Yöntem makalesi

Primer Murin CD8 + T Hücreleri için Gerçek Zamanlı İn Vitro Migrasyon Testi

2.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66580

⸱

24 Mayıs 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester, 2David H. Smith Center for Vaccine Biology and Immunology, University of Rochester

Bu makalede

Özet

Bu protokol, kantitatif analiz ile belirli çevresel koşullar altında primer murin T hücresi izolasyonu ve T hücresi göçünün hızlandırılmış mikroskobu için bir yöntem sağlar.

Özet

Adaptif bağışıklık tepkisi, bir T hücresinin patojenlere ve yabancı cisimlere yanıt olarak kan, lenf ve doku yoluyla göç etme yeteneğine bağlıdır. T hücresi göçü, kemokinler, kemokin reseptörleri ve adezyon molekülleri dahil olmak üzere çevreden ve yerel bağışıklık hücrelerinden gelen birçok sinyal girişinin koordinasyonunu gerektiren karmaşık bir süreçtir. Ayrıca, T hücresi motilitesi, aktivasyon durumunu, transkripsiyonel manzarayı, adezyon molekülü ekspresyonunu ve daha fazlasını değiştirebilen dinamik çevreleyen çevresel ipuçlarından etkilenir. İn vivo, görünüşte iç içe geçmiş bu faktörlerin karmaşıklığı, T hücresi göçüne katkıda bulunan bireysel sinyalleri ayırt etmeyi zorlaştırır. Bu protokol, son derece spesifik çevresel koşullar altında T hücresi göçünü gerçek zamanlı olarak değerlendirmek için T hücresi izolasyonundan bilgisayar destekli analize kadar bir dizi yöntem sağlar. Bu koşullar, göçü düzenleyen mekanizmaları aydınlatmaya, T hücresi kinetiği anlayışımızı geliştirmeye ve hayvan deneyleri yoluyla elde edilmesi zor olan güçlü mekanik kanıtlar sağlamaya yardımcı olabilir. Hücre göçünü etkileyen moleküler etkileşimlerin daha derin bir şekilde anlaşılması, gelişmiş terapötikler geliştirmek için önemlidir.

Giriş

T hücreleri, adaptif, antijene özgü immün yanıtın ana efektörleridir. Popülasyon düzeyinde, T hücreleri heterojendir ve farklı özel işlevlere sahip hücresel alt kümelerden oluşur. Daha da önemlisi, CD8 + T hücreleri, enfekte olmuş veya işlevsiz hücreleri doğrudan ortadan kaldıran bağışıklık sisteminin ana sitolitik efektörleridir1.

Olgun CD8 + T hücreleri dokuda bulunur ve antijen aramak için kan ve lenfatiklerde dolaşır. Enfeksiyon sırasında, T hücreleri kan veya dokuda antijenlerle sunulur ve üretken bir bağışıklık tepkisi başlatmak için hızla dalağa veya en yakın drenaj lenf noduna boşalır. Her iki durumda da, T hücreleri aktive olur, klonal genişlemeye uğrar ve lenfatik sistemi zaten orada değilse, kana girmek için terk eder. Bu işlem sırasında, hücre içi sinyalleme, lenfatik hedef arama reseptörlerinin aşağı regülasyonunu ve dokuya özgü göç için gerekli olan çok sayıda integrin ve kemokin reseptörünün yukarı regülasyonunu sağlar2. Sonuç olarak, T hücrelerinin enfeksiyon bölgelerine yönlendirilmiş göçü, integrin ve kemokin sinyalini içeren yakınsak çevresel sinyaller tarafından yönlendirilir.

Kemokinler genel olarak iki ana sınıfa ayrılabilir: (1) farklılaşma, sağkalım ve bazal fonksiyon için gerekli olan homeostatik sinyaller ve (2) kemotaksis için gerekli olan CXCL9, CXCL10 ve CCL3 gibi inflamatuar sinyaller. Genel olarak, kemokinler, integrin ekspresyonu1'i aktive etmenin yanı sıra, kemotaksis olarak bilinen yönlü göçü yönlendiren bir sinyal gradyanı oluşturur. Kemotaksis, onları belirli bir yöne veya konuma yönlendirebilecek gradyandaki küçük değişikliklere yanıt verebilen T hücreleri ile hassas bir şekilde düzenlenir ve oldukça hassastır.

Bu T hücresi ile ilgili faktörlere ek olarak, migrasyon ayrıca hücre dışı matris (ECM) bileşimi ve yoğunluğundan da etkilenir. ECM, T hücreleri üzerindeki yapışkan integrin reseptörleri için iskele sağlayan kollajen ve proteoglikanlar dahil olmak üzere yoğun bir protein ağından oluşur. İntegrinler, her biri son derece uzmanlaşmış bağlanma alanlarına ve aşağı akış sinyalleme etkilerine sahip çeşitli bir transmembran protein ailesidir. Bir T hücresinin yüzeyindeki integrin reseptörlerinin dinamik ekspresyonu, değişen ortamlarına hızlı adaptasyon sağlar3. Daha da önemlisi, integrinler, T hücresi hareketi için gerekli itme kuvvetini üretmek için birlikte çalışan ECM ve hücre içi hücre içi iskelet aktin ağlarını birbirine bağlar.

