Yöntem makalesi

Küçük moleküllü bileşiğin protein hedef tahmini ve validasyonu

3.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/66564

⸱

23 Şubat 2024

 ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy/School of Modern Chinese Medicine Industry, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Bu makalede

Özet

Burada kullanılan deney, küçük moleküller ve protein hedefleri arasındaki etkileşimi tahmin etmek ve doğrulamak için hücresel termal kayma testi ile birleştirilmiş bir moleküler yerleştirme yöntemini göstermektedir.

Özet

Proteinler insan fizyolojisi için temeldir ve hedefleri araştırma ve ilaç geliştirmede çok önemlidir. Önemli protein hedeflerinin tanımlanması ve doğrulanması, ilaç geliştirmenin ayrılmaz bir parçası haline gelmiştir. Moleküler yerleştirme, özellikle ilaç ve protein hedef etkileşimleri bağlamında, protein-ligand bağlanmasını araştırmak için yaygın olarak kullanılan bir hesaplama aracıdır. Bağlanmanın deneysel olarak doğrulanması ve ilacın ve hedefinin bağlanmasına doğrudan erişmek için hücresel termal kayma testi (CETSA) yöntemi kullanılır. Bu çalışma, ilaçlar ve hayati protein hedefleri arasındaki etkileşimleri tahmin etmek ve doğrulamak için moleküler yerleştirmeyi CETSA ile entegre etmeyi amaçladı. Spesifik olarak, ksantatin ve Keap1 proteini arasındaki etkileşimi ve moleküler yerleştirme analizi yoluyla bağlanma modunu tahmin ettik ve ardından CETSA tahlili kullanılarak etkileşimin doğrulanmasını izledik. Sonuçlarımız, ksantatinin Keap1 proteininin spesifik amino asit kalıntıları ile hidrojen bağları kurabildiğini ve Keap1 proteininin termostabilitesini azaltabildiğini gösterdi, bu da ksantatinin Keap1 proteini ile doğrudan etkileşime girebileceğini gösterdi.

Giriş

Proteinler, canlı organizmalarda son derece önemli makromoleküllerdir ve hücreler içinde zar bileşimi, hücre iskeleti oluşumu, enzim aktivitesi, taşıma, hücre sinyalizasyonu ve hem hücre içi hem de hücre dışı mekanizmalarda yer alma gibi çok çeşitli benzersiz işlevlere sahiptir 1,2,3. Proteinler biyolojik işlevlerini esas olarak diğer proteinler, nükleik asitler, küçük moleküllü ligandlar vemetal iyonları 1,4 dahil olmak üzere çeşitli moleküllerle spesifik etkileşimler yoluyla gösterirler. Ligandlar, bir organizmadaki proteinlere spesifik olarak bağlanan küçük moleküler bileşiklerdir. Proteinler ve ligandlar arasındaki etkileşim, bağlanma cepleri5 olarak da bilinen bağlanma bölgeleri adı verilen protein üzerindeki belirli bölgelerde meydana gelir. Tıbbi kimya araştırmalarında odak noktası, ilaçlar için hedef olarak hizmet eden hastalıklarla açıkça ilişkili olan anahtar proteinlerin belirlenmesinde yatmaktadır6. Bu nedenle, proteinler ve ligandlar arasındaki bağlanma bölgelerinin derinlemesine anlaşılması, ilaç keşfi, tasarımı ve araştırmasının teşvik edilmesinde son derece önemlidir 7,8.

Moleküler yerleştirme, kararlı kompleksler oluştururken birincil bağlanma modlarını ve afinitelerini keşfetmek için proteinlerin ve ligandların üç boyutlu yapılarını kullanan, protein-ligand bağlanmasını incelemek için yaygın olarak kullanılan bir hesaplama aracıdır 9,10,11. Moleküler yerleştirme teknolojisinin uygulanması 1970'lerde ortaya çıkmıştır. Kilit ve anahtar eşleştirme ilkesine dayalı olarak ve moleküler yerleştirme yazılımının algoritmalarını kullanarak, yerleştirme sonuçlarını analiz ederek bileşikler ve moleküler hedefler arasındaki etkileşim belirlenebilir. Bu yaklaşım, hem bileşik hem de hedef molekül için aktif bağlanma bölgelerinin tahmin edilmesini sağlar. Sonuç olarak, bu moleküler etkileşimlerinmekaniğini anlamak için çok önemli olan ligand-reseptör etkileşimleri için optimal bir bağlanma konformasyonunun (burada bağlanma modeli olarak adlandırılır) tanımlanmasını kolaylaştırır 12,13,14,15. Moleküler yerleştirme, ligand-reseptör etkileşimlerinin değerli bilgisayar tabanlı tahminlerini sağlarken, bunların ön bulgular olduğuna dikkat etmek önemlidir. Sonuç olarak, bu etkileşimleri doğrulamak için daha fazla deneysel doğrulama şarttır.

İlk olarak 2013 yılında Pär Nordlund'un araştırma ekibi tarafından önerilen hücresel termal kayma testi (CETSA), ilaç-hedef protein etkileşimlerini doğrulamak için bir yöntem olarak hizmet eder. Bu teknik, ilaç bağlanması ile indüklenen hedef proteinlerin termal stabilitesini spesifik olarak test eder ve moleküler etkileşimleri doğrulamak için pratik bir yaklaşım sağlar 16,17,18. Bu yaklaşım, ligand bağlanmasının hedef proteinler içinde bir termal kayma başlattığı ve hücre lizatları, bozulmamış canlı hücreler ve dokular dahil olmak üzere çok çeşitli biyolojik numunelere uygulanabilir olduğu temel ilkesine dayanmaktadır19,20. CETSA, ligand bağlanması nedeniyle proteinlerin termodinamik stabilizasyonunu tespit ederek ve gözlemlenen fenotipik yanıtı hedef bileşiğebağlayarak bozulmamış hücrelerde küçük moleküllerin doğrudan hedef etkileşimini destekler 21,22. CETSA'dan türetilen çeşitli metodolojiler arasında, Western Blot-CETSA (WB-CETSA) klasik bir yaklaşım olarak kabul edilir. CETSA yöntemi kullanılarak numune hazırlandıktan sonra, hedef proteinin termal stabilitesindeki değişiklikleri tespit etmek için western blot analizi kullanılır. Bu, hücresel sistemler içindeki ilaç-protein etkileşimlerinin kesin olarak belirlenmesine izin verir17,23.

