Yöntem makalesi

Transmisyon elektron mikroskobu için retinal organoid örneklerinin hazırlanması

DOI:

10.3791/66590

⸱

7 Haziran 2024

 ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Eye Hospital, Wenzhou Medical University, 2Laboratory of Retinal Physiology and Disease, School of Ophthalmology and Optometry, Wenzhou Medical University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, transmisyon elektron mikroskobu için retinal organoid numuneler için optimize edilmiş ve ayrıntılı bir hazırlık prosedürü sağlar. Olgun retinal organoidlerde sinapsların analizini içeren uygulamalar için uygundur.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Retinal organoidler (RO'lar), belirli koşullar altında indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) farklılaşan insan retina özelliklerini taklit eden üç boyutlu bir kültür sistemidir. RO'larda sinaps gelişimi ve olgunlaşması immünositokimyasal ve fonksiyonel olarak incelenmiştir. Bununla birlikte, sinaptik temas üst yapısının doğrudan kanıtı, hem özel şerit sinapsları hem de geleneksel kimyasal sinapsları içeren sınırlıdır. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM), insanlarda ve çeşitli türlerde retina gelişimini ve sinaps olgunlaşmasını aydınlatan yüksek çözünürlük ve saygın bir geçmiş ile karakterizedir. RO'lardaki sinaptik yapıyı keşfetmek için güçlü bir araçtır ve RO'ların araştırma alanında yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu nedenle, RO sinaptik kontaklarının yapısını nano ölçekte daha iyi keşfetmek ve yüksek kaliteli mikroskobik kanıtlar elde etmek için, basit ve tekrarlanabilir bir RO TEM numune hazırlama yöntemi geliştirdik. Bu belge, protokolü, kullanılan reaktifleri ve RO fiksasyon hazırlığı, fiksasyon sonrası, gömme ve görselleştirme dahil olmak üzere ayrıntılı adımları açıklamaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsanlarda ve memelilerde hayati bir görsel duyu organı olan retina, nöron somalarını barındıran üç nükleer katman ve geleneksel sinapslarve özel şerit sinaps2,3 dahil olmak üzere sinaptik bağlantılar 1 tarafından oluşturulan iki pleksiform katman ile karakterize edilen belirgin bir lamine yapı sergiler. Şerit sinaps, vezikül uyarılarının kademeli bir şekilde iletilmesinde çok önemli bir rol oynar 2,3. Görme süreci, çeşitli nöron ve sinaps seviyeleri boyunca elektro-optik sinyal iletimini içerir ve sonuçta görsel kortekse 4,5 ulaşır.

Retinal organoidler (RO'lar), retina dokusunun fizyolojik durumlarını in vitro 1,6,7 taklit eden, indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) türetilen üç boyutlu (3D) bir kültür sistemini temsil eder. Bu yaklaşım, retina hastalıkları8, ilaç taraması9 ve retinitis pigmentosa10 ve glokom11 gibi geri dönüşümsüz retinal dejeneratif durumlar için potansiyel bir tedavi olarak hizmet etmek için umut vaat etmektedir. Güçlü bir in vitro optik iletim sistemi olarak, RO'lar içindeki sinaps, etkili sinyal dönüşümünü ve transferini kolaylaştıran çok önemli bir yapıdır5.

RO gelişimi, morfolojik özelliklerine ve moleküler ekspresyon profillerine göre kabaca üç aşamaya ayrılabilir 6,12. Evre 1'deki RO'lar (D21-D60 civarında), retinanın nöral progenitör hücrelerini, birçok retinal ganglion hücresini (RGC'ler) ve insan fetal gelişiminin ilk dönemine karşılık gelen birkaç yıldız patlaması amakrin hücresini (SAC'ler) içerir. Evre 2'de (D50-D150 civarında), RO'lar bazı fotoreseptör öncülerini, internöronları ve sinaptogenezle ilgili genleri eksprese eder, bu da bir geçiş aşamasını temsil eder. Fotoreseptörler, insan fetal gelişimininüçüncü aşamasına karşılık gelen evre 3 RO'larda (yaklaşık D100-D150'den sonra) olgunluk geliştirir 6,12,13. Özellikle, aşama 1 ve aşama 2'deki RO'larla karşılaştırıldığında, aşama 3'teki RO'lar, şerit sinapslarının14 varlığı da dahil olmak üzere, sinapslarıolgunlaşmış 12 belirgin bir lamel yapıya sahiptir. Ayrıca, yakın zamanda yapılan bir çalışma, olgun sinapsların ışık sinyallerinin iletimi için var olduğunu doğruladı ve bu da işlevsel olduklarını gösteriyor13. Bu nedenle, evre 3'teki RO'lar genellikle sinaptik yapıyı araştırmak için seçilir.