Özetle, göç modelleri bağışıklık hücresi fenotipine veya çevresel sinyallere göre değişir. Bu karmaşık biyolojik süreçler, T hücresinin, çevreleyen hücrelerin ve lokal, enfekte olmuş dokunun yüzeyindeki sitokinlerin, kemokinlerin ve integrinlerin ekspresyonu ile sıkı bir şekilde düzenlenir. İn vivo, bu göç mekanizmaları karmaşık olabilir ve birkaç katkı sinyalindenkaynaklanabilir 4. Bu karmaşıklık nedeniyle, görünüşte birbirine kenetlenmiş değişkenler arasında nedensel bir ilişki kurmak imkansız olabilir. Bunun üstesinden gelmek için, spesifik kemokin sinyallerine yanıt ve T hücresi integrinleri ile ECM bağlayıcı proteinler arasındaki etkileşim gibi T hücresi göçünün belirli yönlerini incelemek için birkaç in vitro yaklaşım vardır. Bu protokol, iki boyutlu uzayda in vitro migrasyon testleri ve belirtilen T hücresi migrasyonunu analiz etmek için hesaplamalı analiz araçları ile murin CD8+ T hücrelerini izole etme ve aktive etme yöntemlerini ele alır. Bu yöntemler, literatürde açıklanan diğer bazı hücre göçü tahlillerinde olduğu gibi karmaşık malzemeler veya cihazlar gerektirmedikleri için kullanıcı için avantajlıdır. Bu yöntemlerle oluşturulan hücre göçü verileri, in vivo olarak daha fazla ve bilinçli araştırmayı mümkün kılan basit bir şekilde bağışıklık tepkilerinin kanıtını sağlayabilir.

Protokol

Hayvan protokolleri, Rochester Üniversitesi'ndeki Üniversite Hayvan Kaynakları Komitesi tarafından onaylandı. Bu çalışmadaki fareler, Rochester Üniversitesi hayvan tesisinin patojen içermeyen alanında tutuldu. Bu çalışma için 6-12 haftalık (15-30 g) erkek / dişi C57BL / 6 fareleri kullanıldı. Fare dokusu izolasyonu, elleri örtmek için eldivenler ve burun ve ağzı kapatmak için bir yüz maskesi ile bir tezgah üzerinde veya bir biyogüvenlik kabini içinde gerçekleştirilebilir. Tüm hücre kültürü ve plaka hazırlığı bir biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır. Bu çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. CD8 + T hücresi saflaştırma ve aktivasyonu

  1. Malzemelerin hazırlanması
    1. CD8 + T hücrelerinin negatif seçimi için: Sırasıyla anti-CD4 ve anti-MHCII üreten hibridoma hücre hatları GK1.5 ve M5 / 114 antikorlarının süpernatantından negatif bir seçim ortamı hazırlayın. Süpernatanı 1:1 oranında karıştırın, süzün ve ileride kullanmak üzere 4 °C'de saklayın (her antikordan >0.5 μg / milyon toplam hücre). Alternatif olarak, ticari CD8 + T hücre izolasyon kitleri mevcuttur.
    2. T hücrelerinin aktivasyonu için: 1x DPBS'de (kalsiyum ve magnezyum olmadan) 500 μL CD3 (10 μg/mL) ve CD28 (16 μg/mL) antikorlarını doku kültürü (TC) ile muamele edilmiş 24 oyuklu bir plakaya ekleyin ve plakanın bağlanmasını sağlamak için gece boyunca 4 ° C'de saklayın.
      NOT: Antikorlar ve proteinler, TC ile muamele edilmemiş kültür plakalarını/tabaklarını normal TC ile muamele edilenlerden daha iyi kaplar, bu nedenle TC ile muamele edilmemiş kültür plakaları T hücresi üretimi için kullanılır.
  2. Tabağa 70 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirerek 10 cm'lik bir kültür kabı (veya eşdeğeri) hazırlayın ve filtreye 2 mL R9 ortamı dağıtın (R9 ortamı: %10 FBS ile desteklenmiş RPMI 1640x, %1 antibiyotik-antimikotik, 20 mM HEPES tamponu, %1 MEM esansiyel olmayan amino asitler, 50 μM β-merkaptoetanol).
  3. Deneysel tasarım tarafından belirlenen uygun genetik geçmişe, cinsiyete, yaşa ve kiloya sahip bir fare elde edin.
  4. Fareyi CO2 kullanarak ötenazi yapın, ardından servikal çıkık veya yerel hayvan bakımı ve kullanım protokolleri tarafından tanımlanan ve kurum tarafından onaylanan uygun ötenazi stratejileri uygulayın.
  5. Fareyi sırtüstü pozisyona getirin, dört uzvunu da vücuda dik olarak gerin ve ayak pedlerini fare diseksiyon T pimleri veya eşdeğerini kullanarak bir diseksiyon tahtasına sabitleyin. Fare cerrahi diseksiyon makası ile ventral alt karın bölgesindeki kutanöz tabakadan yüzeysel, merkezi bir kesi yapın ve çeneye kadar düz bir şekilde kesin (~ 8 cm). Lenf düğümlerini ortaya çıkarmak için cildi peritoneal astardan ayırın. Cildi gövdeden dik olarak gerin ve sabitleyin5.
    1. Künt forseps (veya standart bir fare cerrahi diseksiyon kitinden tercih edilen tip) kullanarak servikal, eksenel, brakiyal ve kasık lenf düğümlerini bilateral olarak nazikçe eksize edin. Adım 1.2'de hazırlanan hücre süzgecine aktarın.
    2. Peritonu açın ve dalağı çıkarın. Adım 1.2'de hazırlanan hücre süzgecine aktarın.
    3. Fare karkasını uygun biyolojik tehlike kabına atın.
  6. Doku bozma aletini tekrar tekrar saat yönünde ve saat yönünün tersine yarım tur çevirerek, adım 1.2'den itibaren 2 mL R9 ortamı ile 70 μm hücre süzgeci üzerinde mekanik bozulma yoluyla ikincil lenfoid dokuların tek hücreli bir süspansiyonunu hazırlayın.
    NOT: 3 mL veya 10 mL luer kilitli bir şırınganın piston ucu, dokuyu ezmek ve homojenize etmek için iyi çalışır. Kullanıcının takdirine bağlı olarak alternatif malzemeler kullanılabilir.
  7. Hücreleri, şırınga ucunu, süzgeci ve kültür kabını 7 mL ortamla yıkayın, böylece tek hücreli süspansiyona bulunabilecek daha büyük doku parçalarının veya hücresel agregaların transferini önlemek için süzgecin dik kalmasını sağlayın.
  8. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
  9. Hücreleri oda sıcaklığında (20 ° C) 270 x g'da 5 dakika boyunca pelet haline getirin ve süpernatanı boşaltın.
  10. Kırmızı kan hücrelerini çıkarmak için 1 dakika boyunca 500 μL lizasyon tamponu ekleyin. 9.5 mL R9 ortamı ile seyreltin ve 270 x g'da (20 ° C) 5 dakika döndürün. Süpernatanı boşaltın.
  11. Pelet, anti-MHCII ve anti-CD4 içeren önceden hazırlanmış negatif seçim ortamının 10 mL'sinde yeniden süspanse edin (adım 1.1.1). Oda sıcaklığında (20 °C) 30 dakika boyunca kayalayın.
  12. Hücreleri 5 dakika boyunca 270 x g'da pelet haline getirin ve süpernatanı boşaltın. 3x'i 10 mL R9 ortamı ile yıkayın.
  13. Eşzamanlı olarak, 15 mL'lik bir konik tüpte, 200 μL koyun sıçan önleyici IgG boncuklarını 7 mL ortamda yıkayın. Tüpü bir mıknatısın üzerine yerleştirin, ortamı çıkarın ve yıkama adımını iki kez tekrarlayın. Boncukları 7 mL R9 ortamında yeniden süspanse edin.
  14. Hücreleri 5 dakika boyunca 270 x g'da (20 ° C) pelet haline getirin, süpernatantı boşaltın ve ardından peleti adım 1.13'ten itibaren 7 mL boncuk süspansiyonunda yeniden süspanse edin. Oda sıcaklığında (20 °C) 45 dakika bekletin.
  15. CD8 + T hücrelerini manyetik boncuk tükenmesi ile zenginleştirin. Antikor / boncuk bağlı hücreleri çıkarmak için konik tüpü 3 dakika boyunca kapaksız olarak doğrudan mıknatısın üzerine yerleştirin. CD8 + hücreleri korunmalıdır. Tüp hala mıknatısın içindeyken, serolojik bir pipet veya eşdeğeri kullanarak hücre süspansiyonunu toplayın ve yeni bir 15 mL tüpe aktarın. 270 x g'da (20 °C) 5 dakika santrifüjleyin ve 3 kez orta derecede yıkayın.
  16. Önceden kaplanmış aktivasyon plakasını (adım 1.1.2) plakanın alt yüzeyine doğrudan pipetlemeden 1x DPBS ile iki kez yıkayın.
  17. İsteğe bağlı: Ölü hücreleri çıkarmak için canlı/ölü lenfosit ayrımı yapın.
    1. Hücreleri 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın. Hücre süspansiyonunun altına yavaşça 2 mL lenfosit ayırma ortamı ekleyin. Düşük hızlanma ve yavaşlamada 10 dakika (oda sıcaklığında) 900 x g'da santrifüjleyin.
      NOT: Canlı hücreler, ortam ve ayırma ortamının (ortadaki beyaz katman) arayüzünde ayrılacaktır. Ölü hücreler tüpün dibinde topaklanır ve sonunda atılabilir.
    2. Canlı lenfositleri içeren orta tabakayı yeni bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 270 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltın.
  18. Peletleri 10 U / mL rekombinant fare IL-2 ile 12 mL ortamda yeniden süspanse edin. TC ile muamele edilmemiş 24 oyuklu bir plakada oyuk başına 1 mL plaka ve gece boyunca 37 ° C'ye aktarın.