Ksantatin, geleneksel Çin tıbbında nazal sinüzit ve artrit gibi hastalıkları tedavi etmek için kullanılan anti-inflamatuar gibi özelliklere sahip Xanthium L. bitkisinden izole edilen biyoaktif bir bileşiktir24,25. Kelch benzeri ECH ile ilişkili protein 1 (Keap1), Cullin3 bazlı Cullin-RING E3 ubikitin ligaz çok alt birimli protein kompleksinin bir bileşenidir ve hücre içi redoks durumunu modüle ederek inflamatuar yanıtın yoğunluğunu ve süresini etkileyen hücre içi redoks homeostazının önemli bir düzenleyicisidir26. Bu çalışmada, ilk olarak, bağlanma modlarını tahmin etmeyi amaçlayan, ksantatin (küçük moleküllü) ve Keap1 proteini arasındaki etkileşimi araştırmak için moleküler yerleştirme kullandık. Daha sonra, ksantatinin Keap1 proteininin termal stabilitesi üzerindeki etkisini değerlendirerek bu etkileşimi doğrulamak için CETSA yöntemini kullandık.

Protokol

1. Xanthatin ve Keap1 yapılarının indirilmesi

  1. PubChem veritabanını (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) açın, ksantatın (küçük molekül) girin, ardından Ara'ya basın ve İlk Sonuç'a tıklayın. Bileşiği .sdf formatında kaydetmek için İndir'e tıklayın ve 2B yapı altında Kaydet'e tıklayın.
  2. Proteinin kristal yapısını indirin.
    1. UniProt veritabanını (https://www.uniprot.org/) açın, Keap1 girin ve Ara'ya tıklayın. Sol sütundaki popüler organizmalar altında İnsan'a tıklayın ve ardından sağ sütundaki Q14145 Adlı İlk Giriş'e tıklayın.
    2. Sol sütundaki fonksiyonun altındaki Yapı'ya tıklayın, PDB ID: 2FLU olan yapıyı bulun ve RCSB-PDB'ye tıklayın. Keap1 proteininin kristal yapısını indirmek için Dosyaları İndir'e tıklayın ve PDB Formatını seçin.

