UAS-cDNA/ORF plazmit kütüphanesinin yüksek verimli yapısı için CRISPR tabanlı modüler montaj

Tarafsız tüm genom genetik taraması, belirli bir biyolojik süreçte yer alan genleri tanımlamak ve mekanizmasını aydınlatmak için güçlü bir yaklaşımdır. Bu nedenle, biyolojik araştırmaların çeşitli alanlarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Drosophila genlerinin yaklaşık% 60'ı insanlarda ^1,2 korunur ve insan hastalık genlerinin ~% 75'i Drosophila^3'te homologlara sahiptir. Genetik tarama temel olarak fonksiyon kaybı (LOF) ve fonksiyon kazancı (GOF) olmak üzere iki türe ayrılır. Drosophila'daki LOF genetik taramaları, biyolojinin neredeyse her yönünü yöneten mekanizmaların aydınlatılmasında kritik bir rol oynamıştır. Bununla birlikte, Drosophila genlerinin çoğunluğu belirgin LOF fenotiplerine⁴ sahip değildir ve bu nedenle, GOF taraması bu genlerin ^4,5 işlevini incelemek için önemli bir yöntemdir.

İkili GAL4/UAS sistemi, Drosophila^6'da dokuya özgü gen ekspresyonu için yaygın olarak kullanılır. Bu sistemde, doku, GAL4 duyarlı elemanına (UAS) bağlanan ve böylece aşağı akış genetik bileşenlerinin (örneğin, cDNA ve ORF) transkripsiyonunu aktive eden maya transkripsiyon aktivatörü GAL4'ü spesifik olarak eksprese ^eder6. Drosophila'da genom çapında GOF taramaları gerçekleştirmek için, genom çapında bir UAS-cDNA/ORF plazmit kütüphanesi ve ardından Drosophila'da bir transgenik UAS-cDNA/ORF kütüphanesi oluşturmamız gerekiyor.

Halka açık cDNA/ORF klonlarından geleneksel yöntemlerle genom çapında bir UAS-cDNA/ORF plazmit kütüphanesinin oluşturulması, her genin primer tasarımı ve sentezi, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve jel saflaştırma, dizileme, kısıtlama sindirimi vb. dahil olmak üzere kişiselleştirilmiş tasarımlar gerektirmesi nedeniyle zaman alıcı ve zahmetlidir ^7,8. Bu nedenle, böyle bir plazmit kütüphanesinin inşası, Drosophila'da genom çapında bir transgenik UAS-cDNA/ORF kütüphanesi oluşturmada hız sınırlayıcı bir adımdır. Son zamanlarda, yeni bir yöntem olan CRISPR tabanlı modüler montaj (CRISPRmass)⁹ geliştirerek bu sorunu başarıyla çözdük. CRISPRmass'ın özü, gen düzenleme teknolojisi ve kesintisiz klonlama teknolojisinin bir kombinasyonu yoluyla bir plazmit kütüphanesinin paylaşılan vektör dizilerini manipüle etmektir.

Burada, büyük ölçüde paralel iki aşamalı test tüpü reaksiyonlarını ve ardından bakteriyel dönüşümü içeren CRISPRmass için bir protokol sunuyoruz. CRISPRmass, prensip olarak çeşitli plazmit kütüphanelerinin yüksek verimli inşası için kullanılabilen basit, hızlı, verimli ve uygun maliyetli bir yöntemdir.

CRISPRmass stratejisi
CRISPRmass prosedürü, Escherichia coli (E. coli) dönüşümünden önce paralel iki aşamalı test tüpü reaksiyonları ile başlar (Şekil 1). Adım 1, cDNA/ORF plazmitlerinin özdeş vektör omurgalarının Cas9/sgRNA ile bölünmesidir. İdeal bir bölünme bölgesi, cDNA/ORF'nin 5' ucuna bitişiktir. Dekolte ürünlerinin saflaştırılmasına gerek yoktur. Adım 2, vektöre özgü bir UAS modülünün, Gibson düzeneği (bundan böyle tek adımlı reaksiyon olarak anılacaktır) ile Cas9/sgRNA doğrusallaştırılmış cDNA/ORF plazmitlerine eklenmesidir ve UAS-cDNA/ORF plazmitleri ile sonuçlanır. Bir UAS modülünün 5' ve 3' terminal dizileri, doğrusallaştırılmış cDNA/ORF plazmitlerininkilerle örtüşerek tek adımlı reaksiyonu mümkün kılar.