İmmünohistokimya, çeşitli moleküler proteinlerin ekspresyonunun incelenmesine yaygın olarak uygulanır. Bununla birlikte, optik mikroskobun sınırlaması, bir seferde yalnızca sınırlı sayıda spesifik hücre ve molekülü gözlemleme yeteneğinde yatmaktadır, bu da hücreler ve çevreleri arasındaki ilişkilerin kapsamlı bir analizinin olmamasına neden olmaktadır. Transmisyon Elektron Mikroskobu (TEM), ışık mikroskobunu ~ 10-20 kat15 aşan, 0.1-0.2 nm'lik sınırlı bir çözünürlüğe sahip yüksek çözünürlük ile karakterize edilir. Optik mikroskopinin kusurlarını telafi eder ve insanlarda 16,17 ve çeşitli türlerde 18,19,20,21 retina gelişimini ve sinaps olgunlaşmasını aydınlatmak için kullanılır. TEM, presinaptik ve postsinaptik bileşenlerin18,20 doğrudan ayırt edilmesini sağlar ve hatta şeritler 2,3, veziküller22 ve mitokondri 23 gibi hücre altı yapıların kapsamlı bir şekilde gözlemlenmesine izin verir. Bu nedenle TEM, sinaps türlerini tanımlamak ve RO'lardaki sinaptik kontakların üst yapısını nano ölçekte keşfetmek için önemli bir araçtır.

Yüksek kaliteli elektron mikrografları elde etmek için numune hazırlamanın büyük önem taşıdığına dikkat etmek çok önemlidir. Bazı çalışmalar RO12,13,24 üzerinde EM gerçekleştirmiş olsa da, ayrıntılı prosedürler belirsizdir. Elektron mikroskobu görüntüsünün kalitesi büyük ölçüde RO fiksasyonunun ve reaktif geçirgenliğinin etkisine bağlı olduğundan, hazırlık sırasında çeşitli önemli faktörlerin dikkate alınması gerekir. Sonuç olarak, RO'lardaki sinaptik temasları daha iyi araştırmak için, RO fiksasyonu, gömme ve gözlem bölgelerinin tanımlanmasının çalışma noktalarını gösteren iyi tekrarlanabilirliğe sahip bir yöntem sunuyoruz.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. iPSC'lerden RO elde etme25

NOT: RO'lar, daha önce bildirilen prosedür değiştirilerek iPSC'lerden türetilmiştir.

  1. Bakteriyel bir proteaz kullanarak iPSC'leri ~%90 birleşimde ayırın (bkz. Malzeme Tablosu). Kolonileri parçalara ayırın ve bir hücre kaldırıcı ile kazıyın.
  2. Toplandıktan sonra, hücre kümelerini 0.25 mL buz gibi soğuk Matrigel içinde yeniden süspanse edin. 37 ° C'de 20 dakikalık inkübasyonun ardından, katılaşmış jeli DMEM / F12 ortamı (% 0.5 N2 takviyesi,% 1 B27 takviyesi, 0.1 mM β-merkaptoetanol, 0.2 mM L-glutamin ikamesi, 100 U / mL penisilin ve 100 mg / mL streptomisin). Bu saati farklılaşmanın 0. günü olarak tanımlayın.
  3. 5 günlük yüzen kültürden sonra, hücreler hücre kistleri oluşturmak üzere gruplanır. Bu hücre kistlerini, şimdi yapışacakları ve büyüyecekleri 100 mm'lik bir Petri kabına aktarın.
  4. 15. günde, yapışan hücreleri ayırmak için bakteriyel proteaz kullanın ve bunları DMEM / F12 ortamında (% 2 B27 takviyesi, 0.1 mM esansiyel olmayan amino asitler) kültürleyin.
  5. 21. günde, ortamı 20 mL serum içeren ortamla değiştirin (DMEM / F12 ortamı,% 8 FBS,% 2 B27 takviyesi, 100 mM Taurin ve 2 mM L-glutamin ikamesi) ve ortamı her hafta değiştirin.