2. Moleküler yerleştirme

  1. Masaüstünde molecular docking adında yeni bir klasör oluşturun ve indirilen ksantatin (küçük moleküllü) ve Keap1 (protein) yapılarını bu klasöre kaydedin.
    NOT: Klasör adı ve yolu İngilizce olmalıdır.
  2. Maestro yazılımını açın, Dosya'ya tıklayın, Çalışma Dizinini Değiştir'i seçin, Masaüstü'ne tıklayın, yeni oluşturulan moleküler yerleştirme klasörünü seçmek için çift tıklayın ve Seçenekleri Seç'e tıklayın.
  3. Küçük molekül işleme
    1. Dosya ve yapı seçeneklerini içe aktar'a tıklayın, Masaüstü'ne tıklayın, moleküler yerleştirme klasörüne çift tıklayın, xanthatin Yapı Dosyası'na tıklayın ve ardından küçük molekül dosyasını içe aktarmak için Aç'a tıklayın.
    2. Yazılımın sağ üst köşesindeki Görevler'e tıklayın ve LigPrep seçeneğini seçin. Çalışma alanındaki yapıları kullanın; parametrelerin geri kalanı varsayılan parametrelerdir ve küçük molekül işlemeyi gerçekleştirmek için Çalıştır'a tıklayın.
  4. Protein yapısı işleme
    1. File and Import Structures (Dosya ve Yapıları İçe Aktar) seçeneklerini tıklatın, Desktop'ı (Masaüstü) tıklatın ve Molecular Docking (Moleküler Yerleştirme) klasörüne çift tıklayın. Keap1 Protein Yapısı dosyasına tıklayın ve ardından protein yapısı dosyasını içe aktarmak için Aç'a tıklayın.
    2. Yazılımın sağ üst köşesindeki Görevler'e tıklayın ve Protein Hazırlama Sihirbazı seçeneğini seçin. Het Gruplarından 5 Å'nin Üzerindeki Suları Silmeden Önce kutuyu işaretleyin ve 7.4 +/- 0.0 pH değerini girin. Ön İşlem'i tıklatın, İyileştir'i tıklatın ve sonra En İyileştir'i tıklatın > Suları Kaldır'ı > Küçült'ü tıklatın.
    3. Önceki görev tamamlandığında bir sonraki göreve tıklayın. Görevler'e tıklayın ve Site Haritası seçeneğini belirleyin, tüm parametreler için varsayılan ayarları kullan ve Çalıştır'a tıklayın.
    4. Dosya ve Yapıları İçe Aktar seçeneklerine tıklayın, Masaüstü'ne tıklayın, moleküler yerleştirme klasörüne çift tıklayın ve sitemap_1 adlı klasörü açın. Sitemap_1_out.maegz adlı ilk dosyaya tıklayın ve ardından Aç'a tıklayın.
    5. Çalışma alanında sitemap_1_protein seçmek için noktaya çift tıklayın ve ardından seçmek için Sitemap_1_site_1 tıklayın. Görevler'e tıklayın ve Receptor Grid Generation (Alıcı Izgarası Oluşturma ) seçeneğini belirleyin.
      NOT: Site haritası tarafından tahmin edilen protein siteleri, en yüksek puan alan site ilk sırada olacak şekilde puanlamaya göre sıralanır.
    6. Alıcı altındaki Giriş seçeneğini seçin, kalan parametreler değişmeden kalır. Varsayılan boyutta bir yerleştirme kutusu oluşturmak için protein yapısındaki Küçük Beyaz Top'a tıklayın ve iş adını glide-grid_2FLU olarak değiştirin. Çalıştır'a tıklayın.
  5. Moleküler yerleştirme
    1. Görevler'e tıklayın ve Ligand Yerleştirme seçeneğini seçin. Dosyadan Receptor Grid As (Alıcı Izgarası) seçeneğini seçin ve Browse (Gözat) düğmesini tıklatın. Masaüstü'ne tıklayın, moleküler yerleştirme klasörüne çift tıklayın, glide-grid_2FLU dosyasına çift tıklayın, Glide-grid_2FLU.zip dosyasına tıklayın ve ardından Aç'a tıklayın.
    2. Masaüstüne göz atmak > Dosyalardan Ligandları Kullan'> tıklayın. Moleküler yerleştirme klasörüne çift tıklayın, ligprep_1 dosyasına çift tıklayın, Ligprep_1-out.maegz dosyasına tıklayın ve ardından Aç'a tıklayın.
    3. Ayarlar'a tıklayın ve XP olarak Hassasiyet (ekstra hassasiyet) seçeneğini belirleyin, iş adını kayma-dock_XP_2FLU olarak değiştirin ve Çalıştır'a tıklayın.
  6. Yerleştirme sonuçlarını görüntüleme
    1. File and Import Structures (Dosya ve Yapıları İçe Aktar) seçenekleri'ne tıklayın, Desktop'a tıklayın ve Molecular Docking klasörüne çift tıklayın. glide-dock_XP_2FLU dosyasına çift tıklayın, glide-dock_XP_1_pv.maegz dosyasına tıklayın ve ardından Aç'a tıklayın.
    2. Çalışma alanında ligand'ı seçmek için noktaya çift tıklayın ve ardından sitemap_1_protein'yi seçmek için tıklayın. Tablo'ya tıklayın, en sağa kaydırın ve yerleştirme puanı altında puanı görüntüleyin.
  7. 2D sonuçların görselleştirilmesi
    1. Çalışma alanında ligandı seçmek için noktaya çift tıklayın ve ardından sitemap_1_protein seçmek için de tıklayın. Ligand Etkileşim > Görünümü'ne tıklayın ve LID gösterge kutusunu işaretleyin.
    2. Dosya'ya tıklayın, Ekran Görüntüsünü Kaydet'i seçin, genişliğe 6000 girin, Şeffaf Arka Plan kutusunun işaretini kaldırın ve Tamam'ı tıklayın. Masaüstüne tıklayın, dosyayı 2D-xanthatin-2FLU olarak adlandırın ve görüntüyü kaydedin.
  8. 3D sonuçların görselleştirilmesi
    1. Çalışma alanında ligandı seçmek için noktaya çift tıklayın ve ardından sitemap_1_protein seçmek için de tıklayın.
    2. Küçük molekülleri seçmek için Hızlı Seçim'de L'yi tıklatın ve sonra Stil'i tıklatın. Küçük molekül bağının boyutunu değiştirmek için stildeki İkinci Satıra tıklayın ve küçük molekül rengini değiştirmek için renk atomlarına tıklayın.
    3. Şekildeki küçük molekülü seçin, farenin sağ tuşuna tıklayın, Seçimi Genişlet'i seçin ve 4 Å'yi seçin. Etiketleri görüntülemek için Etiketleri stil olarak uygula'yı tıklatın.
    4. Amino asit bağlarının boyutunu değiştirmek için stildeki ikinci satıra tıklayın ve amino asit rengini değiştirmek için Renk Atomlarına tıklayın.
    5. Sonraki > Ters Çevir'e tıklayın, kontrol tuşunu basılı tutun ve yalnızca etiketli amino asitleri göstermek için stil altındaki ilk göz konumuna tıklayın.
    6. Proteini şerit stili olarak göstermek için Kurdele Stili > 'a tıklayın ve kurdele rengini değiştirmek için kurdelelerin altındaki Kurdele Düzenle'ye tıklayın.
    7. Ekranın sağ alt köşesindeki Etkileşimler Geçişi'ne tıklayın, farenin sağ tuşuna tıklayın ve kişilerin/çakışmaların işaretini kaldırın.
    8. Görevlerde ölçü için arama yapın, Mesafe'yi seçin ve hidrojen bağlarının uzunluklarını ölçmek için ekrandaki sarı noktalı çizgi (hidrojen bağı) ile bağlanan iki atoma tıklayın.
    9. Proteini döndürmek, proteini ekranın ortasına ayarlamak ve her amino asit etiketinin görünür olduğundan emin olmak için farenin tekerleğini basılı tutun.
    10. Çalışma Alanı'na tıklayın > Resmi Farklı Kaydet'e tıklayın ve masaüstüne tıklayın. Görüntüyü varsayılan olarak 600dpi olarak kaydedin, dosyayı 3D-xanthatin-2FLU olarak adlandırın, dosya türünü tiff formatı olarak seçin ve görüntüyü kaydedin.

