antikoru14 (0.5 mg / mL) ile 30 dakika inkübe edin. RPMI-1640 ile yıkayın ve 350 x g'de 5 dakika santrifüjleyin, süpernatanı atın. Hücreleri% 2 FBS içeren 100 μL RPMI-1640'ta yeniden süspanse edin.
  5. CD45 (Alexa Fluor 700), CD3 (FITC), CD4 (APC) ve CD69 (BV674) için spesifik antikorlarla Teff hücreleri15 için 30 dakika, her antikor için 2 μL boyayın. Tem hücreleri16 için CD45 (Alexa Fluor 700), CD3 (FITC), CD4 (APC), CD44 (BV421) ve CD62L (PE) için spesifik antikorlarla 30 dakika, her antikor için 2 μL boyayın. RPMI-1640 ile yıkayın ve 5 dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı atın ve hücreleri 350 μL PBS'de yeniden süspanse edin. Bir akış sitometresi ve ilgili yazılımı kullanarak hücre oranını analiz edin (Malzeme Tablosu).

5. Sitometrik boncuk dizisi ile sitokinlerin analizi

  1. Fare beyinlerinde IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, tümör nekroz faktörü (TNF)-α ve IFN-γ'yi ölçmek için sitometrik boncuk dizisini (Malzeme Tablosu) kullanın, aşağıda açıklanan yöntemler.
  2. Fare beynini adım 2.1'de açıklandığı gibi toplayın.
  3. Toplam proteinin ekstraksiyonu: 50 mg beyin dokusunu kesin ve tartın (kontrol grubunda üç beyin, tepe aşamasında EAE grubu ve RR aşamasında). Beyinleri 1.5 mL'lik tüplere yerleştirin ve PMSF, proteaz inhibitörü ve fosfataz inhibitörleri içeren 500 μL lizis tamponu ekleyin.
  4. Beyinleri 1 mm3 civarında küçük parçalar halinde kesin, ultrasonik homojenizatör ile 400 W, 5 s AÇIK ve 5 s KAPALI'da çıkarın; 5X için tekrarlayın. Tüpü 10 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin, 12000 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı toplayın (Malzeme Tablosu).
  5. Fare Th1 / Th2 / Th17 sitokin standartlarını aşağıda açıklandığı gibi hazırlayın.
    1. Liyofilize fare Th1 / Th2 / Th17 standartlarında bir şişe açın. Standartları 15 mL'lik bir konik polipropilen tüpe aktarın. Tüpün üst kısmını standart olarak etiketleyin.
    2. Standartları 2.0 mL tahlil seyrelticisinde yeniden oluşturun. Sulandırılmış standardın oda sıcaklığında 15 dakika dengelenmesine izin verin. Sulandırılmış proteini pipetleme ile nazikçe karıştırın.
    3. 12 mm x 75 mm'lik tüpleri etiketleyin ve aşağıdaki seyreltme sırasına göre düzenleyin: 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128 ve 1:256. Her etiketli tüpe 300 μL tahlil seyreltici pipetleyin.
    4. Seri seyreltmeler yapın: En üst standarttan 300 μL'yi 1:2 seyreltme tüpüne aktarın ve pipetleyerek iyice karıştırın. 300 μL'yi 1:2 tüpten 1:4 tüpe aktararak seri seyreltmelere devam edin ve bu şekilde 1:256 tüpe kadar devam edin. 12 pg / mL negatif kontrol olarak hizmet etmek için yalnızca test seyrelticisini içeren 75 mm x 0 mm'lik bir tüp hazırlayın.
      NOT: Pipetleme ile iyice karıştırın. Mikroboncuklar üzerindeki antikor eşleşmesinin düşmesini önlemek için girdap yapmayın.
    5. Fare Th1 / Th2 / Th17 sitokin yakalama boncuklarını karıştırmak için, deney için her grupta 3 numune (kontrol grubu, tepe aşamasında EAE grubu ve RR aşaması) bulunan standartlar dahil 19 tüp hazırlayın. Karıştırmadan önce yakalama boncuğu süspansiyonunu 5 saniye kuvvetlice sarın. Her yakalama boncuğundan 190 μL'yi tek bir tüpe ekleyin ve karışık yakalama boncukları olarak etiketleyin. Boncuk karışımını iyice girdaplayın.
      NOT: Antikor konjuge boncuklar zamanla süspansiyondan çıkacaktır. Bir boncuk süspansiyon alikotu almadan önce şişeyi girdaplamak gerekir.
    6. Tahlili gerçekleştirmek için, karışım yakalama boncuklarını girdaplayın. Tüm tahlil tüplerine 50 μL boncuk ekleyin. Tablo 1'deki gibi kontrol tüplerine 50 μL fare Th1 / Th2 / Th17 sitokin standart dilüsyonları ekleyin.
    7. Tüm tahlil tüplerine 50 μL fare Th1 / Th2 / Th17 PE tespit reaktifi ekleyin. Tahlil tüplerini oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin ve ışıktan koruyun. Her tahlil tüpüne 1 mL yıkama tamponu ekleyin ve 200 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı her bir tahlil tüpünden dikkatlice aspire edin ve atın.
    8. Boncuk peletini yeniden süspanse etmek için her bir test tüpüne 300 μL yıkama tamponu ekleyin. FCAP Array yazılımını (Malzeme Tablosu) kullanarak fare Th1 / Th2 / Th17 sitokin verilerini analiz edin.