Tek aşamalı reaksiyon ürünleri doğrudan E. coli dönüşümüne tabi tutulur. Teorik olarak, UAS modülünün antibiyotik direnç genine karşılık gelen seçim antibiyotiklerini içeren Luria-Bertani (LB) plakaları üzerinde yalnızca istenen UAS-cDNA / ORF kolonileri büyüyebilir. UAS modülü, bir çekirdek UAS modülü, cDNA veya ORF plazmitlerinden farklı bir antibiyotik direnç geni ve 5' ve 3' terminal dizilerinden oluşur. Bir çekirdek UAS modülü, 10 UAS kopyası, bir Hsp70 minimal promometre, phiC31 aracılı genomik entegrasyon için bir attB dizisi ve Drosophila⁷ için bir mini-beyaz dönüşüm belirteci içerir.

1. cDNA/ORF'nin yukarı akışında optimal Cas9/sgRNA bölünme bölgesinin belirlenmesi

1. Aynı vektör omurgalı cDNA veya ORF plazmitlerinin hazırlanması
   1. Drosophila genom kaynak merkezi (DGRC, https://dgrc.bio.indiana.edu/) Altın Koleksiyonu^10,11, fare memeli gen koleksiyonu (MGC, https://genecollections.nci.nih.gov/MGC/) ve insan CCSB çapında Lentiviral ekspresyon kütüphanesi¹² gibi kamu kaynaklarında bulunan cDNA/ORF klonlarını satın alın. Bu protokolde, DGRC Altın Koleksiyonunda bulunan pOT2 vektör tabanlı cDNA/ORF klonlarını örnek olarak alıyoruz.
   2. Bir plazmit mini hazırlama kiti kullanarak plazmit DNA'sını çıkarın. Plazmitlerin konsantrasyonunu bir spektrofotometre ile ölçün.
2. sgRNA'ların tasarımı
   1. CHOPCHOP web sitesini ziyaret edin (https://chopchop.cbu.uib.no/). Hedefi Yapıştır düğmesine tıklayın ve ardından ilgilendiğiniz DNA dizisini girin. İlgilenilen dizi, cDNA/ORF 5' ucunun yukarı akışında pOT2 vektör omurgasında bulunan 20-100 bp'lik bir bölgedir.
   2. Drosophila melanogaster türünü seçin. Hedef Siteleri Bul düğmesini tıklayın. Tahmini verimliliği %80'den yüksek olan sgRNA adaylarını seçin.
3. sgRNA'ların hazırlanması
   1. PAGE ile saflaştırılmış oligolar, ileri bir astar sipariş edin (5 "-TAATACGACTCACTATAGG (N) ₂₀GTTTTAGAGCTA
      GAAATAG-3'), burada (N)₂₀ , bir sgRNA'nın hedef dizisidir ve bir sgRNA iskele ters primer sgRNA-REV (5'-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTT-3').
      NOT: PAGE saflaştırılmış yüksek kaliteli oligonükleotidlerin kullanılmasını öneririz.
   2. sgRNA'nın in vitro transkripsiyonu (IVT) için PCR ile bir DNA şablonu hazırlayın. Aşağıdaki gibi 100 μL'lik bir PCR reaksiyonu ayarlayın: 5 μL şablon pX330 (Feng Zhang'ın hediyesi Addgene plazmidi 42230; 0.1 ng/μL), 5 μL ileri astar (10 μM), 5 μL sgRNA-REV (10 μM), 50 μL 2x Yüksek kaliteli PCR ana karışımı ve bir PCR tüpünde 35 μL dietil pirokarbonat (DEPC) ile muamele edilmiş su.
   3. Aşağıdaki termodöngü koşullarını kullanarak PCR gerçekleştirin: 30 saniye boyunca 98 °C'lik 1 döngü; 10 sn boyunca 98 °C, 10 sn için 51 °C, 5 sn boyunca 72 °C'lik 5 döngü; 10 sn boyunca 98 °C'de 30 döngü, 15 sn boyunca 72 °C; 2 dakika boyunca 72 °C'lik 1 döngü. Reaksiyonları bir termal döngüleyicide inkübe edin.
   4. PCR ürünlerini %0,8 agaroz jel elektroforezi ile ayırın. UV altında jel üzerinde ~ 120 bp'lik bir DNA fragmanı görünmelidir. Bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak ~ 120 bp DNA fragmanını saflaştırın. Saflaştırılmış DNA fragmanı, sgRNA'nın IVT'si için bir şablon görevi görür.