3. Hücre kültürü ve CETSA numune hazırlama

  1. Hücre kültürü
    1. 100 mm'lik bir kültür kabına 5 x 106 RAW264.7 hücre / mL ekleyin ve 37 ° C,% 95 nem ve% 5 CO2'de% 10 FBS ve% 1 antibiyotik-antimikotik çözelti içeren 6 mL DMEM ortamı ile inkübe edin. Üç yemek hazırlayın ve hücreler% 80 birleşmeye ulaştığında deneyi gerçekleştirin.
  2. CETSA numune hazırlama
    1. Eski ortamı aspire edin, her yemeğe oda sıcaklığına ısıtılmış 2 mL fosfat tampon salin (PBS) ekleyin ve 2 kez yıkayın.
    2. Her bir hücre kabına 2 mL PBS ekleyin, hücreleri karıştırın ve hücreleri iki adet 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne toplayın. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 377 x g'da santrifüjleyin.
    3. Süpernatanı atın ve hücreleri% 1 Geniş spektrumlu proteaz inhibitör karışımları içeren 2 mL PBS ile yeniden süspanse edin. Her birinde 1 mL hücre süspansiyonu bulunan ayrı mikrosantrifüj tüplerine bölün.
    4. Mikrosantrifüj tüplerini beyaz katı olana kadar sıvı nitrojen içinde dondurun, ardından hemen 37 °C'lik bir su banyosunda çözdürün ve 3 kez tekrarlayın. 12.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
    5. Biri 100 μM ksantatin ve diğeri eşit hacimde DMSO içeren iki mikrosantrifüj tüpü alın ve her tüpe 450 μL santrifüjlenmiş süpernatan ekleyin, 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
    6. İki mikrosantrifüj tüpünden süpernatanı 60 μL / tüp hacminde 14 PCR tüpüne ekleyin ve tüpleri aynı anda değişen sıcaklıklarda (45 °C, 48 °C, 51 °C, 54 °C, 57 °C, 60 °C ve 63 °C) 3 dakika boyunca, DMSO ve ksantatin grupları için her sıcaklıkta iki PCR tüpü ile, sırasıyla.
    7. Isıtılmamış grup için, iki mikrosantrifüj tüpünün her birinden süpernatan alın ve her biri 60 μL'lik bir hacimde DMSO grubu için 7 ve ksantatin grubu için 7 olmak üzere 14 PCR tüpüne ekleyin. Numuneleri burada ısıtmayın.
    8. Isıtılmış grup için tüpleri oda sıcaklığında soğutun. Tüm tüpleri (ısıtılmış ve ısıtılmamış) 12.000 x g'da 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin ve her tüpten 48 μL süpernatant yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne alın. Her tüpe 12 μL SDS-PAGE protein yükleme tamponu ekleyin, iyice karıştırmak için girdap yapın ve 100 ° C'de 5 dakika boyunca bir su banyosunda ısıtın.
      NOT: Hazırlanan CETSA numuneleri -80 °C'de saklanmalı ve 1 hafta içinde western blot ile test edilmelidir.

