Yöntem makalesi

Tek moleküllü korelasyon kuvveti ve floresan mikroskobu için yerinde nükleozom düzeneği

2.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/66579

⸱

6 Eylül 2024

 ,  ,  , 
1Laboratory of Nanoscale Biophysics and Biochemistry, The Rockefeller University, 2Tri-Institutional PhD Program in Chemical Biology

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu makale, tek moleküllü korelasyon kuvveti ve floresan mikroskobu için nükleozom içeren DNA bağlarının yeniden yapılandırılması için ayrıntılı bir deneysel prosedür sunmaktadır. Ayrıca, kromatin ile etkileşime giren proteinlerin bağlanma davranışını görselleştirmek ve nükleozomların fiziksel özelliklerindeki değişiklikleri analiz etmek için yapılabilecek birkaç aşağı akış deneyini açıklar.

Özet

Nükleozomlar, ökaryotik kromatinin birincil birimini oluşturur ve biyofiziksel özellikleri ve kromatin bağlayıcı proteinlerle etkileşimleri hakkında çok sayıda bilgilendirici tek moleküllü araştırmanın odak noktası olmuştur. Bu çalışmalar için DNA üzerinde nükleozom sulandırması tipik olarak, bir DNA bağı boyunca oluşan nükleozomların yerleşimi ve sayısı üzerinde hassas kontrol sağlayan bir tuz diyaliz prosedürünü içerir. Bununla birlikte, bu protokol zaman alıcıdır ve girdi olarak önemli miktarda DNA ve histon oktameri gerektirir. Alternatif bir strateji sunmak için, histon şaperon Nap1'i kullanan tek moleküllü kuvvet ve floresan mikroskobu için yerinde bir nükleozom sulandırma yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem, kullanıcıların güçlü nükleozom konumlandırma dizilerine ihtiyaç duymadan herhangi bir DNA şablonunda nükleozomları birleştirmesine, talep üzerine nükleozom yoğunluğunu ayarlamasına ve daha az reaktif kullanmasına olanak tanır. Yerinde nükleozom oluşumu saniyeler içinde gerçekleşir ve daha basit bir deneysel iş akışı ve tek moleküllü ölçümlere uygun bir geçiş sunar. Nükleozom mekaniğini araştırmak ve tek tek proteinlerin kromatin üzerindeki davranışını görselleştirmek için iki aşağı akış testinin örnekleri daha fazla açıklanmaktadır.

Giriş

Ökaryotik kromatinin birincil paketleme birimi, ~147 baz çiftinin (bps) DNA'nın bir oktameri çekirdek histon proteinleri 1,2 etrafına sarıldığı nükleozomdur. Genom paketlemeye ek olarak, nükleozom mimarisi, çeşitli işlevlerini yerine getirirken kromatin bağlayıcı proteinler tarafından kullanılabilecek başka bir zengin biyofiziksel düzenleme katmanı olarak hizmet eder 3,4. Nükleozomların fiziksel özelliklerine deneysel olarak erişmek ve bunları ölçmek teknik olarak zor olmuştur, çünkü bu birimler küçük ölçeklerde (örneğin, nanometre uzunlukları, piconewton kuvvetleri) performans gösterir ve bu nedenle, sondalamaları, işlevi anlamlı bir şekilde bilgilendirmek için yeterli hassasiyet ve hassasiyet gerektirir. Ayrıca, kromatin bağlayıcı proteinler genellikle substratları ile geçici olarak etkileşime girer ve çoğu topluluk yaklaşımı, bu etkileşimlerin kinetiğini bilgilendirmek için uygun zamansal çözünürlükten yoksundur5. Neyse ki, tek moleküllü tekniklerin ortaya çıkışı, tek tek proteinleri ve etkileşimlerini gerçek zamanlı olarak görselleştirmeyi ve manipüle etmeyi mümkün kıldı ve nano ölçekte meydana gelen bu moleküler olaylar hakkında mekanik bilgileri ortaya çıkardı6. Özellikle, tek moleküllü korelasyon kuvveti ve floresan mikroskobu (smCFFM), kromatin ve kromatin-protein komplekslerininmekaniğini, bileşimini ve koordinasyonunu aynı anda çözmek için hem yüksek çözünürlüklü floresan algılama hem de kuvvet manipülasyon araçlarını kullanır 7,8.

Kuvvet manipülasyon yöntemi olarak özellikle "optik cımbız" kullanan smCFFM'de,üç boyutlu 9 bir dielektrik nesneyi, tipik olarak mikron boyutunda bir plastik boncuk yakalamak için sıkıca odaklanmış bir lazer kullanılır. Bir DNA parçası gibi bir biyopolimer, boncuğa konjuge edilebilir (örneğin, streptavidin-biotin, digoksijenenin-anti-digoksigenin antikor bağlantısı yoluyla) ve kullanıcı hem kalibre edilmiş bir kuvvet uygulayabilir hem de sistem tarafından üretilen kuvveti/yer değiştirmeyi ölçebilir10. Eklenen floresan modülü, protein bileşimini ve davranışını izlemek için eş zamanlı çok renkli floresan görüntülemeyi mümkün kılar.

smCFFM için nükleozom şablonlarının yeniden oluşturulması için ana yöntem, tuz diyalizi 11,12,13 ile özel DNA şablonları üzerinde nükleozomların birleştirilmesini içerir. Bu prosedürde, saflaştırılmış histon oktamerleri, yüksek tuzlu bir tamponda (~ 1 M sodyum klorür) DNA şablonları ile inkübe edilir ve tuz yavaşça diyalize edilirken, nükleozomlar, diziye bağlı konumsal bir şekilde DNA üzerinde kendiliğinden toplanır14,15. Bu nedenle, güçlü nükleozom konumlandırma dizilerinin (örneğin, Widom 60116, X. laevis 5S rDNA17) özel nükleozom dizileri oluşturmak için DNA şablonlarına dahil edilmesi gelenekseldir. Bu iyi bilinen yöntem, DNA boyunca nükleozomların yerleşimi ve sayısı üzerinde hassas kontrol sağlasa da, birkaç dezavantajdan muzdariptir: (1) güçlü nükleozom konumlandırma DNA dizilerinin dahil edilmesi, kromatin bağlayıcı proteinlerin aktivitesini önyargılı hale getiren yapay olarak kararlı nükleozomlar üretebilir, (2) nükleozom oluşumu için tuz diyalizi işlemi yüksek miktarda DNA ve oktamer gerektirir, ve (3) prosedür, bir ila birkaç günlük çalışmanın yanı sıra, optimum nükleozom dizi yoğunluğu için doğru DNA/oktamer oranını titre etmek için önemli bir çaba gerektirir.