2. RO'ların anterior fiksasyonu

  1. Kültürlenmiş RO'lardan birini (~ D180, yaklaşık 1 ~ 2 mm çapında bir boyut en uygunudur) Petri kabından bir pipetle 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine yavaşça hareket ettirin ve RO'larla ilgili bilgileri işaretleyin.
    NOT: RO'lar çok büyükse, RO'ları ikiye bölün veya fiksatif içeren tabakta mikroskop altında bir ustura ile kötü yapılandırılmış dokuyu kesin.
  2. Kültür ortamını 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerinden bir pipetle çıkarın. 0.1 M fosfat tamponu (PB), pH 7.4 içinde seyreltilmiş 1.5 mL %2 paraformaldehit-%2 gluteraldehit fiksatif ekleyin ve oda sıcaklığında (RT) 4 saat sabitleyin. Mikrosantrifüj tüplerini gece boyunca 4 °C'de saklayın.
    NOT: Bu adım 1 hafta duraklatılabilir, ancak mümkün olduğunca erken yeniden başlatılması önerilir. RO'lar daha uzun süre bırakılırsa, hücrelerin otolizine neden olabilir ve bu da RO'ların üst yapısının tahrip olmasına neden olabilir. RO'ların kırılganlığı nedeniyle dönmekten, salınım yapmaktan, çevirmekten veya sert işlemlerden kaçının.

3. RO'ların sabitlenmesi sonrası

  1. % 2 paraformaldehit-% 2 glutaraldehit fiksatifini çıkarın ve 1 mL 0.01 M fosfat tamponlu salin (PBS) ile pH 7.4'te 3 x 10 dakika yıkayın. Tamamen durulama için yıkama işlemi sırasında RO'ları 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerinde nazikçe askıya alın. Her ek fiksasyon günü için, kalan fiksatifi mümkün olduğunca çıkarmak için yıkama sayısını iki artırın.
  2. Kalan PBS'yi bir pipet kullanarak çıkarın ve doku blokları suya batırana kadar ~150 μL %1 osmik asit (OsO4) ile değiştirin. Mikrosantrifüj tüplerini ışıktan korumak için karanlık bir kutuya yerleştirin ve 1 saat boyunca RT'de sızın.
    NOT: OsO4 güçlü bir oksidandır ve çeker ocakta kullanılmalıdır.

4. Lekelenme ve dehidrasyon

NOT: Bu adımdan itibaren ortamı kurutmak için nem alma cihazı açılmalıdır.

  1. Bir pipet kullanarak OsO4'ü çıkarın, 0.01 M PBS (pH 7.4) ile 3 x 10 dakika yıkayın ve ardından 3 x 10 dakika deiyonize su ile yıkayın.
    NOT: RO'ların tamamen durulanmasını sağlamak için RO'ları askıya almanızı öneririz. OsO4'ü özel bir atık şişesine aspire edin.
  2. Son deiyonize su yıkamasını çıkarın ve tüp başına ~ 150 μL (doku bloklarının tam sızmasını sağlayın) uranyum asetat ile değiştirin ve RT'de 1-2 saat boyayın. Mikrosantrifüj tüplerini ışıktan koruyun.
  3. Uranyum asetatı çıkarın ve çeker ocakta 1 mL %50 aseton ile değiştirin ve 10 dakika kurutun. Ardından, RO'ların art arda gradyan dehidrasyonu için %70, %80, %90, %100 ve %100 aseton kullanın. Her dehidrasyon 10 dakika sürer.
    NOT: Havaya ve neme maruz kalmayı önlemek için her değişim için RO'ları ıslatmak için biraz sıvı bırakın. Ek olarak, aseton uçucu olduğu için mümkün olan en kısa sürede hızlı bir şekilde çalıştırın. Uranyum asetatı özel bir bertaraf şişesine aspire edin.