  

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Klinik puanların değerlendirilmesi
Şekil 1'de gösterildiği gibi, kontrol grubundaki fareler herhangi bir klinik semptom göstermedi. MOG35-55 ile aşılanan EAE grubundaki fareler, aşılamadan yaklaşık 12 gün sonra kuyruk felci gösterdi. 16. günde, semptomlar tam arka bacak felcine ulaştı (tepe evresi, Tepe olarak tanımlanır). Bundan sonra, semptomlar yavaş yavaş havale edildi. Farelerin klinik semptomları yaklaşık 25. günde şiddetlendi ve yaklaşık 30. günde tam arka bacak fe...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

MS, dünya çapında milyonlarca insanı etkileyen CNS'nin en yaygın otoimmün demiyelinizan hastalığıdır17. EAE, MS18'in klinik patolojik özelliklerini simüle etmek için tipik bir hayvan modelidir. Çalışmalar, MS'li bireylerin CNS'deki akson ve nöronların dejenerasyonu nedeniyle bilişsel bozukluk ve diğer sakatlıklar yaşadığını göstermiştir 19,20,21. E...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Ningxia Doğa Bilimleri Vakfı (2022AAC03601 ve 2023AAC02087) ve Ningxia Tıp Üniversitesi Araştırma Vakfı (XM2019052) tarafından desteklenmiştir. Ningxia Tıp Üniversitesi Tıp Bilimi ve Teknolojisi Araştırma Merkezi'nin desteği için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Anestezi makinesi evaporatörüNorvap20-17368
  IsofluraneSigma-Aldrich (Şangay) Ticaret Co.Ltd.
792632 70 μ m hücre süzgeciXIYAN Co., Ltd.15-1070
Alexa Fluor 700 anti-fare CD45 AntikorBiolegend103128
APC anti-fare CD4 AntikorBiolegend100616
Otomatik hücre sayacıJiangsu JIMBIO technology Co., LTDJIMBIO iCyta S2
BD * Sitometrik Boncuk Dizisi (CBA) Fare Th1 / Th2 / Th17 CBA KitiBD Biosciences560485
Biotin anti-fare CD16 / 32 AntikorBiolegend101303
Brilliant Violet 510 anti-fare CD69 AntikorBiolegend104532
BV786 Sıçan Anti-Fare CD62L (MEL-14)BD Pharmingen563109
Sütun Dokusu ve Hücre Protein Ekstraksiyon KitiŞangay Epizyme Biyomedikal Technology Co, LtdPC201Plus
Komple Freund'un AdjuvanıSigma-Aldrich (Şangay) Ticaret Co.Ltd. 
KurutucuDIAPATHDonatello
Tek kullanımlık sterilize şırınga (1 mL)Yikang Group210820
Tek kullanımlık sterilize şırınga (2,5 mL)Yikang Group210820
Tek kullanımlık sterilize şırınga (5 mL)Yikang Group210820
Boyama makinesiDIAPATHGiotto
Gömme makinesiWuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-P5
EtanolSCRC100092683
Fetal Sığır SerumuProcell Yaşam Bilimleri ve Teknoloji Co., Ltd.FSP500
FITC Hamster Anti-Fare CD3e (145-2C11)BD Pharmingen553062
Akış sitometresiBecton, Dickinson ve ŞirketiFACSCelesta
Akış sitometresiBecton, Dickinson ve ŞirketAccuri C6
Flow Jo yazılımıBD Biosciences10.8.1
Donmuş platformWuhan Junjie Electronics Co., ve Tic. Ltd. Şti.JB-L5
Cam kaydırakServicebioG6004
HE boya solüsyon setiServicebioG1003
Hematoksilen-Eozin çözeltisiServicebioG1002
Yüksek hızlı soğutmalı santrifüjThermo Fisher ScientificMogafugo8R
Görüntüleme sistemiNikonNIKON DS-U3
Luxol hızlı mavi boyama kitiServicebioG1030
Ms CD44 BV421 IM7BD Pharmingen564970
Mycobacterium tuberculosis H37RABD Pharmingen231141
Miyelin oligodendrosit glikoprotein (MOG35-55)AnaSpecAS-60130-1
Nötr sakızSCRC10004160
DüzenleyiciKEDEEKD-P
FırınLaboteryGFL-230
Patoloji dilimleyiciLeicaRM2016
Bordetella pertussisSigma-Aldrich (Şangay) Ticaret Co.LtdP7208
Fosfat tamponlu tuzlu suServicebioG4202
Pipet 0.5-10 μ LDLAB Bilimsel7010101004
Pipeti 100-1000 μ LDLAB Bilimsel7010101014
Pipet 20-200 μ LDLAB Bilimsel7010101009
RPMI-1640Procell Yaşam Bilimleri & Teknoloji Co., Ltd.
Tee valfGuangdong Kanghua Medical Co., LTDA06
Doku yayıcıZhejiang Kehua Instrument Co., LtdKD-P
Dik optik mikroskopNikonNIKON ECLIPSE E100
KsilenSCRC10023418
SLCH4887 Toksin.PM150110