Bu el yazmasında, in vivo nükleozom oluşumunun fizyolojik yoluna benzeyen rekombinant histon şaperon Nap1 kullanarak tek moleküllü bir korelasyon kuvveti ve floresan mikroskobu içinde yerinde DNA boyunca nükleozomlar oluşturmak için alternatif bir yöntem açıklanmaktadır 18,19,20,21,22. Bu yöntem, kullanıcıların nükleozomları spesifik olmayan DNA dizileri üzerinde birleştirmesine, nükleozom yoğunluğunu kolayca ayarlamasına ve önemli ölçüde daha az miktarda reaktif kullanmasına olanak tanır, hepsi de dakikalar içinde. Ek olarak, yerinde nükleozomal DNA bağlarının oluşturulması, daha basit deneysel iş akışı ve yerleşik tek moleküllü görselleştirme ve manipülasyonun rahatlığını sağlar. Bu nedenle, tek tip ve spesifik nükleozom konumlandırması bir gereklilik olmadığında, bu protokol, nükleozom mekaniğinin veya kromatin üzerindeki protein davranışının araştırılması için yararlı bir seçenek sunar, bunun için örnek tahlilleri de tanımladık.

Protokol

Çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Biyotinile DNA'nın hazırlanması

  1. 20 μg λ DNA, 33 μM biotin-dCTP, 33 μM biotin-dUTP, 33 μM biotin-dATP, 33 μM dGTP, 10 ünite Klenow enzimi ve 1x NEB Tampon 2 içeren 120 μL'lik bir hacim reaksiyonu hazırlayın.
    NOT: Bu prosedür özellikle 12-nükleotid (nt) 5' tek sarmallı (ss) DNA çıkıntısı23 içeren doğrusal çift sarmallı (ds) metilasyon içermeyen bakteriyofaj λ genomik DNA'yı (48,502 bps) kullanır. Bununla birlikte, protokol, en az birkaç nts ss 5' çıkıntısı içermesi koşuluyla, optik tuzaklar arasında aşağı akış bağlantısı için her iki uca monte edilen biyotinillenmiş ntlerin sayısını belirleyen uzunluk ve nt dizisi içermesi koşuluyla, herhangi bir uzunluk veya doğrusal dsDNA dizisini kullanacak şekilde uyarlanabilir. Ek olarak, reaksiyon küçültülebilir. Örneğin, 30 μL'lik bir hacim reaksiyonunda 5 μg DNA kullanılabilir. Ek olarak, bu şekilde üretilen DNA substratları burulma ile sınırlı değildir. Burulma ile kısıtlanmış DNA oluşturma protokolleri için lütfen daha önce yayınlananraporlara bakın 24,25.
  2. Reaksiyonu oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
  3. 10 mM EDTA ekleyin ve 75 °C'de 20 dakika inkübe edin.
  4. Biyotinile DNA ürününü elde etmek için etanol çökeltme işlemi yapın.
    1. 0,1 kat 3 M sodyum asetat ve 3 kat buz gibi soğuk %100 etanol ekleyin. -20 °C'de en az 1 saatten gece boyunca tutun. 4 °C'de 30 dakika boyunca 13.500 x g'da santrifüjleyin.
    2. Peleti rahatsız etmeden süpernatanı dikkatlice çıkarın ve 1 mL %75 etanol ekleyin. 4 ° C'de 1 dakika boyunca 13.500 x g'da santrifüjleyin.
    3. Süpernatan çıkarma, etanol ekleme ve santrifüjleme adımlarını tekrarlayın.
    4. Tüm süpernatanı dikkatlice çıkarın ve pelet havasının 10 dakika kurumasını bekleyin. Peleti 100-200 μL TE tamponu veya ddH2O'daçözün (çözünmeyi kolaylaştırmak için 37 ° C'de inkübe edilebilir). Bir Nanodrop spektrofotometresi kullanarak konsantrasyonu ölçün.

2. Bir akış hücresinde kanalların hazırlanması

NOT: Bu prosedür, ticari olarak temin edilebilen bir mikroakışkan çipe dayanmaktadır (Malzeme Tablosuna bakınız), ancak çok kanallı bir akış hücresine sahip herhangi bir smCFFM cihazına uyarlanabilir.

  1. Kanalları pasifleştirin (ch.), 4 ve 5 (veya protein içerecek herhangi bir kanal ) ( Şekil 1A'daki kanalların şemasına bakınız). Her kanala 500 μL %0,1 BSA ekleyin ve 8 dakika boyunca 0,8 bar'da (0,010 inç iç çapa sahip borular için ~ 0,45 μL/sn) akıtın. Çözeltiyi çıkarın.
  2. Her kanala 500 μL %0,05 Pluronic-F127 ekleyin ve 0,8 bar'da 8 dakika boyunca akıtın. Solüsyonu çıkarın ve şırıngaları 1x PBS ile durulayın. Her kanala 2 mL 1x PBS ekleyin ve 27 dakika boyunca 0,8 bar'da akıtın.
  3. Streptavidin kaplı boncukların stok çözeltisini girdaplayın (bu prosedür 3.13 μm boyutunda boncuklar kullanır) ve 1 mL 1x PBS'ye 2.15 μL boncuk çözeltisi ekleyin. Bölüm 1'e ekleyin.
    NOT: Streptavidin kaplı boncukların boyutu ve konsantrasyonu kullanıcı tercihine göre ayarlanabilir.
  4. 1 mL 1x PBS'ye 30-80 ng biyotinile λ λ DNA ekleyin. Bölüm 2'ye ekleyin.
    NOT: Biyotinile DNA konsantrasyonu kullanıcı tercihine göre ayarlanabilir. Daha fazla miktarda DNA, DNA bağları oluşturma sıklığını artıracak, ancak aynı anda birden fazla DNA molekülünü bağlama sıklığını da artıracaktır, bu da deneyin zorluğunu artırabilir.