5. Sızma

  1. Asetonu atın ve 1:1 oranında aseton ve Epon-812 reçinesinden oluşan karışımdan ~ 150 μL ekleyin. 37 °C fırında 1 saat pişirin.
  2. Yukarıdaki karışımı çıkarın ve 1:4 oranında aseton ve Epon-812 reçinesinden oluşan bir karışımla değiştirin. Gece boyunca 37 °C fırına koyun.
  3. RO'ları ~500 μL saf epoksi reçine içeren yeni tüplere dikkatlice aktarın ve 1 saat boyunca 45 ° C'lik bir fırına koyun.

6. Gömme

  1. 30-50 mL saf epoksi reçineyi 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde reaktif kitini üreticinin talimatlarına göre önceden karıştırarak hazırlayın. Mikser tarafından ortaya çıkan hava kabarcıklarını azaltmak için saf epoksi reçineyi 30 dakika boyunca yavaşça baş aşağı döndürün. Daha sonra 37 °C fırında 20 dakika bekletin. Gömme kalıbının oluğuna 2/3 hacim saf epoksi reçine ekleyin.
  2. Saf epoksi reçine ile donatılmış gömme kalıbına RO'ları almak için bir kürdan kullanın.
  3. Oluğu hafifçe çıkıntı yapana veya şişene kadar saf epoksi reçine ile doldurun.
  4. Yönlü gömme için gömme kalıbının her iki ucundaki RO'ların konumunu ayarlayın. Gömme kalıbını 45 °C'lik bir fırına 1-2 saat koyun ve ardından 65 °C'lik bir fırına 48-72 saat koyun.

7. Yarı ince konumlandırma

  1. Yamuk bir yüz oluşturmak için gömme bloğunun daha uzun dört tarafının uçlarından dokunun etrafındaki fazla epoksi reçineyi zımparalayın. Gömme bloğunu s'ye takınample montaj standı ve cıvatayı bir L tornavidayla vidalayın. Ardından, bıçak sehpasına cam bıçaklar takın ve somunu manuel olarak sıkın.
  2. İstenilen alan açığa çıkana kadar fazla reçineyi kesin.
  3. Cam bıçağın oluğunu suyla doldurun. Yarı ince bir mikrotom kullanarak yarı ince dilimleri 1 μm kalınlığa kadar kesin ve bunları bir iğne ile bir mikroskop lamı üzerine koyun.
  4. Yarı ince dilimler halinde boyamak için 50 μL %1 toluidin mavisi ekleyin ve ısıtma plakası üzerinde 95 °C'de 1 dakika inkübe edin. Damıtılmış su ile 2 dakika durulayın. Bölümlerin yapısını gözlemlemek için 20x sıradan bir optik mikroskop kullanın.

8. Ultra ince kesit alma

  1. Gömme bloklarını ve cam bıçakları adım 7.1'de açıklandığı gibi takın. Bıçak ile doku bloğu arasındaki mesafeyi, lavabonun sıvı seviyesini ve dilimleme hızını ayarlayın. Ultra ince bir mikrotom ile ~ 70-100 nm kalınlığındaki ultra ince bölümleri kesin ve dilimleri destekleyici film ile bakır ağ (200 göz) üzerine alın.
  2. İkili boyama prosedüründe kontrastı artırmak için ultra ince bölümleri 15 dakika boyunca %3 kurşun sitrat ile boyayın.