2. Aktive edilmiş CD8 + T hücrelerinin kaldırılması

  1. 4x veya 10x objektifi kullanarak standart bir tezgah üstü ışık mikroskobu kullanarak hücreleri görselleştirin.
    NOT: Aktive edilmiş T hücreleri, inaktive edilmiş T hücrelerine kıyasla daha büyük ve yuvarlak veya uzun görünecektir ve kuyu boyunca yoğun hücre kümelerine sahip olmalıdır.
  2. Aktive olmuş hücreleri kaldırmak için, hücreleri 1 mL'lik bir pipetle parçalayın ve plakanın kenarlarında iyice karıştığından emin olun. Hücreleri 15 mL'lik yeni bir konik tüpe aktarın.
    NOT: Etkinleştirilmiş hücreler daha yapışkandır ve daha güçlü pipetleme gerektirir.
  3. Kalan hücreleri çıkarmak için kuyuları 1 mL R9 ortamı ile yıkayın. Gerekirse bir kez daha tekrarlayın. Hücreleri 270 x g'da (20 ° C) 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
  4. Adım 1.17-1.18'de olduğu gibi ölü hücreleri çıkarmak için canlı / ölü lenfosit ayrımı yapın.
  5. TC olmayan 6 oyuklu bir plakada IL-2 ile R9 ortamında her 3-4 günde bir canlı / ölü hücre temizliği ile T hücrelerini koruyun.
    NOT: T hücreleri, muhtemelen aktivasyonlarına yardımcı olan T hücresi-T hücresi temasları veya T hücresi kaynaklı çözünür faktörler nedeniyle, erken aktivasyon sırasında küçük boyutlu kuyularda daha iyi çoğalır. Hızlı T hücresi proliferasyonu, kültür ortamının kültürden 24-48 saat sonra sararmasına neden olur. Bu noktada, hücreleri kaldırın ve hücreleri, hücreleri beslemek için yeterli taze kültür ortamı (tipik olarak kuyucuk başına 5 mL) ile daha büyük bir kuyuya (kaplanmamış, TC olmayan 6 oyuklu plaka) aktarın. Tükenmiş ortamı, sarı orta renk değişimi ile belirtildiğinde veya her 3-4 günde bir taze ile değiştirin.