3. Nap1 aracılı in situ nükleozom oluşumu

  1. Bölüm 3'e 500 μL proteinsiz görüntü tamponu ekleyin.
    NOT: Bölüm 3'teki tampon bileşimi esnektir ve hem nükleozomlar hem de ilgilenilen spesifik protein(ler) için uygun olmalıdır. İsteğe bağlı olarak, kullanıcılar, nükleozomlara düzgün şekilde sarılmamış histon oktamerlerini çıkarmak için floroforların ve/veya rakip DNA'nın azaltılmış fotoağartması için oksijen temizleme sistemleri eklemeyi seçebilirler.
  2. 500 μL 1x HR tamponuna 2 nM S. cerevisiae Nap1 ve 2-5 nM LD655 etiketli H4 histon oktamer (HO) ekleyin18. Bölüm 4'e ekleyin.
    NOT: Histon oktamerleri ve Nap1 ticari olarak satın alınabilir veya şirket içinde hazırlanabilir (Malzeme Tablosuna bakınız). Her bağlı DNA boyunca oluşturulacak nükleozom sayısı, oktamer konsantrasyonuna ve bu kanalda geçirilen süreye bağlıdır. Kullanıcının her bir DNA molekülü boyunca arzu ettiği ve yaklaşık nükleozom yoğunluğu, bu parametrelerden biri veya her ikisi ayarlanarak modüle edilebilir. Ek olarak, kullanıcı histon oktamerlerini tercih ettikleri floroforla etiketlemeyi seçebilir.
  3. İsteğe bağlı: Kromatin bağlayıcı proteini veya ilgilenilen başka bir proteini uygun bir tamponda bölüm 5'e ekleyin.
  4. Akış hücresi kanallarını numunelerle yıkamak için tüm kanalları 1,0 bar'da (mevcut deney düzeneğinde ~0,55 μL/s) 30 saniye boyunca akıtın.
  5. Akışı 0,2 bar'a ayarlayın (mevcut deney düzeneğinde ~0,16 μL/s). Optik tuzakları (OT'ler) bölüm 1'e getirin ve uygun bir çift streptavidin kaplı boncuk yakalayın.
  6. OT'leri kanal 3'e getirin, boncuk çifti için bir kuvvet kalibrasyonu yapın, kırmızı konfokal lazeri (veya tercih edilen başka bir lazer çizgisini) açın ve görüntüleme alanını kalibre edin.
  7. Akışı 0,2 bar'a ayarlayın ve OT'leri kanal 2'ye taşıyın. Biyotinile DNA'yı yakalayın.
  8. OT'leri bölüm 3'e taşıyın ve akışı durdurun. DNA'yı germek için OT'ler arasındaki mesafeyi artırın ve tek bir DNA bağının varlığını doğrulamak için (çoklu bağların aksine) ilişkili kuvvet-mesafe (FD) eğrisini izleyin. Eğri, verilen kontur uzunluğu26'da dsDNA için solucan benzeri zincir modelini takip etmelidir.
  9. OT'ler arasındaki mesafeyi, DNA gerilimi yaklaşık 1 pN olacak şekilde ayarlayın.
    NOT: 1 pN gerilim, nükleozomların DNA27 tarafından sarılı kalmasına izin verecek kadar düşüktür, ancak tüm DNA molekülünü çizgi taramalı görüntüleme ekseni içine yerleştirecek kadar yüksektir.
  10. Kırmızı lazer açıkken bir kymograph almaya başlamak için satır taramasını açın.
    NOT: Kullanıcı tercihine bağlı olarak kimografiler veya bağlı DNA'nın 2D taramaları elde edilebilir.
  11. OT'leri akış kapalıyken bölüm 4'e taşıyın. Nap1 tarafından kolaylaştırılan HO'lar DNA'ya yüklenir ve gerçek zamanlı olarak nükleozomlar oluşturmak üzere sarılır. Nükleozom yüklemesi, kimografilerde DNA üzerinde görünen floresan yörüngeler olarak görselleştirilir. Aynı zamanda, DNA üzerindeki nükleozom oluşumu, OT'lerin konumları sabit tutulduğunda daha fazla HO yüklendiği için kuvvet artışı ile izlenebilir.
    NOT: Floresan uyarma lazeri, floroforların fotoağartılmasını önlemek için nükleozom oluşum adımları sırasında kapatılabilir. Ek olarak, histon oktamerlerinin DNA'ya spesifik olmayan bağlanması, oktamerlerin nükleozomlara sarılmadığı durumlarda bu protokol kullanılarak gerçekleşebilir. Bu bağlanma olayları, aşağıdaki Nükleozomları Açma (adım 4) protokolünde açıklandığı gibi, DNA gerildiğinde bir "yırtılma" oluşturmaz ve bazen, özellikle tampon serbest rakip DNA içeriyorsa, hafif bir tampon akışıyla yıkanabilir.
  12. Yaklaşık istenen sayıda nükleozom oluştuğunda, veri toplamaya başlayın.