   5. Aşağıdaki gibi 5 μL'lik bir IVT reaksiyonu ayarlayın: 165 ng ~ 120 bp saflaştırılmış jel DNA fragmanı, 1.65 μL NTP tampon karışımı, 0.33 μL T7 RNA polimeraz karışımı ve DEPC ile muamele edilmiş su. Reaksiyonları 37 ° C'de 4 saat inkübe edin. Bir in vitro transkripsiyon kitinin manuel talimatlarını izleyin.
   6. IVT reaksiyon ürününe 45 μL DEPC ile arıtılmış su ekleyin. IVT reaksiyon ürünlerini RNA olarak değerlendirin ve DEPC ile arıtılmış suyu boş kontrol olarak kullanın. sgRNA konsantrasyonunu bir spektrofotometre ile ölçün. Seyreltilmiş sgRNA konsantrasyonu 870 ng/μL civarındadır.
   7. IVT reaksiyon ürününü DEPC ile muamele edilmiş su ile 20 ng / μL'ye seyreltin. sgRNA'yı doğrudan -80 °C'de ayırın ve saklayın.
      NOT: IVT reaksiyonundan sonra, DNA şablonunun miktarı sgRNA'nınkinin %0.4'ünden daha az olduğundan ve DNA şablonu sonraki CRISPRmass reaksiyonunu etkilemediğinden, sgRNA'nın kesin konsantrasyonunu ölçmek için DNA şablonunun DNaz sindirimi ile çıkarılması gerekli değildir. Bu nedenle, sgRNA saflaştırması gerekli değildir.
4. sgRNA'ların değerlendirilmesi
   1. Bir restriksiyon enzimi ile pOT2 vektör omurgası taşıyan bir cDNA/ORF plazmidini sindirin. Elde edilen DNA fragmanlarını% 0.8 agaroz jel elektroforezi ile ayırın. DNA substratını bir jel ekstraksiyon kiti ile saflaştırın.
      NOT: pOT2 vektör omurgasının sgRNA hedefleme dizilerini içeren bir DNA fragmanı, Cas9/sgRNA'ların DNA substratı olarak hizmet eder. Cas9/sgRNA'ların bölünme bölgeleri asimetrik olarak DNA substratında bulunur ve bu nedenle, DNA substratının Cas9/sgRNA'lar tarafından bölünmesi, farklı boyutlarda iki DNA fragmanı verir, bu da onları sindirim reaksiyonunda parçalanmamış DNA substratından ayırt etmeyi kolaylaştırır.
   2. Aşağıdaki gibi 5 μL'lik bir Cas9 bölünme reaksiyonu ayarlayın: 0.2 μL 1.22 μM S. pyogenes Cas9, 0.5 μL 20 ng/μL sgRNA, 0.015 pmol DNA substratı, 0.5 μL 10x Cas9 Tamponu ve DEPC ile arıtılmış su. Reaksiyonları 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
   3. Bölünme ürünlerini %0.8 agaroz jel elektroforezi ile ayırın. Bozulmamış DNA substratını, sindirilmiş DNA substratı için negatif bir kontrol olarak yükleyin.
      NOT: Burada, bozulmamış DNA substratı, Cas9/sgRNA'lar tarafından sindirim reaksiyonlarına tabi tutulmayan DNA substratını ifade eder. DNA substratının Cas9/sgRNA'lar tarafından bölünmesi, farklı boyutlarda iki DNA fragmanı verir, bu da sindirim reaksiyonunda bölünmemiş DNA substratından ayırt edilmelerini kolaylaştırır.
   4. Dijital bir görüntüleme sistemi ile bölünme modellerini analiz edin (Şekil 2). Sonraki CRISPRmass deneyleri için en verimli sgRNA'yı seçin. Şekil 2 , dört sgRNA'nın tümünün yüksek bölünme verimliliği sergilediğini ve CRISPRmass için kullanılabileceğini göstermektedir. Sonraki deneyler için altı çizili sgRNA'yı seçin.
      NOT: Bölünmemiş DNA substratı ne kadar küçükse, sgRNA, DNA substratının Cas9/sgRNA sindirimi için o kadar verimli olur.