9. TEM ile RO'ların Görüntülenmesi

  1. Yazılımı başlatın ( Malzeme Tablosuna bakın).
  2. Hafıza modu düğmesine tıklayın ve her ultra ince bölümü kabaca işaretleyin.
  3. Sinaptik yapıları arayın.
    1. Düşük büyütmede RO'ların lamine yapısını ayırt edin.
    2. Daha derin bir elektron yoğunluğuna sahip bir nükleer yapı gösteren dış nükleer katmanı (ONL) bulun. Daha sonra, çok sayıda vezikülün biriktiği fotoreseptörün terminaline gidin. Tek bir sinaptik şeritli çubuk terminallerini ve birden fazla sinaptik şeritli koni terminallerini arayın.
    3. İç pleksiform katmana (IPL) geçin ve küçük bir kurdele ile benzer bir yapı arayın.
  4. Mikroskobik görüntüyü yakalayın.
    1. Başlat'a tıklayın ve ilgili büyütme gücünü girin.
    2. Görüntüleri kaydedin.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

iPSC farklılaşması yoluyla 3D RO'ların oluşturulması, retina hastalığı mekanizmalarını ve kök hücre replasman tedavisini incelemek için güçlü bir araç sağlar. Diğerleri RO'lardaki sinaptik bağlantıları fonksiyonel ve immünositokimyasal olarak göstermiş olsa da, konvansiyonel ve şerit sinapsların doğrudan kanıtları çok sınırlıdır. Burada, RO'larda TEM ile iki tip sinapsın üst yapısını araştırmak için bir yöntem sunuyoruz. 180 günlük kültürden sonra, RO'lar sabitlendi, boyandı, gömüldü ve ultra ince dilimlendi. TEM gözlemi, OPL'de dağıtılan fotoreseptörlerin aksonal terminallerinde (Şekil 1 ve Şekil 2) şerit sinapslarını ortaya çıkardı. TEM altında, çubuk şeritleri sinaptik istilanın etrafına yayılır ve yatay hücrelerle at nalı şeklinde bir profil oluşturur (Şekil 1). Çubuklar tipik olarak yalnızca tek bir şeride sahiptir, ancak konilerin birden fazla şeridi vardır (Şekil 2). Ek olarak, IPL'deki amakrin hücreleri arasındaki klasik kimyasal sinapslar gözlenmiştir (Şekil 3). TEM altında, kimyasal sinaps üç bölümden oluşur: presinaptik, sinaptik yarık ve postsinaptik. Presinaptik ve postsinaptik kısımlara karşılık gelen hücre zarları, diğer parçalardan biraz daha kalındır ve iki zar arasındaki dar boşluğa sinaptik yarık denir. Presinaptik membran bölgesinin sitoplazmasında birçok sinaptik vezikül vardır. Bu çalışma, iPSC'den türetilen 3D RO'larda tam sinaptik bağlantıların varlığını doğrulamaktadır. Bununla birlikte, adımlar arasındaki eksik durulamanın, numune hazırlama işlemi sırasında siyah parçacıkların çökelmesine yol açacağına dikkat edilmelidir (Şekil 4).