4. Batı lekesi

  1. SDS-PAGE jelin hazırlanması
    1. Bir uzun ve bir kısa cam plakayı ultra saf suyla durulayın. Plakaları sıkıştırma yuvasına, ardından şeffaf bir tahtaya yerleştirin. Ultra saf su ekleyin ve 10 dakika boyunca sızıntı kontrolü yapın.
    2. Konik bir şişeye 8 mL düşük jel çözeltisi ve 8 mL düşük jel tamponu ekleyin ve hafifçe çalkalayarak karıştırın. Jel çözeltisine 160 μL pıhtılaştırıcı arttırıcı ekleyin ve iyice karıştırın.
      NOT: Alt yapışkan tabakasının hacmi, sıkıştırma yuvasındaki yeşil çizgiyi aşmamalıdır.
    3. Plakalardaki ultra saf suyu boşaltın ve filtre kağıdı ile kurulayın. Hazırlanan alt jel çözeltisini ekleyin. 2 mL izopropil alkol ekleyin ve katılaşma için 20 dakika bekleyin.
    4. 2 mL üst jel solüsyonu ve 2 mL üst jel tamponunu konik bir şişeye alın ve şişeyi hafifçe sallayarak karıştırın.
    5. İzopropil alkolü jel tabakasından çıkarın ve fazla izopropil alkolü filtre kağıdı ile kurulayın.
    6. Karışık üst jel solüsyonuna 40 μL pıhtılaştırıcı arttırıcı ekleyin, iyice karıştırın, ardından uzun ve kısa cam plakaların arasına ekleyin ve 1,5 mm 15 delikli bir tarak yerleştirin, 20 dakika bekleyin.
      NOT: Tarak, tarak ile çözelti arasında hava kabarcığı olmayacak şekilde üst katmana dik olarak yerleştirilmelidir.
  2. Elektroforez
    1. Bir behere 1 L ultra saf su ekleyin, bir poşet SDS-PAGE çalışan tampon tozu ekleyin, bir cam çubukla iyice karıştırın ve hazırlanan jeli elektroforez ünitesine ekleyin. Üniteyi kutuya yerleştirin ve tarağı dışarı çekin.
    2. İşaretleyici ve CETSA örneklerini oda sıcaklığında, girdapta çözün ve aşağı döndürün. Önceden belirlenmiş sıraya göre ilk kuyucuğa 2,5 μL işaretleyici ve kalan kuyucukların her birine 20 μL CETSA numunesi ekleyin.
      NOT: CETSA numuneleri, adım 3.2.6'da 45 °C ila 63 °C arasında açıklanan sıcaklık işlemine göre art arda eklenmiştir; önce DMSO grubu, ardından ksantatın grubu eklendi (Şekil 1).
    3. Kalan elektroforez çözeltisini elektroforez ünitesine ekleyin, kapağı kapatın ve elektrodu, pozitif kutbu pozitif kutba, negatif kutbu negatif kutba yerleştirin.
    4. Güç anahtarını AÇIN ve elektroforezi başlatmak için voltaj anahtarını 80 V'a ayarlayın.
  3. Membrana transfer
    1. Bir behere 850 mL ultra saf su, 100 mL susuz etanol ve 50 mL hızlı transfer tamponu ekleyin ve iyice karıştırın. Köpük levha, plastik bıçaklar, cımbız, tepsiler ve membran transfer cihazları hazırlayın.
    2. PVDF membranını jelin boyutuna göre kesin, işaretleyin ve etkinleştirmek için 30 saniye metanolde bekletin.
    3. Transfer solüsyonunu tepsiye dökün, transfer kelepçelerini yerleştirin ve açın ve bir sünger ped ve üç kat transfer filtre kağıdı yerleştirin.
    4. Elektroforezi durdurun ve ardından elektroforez kutusunun kapağını açın. Elektroforez cihazını alın, elektroforez solüsyonunu dökün ve plakayı çıkarın. Plakayı köpük levhanın üzerine yerleştirin, plastik bir bıçakla nazikçe kaldırın ve protein işaretleyicisini ve hedef proteinleri net bir şekilde görselleştirmek için jeli kesin.
    5. İşaretleyicinin bir tarafını cımbızla tutun, transmembran solüsyonu içeren bir tepside yıkayın ve filtre kağıdının üzerine düz bir şekilde koyun. Aktive edilmiş PVDF membranını transfer solüsyonuna batırın, etiketli tarafı cımbızla tutun ve jeli yüzü aşağı bakacak şekilde kapatın.
      NOT: PVDF membranın işaretli tarafı ön taraftır ve yerleştirme işlemi sırasında kabarcık oluşmamasına dikkat edin.
    6. PVDF membranının üzerine iki kat transfer filtre kağıdı ve bir kat sünger ped yerleştirin, transfer klipslerini kapatın ve sıkıştırın ve transfer tankına koyun.
      NOT: Aktarım klipsinin siyah rengi, aktarım yuvasının siyah rengine.
    7. Kalan transmembran çözeltisini transmembran kasete ekleyin, kapakla kapatın, pozitiften pozitife, negatiften negatife.
    8. Akımı 400 mA'ya, süreyi 30 dakikaya ayarlayın ve ardından membranı oda sıcaklığında aktarmaya başlamak için Çalıştır'a basın.
  4. Engelleme
    1. Bir cam şişeye 2 L ultra saf su ekleyin, bir poşet TBS tozu ekleyin ve ardından TBST çözeltisi yapmak için 2 mL Tween ekleyin. TBST ile% 5'lik bir BSA çözeltisi hazırlamak için BSA tozunu tartın ve inkübasyon kutusuna 6 mL BSA çözeltisi ekleyin.
    2. Membran transferini durdurun ve ardından transfer klipsini açın. PVDF membranının işaretleyici tarafını sıkıştırın ve inkübasyon kutusuna yerleştirin. Kuluçka kutusunu bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin ve oda sıcaklığında 1,5 saat bloke edin.
  5. Primer antikorun inkübasyonu
    1. Primer antikoru 1:1000'de% 5 BSA solüsyonu ile hazırlayın (ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakınız), BSA solüsyonunu inkübatör kutusunda geri dönüştürün ve inkübasyon kutusuna 6 mL primer antikor ekleyin. Kuluçka kutusunu buz paketleri olan bir köpük kutuya yerleştirin ve gece boyunca bir çalkalayıcı üzerinde tutun.
  6. İkincil antikorun inkübasyonu
    1. Ertesi gün inkübasyon kutusunda birincil antikoru toplayın, ardından 6 mL TBST çözeltisi ekleyin ve 5 dakika boyunca yıkamak için bir çalkalayıcı üzerine koyun.
    2. Yıkanmış TBST çözeltisini dökün ve yıkamak için taze ekleyin; 5x'i tekrarlayın ve ikincil antikoru 1:5000'de% 5 BSA çözeltisi ile hazırlayın.
    3. TBST çözeltisini dökün ve inkübasyon kutusuna 6 mL ikincil antikor ekleyin. Kuluçka kutusunu bir çalkalayıcıya yerleştirin ve oda sıcaklığında 1,5 saat inkübe edin.
    4. İkincil antikoru toplayın (ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın), ardından 6 mL TBST çözeltisi ekleyin ve 5 dakika boyunca yıkamak için bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Yıkanmış TBST çözeltisini dökün ve yıkamak için taze ekleyin; 5x tekrarlayın.
  7. Şeritlerin açığa çıkarılması
    1. TBST solüsyonunu son yıkamanın sonunda saklayın. Eşit hacimlerde kemilüminesan reaktifler A ve B alın, çalkalayın ve iyice karıştırın. Çözeltiyi ışıktan koruyun.
    2. Jel görüntüleme sistemini açın, Numuneler'e tıklayın, kalibrasyonu kontrol edin, kalibrasyonun tamamlanmasını bekleyin ve ardından İşaretleyici'ye tıklayın, kalibrasyonu kontrol edin.
    3. Şeridin işaretleyici tarafını cımbızla alın ve kemilüminesan reaktif çözeltisine tamamen daldırın. Şeridi görüntüleyiciye yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirmek için işaretleyicinin bir tarafını sıkıştırın, görüntüleyicinin kapağını kapatın, Pozlama'ya tıklayın ve pozlama süresini 1 s'ye ayarlayın.
      NOT: Geliştirici şeridi tamamen kaplamalı ve geliştirme karanlık bir ortamda olmalıdır.
    4. Kaydet'i tıklatın, görüntüyü adlandırın ve .tif dosyası olarak kaydedin. Batı lekesinin optik yoğunluğunu analiz edin. DMSO grubundaki her bir sıcaklığın gri değerleri 45 °C'lik gri değerleri ile karşılaştırıldı ve ksantatin grubundaki her bir sıcaklığın gri değerleri, 45 °C'deki ksantatinin gri değerleri ile karşılaştırıldı.

Sonuçlar

Moleküler yerleştirme analizi, ksantatin ve Keap1 proteini arasındaki etkileşimi öngördü. Şekil 2 , Gly-367 için 2.17 şve Val-606 için 2.13 şhidrojen bağı uzunluğuna sahip Keap1 proteininin ksantatin ve amino asit kalıntıları Gly-367 ve Val-606 arasındaki hidrojen bağlarının oluşumunu göstermektedir. Ek olarak, -5.69 kcal/mol'lük hesaplanan yerleştirme skoru, ksantatin ve Keap1 proteini arasında iyi bir bağlanma afinitesini gösterir.