2. Bir İHA modülünün inşası

NOT: Bir UAS modülü, bir çekirdek UAS ve omurga bölünme bölgesinin sırasıyla 5' ve 3' uçları ile örtüşen 5' ve 3' terminal dizilerinin yaklaşık 20-40 bp'sini içerir (Şekil 1). UAS modülünün 5' ve 3' terminal dizileri, pOT2 vektörünün omurga bölünme bölgesi tarafından belirlenir.

1. pOT2 vektörüne özgü UAS modülünü pCR8GW vektörünün EcoRI bölgesine klonlayın, böylece pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70 plazmidi elde edin (Ek Dosya 1). pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70 plazmitinin EcoRI ile 37 °C'de 1 saat süreyle sindirilmesiyle pOT2 vektörüne özgü UAS modülünü serbest bırakın.
2. Bölünme ürünlerini %0.7 agaroz jel elektroforezi ile ayırın. 6178-bp UAS modülünü bir jel ekstraksiyon kiti ile saflaştırın. Sonraki deneyler için UAS modülünü 23 ng/μL'ye seyreltin. Bu 6178 bp fragmanı, pOT2 vektör tabanlı cDNA/ORF klonlarından UAS-cDNA/ORF plazmitlerinin inşası için bir UAS modülü görevi görür.

3. CRISPRmass ile UAS-cDNA/ORF plazmitlerinin büyük ölçekli inşası

NOT: CRISPRmass, E. coli dönüşümünden önce büyük ölçüde paralel iki aşamalı test tüpü reaksiyonları olarak standardize edilmiştir (Şekil 1).