3. Cam tabağın hazırlanması

  1. Gece boyunca 4 °C'de 300 μL/cm2 Protein A (0.1 mg/mL) ile kaplayarak cam hücre migrasyon odalarını veya plakalarını hazırlayın, bir sonraki adıma geçmeden önce tabağa dağıtarak ve boşaltarak 1x DPBS ile iki kez yıkayın.
  2. Göç odasını veya plakasını 300 μL / cm2 rekombinant fare ICAM-1 veya VCAM-1 Fc kimera (0.1-2.75 mg / mL) ile rekombinant fare kemokini (0.1-10 μg / mL) ile kaplayın oda sıcaklığında 2-3 saat. Fibronektin, fare kollajen IV ve fare E-kaderin gibi diğer integrin ligandları, 4 ° C'de gece boyunca 2.5-10 μg / mL'de odayı doğrudan kaplamak üzere işlenir.
    1. Hücreleri eklemeden önce tabağa dağıtarak ve hemen ardından boşaltarak hazneleri 1x DPBS ile iki kez yıkayın.
      NOT: T hücreleri, aktivasyon, farklılaşma, duyarlılaşma ve hazırlama durumuna bağlı olarak farklı integrin ligandları ve kemokin konsantrasyonlarında farklı şekilde göç edebilir. Birden fazla farklı konsantrasyonda hücre göçünün test edilmesi şiddetle tavsiye edilir.
  3. Kanser hücrelerinin T hücresi öldürmesini gerçek zamanlı olarak ölçmek için T hücrelerini kanser hücreleri gibi diğer hücrelerle birlikte kültürlüyorsanız, görüntülemenin başlamasından 24 saat önce yapışık hücreleri cam kaplı plakalar üzerine yerleştirin.

4. Hücrelerin hazırlanması

  1. İsteğe bağlı: T hücrelerini ve yapışkan hücreleri, 37 °C'de 15 dakika boyunca 1x DPBS'de 1 x 107 hücre başına 1 μg/mL'de tercih edilen hücre izleyici boyası ile boyayın.
  2. Bir hemositometre veya eşdeğeri kullanarak hücreleri sayın.
  3. Plaka: 1 x 10,5 CD8 + Leibovitz'in L-15 ortamındaki T hücreleri (veya istenen miktar), 37 ° C'lik bir odada 1-5 g / L glikoz ile desteklenmiştir.
    NOT: L-15 ortamı, CO2-sodyum bikarbonat sistemi olmadan kullanım için formüle edilmiştir. PH seviyelerini korumak için serbest bazik amino asitler, fosfat tamponları ve galaktoz kullanılarak tamponlanır.
  4. İsteğe bağlı: İntegral engelleme gerçekleştirin.
    1. T hücrelerini bir integrine (1-10 μg/mL, anti-fare CD11a (M17/4), anti-fare CD18 (M18/2), anti-fare VLA-4'e (9C10) karşı bloke edici bir antikor ile 10 dakika önceden inkübe edin ve aynı antikorun varlığında taramaya bırakın.

5. Hızlandırılmış mikroskopi

  1. Video mikroskobu yapın.
  2. T hücreleri için, 10-60 dakika boyunca her 10-60 saniyede bir parlak alan ve floresan görüntüler veya istenen çekim ayarları elde edin.
    NOT: T hücresi göçü sıcaklığa duyarlıdır ve fare T hücresi göçü için en uygun sıcaklık 37 °C'dir. Bu protokolün kullandığı sıcaklık kontrol sistemi, bağlı bir ısıtma sistemine sahip kapalı ve yalıtımlı bir mikroskop güvertesinden oluşur. Görüntüleme odası, görüntüleme güvertesine oturur. Bu odanın çevresi, görüntüleme sırasında tutarlı ısı ve neme izin veren damıtılmış su ile doldurulmuş bir kuyuya sahiptir. Mikro kuyu, görüntüleme odasının merkezine yerleştirilmiştir.