figure-results-1
Şekil 1: RO'lardaki çubuk şerit sinapslarının TEM görüntüleri. (A,B) Çubuk ve yatay hücreler at nalı şeklinde bir profil oluşturur. RO'ların OPL'sindeki her çubuk küresinde, çok sayıda vezikül ile çevrili tek bir şerit (ok uçları) gözlendi. Ölçek çubukları = 0,2 μm. Kısaltmalar: RO'lar = retinal organoidler; HC = yatay hücre; OPL = dış pleksiform tabaka. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: RO'lardaki koni şerit sinapslarının TEM görüntüleri. RO'ların OPL'sindeki bir koni pedikülünde üç şerit sinaps (ok ucu) belirgindi. Ölçek çubuğu = 0,2 μm. Kısaltmalar: TEM = transmisyon elektron mikroskobu; RO'lar = retinal organoidler; OPL = dış pleksiform tabaka. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: RO'lardaki kimyasal sinapsların TEM görüntüsü. RO'ların IPL tabakasındaki amakrin hücreler arasında geleneksel bir kimyasal sinaps gözlendi. Kimyasal sinaps üç bölümden oluşur: presinaptik, sinaptik yarık ve postsinaptik. Presinaptik membran bölgesinin sitoplazmasında birçok sinaptik vezikül vardır. Bir ok, sinaptik iletimin yönünü gösterir ve çok sayıda vezikülün bir AC1 işleminden başka bir AC2 profiline transferini gösterir. Ölçek çubuğu = 0,2 μm. Kısaltmalar: TEM = transmisyon elektron mikroskobu; RO'lar = retinal organoidler; IPL = iç pleksiform tabaka; AC'ler = amakrin hücreleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Numune hazırlama işlemi sırasında meydana gelebilecek bir sorun örneği. Adımlar arasındaki eksik durulama nedeniyle koni pedikülünde çok sayıda siyah parçacık (daire) vardır. Oklar: şerit sinaps. Ölçek çubuğu = 0,2 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda, TEM ile RO'larda konvansiyonel ve şerit sinaptik üst yapının gözlemlenmesi için ayrıntılı bir protokol sunduk. Bu protokol, bazı modifikasyonlarla daha önce tarif edilen retina hazırlama yöntemlerine dayanmaktadır20. Numune işlemenin başarı oranını ve TEM mikrograflarının kalitesini artırmak için aşağıdaki önemli noktaları göz önünde bulundurun. İlk olarak, RO'ların iPSC'lerden geliştiğini ve vaskülatür 6,26 ve glial hücreler26'dan yoksun bir hücre kütlesi oluşturduğunu kabul etmek önemlidir. Bu eksiklik, in vivo retinaya kıyasla daha az kompakt bir organizasyona yol açabilir. Bu nedenle, yapılarını ve bütünlüklerini korumak için Ros'u nazikçe ele almak çok önemlidir. Rahatsızlığı en aza indirmek için tüp duvarı boyunca sıvılar ekleyin.

Daha da önemlisi, protokol adımı 4'te dokunun tamamen dehidrasyonunu sağlayın ve dehidrasyon adımına başlamadan önce oda nemini azaltmak için nem alma cihazını açın. Asetonu değiştirirken, hızlı bir şekilde çalışın ve dokuyu batırmak için bir miktar sıvı bırakın, bu da RO doku yapısının ciddi şekilde tahrip olmasını önler. Susuz kalmamış doku, yüksek EM irtifalarında keskin bir şekilde kasılır ve dokudaki su, gömme ajanın penetrasyonunu engeller.

RO'lar şeffaf küreler halinde bulunduğundan, sağlam katmanlı yapılar elde etmek için yarı ince dilimleri keserken doğru yönü sağlayın. Son olarak, aşama 3'teki RO'lar (yaklaşık D100-D150'den sonra) olgun olarak kabul edilir ve integral sinapslara12 sahiptir, bunun sonucunda şerit sinapsları ve kimyasal sinapslar dahil olmak üzere sinaptik temasların araştırılmasının bu RO'larda yapılması önerilir.

Önceki çalışmalarda RO sinapslarının sınırlı ultrastrüktürel kanıtı sağlanmış olsa da, RO numune hazırlamanın tam prosedürü ve çeşitli sinaptik yapı türlerinin tanımlanması hakkında hiçbir ayrıntı yoktur 12,13,24. Capowski ve ark. farklı aşamalarda farklı hPSC hatları tarafından indüklenen RO'ların özelliklerini araştırmak için, koni pedikülünde vezikül yüklü şerit sinapslarının varlığını gösteren elektron mikrografları da dahil olmak üzere farklı teknikler kullandılar ve bu da çeşitli hPSC hatları tarafından indüklenen evre 3'teki RO'ların olgun ve fonksiyonel olduğunu ortaya çıkardı12. TEM ve iki fotonlu görüntüleme kullanarak, Cowan ve ark. olgun RO'larda13 fonksiyonel şerit sinaptik yapıların oluşumunu doğruladı, ancak sinaps tipi belirtilmedi (koni veya çubuk sinapsları). Bununla birlikte, birkaç mikrograf sonucumuz, şerit sinapslarının membran yapısını ideal bir netlik ve kontrastla gösterdi, bu da yöntemimizin uygulanabilir ve tekrarlanabilir olduğunu gösteriyor. Ek olarak, farklı morfolojik özelliklerine göre farklı sinaps türleri belirledik: koni sinapsları genellikle daha büyüktür ve birkaç şeride sahipken, çubuk sinapslar genellikle daha küçüktür ve yalnızca bir şerit gösterir; Kimyasal sinapslarda, presinaptik yapılarda veziküller birikir ve sinaptik yarığın elektron yoğunluğu artar.