CETSA yöntemi, ksantatin bağlanmasının Keap1 proteininin termal stabilitesini değiştirdiğini gösterdi ve ksantatin ile Keap1 proteini21 arasındaki etkileşimi doğruladı. Şekil 3 , ksantatın, DMSO grubuna kıyasla 48 ° C ila 57 ° C sıcaklık aralığında Keap1 proteininin termal stabilitesini önemli ölçüde değiştirdiğini göstermektedir. Eşit numune yüklemesini sağlamak için, ilk olarak, deneyleri gerçekleştirdiğimiz hücre aşılamasının yoğunluğu tutarlıydı; ikinci olarak, DMSO grubundan ve ksantatin grubundan alınan hücre örnekleri, hücre kültürü kaplarında iyice karıştırıldı ve daha sonra iki mikrosantrifüj tüpüne eşit olarak dağıtıldı, bu da tutarlı miktarda hücre numunesi sağladı ve her bir PCR tüpüne eklenen süpernatant hacmi 60 μL idi ve son olarak, Western blot'a yüklenen her numunenin hacmi 20 μL idi, Bu, ısıtılmış numuneler için eşit yükleme sağladı. Yaklaşık 51 °C'den itibaren numunelerde protein bozunması, esas olarak protein yapısındaki değişikliklerden ve yüksek sıcaklıkların neden olduğu hızlandırılmış kimyasal reaksiyonlardan kaynaklanmaktadır. Yukarıdaki sonuçlar, ksantatinin doğrudan Keap1 proteinine bağlanabileceğini göstermektedir.

figure-results-1
Şekil 1: Western blot'un yükleme sırası. Soldan sağa sırayla sıcaklık 45 °C, 48 °C, 51 °C, 54 °C, 57 °C, 60 °C ve 63 °C idi.  İlk şerit bir işaretleyici ile eklendi; her sıcaklık için iki şerit kullanıldı; ilk şerit DMSO grubu, ikinci şerit ise ksantatın grubuydu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Ksantatin ve Keap1 (PDB: 2FLU) proteini arasındaki etkileşim. (A) Keap1'e bağlanan ksantatinin 2B temsili. (B) Ksantatin ve Keap1 proteininin 3D görselleştirilmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Ksantatinin Keap1 proteininin termal stabilitesi üzerindeki etkisi. (A) Ksantatinin Keap1'in termal stabilitesi üzerindeki etkileri CETSA tarafından tespit edildi. (B) Keap1'in optik yoğunlukları, 45 ° C'de elde edilenlere normalize edildi. Veriler ortalama ± SD olarak temsil edilmiştir. İstatistiksel analiz, tek yönlü varyans analizi (tek yönlü varyans analizi) ile gerçekleştirilmiştir. n = 3 olur. *p < 0.05, **p < 0.01, p < 0.001, p < 0.0001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Hastalık hedeflerinin belirlenmesi ve ilaçların keşfi ve geliştirilmesi birbiriyle yakından bağlantılıdır27. Spesifik hedefleri tam olarak hedefleyerek, ilaçlarla ilişkili yan etkileri en aza indirirken aynı zamanda belirli hastalıkları daha etkili bir şekilde tedavi etmek için ilaç adayları geliştirilebilir28,29. En sık kullanılan hedefler protein hedefleridir30. Bununla birlikte, özel protein hedeflerinin tanımlanması,hücreler 30,31 içindeki geniş protein çeşitliliği nedeniyle büyük bir zorluk teşkil etmektedir. Bu yazıda, protein hedeflerini belirlemek ve doğrulamak için moleküler yerleştirmeyi CETSA ile birleştiren bir yaklaşım benimsedik. Sonuçlar, ksantatin ve Keap1 proteini arasında doğrudan bir etkileşim olduğunu ortaya koydu. Bilgisayar teknolojisi ve biyolojik deneylerin entegrasyonu, ilaç ile hedef arasında doğrudan bir etkileşimin varlığını tespit etmek için diğer ilaçların ve protein hedeflerinin araştırılmasında da kullanılabilir. Tahmin ile doğrulamayı birleştiren bu yaklaşım, hem zaman tüketimini hem de ekonomik maliyetleri etkili bir şekilde azaltır. Ayrıca, deney aletlerinin ve malzemelerinin elde edilmesi kolaydır ve işlem süreci karmaşık değildir. Son olarak, CETSA numunelerinin hazırlanması ve test edilmesi kolaydır, bu da numunelerin tekrarlanabilirliğini sağlayan western blot yöntemi ile yapılır.

Deneyimlerimize göre, deneysel prosedürler sırasında özel dikkat gerektiren birkaç kritik husus vardır. İlk olarak, moleküler yerleştirmeden önce protein yapısını seçerken, X-ışını analizi ile çözülen proteinin kristal yapısını seçmek önemlidir. İkinci olarak, hücre yoğunluğu ve donma/çözülme süresi CETSA deneylerinde çok önemli faktörlerdir. Logaritmik büyüme fazındaki hücreler, büyüme durumları stabil olduğundan ve deney sonuçları üzerinde minimum etkiye sahip olduğundan CETSA deneyleri için seçilmelidir. Hücrelerin tekrar tekrar dondurulması ve çözülmesi sırasında, beyaz bir katı forma girene kadar dondurma için kullanılan sıvı nitrojen ile zamanlama iyi kontrol edilmeli, ardından sonraki dondurma döngülerinden önce oda sıcaklığında hemen çözülmelidir. Son olarak, protein bozulmasını önlemek için CETSA numuneleri hazırlandıktan sonra western blot deneyleri derhal tamamlanmalıdır.

Moleküler yerleştirme ve CETSA, ilaç geliştirme alanında çok önemli bir rol oynayan köklü tekniklerdir. Moleküler yerleştirme, bileşikler ve hedefleri arasındaki moleküler düzeydeki etkileşimleri tahmin etmede etkilidir ve potansiyel bağlanma modları hakkında değerli bilgiler sunar10,11. Buna karşılık CETSA, ilaçların protein termal stabilitesi üzerindeki etkisini değerlendirmeye odaklanır ve ilaç-protein etkileşimlerini doğrulamak için bir araç olarak hizmet eder17. CETSA, doğrulama için nispeten basit bir yöntem olsa da, aynı zamanda ilaç-protein kompleksinin termal kaymasının incelenmesi için western blot kullanarak düşük verimli bir yoldur ve güvenilen tek teknik olmamalıdır. Ek olarak, CETSA'nın adımları karmaşıktır ve işlem sırasında herhangi bir adım hatasının sonuçlar üzerinde büyük bir etkisi olabilir. Ayrıca, CETSA yöntemi, bileşiğin protein hedefine spesifik bağlanma bölgesini ve bağlanma modunu belirleyemez ve bağlanmanın kovalent mi yoksa kovalent olmayan mı olduğunu gösteremez 17,18,23. Termal kayma tahlilinin ötesinde, pH'a bağlı protein çökeltmesi (pHDPP) gibi diğer enerjik tahlil türleri de ligand-protein etkileşimlerinin incelenmesi için kullanılabilir32. Ayrıca, termal proteom profillemesi, ligand-protein etkileşimlerini ortaya çıkarmak için enerji tabanlı bir yöntemdir ve proteomikleri CETSA33 ile birleştirerek protein-ilaç etkileşimlerinin yüksek verimli, büyük ölçekli analizine olanak tanır.