6. T hücresi göçünün yazılım destekli analizi

  1. T hücresi göçünü değerlendirmek için Volocity yazılımını kullanın.
    1. Volocity'yi açın ve yeni bir görüntü dizisi oluşturun.
    2. Tüm zaman atlamalı video mikroskobu filmlerini seçin ve Volocity'deki mavi alana taşıyın.
    3. Kontrast geliştirme aracını kullanarak parlaklığı ve kontrastı araştırmacının istediği ayarlara ayarlayın.
    4. Görüntü boyutlarını kontrol edin: 20x için 0,325 μm, 10x için 0,65 μm.
    5. Sıra: zaman noktalarını ayarlayın (ör. 20 dakika boyunca her 15 saniyede bir görüntü çekiyorsanız 81 görüntü, dakikada 4 görüntü).
    6. Ölçüm sekmesindeki tüm zaman noktalarının işaretini kaldırın.
    7. Yoğunluğu kullanarak nesneleri bulun - çubuğu zirvenin tam sağında olacak şekilde kaydırın.
    8. Nesneleri boyuta göre hariç tutun: hücre kalıntılarını veya hücresel olmayan parçacıkları dışlamak için çapı 10 μm'den küçük ve 100 μm'den büyük tüm hücreler. Kayıt süresinin %20'sinden daha az bir süre boyunca geçiş yapan T hücrelerini hariç tutun (bu, her araştırmacının tanımına bağlı olarak değişebilir).
    9. Statik nesneleri yoksay (onay kutusu).
    10. Bozuk yolları otomatik olarak birleştir (onay kutusu).
    11. En kısa yolu 20 μm'den fazla olmayacak şekilde ayarlayın.
    12. Bir hücre göçünün izi, aynı hücrenin zaman içindeki konumunu birbirine bağlayan çizgidir. İzleme algoritmasının, her bir karede segmentasyon ile tek tek nesnelerin nerede algılandığını algılayarak izleme yaptığından ve nesnelerin çerçeveler arasında eşleştirildiğinden emin olun.
    13. Ölçümler > Protokolü Kaydet > Yeni Protokol Adlandır'ı seçerek yeni bir protokol kaydedin.
    14. Ölçüm sekmesinde tüm zaman noktalarını ölç'e tıklayın.
    15. Parçaları zaman aralığına göre, yüksekten düşüğe doğru sıralayın.
    16. Araştırmacı tarafından tanımlandığı şekilde iyi izlere sahip tüm hücreler için parça kimlik numaralarını kaydedin. Otomatik hücre izlemeden sonra, yanlış tanımlanmış veya bozuk izleri dışlamak için her hücre izinin manuel olarak değerlendirilmesi gerekir. Kötü izlere sahip hücreleri hariç tutun.
    17. Dosyayı virgülle ayrılmış metin olarak dışa aktarın ve verileri istenen analiz yazılımına aktarın.
      NOT: Temel parametreler: Hız (μm/dak), yer değiştirme (net hareket, μm), iz uzunluğu (toplam yol uzunluğu, μm) ve kıvrım indeksi (MI; net yer değiştirme/iz uzunluğu. MI = 1 tamamen düz bir doğrusal izi gösterir).
  2. Image J'yi kullanarak manuel izleme gerçekleştirin.
    1. Eklentileri açın ve izleme ve manuel izlemeyi seçin. Parametreleri ayarlayın - zaman aralıkları, x/y kalibrasyonu (piksel boyutu) ve z kalibrasyonu (manuel izleme modunda). İz ekle'ye tıklayarak, ilk zaman noktasında bir hücre seçerek ve tüm zaman noktalarında devam ederek tek tek hücre izlemeyi başlatın. Ardından, Parçayı sonlandır'a tıklayın. İlgilendiğiniz tüm hücreler için tekrarlayın.
      NOT: Hücre takibi için başka bir araç olan Trackmate, ImageJ eklentisi aracılığıyla kullanılabilen otomatik bir izleme yazılımıdır.

Sonuçlar

T hücresi aktivasyonunun doğrulanması, murin T hücrelerinde6 kanonik aktivasyon belirteçleri olan CD69 ve CD44'ün artmış ekspresyonunu arayan akış sitometrisi ile sağlanabilir. Ek olarak, T hücresi popülasyonunun saflığı, CD3 + CD8 + T hücreleri için akış sitometrisi ile belirlenebilir. Bu yöntem %>90 CD8+ T hücre popülasyonu sağlar.

T hücresi göçü, hem tekrarlanabilir hem de araştırmacının ihtiyaçlarına uyacak şekilde ayarlanabilen yazılım destekli hücre izleme programları ile değerlendirilebilir. Deneysel etkileri belirlemek için kullanılan bazı temel parametreler arasında hücresel hız (bir hücrenin ne kadar hızlı hareket ettiğini belirlemek için belirli bir süre başına göç uzunluğu), yer değiştirme (göç mesafesi, bir hücrenin ne kadar uzağa göç ettiğini belirlemek için başlangıç noktasından bitiş noktasına kadar düz bir çizgi), iz uzunluğu (göç mesafesi, bir hücrenin ne kadar göç ettiğini belirlemek için göç yolunun toplam uzunluğu), ve kıvrımlı indeks (MI, göçün düzlüğünü belirlemek için 0 ile 1 arasındadır, 1 = düz). Bu parametreler, CXCL12 ile ICAM-1 kaplı cam boyunca sürünen saf ve aktive edilmiş CD8+ T hücrelerindeki göç farklılıklarını değerlendirmek için kullanılır (Şekil 1). Aktive edilmiş CD8 + T hücrelerinde naif hücrelere kıyasla artmış ortalama hız, yer değiştirme ve kıvrım indeksi gözlendi, bu da aktive edilmiş T hücrelerinin migrasyon kabiliyetinin arttığını gösteriyor. Benzer şekilde, farklı kemokinlerin hücresel göç paternleri üzerindeki etkisi bu yöntemlerle açıklanabilir. Örneğin, aktive edilmiş CD8 + T hücreleri, CXCL12 varlığında artmış migrasyon sergiler, ancak CCL2 veya CCL22 göstermez ve migrasyon, doza bağlı bir şekilde doymuş bir konsantrasyona yükselir (Şekil 2). Ayrıca, yazılım destekli hücre izleme, bireysel ligandların T hücresi davranışı üzerindeki etkilerinin anlaşılmasını sağlayan bireysel hücre göçünün karakterizasyonunu sağlar. Temsili hücre izleri Şekil 3'te görülebilir.

Birlikte ele alındığında, bu veriler (1) hücre göçünü tek tek hücre bazında izleyebildiğimizi ve (2) aktivasyon durumuna ve farklı kemokinlerin ve adezyon moleküllerinin varlığına dayalı olarak CD8 + T hücrelerinin göçündeki farklılıkları ayırt edebileceğimizi doğrulayarak mevcut yöntemlerin etkinliğini desteklemektedir. Bu tahlil, karmaşık sinyalleme mekanizmalarının incelenmesinde ve spesifik sinyallerin biyolojik katkılarını hücre tipine özgü bir şekilde daha fazla ele alabilen odaklanmış in vivo deneylerin bilgilendirilmesinde kritik bir adımdır.