4. Nükleozomların açılması

  1. 2. ve 3. adımları tamamlayın.
  2. Nükleozom içeren bir DNA bağı oluşturduktan sonra, OT'leri bölüm 3'e taşıyın.
  3. Kuvvet yaklaşık sıfır olana kadar OT'ler arasındaki mesafeyi azaltarak nükleozom açma deneylerine hazırlanın. Kuvveti sıfırlayın.
  4. OT 1'i 0,1 μm/s'lik sabit bir hızla OT 2'den uzaklaştırmaya başlayın. Bir kymografta, OT 1'deki boncuk görsel olarak OT 2'deki boncuktan daha uzağa hareket edecektir. FD eğrisinde, mesafe arttıkça kuvvet artacaktır. Nükleozomlar açılırken, tek tek nükleozomların 27,28,29 iç sargısının çözülmesini gösteren kuvvette (~ 8-37 pN) "yırtılmalar" veya geçişler görünecektir.
    NOT: Sarmanın meydana geldiği kuvvet, denge dışı işlemler için beklenen çekme hızına bağlıdır. Bazen, birden fazla nükleozom aynı anda açılır ve FD eğrisi üzerindeki geçişte daha büyük bir mesafe değişikliği üretir. Ek olarak, nükleozomun dış sargısının çözülmesi bu deneysel ortamda kolayca görülemez (Tartışma bölümüne bakın).

5. Proteinin kromatine bağlanmasını görselleştirmek

  1. 2. ve 3. adımları tamamlayın.
  2. Bölüm 5'te 10 nM Cy3 etiketli histon H1.4'ü 500 μL görüntü arabelleğine ekleyin.
    NOT: İlgilenilen herhangi bir protein, tercih edilen bir konsantrasyonda (tipik olarak tek moleküllü görselleştirme için 100 nM'nin altında) kanal 5'e eklenebilir.
  3. Nükleozom içeren bir DNA bağı oluşturduktan sonra, kırmızı lazere ek olarak yeşil lazeri açın ve H1'in kromatine bağlanmasının gerçek zamanlı görüntülenmesi için OT'leri bölüm 5'e taşıyın.
  4. Yeterli istatistik elde edilene kadar kimografi veya tarama toplamaya devam edin (olayların sıklığına ve deneysel zorluğa bağlı olarak en az ~ 10-20 kimografi).

Sonuçlar

Adım 3'te (Şekil 1A) açıklanan kurulum kullanılarak, DNA bağı boyunca nükleozom oluşumu, bir 2D taramada kırmızı floresan odakların görünümü (Şekil 1B, solda) veya bir kimografide zaman içinde yörüngeler (Şekil 1B, sağ) olarak görselleştirildi. Düzgün bir şekilde sarılmış nükleozomlar, konfokal tespitin kırınım sınırı (~ 300 nm) içinde zaman içinde sabit olan floresan yörüngeleri verdi. Özellikle, kırınım sınırı altında birbirine yakın oluşan çoklu nükleozomlar uzamsal olarak çözülemez ve daha parlak odaklar veya yörüngeler olarak görünür. Bununla birlikte, tek tek nükleozomal yörüngelerin fotoağartma adımları analiz edildi ve sıklıkla 1 adımlı (Şekil 1C) veya 2 adımlı (Şekil 1D) fotoağartma olayları gösterdi, bu da odakların bu numunedeki H4 proteininin yaklaşık% 70 etiketleme oranı göz önüne alındığında çoğunlukla mononükleozomlar içerdiğini gösterir. Ayrıca, bu deneysel koşulda tek bir LD655 florofor için ortalama foton sayısına dayanarak, her bir nükleozom yörüngesindeki etiketli H4 kopyalarının sayısı tahmin edildi ve nükleozom lokuslarının ağırlıklı olarak (%>75) 1 veya 2 etiketli H2A kopyası içerdiğini gösterdi (Şekil 1E), yine bunların esas olarak uzamsal olarak ayrılmış mononükleozomlar olarak yüklendikleri fikriyle tutarlıdır. Diğer daha parlak odaklar, muhtemelen kırınım sınırı içinde çoklu nükleozomları temsil eden 3'ten fazla etiketli H4 kopyası içeriyordu.

Nükleozom oluşumu, histon oktamerlerinin etrafına daha fazla DNA sarılırken OT'lerin konumları sabit kaldığında, bağ boyunca gerilimde bir artışla da izlendi (Şekil 1B, altta). Nap1'in yokluğunda, histon oktamerleri hala DNA'yı bağlayabilir, ancak OT pozisyonları tutulduğunda ilişkili gerilim sabit kaldığından, çoğunlukla sargısız kalabilir (Şekil 1F). Histon oktamerlerinin DNA'ya spesifik olmayan bağlanmasının Nap1 varlığında bile meydana gelmesi mümkündür. Başka bir deneyde, Cy3 etiketli H2A içeren nükleozomları oluşturmak için aynı protokol gerçekleştirildi ve bu, LD655 etiketli H4 ile yapılanlarla benzer sonuçlar verdi (Şekil 1G), bu da sağlam oktamerlerin nükleozomlara birleştirildiğini gösterir.