RO'lardaki sinaptik kontakların ultrastrüktürel bütünlüğü, işlevleri için hayati önem taşır. Bu temasları araştırmak için TEM'in kullanılması, diğer uygulamaların yanı sıra retinanın patogenezinin in vitro olarak incelenmesi, RO'larda ilaç taraması yapılması ve RO'ların farklılaşma tekniklerinin değerlendirilmesi gibi çeşitli alanlarda geniş ve önemli avantajlar sunar. 2D TEM görüntüleme ile sınırlı olarak, RO'nun üst yapısının yalnızca belirli bir yönü gözlemlenebilir, bu da sinapsın tüm yapısını stereoskopik olarak analiz etmeyi zorlaştırır. Ek olarak, farklılaşmanın sınırlılığı, yanlış yerleştirilmiş hücrelere(13,26) katkıda bulunur ve gözlem sürecini daha da karmaşıklaştırır. Bu nedenle, hacim EM'yi 3D rekonstrüksiyon ile birleştirmek, gelecekte bu eksikliklerin üstesinden gelebilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma kısmen Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2022YFA1105503), Devlet Sinirbilim Anahtar Laboratuvarı (SKLN-202103) ve Çin Zhejiang Doğa Bilimleri Vakfı (Y21H120019), Çin Doğa Bilimleri Vakfı (82070981) tarafından sağlanan hibelerle desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
100 mm Petri kabıCorning430167
Aseton ElektronMikroskobu Bilim10000
B27 takviyesiGibcoA3582801
Hücre kaldırıcıSanta Cruzsc-395251
Bakır ızgaralarBeijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.
DigitalMicrograph YazılımıGatan, Inc.Yazılım
DispaseStemCell Technologies# 07913Bakteriyel proteaz
DMEM / F12 ortaGibco# 11320033
Gömme kalıpBeijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.
Epon-812 reçineElektron Mikroskobu Bilimi# 14900
Fetal Sığır Serumu (FBS)Biyolojik Endüstriler# 04-0021A
GlutaraldehitElektron Mikroskobu Bilimi16020
hiPSCShownin Biotechnology Co., Ltd.RC01001-A
Kurşun sitratBeijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.
L-GlutaMaxYaşam Teknolojileri#35050061L-glutamin ikamesi
MatrigelCorning356234
Mikroskop slaydıCITOTEST80312-3161
N2 takviyesiGibco17502048
Na2HPO4· 12H2OSigma71650PB/PBS NaH'nin bir bileşeni
2PO4· H2OSigma71507PB/PBS'nin bir bileşeni
Esansiyel olmayan amino asitlerSigma#M7145
Optik mikroskopLaboratuvar Binoküler Biyolojik MikroskopXsz-107bnii
OsO4TED PELLA4008-160501
FırınBluepardBPG9040A
ParaformaldehitElektron Mikroskobu Bilimi157-8
Penisilin-StreptomisinGibco#15140-122
Yarı / ultra ince mikrotomReichert-Jung396649
TaurinSigma#T0625
Toluidin mavisiSangon BiotechE670105-0100
Transmisyon Elektron MikroskoplarıHITACHIH-7500
Uranil asetatTED PELLACA96049
β-merkaptoetanolSigma444203
AZH400HHGZ10592GZ02618