figure-results-1
Şekil 1: Naif ve aktive edilmiş CD8 + T hücresi göçü için in vitro deneyler. Naif veya CD3 / CD28 ile aktive edilen fare CD8 + T hücrelerinin ICAM-1 ve CXCL12 üzerinde 10 dakika boyunca göç etmesine izin verildi. Hücre göçünün hızı, yer değiştirmesi ve kıvrımlı indeksi, hızlandırılmış mikroskopi ve Volosite kullanılarak analiz edildi. Her grupta 36 ayrı T hücresi vardır (ortalama ± SEM). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Aktive edilmiş CD8 + T hücrelerinin kemokin bağımlı göçü için in vitro deneyler. CD3 / CD28 ile aktive edilen fare CD8 + T hücrelerinin ICAM-1 artı endike bir kemokin üzerinde göç etmesine izin verildi. 20 dakika boyunca 50 μm'den fazla sürünen hücre sayısının oranları (toplam yüzdesi) bir görüş alanında belirlendi. Tek bir tahlil >10 hücreyi analiz etti (n = grup başına 3 tahlil, ortalama ± SEM). Eşlenmemiş t-testi, *p< kontrol ile karşılaştırıldığında 0.05. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: ICAM-1 ve CXCL12 üzerinde 20 dakika boyunca aktive edilmiş CD8+ T hücrelerinin göç izleri. Her renkli çizgi, her bir T hücresinin, hücrenin noktasından karşısına doğru bir yönde göç izini gösterir. Bu özel tahlilde, 38 hücreden 24'ü önemli bir uzunlukta (en azından bizim tanımımıza göre hücre genişliklerinin mesafesi) göç etti. T hücreleri farklı mesafelerde göç etti, bu da her hücrenin farklı bir aktivasyon veya hazırlama durumunda olduğunu gösteriyor. Göç eden tüm hücreler, yüzeyin düzgün bir şekilde kaplanması koşuluyla farklı yönlerde hareket etti. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

İn vivo olarak yakınsak sinyallerin biyolojik etkisini anlamak zordur ve yorumlanması kolay değildir. Burada sunulan protokoller, yüksek düzeyde tanımlanmış ve biyolojik olarak ilgili koşullarda T hücresi göçünü anlamak için makul bir yöntem sağlar. Bu koşullar, araştırmacının takdirine bağlı olarak belirlenebilir ve protokoller, çeşitli T hücresi popülasyonlarının, aktivasyon durumunun ve hücre fenotipinin ihtiyaçlarına uyacak şekilde değiştirilebilir. Ayrıca, birçok ligand ve reseptör, bu tanımlanmış antikor blokeedici 7,8 ve ligand kaplı cam prosedürleri8,9,10 aracılığıyla sorgulanabilir. Bu teknik aynı zamanda tasarlanmış bağışıklık hücreleri geliştirmek için kritik bir platform olmuştur 11,12.

Protokoldeki önemli adımlar arasında sekonder lenfoid dokunun izolasyonu, T hücrelerinin aktivasyonu, cam görüntüleme kaplarının kaplanması ve veri analizi yer almaktadır. Deneyimsiz bir göz için, dokuya gömülü lenf düğümlerinin tanımlanması ve çıkarılması zor olabilir. Bu pratik ile aşılabilir. T hücreleri izole edildikten ve saflaştırıldıktan sonra, aktivasyon adımı, düzgün bir şekilde kaldırılmadığı takdirde düşük verime neden olabilecek yapışkan hücrelerle sonuçlanır. Bu, kuyuların cömert ve dikkatli bir şekilde yıkanmasıyla önlenebilir. Cam tabaklar, ilgilenilen ligand ile uygun şekilde kaplanmalı ve hücrelerin eklenmesinden önce yıkanmalıdır. Bu, hücrelerin yapışması için sağlam bir protein tabakasının mevcut olmasını sağlarken, aynı zamanda fazla reaktifin biyolojiyi bozmamasını da sağlayacaktır. Fizyolojik pH ve tuz konsantrasyonundaki protein A-cam yüzey bağlanması ve Fc-Protein A bağlanması, tamponu nazikçe dökerken ve boşaltırken yıkanmaya direnecek kadar güçlüdür. Ortamdaki kalıntı proteinler, eğer varsa, bağlanmamış olanlar yüksek konsantrasyonlarda ise, bağlı ligandlarla hücre etkileşimini bozabilseler bile, herhangi bir toksisiteye neden olmazlar. Kaplanmış camı birkaç kez durulayarak bu olasılığı ortadan kaldırıyoruz. Son olarak, araştırmacıların hücresel davranışlar ve morfolojilerdeki ince farklılıkları bile tespit etmelerine olanak tanıyan birçok kullanıcı dostu ticari ve ticari olmayan yazılım mevcuttur. Yazılımın yapabileceği hataları dışlamak için analiz edilen sonuçları manuel olarak güvence altına almanın önemi göz ardı edilemez.

T hücresi saflaştırma ve aktivasyon yöntemleri, in vivo gözlemleri özetlemek için uygun hücre durumunu ve fenotipini elde etmek için araştırmacının ihtiyaçlarına uyacak şekilde değiştirilebilir. Farklı enfeksiyon ve bağışıklık tepkisi mekanizmalarını ele almak için çeşitli hücre tipleri ve durumları kullanılabilir 7,8,9,10,11,13, naif ve hafıza T hücresi davranışını ve dokuya özgü koşullarda hazırlama ve işe alma gibi hafıza tepkisinin çeşitli yönlerini ele almak da dahil olmak üzere 14. Bu yöntem, hücre-hücre temas sürelerive süresi 7,9, antijen sunumu 9,13 ve hedef hücre öldürme6 dahil olmak üzere hücresel etkileşimleri daha iyi anlamak için farklı hücre tipleriyle ko-kültür için kullanılabilir. Hücre altı yapıları 7, granülleri 15, apoptozu 6 ve daha fazlasını değerlendirmek için ek raporlayıcılar ve etiketler kullanılabilir.

Protokol, basitleştirilmiş ve yüksek düzeyde tanımlanmış koşullardaki gözlemlere dayalı ek in vivo deneylere rehberlik etmek için mükemmel bir araçtır. Hücre motilitesinin in vitro değerlendirmesi oldukça indirgeyici olabilirken, karmaşık biyolojik aktivitelerin parçalanmasında önemli bir adımdır. Bu deneylerin sonuçlarıyla, araştırmacılar in vivo çalışmalara fizyolojik olarak daha ilgili ve hedeflenmiş bir şekilde yaklaşabilirler.