Kaynaklar

  1. Swanberg, K., et al. Multiple sclerosis diagnosis and phenotype identification by multivariate classification of in vivo frontal cortex metabolite profiles. Sci Rep. 12 (1), 13888(2022).
  2. Zahoor, I., et al. An emerging potential of metabolomics in multiple sclerosis: a comprehensive overview. Cell Mol Life Sci. 78 (7), 3181-3203 (2021).
  3. Vitturi, B., et al. Spatial and temporal distribution of the prevalence of unemployment and early retirement in people with multiple sclerosis: A systematic review with meta-analysis. PloS one. 17 (7), 0272156(2022).
  4. Brambilla, R. The contribution of astrocytes to the neuroinflammatory response in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. Acta neuropathologica. 137 (5), 757-783 (2019).
  5. Niedźwiedzka-Rystwej, P., Tokarz-Deptuła, B., Deptuła, W. Characteristics of T lymphocyte subpopulations. Postepy Hig Med Dosw. 67, 371-379 (2013).
  6. Loos, J., et al. Functional characteristics of Th1, Th17, and ex-Th17 cells in EAE revealed by intravital two-photon microscopy. J neuroinflammation. 17 (1), 357(2020).
  7. Prajeeth, C., et al. Effectors of Th1 and Th17 cells act on astrocytes and augment their neuroinflammatory properties. J neuroinflammation. 14 (1), 204(2017).
  8. Nielsen Birgitte, R., et al. Characterization of naïve, memory and effector T cells in progressive multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 310, 17-25 (2017).
  9. Xie, L., et al. The role of CD4+ T cells in tumor and chronic viral immune responses. Med Comm. 4 (5), e390(2023).
  10. Sun, L., et al. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235(2023).
  11. Kawabe, T., et al. Memory-phenotype CD4+ T cells spontaneously generated under steady-state conditions exert innate TH1-like effector function. Sci Immunol. 2 (12), (2017).
  12. Moon, J., et al. A study of experimental autoimmune encephalomyelitis in dogs as a disease model for canine necrotizing encephalitis. J Vet Sci. 16 (2), 203-211 (2015).
  13. Pérez-Nievas, B., et al. Chronic immobilisation stress ameliorates clinical score and neuroinflammation in a MOG-induced EAE in Dark Agouti rats: mechanisms implicated. J neuroinflammation. 7, 60(2010).
  14. Zheng, J., et al. Prostaglandin D2 signaling in dendritic cells is critical for the development of EAE. J Autoimmun. 114, 102508(2020).
  15. Adamczyk, M., et al. The expression of activation markers CD25 and CD69 increases during biologic treatment of Psoriasis. J Clin Med. 12 (20), 6573(2023).
  16. Meng, R., et al. Echinococcus multilocularisIndoleamine 2,3-dioxygenase 1 signaling orchestrates immune tolerance in -infected mice. Front Immunol. 13, 1032280(2022).