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Andreazzoli, M., Barravecchia, I., De Cesari, C., Angeloni, D., Demontis, G. C. Inducible pluripotent stem cells to model and treat inherited degenerative diseases of the outer retina: 3d-organoids limitations and bioengineering solutions. Cells. 10 (9), 2489(2021).
  2. Moser, T., Grabner, C. P., Schmitz, F. Sensory processing at ribbon synapses in the retina and the cochlea. Physiol Rev. 100 (1), 103-144 (2020).
  3. Tom Dieck, S., Brandstätter, J. H. Ribbon synapses of the retina. Cell Tissue Res. 326 (2), 339-346 (2006).
  4. Webvision: The organization of the retina and visual. Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. , University of Utah Health Sciences Center, Webvision. Salt Lake City (UT). (1995).
  5. Soto, F., Zhao, L., Kerschensteiner, D. Synapse maintenance and restoration in the retina by ngl2. Elife. 7, e30388(2018).
  6. Kruczek, K., Swaroop, A. Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies. Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).
  7. O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: A window into human retinal development. Development. 147 (24), dev189746 (2020).
  8. Norrie, J. L., et al. Retinoblastoma from human stem cell-derived retinal organoids. Nat Commun. 12 (1), 4535(2021).
  9. Luni, C., Serena, E., Elvassore, N. Human-on-chip for therapy development and fundamental science. Curr Opin Biotechnol. 25, 45-50 (2014).
  10. Chahine Karam, F., et al. Human ipsc-derived retinal organoids and retinal pigment epithelium for novel intronic rpgr variant assessment for therapy suitability. J Pers Med. 12 (3), 502(2022).
  11. Lo, J., et al. Therapeutic strategies for glaucoma and optic neuropathies. Mol Aspects Med. 94, 101219(2023).
  12. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3d human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686(2019).
  13. Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), e1634 1623-1640 (2020).
  14. Cora, V., et al. A cleared view on retinal organoids. Cells. 8 (5), 391(2019).
  15. Żak, A. M. Light-induced in situ transmission electron microscopy─development, challenges, and perspectives. Nano Lett. 22 (23), 9219-9226 (2022).
  16. Tschulakow, A. V., Oltrup, T., Bende, T., Schmelzle, S., Schraermeyer, U. The anatomy of the foveola reinvestigated. PeerJ. 6, e4482(2018).
  17. Syrbe, S., et al. Müller glial cells of the primate foveola: An electron microscopical study. Exp Eye Res. 167, 110-117 (2018).
  18. Xiao, J., et al. Rod bipolar cells receive cone photoreceptor inputs through both invaginating synapses and flat contacts in the mouse and guinea pig retinas. J Comp Neurol. 531 (11), 1184-1197 (2023).
  19. Liu, X., et al. Retinal degeneration in rpgra mutant zebrafish. Front Cell Dev Biol. 11, 1169941(2023).
  20. Yang, Q., et al. Expression of α-synuclein in the mouse retina is confined to inhibitory presynaptic elements. J Comp Neurol. 531 (10), 1057-1079 (2023).
  21. Zhang, J., et al. Early degeneration of photoreceptor synapse in ccl2/cx3cr1-deficient mice on crb1(rd8) background. Synapse. 67 (8), 515-531 (2013).
  22. De Robertis, E., Franchi, C. M. Electron microscope observations on synaptic vesicles in synapses of the retinal rods and cones. J Biophys Biochem Cytol. 2 (3), 307-318 (1956).
  23. Frey, T. G., Mannella, C. A. The internal structure of mitochondria. Trends Biochem Sci. 25 (7), 319-324 (2000).
  24. Gonzalez-Cordero, A., et al. Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors. Stem Cell Reports. 9 (3), 820-837 (2017).
  25. Gao, M. L., et al. Patient-specific retinal organoids recapitulate disease features of late-onset retinitis pigmentosa. Front Cell Dev Biol. 8, 128(2020).
  26. Afanasyeva, T. aV., et al. A look into retinal organoids: Methods, analytical techniques, and applications. Cell Mol Life Sci. 78 (19-20), 6505-6532 (2021).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Retinal OrganoidlerOrganoid Numune Haz rlamaSinaps Ultrast yap serit Sinapslarnd klenmi Pluripotent K k H crelerOrganoid G mmeGradyanl DehidrasyonEpoksi Re ine ile G mmeYar nce Mikrotom

İlgili makaleler