Adım 4'te (Şekil 2A) açıklanan kurulum kullanılarak, bağ mesafesi arttıkça nükleozomun açılması zamanla bir kimografi üzerinde görselleştirildi (Şekil 2B). Daha önce, histon oktamerleriningenellikle 30,31 açıldıktan sonra DNA'ya bağlı kaldığı ve bu nedenle floresan yörüngelerin genellikle yüksek gerilimlerde bile devam ettiği bildirilmişti. Nükleozomun açılması, ilişkili FD eğrisi üzerinde de izlendi (Şekil 2C). FD eğrisinin ölçülebilir özellikleri, nükleozom(lar)ın açıldığı kuvveti (Şekil 2C ekindeki "Geçiş F"ye bakınız) ve ayrıca histon oktamerinden salınan DNA'nın uzunluğunu içerir (Şekil 2C ekindeki "ΔL"ye bakın), ~24 nm'nin katları halinde bulunur, tek tek nükleozomların27 DNA'sının iç dönüşlerinin bağımsız olarak açılmasıyla tutarlı olarak, 30. Bu parametreler, her bir bağda oluşan nükleozomların sayısını tahmin etmek veya nükleozom mekaniğinin ek aşağı akış analizi için kullanılabilir. Bu nedenle, mekanik çekme deneylerinden elde edilen iç dönüş kopmalarının sayısı, monomer yoğunluğuna dayalı olarak her bir nükleozom yörüngesindeki tahmini etiketli H4 kopya sayısı ile karşılaştırıldı, bu da sayıların büyük ölçüde tutarlı olduğunu gösterdi (Şekil 2D-G'de gösterilen örnekler). Bununla birlikte, Şekil 1F'de gösterildiği gibi, numunedeki H4 proteininin ~p etiketli verimliliği ve DNA'ya herhangi bir kalıntı Nap1'den bağımsız histon bağlanması nedeniyle mükemmel bir şekilde eşleşmedikleri kaydedildi. Son olarak, beklendiği gibi, Nap1'e bağlı çıplak DNA bağlarının gerilmesi (histonlar olmadan) kuvvet kaynaklı geçişler oluşturmaz (Şekil 2H), bu da Nap1'in tek başına DNA'yı önemli ölçüde bozmadığını gösterir.

Adım 5'te (Şekil 3A) açıklanan kurulum kullanılarak, bağlayıcı histon H1'in kromatine bağlanması, kromatin bağı boyunca yeşil floresan odakların görünümü olarak görselleştirildi (Şekil 3B). Özellikle, H1'e bağlı nükleozomlar, zamanla durağan görünen çift renkli yörüngeler ( Şekil 3B'deki beyaz oklara bakın) üretti. Ek olarak, nükleozomsuz DNA bölgeleri boyunca yayılan H1 yörüngeleri gözlenmiştir ( Şekil 3B'deki yeşil yıldızlara bakınız).

figure-results-1
Şekil 1: Nap1 aracılı in situ nükleozom oluşumu. (A) Nap1 aracılı in situ nükleozom oluşum protokolünde açıklanan deney düzeneğinin şeması (adım 3). Bir çift boncuk optik olarak bölüm 1'de yakalandı ve tek bir λ DNA molekülü, bölüm 2'de biyotin-streptavidin bağlantısı yoluyla boncuklar arasına bağlandı. Tether daha sonra DNA boyunca gerçek zamanlı nükleozom oluşumu için LD655 etiketli histon oktamerleri (kırmızı) ve Nap1 içeren bölüm 4'e taşındı. (B) LD655-H4 etiketli nükleozom içeren bir DNA bağının temsili 2D taraması (solda) ve kimografisi (sağda). İlgili kuvvet okuması (altta), OT konumları sabit tutulduğunda bağ bölüm 4'e hareket ettirildiğinde hemen kuvvette bir artış gösterir ve bu da nükleozom sarılmasını gösterir. Daha parlak yörüngeler, ~ 300 nm'lik kırınım sınırı içinde bulunan birden fazla bitişik nükleozomu ifade eder. (C) LD655-H4 içeren bir nükleozomun 1 aşamalı foto-ağartma olayını (beyaz ok) gösteren örnek kimografi. (D) LD655-H4 içeren bir nükleozomun 2 aşamalı foto ağartma olayını (beyaz oklar) gösteren örnek kimografi. (E) Floresan yoğunluklarından tahmin edilen yörünge başına LD655 etiketli H4 sayısının nispi frekansı. (F) Nap1'in yokluğunda histon oktamerleri ile bağlanmış bir ipin temsili kimografisi. İlişkili kuvvet okuması (altta), histon oktamerleri DNA'yı bağlarken bile değişmeden kalır. (G) Cy3-H2A etiketli nükleozom içeren bir DNA bağının temsili kimografisi. İlişkili kuvvet okuması (altta), OT konumları sabit tutulduğunda nükleozomlar oluştuğundan, bağ 4. bölüme (oktamerler ve Nap1 içeren) hareket ettirildiğinde hemen kuvvette bir artış gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Nükleozom açma deneyi. (A) Nükleozomların açılması protokolünde açıklanan deney düzeneğinin şeması (adım 4). Nükleozomları içeren DNA bağı, boncuklar arası mesafenin arttırıldığı ve nükleozomların açıldığı proteinsiz bir görüntü tamponu içeren bölüm 3'e taşındı. (B) Boncuklar arası mesafeyi kademeli olarak artırarak yüksek kuvvetlere çekilen nükleozom içeren bir DNA bağının temsili kimografisi. Alt boncuğa doğru floresan yoğunluğundaki azalma, muhtemelen DNA'nın çizgi tarama odağının biraz dışına eğilmesinden kaynaklanıyordu. (C) 8-37 pN arasında meydana gelen kuvvet kaynaklı iç dönüş açma geçişlerini gösteren ilişkili FD eğrisi. İç kısım, sarılmamış mesafenin (tek tek nükleozomların DNA'sının iç dönüşü için ΔL = ~ 24 nm) ve geçiş kuvvetinin (Geçiş F) kaydedilebildiği ve daha fazla analiz edilebildiği örnek bir geçişin yakınlaştırma görünümünü gösterir. Bu bağ için, 26 nükleozom açıldı ve ip, kimografideki beyaz noktalı çizgi ile gösterildiği gibi ~ 65 pN'de yırtıldı. (D,E) Örnek LD655-H4 nükleozom içeren bağ, yörünge başına H4 sayısının floresan yoğunluğu ( kimograf, D'de belirtilmiştir) yoluyla tahmin edildiği ve sarılmış nükleozomların sayısının kuvvet kaynaklı mesafe değişiminin boyutu yoluyla tahmin edildiği yüksek kuvvetlere çekilir (ilgili kuvvet-mesafe eğrisi, E'de belirtilmiştir). (F,G) (D,E)'deki gibi başka bir örnek. (H) DNA bağları (n = 5) sadece Nap1 içeren bir kanalda inkübe edildikten sonra yüksek kuvvetlere çekilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Protein-kromatin etkileşiminin görselleştirilmesi. (A) Proteinlerin kromatin protokolüne bağlanmasının görselleştirilmesinde açıklanan deney düzeneğinin şeması (adım 5). Nükleozomları içeren DNA bağı, 10 nM Cy3 etiketli histon H1 (yeşil) içeren bölüm 5'e taşındı. (B) Nükleozom içeren bir DNA bağına bağlanan H1'in temsili iki renkli kimografisi. H1-nükleozom kolokalizasyon olayları beyaz oklarla gösterilir. Bağlanmamış nükleozom yörüngesi macenta ok ile gösterilir. Çıplak DNA üzerinde yayılan H1 molekülleri yeşil yıldızlarla gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Açıklanan protokol, nükleozomun yeniden yapılandırılması için, reaktifleri ve zamanı en aza indirmenin yanı sıra herhangi bir (potansiyel olarak doğal) DNA dizisi boyunca şaperona bağımlı nükleozom oluşumunu mümkün kılmak da dahil olmak üzere çeşitli avantajlar sağlar. Ayrıca, yerinde yöntem, daha basit deneysel iş akışına ve nükleozom mekaniği ve protein-kromatin etkileşiminin tek moleküllü tahlillerine uygun bir geçişe izin verir. Öte yandan, bu yaklaşımın sınırlamaları, DNA boyunca nükleozom konumlandırmasını yönlendirememe (güçlü nükleozom konumlandırma dizilerinin dahil edilmesiyle bile) ve DNA bağı başına oluşturulan nükleozom sayısını hassas bir şekilde kontrol edememeyi (ancak bu, deneysel iş akışını standartlaştırarak ampirik olarak ayarlanabilir). Gerçekte, bu yöntemi seçenler, seçimi her bir spesifik deneye bağlı olan daha fazla iş akışı kolaylığı ve düşük reaktif gereksinimi için nükleozom konumlandırma ve yoğunluğunun hassas kontrolünü takas ederler. Ayrıca, DNA'nın dış dönüşünün, bağın uzun uzunluğu (~ 48.5 kbps) ve tampon koşulları32 nedeniyle mevcut protokolde çözülmediği de belirtilmektedir. DNA'nın dış dönüşü ve nükleozomlar arası istifleme hakkında bilgi elde etmek için, kullanıcı DNA uzunluğunu kısaltmayı ve DNA'ya daha yüksek yoğunlukta nükleozom yüklemeyi seçebilir ve/veya nükleozomları düzenli bağlayıcı uzunlukları ile ayrılmış güçlü konumlandırma dizilerine yerleştirmek için tuz diyalizi yöntemini kullanabilir. Son olarak, histon oktamerlerinin DNA'ya spesifik olmayan bağlanmasının meydana gelmesi muhtemeldir; Bu nedenle, sonuçları yorumlarken hem floresan hem de kuvvet sinyallerini dikkate almak önemlidir.