1. Test tüpü reaksiyonu adım 1
   1. cDNA/ORF plazmitlerinin özdeş vektör omurgalarını Cas9/sgRNA ile ayırın. 0,2 mL'lik tüpleri buz üzerinde alüminyum bir soğutma bloğuna yerleştirin ve tüpleri dikkatlice etiketleyin. Ana karışımı aşağıdaki gibi hazırlayın.
      1. Tek bir reaksiyon için 0.16 μL 1.22 μM S. pyogenes Cas9, 0.4 μL 20 ng/μL sgRNA, 0.24 μL 10x Cas9 tamponu, 1.2 μL DEPC ile arıtılmış su ekleyin. N reaksiyonları için (N+1) x 0.16 μL 1.22 μM S. pyogenes Cas9, (N+1) x 0.4 μL 20 ng/μL sgRNA, (N+1) x 0.24 μL 10x Cas9 tamponu, (N+1) x 1.2 μL DEPC ile arıtılmış su ekleyin.
   2. Girdap, iyice karıştırın ve döndürün. Her tüpe 2 μL ana karışım ekleyin. Her tüpe 0.4 μL 0.019 μM cDNA / ORF plazmidi ekleyin. Bölünme reaksiyonlarını 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
      NOT: Her bir plazmidi DEPC ile muamele edilmiş su ile 0.019 μM'ye seyreltin. Bir plazmitin konsantrasyonu 0.019 μM'den düşükse, plazmit DNA'sını doğrudan bölünme reaksiyonuna ekleyin. RNaz içermeyen tüpler ve DEPC ile arıtılmış su kullanın. Bu adımların büyük ölçekte gerçekleştirilmesi birkaç saat sürecektir. Aksi belirtilmedikçe, reaktifleri ve reaksiyonları buz üzerinde tutun.
2. Test tüpü reaksiyonu adım 2
   1. 2. adımdan vektöre özgü bir UAS modülünü, tek adımlı reaksiyon düzeneği ile Cas9 doğrusallaştırılmış cDNA/ORF plazmitlerine yerleştirin. Her numune için 1,4 μL'lik tek adımlı bir reaksiyon ayarlayın. 0.2 mL'lik tüpleri buz üzerinde alüminyum bir soğutma bloğuna yerleştirin ve tüpleri dikkatlice etiketleyin.
      1. Ana karışımı aşağıdaki gibi hazırlayın. Tek bir reaksiyon için, 0.07 μL 0.006 μM UAS modülü ve 0.7 μL tek adımlı reaksiyon düzeneği ana karışımı ekleyin. N reaksiyonlar için, (N + 1) x 0.07 μL 0.006 μM UAS modülü ve (N + 1) x 0.7 μL tek adımlı reaksiyon düzeneği ana karışımı ekleyin.
   2. Girdap, iyice karıştırın ve döndürün. Her tüpe 0.77 μL ana karışım ekleyin. Her tüpe 0.7 μL Cas9 ile doğrusallaştırılmış cDNA / ORF plazmidi ekleyin. Reaksiyonları 50 ° C'de 1 saat inkübe edin.
      NOT: Tek adımlı montaj reaksiyon ürünlerinin saflaştırılması gerekli değildir. Bu adımların büyük ölçekte gerçekleştirilmesi birkaç saat sürer. Aksi belirtilmedikçe, reaktifleri ve reaksiyonları buz üzerinde tutun.
3. Tek adımlı montaj reaksiyon ürünlerini büyük ölçekte E. coli'ye dönüştürün.
   1. 10 μL'lik uçları 4 °C'de soğutun. 1,5 mL'lik tüpleri buz üzerinde alüminyum bir soğutma bloğunda prechill edin.
   2. Yetkili E. coli hücrelerini buz üzerinde 5 dakika boyunca çözdürün. Her önceden soğutulmuş 1.5 mL'lik tüpe 10 μL yetkin hücre ekleyin.
      NOT: En az 1 x 10⁸ CFU/μg pUC19 DNA'sı dönüşüm verimliliğine sahip, ticari olarak temin edilebilen yetkin E. coli hücrelerini kullanın.
   3. 10 μL yetkin hücreye 1 μL tek adımlı montaj reaksiyon ürünü ekleyin, karıştırmak için hafifçe döndürün ve 30 dakika boyunca buz üzerine koyun.
   4. Tüpleri 42 ° C'lik bir su banyosunda 1 dakika inkübe edin ve ardından hemen 2 dakika buz üzerinde soğutun.
   5. Oda sıcaklığında her tüpe 100 μL SOC ortamı (önceden 37 °C'ye ısıtılmış) ekleyin ve çalkalanan bir inkübatörde (250 rpm) 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
   6. UAS modülünün antibiyotik direnç genine karşılık gelen bir antibiyotik içeren LB plakalarını 37 °C'ye kadar ısıtın. Hücreleri plakalara yayın ve gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
      NOT: Bu adımların büyük ölçekte gerçekleştirilmesi birkaç saat sürer. Aksi belirtilmedikçe, reaktifleri ve reaksiyonları buz üzerinde tutun.
4. CRISPRmass tarafından oluşturulan UAS-cDNA/ORF plazmitlerini doğrulayın
   1. Tek bir koloni seçin ve onu, UAS modülünün antibiyotik direnç genine karşılık gelen uygun antibiyotik seçimi ile desteklenmiş 4.5 mL LB sıvı ortama aşılayın. 250 rpm'de çalkalarken gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
   2. Bir plazmit mini hazırlama kiti kullanarak plazmit DNA'yı çıkarın. Aşağıdaki gibi 20 μL'lik bir kısıtlama sindirim reaksiyonu ayarlayın: 300-500 ng / μL plazmit, uygun kısıtlama enzimleri (enzimleri), kısıtlama sindirim tamponu ve ultra saf su. Reaksiyonları 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
   3. DNA fragmanlarını %0.8 agaroz jel elektroforezi ile ayırın ve bir dijital görüntüleme sistemi ile analiz edin (Şekil 3).

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.