Ek olarak, lokalize yüzey plazmon rezonansı (LSPR) daha fazla kalitatif ve kantitatif analiz sağlayabilir34,35. Sadece bir ilaç ile hedefi arasındaki etkileşimlerin varlığını belirlemekle kalmaz, aynı zamanda bu moleküller arası etkileşimlerin afinite parametrelerini ve kinetik parametrelerini ölçerek daha kapsamlı bir anlayış sunar.

Termal kayma testinin ötesinde, pH'a bağlı protein çökeltmesi (pHDPP), ligand-protein etkileşimlerinin incelenmesi için de kullanılabilir32. Moleküler yerleştirme, küçük moleküller ve biyomoleküller arasındaki etkileşimleri tahmin etmek için fiziko-mekanik tabanlı bir simülasyon yöntemidir. Bu yöntem, küçük moleküllerin konformasyonunu ve yönelimini optimize ederek ve biyomoleküller arasında en iyi tamamlayıcılığı üreterek bağlanmayı sağlamayı amaçlar. Hedef tahmini, küçük moleküller ve biyomoleküller arasındaki bağlanma bölgelerini tahmin etmek için yapay zeka tekniklerini kullanır. İki yaklaşım, yöntem uygulaması ve tahmin doğruluğu açısından önemli farklılıklara sahiptir. Yöntem uygulaması: moleküler yerleştirme, esas olarak ilaç tasarımı ve optimizasyonu için kullanılır ve yeni ilaç keşfi için teorik bir temel sağlar. Hedef tahmini, daha gelişmiş yapay zekanın yardımıyla, ilaç keşfinin verimliliğini artırmak için yüksek verimli taramaya ve kurşun bileşiklerinin hızlı keşfine daha sık uygulanır. Tahmin doğruluğu: Moleküler yerleştirme fiziksel simülasyonlara dayandığından, tahmin doğruluğu daha yüksektir, ancak hesaplama maliyeti de nispeten yüksektir. Hedef tahmin daha düşük bir hesaplama maliyetine sahip olsa da, tahmin doğruluğu eğitim verilerinin bolluğuna ve model seçimine bağlıdır.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82004031) ve Sichuan Bilim ve Teknoloji Programı (2022NSFSC1303) tarafından desteklenmiştir. Chengdu Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi, Yenilikçi Çin Tıbbı ve Eczacılık Enstitüsü'nden Jiayi Sun'a batı lekesine yardım ettiği için büyük takdirimizi sunuyoruz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.45 μ m Poliviniliden florür membranKırlangıçPR05509
Susuz etanolChron kimyasalları64-17-5
Sığır serum albüminiBioFroxx4240GR100
Geniş spektrumlu proteaz inhibitör karışımlarıBoster Biological Technology Co., LtdAR1193
DMSOBoster Biological Technology Co., LtdPYG0040
Geliştirilmiş kemilüminesans reaktifiBeyotime Biotechnology Co., LtdP0018S
GAPDH antikoruProteinTech Group Co., Ltd10494-1-AP
Jel Görüntüleme CihazıE-BLOTDokunmatik Görüntüleyici Pro
Gradient PCR cihazıBiometra TADVANCEDBiometra Tadvanced 96SG
Yüksek hızlı dondurma santrifüjüBeckman CoulterAllegra X-30R
Yaban turpu peroksidaz konjuge afiniSaf keçi antikoruProteinTech Group Co., LtdSA00001-2
İzopropil alkol Kron kimyasalları67-63-0
Keap1 antikoruZen BioScience Co., LtdR26935
Metal banyoAnalytik JenaTSC
MetanolChron kimyasalları67-56-1
Ncmblot hızlı transfer tamponu (20 kez;)NCM Biotech Co., LtdWB4600
Omni-Easy OneStep PAGE jel hızlı hazırlama kieEpizyme Biotech Co., LtdPG212
Fosfat tamponu salinBoster Biological Technology Co., LtdPYG0021
Önceden Boyanmış Renkli Protein İşaretleyiciBiosharp BL741A
Protein Lekeleme Elektroforez SistemiBio-RadMiniPROTEANÒ Tetra Cell
RAW264.7 hücresiBeyotime Biotechnology Co., LtdC7505
RAW264.7 hücreye özgü ortamProcell Life Science & Technology Co., LtdCM-0597
SDS-PAGE protein yükleme tamponuBoster Biological Technology Co., LtdAR1112-10
SDS-PAGE çalışan tampon tozuServicebioG2018
Tris tamponlu tuzlu su tozuServicebioG0001
Tween 20BioFroxx1247ML100
Su banyosuMemmertWNE10
Su arıtma cihazıMilliporeMilli- IQ 7005
XanthatinChemConst Biotechnology Co., LtdCONST210706