Mevcut protokolün kritik bir yönü, kullanıcının histon oktamerleri için (görselleştirme gerekiyorsa) yüksek bir floresan etiketleme oranı elde etmesini sağlamaktır, böylece hepsi olmasa da çoğu nükleozom görsel olarak tespit edilebilir. Bir diğer kritik husus, kullanıcının görüntüleme kanalı için nükleozomlar ve diğer ilgili proteinlerle uyumlu uygun bir tampon seçtiğini doğrulamaktır. Protokolde kullanıcıya özel değişiklikler, farklı bir histona florofor konjugasyonunu (H3 veya H2B etiketli nükleozomlar oluşturmak için bu yöntemi kullanan örnekler için rapor 33,34'e bakın), alternatif bir florofor seçmeyi, farklı dizi ve uzunluklarda DNA bağlarını birleştirmeyi, floroforların ömrünü uzatmak için bir oksijen süpürme sistemi eklemeyi, farklı bir boncuk boyutu seçmeyi, ve alternatif bir DNA-boncuk konjugasyon sistemi (örneğin, digoksijenenin-anti-digoksijenenin antikor bağlantısı) kullanarak.

Özetle, açıklanan yöntem, smCFFM'ye, biyolojide çok çeşitli kromatin odaklı soruları incelemek için kolayca kullanılabilecek nükleozom içeren bağlar oluşturmak için uygun ve çok yönlü bir yaklaşım sağlar. Uygulanabilir araştırma alanları arasında, histon varyantları ve translasyon sonrası modifikasyonlar tarafından düzenlenen kromatin mekaniği, kromatin bağlayıcı proteinlerin biyofiziksel katılımı ve kinetiği ve biyomoleküler yoğunlaşma 35,36,37,38 gibi nükleozoma yönelik yüksek dereceli montaj işlemleri yer alır.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rekabet çıkarı beyan etmezler.