  17. Sheinin, M., et al. Suppression of experimental autoimmune Encephalomyelitis in mice by β-Hydroxy β-Methylbutyrate, a body-building supplement in humans. J Immunol. 211 (2), 187-198 (2023).
  18. Ghareghani, M., et al. Hormones in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) animal models. Transl Neurosci. 12 (1), 164-189 (2021).
  19. Pérez-Miralles, F., et al. Clinical impact of early brain atrophy in clinically isolated syndromes. Mult Scler. 19 (14), 1878-1886 (2013).
  20. Nygaard, G., et al. Cortical thickness and surface area relate to specific symptoms in early relapsing-remitting multiple sclerosis. Mult Scler. 21 (4), 402-414 (2015).
  21. Biberacher, V., et al. Atrophy and structural variability of the upper cervical cord in early multiple sclerosis. Mult Scler. 21 (7), 875-884 (2015).
  22. Ma, Y., et al. Epsilon toxin-producing Clostridium perfringens colonize the multiple sclerosis gut microbiome overcoming CNS immune privilege. J Clin Invest. 133 (9), e163239(2023).
  23. Cibrián, D., Sánchez, M. CD69: from activation marker to metabolic gatekeeper. Eur J Immunol. 47 (6), 946-953 (2017).
  24. Clarkson Benjamin, D., et al. Preservation of antigen-specific responses in cryopreserved CD4 and CD8 T cells expanded with IL-2 and IL-7. J Transl Autoimmun. 5, 100173(2022).
  25. Raeber Miro, E., et al. The role of cytokines in T-cell memory in health and disease. Immunol Rev. 283 (1), 176-193 (2018).
  26. Ville, S., et al. Co-stimulatory blockade of the CD28/CD80-86/CTLA-4 balance in transplantation: Impact on memory T cells. Front Immunol. 6, 411(2015).
  27. Natalini, A., et al. OMIP-079: Cell cycle of CD4+ and CD8+ naïve/memory T cell subsets, and of Treg cells from mouse spleen. Cytometry A. 99 (12), 1171-1175 (2021).
  28. Joffre, O., et al. Cross-presentation by dendritic cells. Nat Rev Immunol. 12 (8), 557-569 (2012).
  29. Montes, M., et al. Oligoclonal myelin-reactive T-cell infiltrates derived from multiple sclerosis lesions are enriched in Th17 cells. Clin Immunol. 130 (2), 133-144 (2009).
  30. Feruglio, S., Kvale, D., Dyrhol, R. T. Cell responses and regulation and the impact of in vitro IL-10 and TGF-β modulation during treatment of active tuberculosis. Scand J Immunol. 85 (2), 138-146 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

CD4 T HücreleriMultipl Skleroz ModeliRelaps Remiten EAEİmmün Hücre İnfiltrasyonuMerkezi Sinir SistemiDemiyelinizasyon AnaliziEfektör Bellek T HücreleriTh1 Th17 HücreleriDüzenleyici T Hücreleri

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.