Bu yöntemin basitliği aynı zamanda ana sınırlamasını da temsil eder; İn vivo aktiviteleri temsil etse de, tüm sonuçlar, örneğin intra-vital multifoton mikroskobu kullanılarak daha fazla doğrulanabilir. Burada açıklanan yöntem, mikroskop sistemine entegre edilmiş veya dürbünün amacına ayrı olarak yerleştirilmiş bir dijital kameraya sahip bir parlak alan mikroskobu ve/veya epifloresan mikroskobu ile araştırma laboratuvarları için tamamen mevcut olan en basit yöntemlerden biridir. Öte yandan, in vitro immün hücre göçünün ileri analizi için daha fazla seçenek vardır. İlk olarak, bağışıklık hücreleri genellikle biyolojik sistemdeki kemokin gradyanları tarafından yönlendirilir. Kemokin gradyanları altında bağışıklık hücresi davranışlarının analizi çeşitli yollarla elde edilebilir. Basit bir yöntem, özel olarak tasarlanmış bir slayt kullanmaktır (bkz. Bu kanallı kuyu sistemi, tabanı integrin ligandları ile kaplandığında, statik kemokin gradyanı altında bağışıklık hücresi göçünün analizini sağlar. İmmün hücre kemotaksisi için diğer basit tahliller, agaroz tahlili17 ve Zigmond odası18 altında kemokin16 salgılayan bir mikropipet ucuna hücre göçünün hızlandırılmış mikroskobunu içerir. Kontrollü kemokin gradyanları altında daha karmaşık migrasyon deneyi için, mikroakışkan gradyan üreteçleri ile özelleştirilmiş slaytlar gereklidir19,20. İkincisi, bağışıklık hücreleri, bazen ligandlara integrine bağımlı yapışma kullanmadan, farklı mekanizmalar kullanarak benzersiz fiziksel koşullarda göç edebilir. Tek boyutlu in vitro migrasyon testi, integrin ligand kaplaması ile veya kaplaması olmadan yapılabilir ve kılcal damarlardaki bağışıklık hücrelerinin motilitesini yeniden üretir21,22. Başka bir seçenek, hücrelerin 25,26 interstisyel göçünün altında yatan mekanizmaları araştırmak için üç boyutlu uzayda 23,24 hücre göçü deneyidir. Genel olarak, dinamik hücresel göç olaylarını incelemek için basit, tekrarlanabilir ve güvenilir yöntemler belirledik.

Açıklamalar

Yazarlar, tüm araştırma ve makale hazırlığının, potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda yürütüldüğünü beyan eder.

Teşekkürler

Zaman içinde bu protokollerin geliştirilmesine katkıda bulunan Kim Lab'ın önceki ve mevcut üyelerine teşekkür ederiz. Temsili veriler P01 AI102851/AI/NIAID NIH HHS/Amerika Birleşik Devletleri ve P01 HL018208/HL/NHLBI NIH HHS/Amerika Birleşik Devletleri tarafından mümkün kılınmıştır. Bu yayın, kısmen Kurumsal Ruth L. Kirschstein Ulusal Araştırma Hizmeti Ödülü'nden GM135134 T32 Hibe Numarası ile mümkün olmuştur.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10 cm'lik çanakCorning353003veya eşdeğeri
15 mL konik tüpThermoFisher339650veya eşdeğeri
1x DPBSGibco14190144kalsiyum ve magnezyum içermez
6 oyuklu plaka, TC işlem görmemişCorning3736veya eşdeğeri
70 &mikro; m hücreli süzgeçFisherScientific352350veya eşdeğeri
ACK parçalama tamponuThermoFisherA1049201veya eşdeğeri
Allegra 6KR santrifüjThermoScientificsorvall 16R, tx400 3655 rotor ve kovaveya eşdeğeri
Beta merkaptoetanolSigmaM3148veya eşdeğeri
CellTrace VioletThermoFisherC34571Veya eşdeğeri
SantrifüjThermoScientificSorvall ST 16Rveya eşdeğeri
Kollajen (IV)Corning354233veya eşdeğeri
DeltaT kültür kabı .17 mm kalınlığında cam şeffafBioptechs04200417C
Dynabeads Koyun sıçan önleyici IgGInvitrogen11035
DynaMag 15 MıknatıslıThermoFisher Scientific12301Dveya eşdeğeri
Kolay sep fare T hücre izolasyon kitiKök Hücre19851
FBSSigmaAldrichF2442-500MLveya eşdeğeri
FibronektinSigmaAldrich10838039001veya eşdeğeri
Fijihttp://fiji.sc/weblink
Filtre küpleriNikon veya Olympus
GK1.5ATCCTIB-207
HEPESThermoFisher15630080veya eşdeğeri
HQ CCD kameraCoolSNAPveya eşdeğeri
https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.htmltakın web bağlantısı
L-15Çeşitli Bkz. MalzemelerOrta Tarif: Leibovitz' 1-5 g/L glikoz ile desteklenmiş fenol kırmızısı (Gibco) içermeyen L-15 ortamı
Liebovitz'in L-15 ortamı, fenol kırmızısı içermezThermoFisher21083027
Luer Lok tek kullanımlık şırıngaFisher Scientific14-955-459veya eşdeğeri
Lenfosit ayırma ortamıCorning25-072-CIveya eşdeğeri
M5/114ATCCTIB-120
MEM Esansiyel Olmayan Amino AsitlerThermoFisher11140050veya eşdeğeri
Mikroskop ısıtma sistemiOkolabokolab.comÖzel tasarımlar mevcuttur
Millicell EZ slaytMilliporeC86024
Mojosort fare CD8 + Naï ve T hücre izolasyon kitiBiolegend480043
Mouse E-cadherinR& D sistemleri8875-EC-050veya eşdeğeri
Fare cerrahi diseksiyon kitiFisher Scientific13-820-096veya eşdeğeri
NIS öğeleriNikonYazılımı
TC olmayan 24wpCorning353047veya eşdeğeri
Penisilin-streptomisinThermoFisher15140122veya eşdeğeri
Protein AThermoFisher Scientificveya eşdeğeri
R9Çeşitli BakınızMalzemeleriOrta Tarif: RPMI 1640x, %10 FBS, %1 antibiyotik-antimikotik (Gibco), 20 mM HEPES tamponu (Gibco), %1 MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler (Gibco), 50 & mu; M β-merkaptoetanol (Sigma-Aldrich)
Rekombinant fare ICAM-1 Fc chimeraR& D sistemleri796-IC-050veya eşdeğeri
Rekombinant Fare IL2Biolegend575410veya eşdeğeri
RPMI 1640xThermoFisher11875093veya eşdeğeri
T pinleriFisherScientific S99385veya eşdeğeri
TE2000-U mikroskobuNikonveya eşdeğeri
Çeşitli rekombinant fare kemokiniR& D sistemleriveya eşdeğeri
VCAM-1 Fc chimeraR& D sistemleri643-VM-050veya eşdeğeri
VolocityPerkinElmerYazılımı
ImageJ http://imagej.nih.gov/ij/h web bağlantısı ImageJ otomatik izleme eklentisi http://imagej.net/TrackMate web bağlantısı ImageJ manuel izleme