Teşekkürler

G. N. L. C., Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüsü'nden F31MH132306 numaralı ödülle destek aldığını kabul eder. SL, Robertson Vakfı, Uluslararası Rett Sendromu Vakfı ve NIH (ödül numarası R01GM149862) tarafından desteklenmektedir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1x HR tamponuN/AN/A30 mM  tris  asetat pH 7.5, 20 mM magnezyum asetat, 50 mM potasyum klorür, 0.1 mg/mL BSA 
1x PBS (Fosfat tamponlu tuzlu su)N / AN / A137 mM sodyum klorür, 2.7 mM potasyum klorür, 10 mM sodyum fosfat dibazik, 1.8 mM potasyum fosfat monobazik 
Asetik asit, buzulMillipore SigmaAX0074-6Tris asetat yapmak için kullanın
Biotin-11-dUTPJena BioscienceNU-803-BIOX-S
Biotin-14-dATPJena BioscienceNU-835-BIO14-S
Biotin-14-dCTPJena BioscienceNU-956-BIO14-S
Sığır Serumu AlbüminMillipore SigmaA9418-50GÇözün H2O'da ve 0.22 um filtreden geçer
Cy3 Maleimide Mono-ReaktifBoya CytivaPA23031Maleimid işlevselleştirilmiş Cy3 florofor
dGTPNew England BiolabsN0442S
Eppendorf Santrifüj 5425 RFisher Scientific05-414-051tezgah üstü santrifüj
, SafMillipore Sigma459844
Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)Millipore SigmaE9884H2O'da 0,5 M'ye
İnsan histon oktameri (H4, L50C; H2A, K119C) N/AN/ARekombinant histon proteinleri ve etiketleme mutasyonlarını barındıranlar, daha önce tarif edildiği gibi kurum içinde saflaştırıldı (bkz. ref. 33, 34, 35, 36). Kısaca rekombinant histonlar BL21 (De3) pLySS hücrelerinde (Promega) eksprese edildi. İnklüzyon cisimleri sonikasyondan sonra izole edildi ve histonlar denatüre edici koşullar altında ekstrakte edildi. Histonlar tampon A'ya (7 M üre, 10 mM tris hidroklorür pH 8.0, 100 mM sodyum klorür, 1 mM EDTA ve 5 mM 2-merkaptoetanol) diyalize edildi ve çözelti, Q Sefaroz Hızlı Akış (Cytiva) ile yüklü bir yerçekimi kolonuna eklendi. Akış daha sonra yerçekimi kolonu yüklü bir SP Sefaroz Hızlı Akış'a (Cytiva) eklendi ve histonlar, 600 mM sodyum klorür ile takviye edilmiş tampon A eklenerek kolondan ayrıştırıldı. Etiketleme mutasyonlarını barındıran histonlar (H4, L50C; H2A, K119C) saflaştırıldı ve daha sonra 20: 1 boya-protein molar oranı kullanılarak maleimid ile işlevselleştirilmiş boyalar (Cytiva, Lumidyne) yoluyla istenen florofora konjuge edildi (bkz. ref. 33, 34). Histon oktamerleri, denatüre edici koşullar altında her bir vahşi tip veya florofor etiketli histonun eşit bir molar oranı eklenerek birleştirildi, 2 M sodyum klorür içeren yüksek tuzlu bir tampona diyaliz edildi ve daha sonra daha önce tarif edildiği gibi boyut dışlama kromatografisi ile saflaştırıldı (bkz. ref. 36, 37). Alternatif olarak, bireysel histon proteinleri ve hazır histon oktamerleri ticari olarak satın alınabilir (örneğin, Epicypher). 
Görüntü arabelleğiN/AN/A 20 mM tris hidroklorür pH 8.0, 100 mM sodyum klorür
Klenow Parçası (3' ila 5' ekzo-)New England BiolabsM0212S
Lambda DNA (dam-, dcm-)Thermo Fisher ScientificSD0021Metilasyon içermeyen ve lambda; DNA
LD655-MALLumidyne Teknolojileri9Maleimid işlevselleştirilmiş LD655 florofor
Bağlayıcı histon H1.4 (A4C)N/AN/AŞirket içinde yapılan saflaştırılmış rekombinant protein (bkz. ref. 38)
LUMICKS C-Trap DymoLUMICKSN/AÇift tuzak konfigürasyonu; üretici tarafından sağlanan cihaz için standart malzemeler
Magnezyum asetat çözeltisiKırlangıç Sigma63052-100MLHR tamponu yapmak için kullanın
NEBuffer 2New England BiolabsB7002SKlenow Fragment kit ile birlikte verilir
Pluronic F-127Millipore SigmaP2443-250GH2O'da çözün ve 0.22 um filtreden geçirin
Potasyum klorürMillipore SigmaP3911PBS ve HR tamponu yapmak için kullanın
Potasyum fosfat monobazikMillipore SigmaP0662PBS
S. cerevisiae yapmak için kullanın> Nap1 N/AN/ANap1, daha önce açıklandığı gibi şirket içinde saflaştırılmıştır (bkz. ref. 33, 34). Alternatif olarak, Nap1 ticari olarak satın alınabilir (örneğin, Active Motif).
Sodyum asetatMillipore Sigma241245H2O'da 3 M'ye Çözün
Sodyum klorürMillipore SigmaS9888PBS ve görüntü tamponu yapmak için kullanın
Sodyum fosfat dibazikMillipore SigmaS9763
PBS SPHERO Biotin Kaplı Parçacıklar (3.0-3.4 ve mikro; m)SpherotechTP-30-5
Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c SpektrofotometreFisher ScientificND2000NanoDrop Spektrofotometre
Tris BaseFisher ScientificBP152-500H2O'da çözün ve uygun pH'a ayarlayın; Görüntü arabelleği ve tris asetat yapmak için kullanın
Soğutmalı Etil alkollü çözün