Kaynaklar

  1. Soleymani, F., Paquet, E., Viktor, H., Michalowski, W., Spinello, D. Protein-protein interaction prediction with deep learning: A comprehensive review. Computat Struct Biotechnol J. 20, 5316-5341 (2022).
  2. Du, X., et al. Insights into protein-ligand interactions: mechanisms, models, and methods. Int J Mol Sci. 17 (2), 144(2016).
  3. Wu, Q., Peng, Z., Zhang, Y., Yang, J. COACH-D: improved protein-ligand binding sites prediction with refined ligand-binding poses through molecular docking. Nucleic Acids Res. 46, W438-W442 (2018).
  4. Zhang, F., et al. PROBselect: accurate prediction of protein-binding residues from proteins sequences via dynamic predictor selection. Bioinfo. 36, i735-i744 (2020).
  5. Kandel, J., Tayara, H., Chong, K. T. PUResNet: prediction of protein-ligand binding sites using deep residual neural network. J Cheminfo. 13 (1), 65(2021).
  6. Dhakal, A., Mckay, C., Tanner, J. J., Cheng, J. Artificial intelligence in the prediction of protein-ligand interactions: recent advances and future directions. Brief Bioinform. 23 (1), 476(2022).
  7. Hatty, C. R., Banati, R. B. Protein-ligand and membrane-ligand interactions in pharmacology: the case of the translocator protein (TSPO). Pharmacol Res. 100, 58-63 (2015).
  8. Chaires, J. B. Calorimetry and thermodynamics in drug design. Ann Rev Biophys. 37, 135-151 (2008).
  9. Huang, S. Y., Zou, X. Advances and challenges in protein-ligand docking. Int J Mo Sci. 11 (8), 3016-3034 (2010).
  10. Li, J., Fu, A., Zhang, L. An overview of scoring functions used for protein-ligand interactions in molecular docking. Interdiscip Sci. 11 (2), 320-328 (2019).
  11. Crampon, K., Giorkallos, A., Deldossi, M., Baud, S., Steffenel, L. A. Machine-learning methods for ligand-protein molecular docking. Drug Discov Today. 27 (1), 151-164 (2022).
  12. Pinzi, L., Rastelli, G. Molecular docking: Shifting paradigms in drug discovery. Int J Mol Sci. 20 (18), 4331(2019).
  13. Abdolmaleki, A., Ghasemi, F., Ghasemi, J. B. Computer-aided drug design to explore cyclodextrin therapeutics and biomedical applications. Chem Biol Drug Des. 89 (2), 257-268 (2017).
  14. Chen, G., Seukep, A. J., Guo, M. Recent advances in molecular docking for the research and discovery of potential marine drugs. Mar Drugs. 18 (11), 545(2020).
  15. Li, T., Guo, R., Zong, Q., Ling, G. Application of molecular docking in elaborating molecular mechanisms and interactions of supramolecular cyclodextrin. Carbohydr Polym. 276, 118644(2022).
  16. Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
  17. Tu, Y., Tan, L., Tao, H., Li, Y., Liu, H. CETSA and thermal proteome profiling strategies for target identification and drug discovery of natural products. Phytomedicine. 116, 154862(2023).
  18. Dai, L., et al. Horizontal cell biology: Monitoring global changes of protein interaction states with the proteome-wide cellular thermal shift assay (CETSA). Annu Rev Biochem. 88, 383-408 (2019).
  19. Lade, D. M., Nicoletti, R., Mersch, J., Agazie, Y. M. Design and synthesis of improved active-site SHP2 inhibitors with anti-breast cancer cell effects. Eur J Med Chem. 247, 115017(2023).
  20. Jiang, X., et al. Novel chemical-structure TPOR agonist, TMEA, promotes megakaryocytes differentiation and thrombopoiesis via mTOR and ERK signalings. Phytomedicine. 110, 154637(2023).
  21. Mateus, A., et al. Thermal proteome profiling for interrogating protein interactions. Mol Syst Biol. 16 (3), 9232(2020).
  22. Sanchez, T. W., et al. Real-time cellular thermal shift assay to monitor target engagement. ACS Chem Biol. 17 (9), 2471-2482 (2022).
  23. Tolvanen, T. A. Current advances in CETSA. Front Mol Biosci. 9, 866764(2022).
  24. Liu, M., et al. Xanthatin inhibits STAT3 and NF-κB signalling by covalently binding to JAK and IKK kinases. J Cell Mol Med. 23 (6), 4301-4312 (2019).
  25. Liu, Y., Chen, W., Zheng, F., Yu, H., Wei, K. Xanthatin alleviates LPS-Induced inflammatory response in RAW264.7 macrophages by Inhibiting NF-κB, MAPK and STATs activation. Molecules. 27 (14), 4603(2022).
  26. Dinkova-Kostova, A. T., Kostov, R. V., Canning, P. Keap1, the cysteine-based mammalian intracellular sensor for electrophiles and oxidants. Arch Biochem Biophys. 617, 84-93 (2017).
  27. Tabana, Y., Babu, D., Fahlman, R., Siraki, A. G., Barakat, K. Target identification of small molecules: An overview of the current applications in drug discovery. BMC Biotechnol. 23 (1), 44(2023).
  28. Schenone, M., Dančík, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery. Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).
  29. Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
  30. Chakraborty, C., et al. SARS-CoV-2 protein drug targets landscape: A potential pharmacological insight view for the new drug development. Expert Rev Clin Pharmacol. 14 (2), 225-238 (2021).
  31. Ziegler, S., Pries, V., Hedberg, C., Waldmann, H. Target identification for small bioactive molecules: Finding the needle in the haystack. Angew Chem Int Ed Engl. 52 (10), 2744-2792 (2013).
  32. Zhang, X., et al. Highly effective identification of drug targets at the proteome level by pH-dependent protein precipitation. Chem Sci. 13 (42), 12403-12418 (2022).
  33. Zhang, X., et al. A simplified thermal proteome profiling approach to screen protein targets of a ligand. Proteomics. 20, 1900372(2020).
  34. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568(2022).
  35. Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiolacrenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278(2022).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Molek ler KenetlemeH cresel Termal KaymaCETSA AnaliziProtein Ligand Ba lanmasKeap1 ProteiniK k Molek l ValidasyonuSDS PAGEKemil minesans Tespitla Hedef Etkile imi
Küçük moleküllü bileşiğin protein hedef tahmini ve validasyonu
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.