Kaynaklar

  1. Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235(2023).
  2. Fowell, D. J., Kim, M. The spatio-temporal control of effector T cell migration. Nat Rev Immunol. 21 (9), 582-596 (2021).
  3. Tabdanov, E. D., et al. Engineering t cells to enhance 3d migration through structurally and mechanically complex tumor microenvironments. Nat Commun. 12 (1), 2815(2021).
  4. Kameritsch, P., Renkawitz, J. Principles of leukocyte migration strategies. Trends Cell Biol. 30 (10), 818-832 (2020).
  5. Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse naive CD4+ T cell isolation and in vitro differentiation into t cell subsets. J Vis Exp. (98), e52739(2015).
  6. Sailer, C. J., et al. Pd-1(hi) CAR-T cells provide superior protection against solid tumors. Front Immunol. 14, 1187850(2023).
  7. Lim, K., Hyun, Y. M., Lambert-Emo, K., Topham, D. J., Kim, M. Visualization of integrin mac-1 in vivo. J Immunol Methods. 426, 120-127 (2015).
  8. Lim, K., et al. Neutrophil trails guide influenza-specific CD8+ T cells in the airways. Science. 349, 4352(2015).
  9. Lim, K., et al. In situ neutrophil efferocytosis shapes T cell immunity to influenza infection. Nat Immunol. 21 (9), 1046-1057 (2020).
  10. Reilly, E. C., et al. T(rm) integrins CD103 and CD49a differentially support adherence and motility after resolution of influenza virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (22), 12306-12314 (2020).
  11. Amitrano, A. M., et al. Optical control of CD8(+) T cell metabolism and effector functions. Front Immunol. 12, 666231(2021).
  12. Xu, Y., et al. Optogenetic control of chemokine receptor signal and t-cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (17), 6371-6376 (2014).
  13. Capece, T., et al. A novel intracellular pool of IFA-1 is critical for asymmetric CD8(+) T cell activation and differentiation. J Cell Biol. 216 (11), 3817-3829 (2017).
  14. Hirai, T., Whitley, S. K., Kaplan, D. H. Migration and function of memory CD8(+) T cells in skin. J Invest Dermatol. 140 (4), 748-755 (2020).
  15. Mouchacca, P., Schmitt-Verhulst, A. M., Boyer, C. Visualization of cytolytic T cell differentiation and granule exocytosis with T cells from mice expressing active fluorescent granzyme B. PLoS One. 8 (6), e67239(2013).
  16. Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of neutrophil chemotaxis. Methods Mol Biol. 370, 23-36 (2007).
  17. Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients. J Cell Biol. 159 (1), 91-102 (2002).
  18. Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J Cell Biol. 75 (2), Pt 1 606-616 (1977).
  19. Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis. Integr Biol (Camb). 2 (11-12), 648-658 (2010).
  20. Sai, J., Walker, G., Wikswo, J., Richmond, A. The IL sequence in the LLKIL motif in CXCR2 is required for full ligand-induced activation of Erk, Akt, and chemotaxis in HL60 cells. J Biol Chem. 281 (47), 35931-35941 (2006).
  21. Choi, Y., Sunkara, V., Lee, Y., Cho, Y. K. Exhausted mature dendritic cells exhibit a slower and less persistent random motility but retain chemotaxis against ccl19. Lab Chip. 22 (2), 377-386 (2022).
  22. Harding, M. G., Zhang, K., Conly, J., Kubes, P. Neutrophil crawling in capillaries: A novel immune response to staphylococcus aureus. PLoS Pathog. 10 (10), e1004379(2014).
  23. Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zanker, K. S., Dittmar, T. Analysis of cell migration within a three-dimensional collagen matrix. J Vis Exp. (92), e51963(2014).
  24. Wu, P. H., Giri, A., Sun, S. X., Wirtz, D. Three-dimensional cell migration does not follow a random walk. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (11), 3949-3954 (2014).
  25. Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
  26. Overstreet, M. G., et al. Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin αv. Nat Immunol. 14 (9), 949-958 (2013).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

T H cresi MigrasyonuCD8 Pozitif T H creleriZaman Atlamal MikroskopiLenfosit zolasyonuMikroak kan CihazlarH cre zlemeIntegrin BlokajAyd n Alan MikroskopisiManuel H cre zleme
Primer Murin CD8 + T Hücreleri için Gerçek Zamanlı İn Vitro Migrasyon Testi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.