Kaynaklar

  1. Kornberg, R. D. Chromatin structure: A repeating unit of histones and DNA. Science. 184, 868-871 (1974).
  2. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
  3. Zhou, K., Gaullier, G., Luger, K. Nucleosome structure and dynamics are coming of age. Nat Struct Mol Biol. 26, 3-13 (2019).
  4. McGinty, R. K., Tan, S. Principles of nucleosome recognition by chromatin factors and enzymes. Curr Opin Struct Biol. 71, 16-26 (2021).
  5. Fierz, B., Poirier, M. G. Biophysics of chromatin dynamics. Annu Rev Biophys. 48, 321-345 (2019).
  6. Single-molecule techniques: A laboratory manual. Selvin, P. R., Ha, T. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
  7. Chua, G. N. L., Liu, S. When force met fluorescence: Single-molecule manipulation and visualization of protein-DNA interactions. Annu Rev Biophys. , (2024).
  8. Hashemi Shabestari, M., Meijering, A. E. C., Roos, W. H., Wuite, G. J. L., Peterman, E. J. G. Recent Advances in biological single-molecule applications of optical tweezers and fluorescence microscopy. Methods Enzymol. 582, 85-119 (2017).
  9. Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Opt Lett. 11, 288(1986).
  10. Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Rev Sci Instrum. 75, 2787-2809 (2004).
  11. Hansen, J. C., van Holde, K. E., Lohr, D. The mechanism of nucleosome assembly onto oligomers of the sea urchin 5 S DNA positioning sequence. J Biol Chem. 266, 4276-4282 (1991).
  12. Salt Peterson, C. L. gradient dialysis reconstitution of nucleosomes. CSH Protoc. 2008, 5113(2008).
  13. Leicher, R., Liu, S. Probing the interaction between chromatin and chromatin-associated complexes with optical tweezers. Methods Mol Biol. 2478, 313-327 (2022).
  14. Segal, E., et al. A genomic code for nucleosome positioning. Nature. 442, 772-778 (2006).
  15. Ioshikhes, I. P., Albert, I., Zanton, S. J., Pugh, B. F. Nucleosome positions predicted through comparative genomics. Nat Genet. 38, 1210-1215 (2006).
  16. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. J Mol Biol. 276, 19-42 (1998).
  17. Chipev, C. C., Wolffe, A. P. Chromosomal organization of Xenopus laevis oocyte and somatic 5S rRNA genes in vivo. Mol Cell Biol. 12, 45-55 (1992).
  18. Crickard, J. B., Moevus, C. J., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. Rad54 drives ATP hydrolysis-dependent DNA sequence alignment during homologous recombination. Cell. 181, 1380-1394 (2020).
  19. Vlijm, R., et al. Comparing the assembly and handedness dynamics of (H3.3-H4)2 tetrasomes to canonical tetrasomes. PLoS One. 10, e0141267(2015).
  20. Mazurkiewicz, J., Kepert, J. F., Rippe, K. On the mechanism of nucleosome assembly by histone chaperone NAP1. J Biol Chem. 281, 16462-16472 (2006).
  21. Nakagawa, T., Bulger, M., Muramatsu, M., Ito, T. Multistep chromatin assembly on supercoiled plasmid DNA by nucleosome assembly protein-1 and ATP-utilizing chromatin assembly and remodeling factor. J Biol Chem. 276, 27384-27391 (2001).
  22. Andrews, A. J., Chen, X., Zevin, A., Stargell, L. A., Luger, K. The histone chaperone Nap1 promotes nucleosome assembly by eliminating nonnucleosomal histone DNA interactions. Mol Cell. 37, 834-842 (2010).
  23. Wu, R., Taylor, E. Nucleotide sequence analysis of DNA. II. Complete nucleotide sequence of the cohesive ends of bacteriophage lambda DNA. J Mol Biol. 57, 491-511 (1971).
  24. King, G. A., Peterman, E. J., Wuite, G. J. Unravelling the structural plasticity of stretched DNA under torsional constraint. Nat Commun. 7, 11810(2016).
  25. Paik, D. H., Roskens, V. A., Perkins, T. T. Torsionally constrained DNA for single-molecule assays: An efficient, ligation-free method. Nucleic Acids Res. 41, e179(2013).
  26. Bustamante, C. J., Chemla, Y. R., Liu, S., Wang, M. D. Optical tweezers in single-molecule biophysics. Nat Rev Methods Primers. 1, 25(2021).
  27. Diaz-Celis, C., et al. Assignment of structural transitions during mechanical unwrapping of nucleosomes and their disassembly products. Proc Natl Acad Sci USA. 119, e2206513119(2022).
  28. Leicher, R., et al. Single-molecule and in silico dissection of the interaction between Polycomb repressive complex 2 and chromatin. Proc Natl Acad Sci USA. 117, 30465-30475 (2020).
  29. Chua, G. N. L., et al. Differential dynamics specify MeCP2 function at methylated DNA and nucleosomes. bioRxiv. , (2023).
  30. Brower-Toland, B. D., et al. Mechanical disruption of individual nucleosomes reveals a reversible multistage release of DNA. Proc Natl Acad Sci USA. 99, 1960-1965 (2002).
  31. McCauley, M. J., et al. Human FACT subunits coordinate to catalyze both disassembly and reassembly of nucleosomes. Cell Rep. 41, 111858(2022).
  32. Mihardja, S., Spakowitz, A. J., Zhang, Y., Bustamante, C. Effect of force on mononucleosomal dynamics. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 15871-15876 (2006).
  33. Li, S., et al. Nucleosome-directed replication origin licensing independent of a consensus DNA sequence. Nat Commun. 13, 4947(2022).
  34. Li, S., et al. Origin recognition complex harbors an intrinsic nucleosome remodeling activity. Proc Natl Acad Sci USA. 119, e2211568119(2022).
  35. Harada, B. T., et al. Stepwise nucleosome translocation by RSC remodeling complexes. Elife. 5, e10051(2016).
  36. Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Expression and purification of recombinant histones and nucleosome reconstitution. Methods Mol Biol. 119, 1-16 (1999).
  37. Rogge, R. A., et al. Assembly of nucleosomal arrays from recombinant core histones and nucleosome positioning DNA. J Vis Exp. (79), e50354(2013).
  38. Leicher, R., et al. Single-stranded nucleic acid binding and coacervation by linker histone H1. Nat Struct Mol Biol. 29, 463-471 (2022).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

In Situ Rekonstit syonTek Molek l MikroskobuKuvvet MikroskobuKromatin Mekani iHiston aperonu Nap1DNA Ba lant sN kleozom A lmasLinker Histon Ba lanmas

İlgili makaleler