Hidrojel İçinde Yağ Kaynaklı Kök Hücrelerin Fotobiyomodülasyon Ogmentasyonu ile Üç Boyutlu Hücre Kültürü

Özet

Burada, adipoz kaynaklı kök hücre (ADSC) kültürü için üç boyutlu (3D) hücre kültürü çerçevesi olarak hidrojelin kullanımını gösteren ve 3D kültür ortamında ADSC'lerin proliferasyonunu arttırmak için fotobiyomodülasyonu (PBM) tanıtan bir protokol sunuyoruz.

Özet

Kök hücrelere benzer multipotent mezenkimal özelliklere sahip olan yağ kaynaklı kök hücreler (ADSC'ler), çok çeşitli hücre farklılaşması kapasiteleri ve göçü, proliferasyonu artırma ve iltihabı hafifletme yetenekleri nedeniyle rejeneratif tıpta sıklıkla kullanılmaktadır. Bununla birlikte, ADSC'ler, öncelikle elverişsiz enflamatuar koşullar nedeniyle, yaralarda sağkalım ve aşılamada sıklıkla zorluklarla karşılaşırlar. Bu sorunu çözmek için, yaralarda ADSC canlılığını sürdürmek ve yara iyileşme sürecini hızlandırmak için hidrojeller geliştirilmiştir. Burada, fotobiyomodülasyonun (PBM) ADSC proliferasyonu ve sitotoksisite üzerindeki sinerjik etkisini 3 boyutlu hücre kültürü çerçevesinde değerlendirmeyi amaçladık. Ölümsüzleştirilmiş ADSC'ler, 2.5 x 10³ hücre yoğunluğunda 10 μL hidrojellere ekildi ve 5 J /^cm2 ve 10 J /^cm2 akıcılıklarında 525 nm ve 825 nm diyotlar kullanılarak ışınlamaya tabi tutuldu. Morfolojik değişiklikler, sitotoksisite ve proliferasyon, PBM maruziyetinden 24 saat ve 10 gün sonra değerlendirildi. ADSC'ler yuvarlak bir morfoloji sergiledi ve jel boyunca tek tek hücreler veya sferoid agregalar olarak dağıldı. Daha da önemlisi, hem PBM hem de 3D kültür çerçevesi hücreler üzerinde sitotoksik etki göstermezken, PBM ADSC'lerin proliferasyon oranlarını önemli ölçüde arttırdı. Sonuç olarak, bu çalışma, hidrojelin ADSC kültürü için uygun bir 3D ortam olarak kullanımını göstermekte ve PBM'yi, özellikle 3D hücre kültürü ile ilişkili yavaş proliferasyon oranlarını ele alan önemli bir büyütme stratejisi olarak tanıtmaktadır.

Giriş

ADSC'ler, kendi kendini yenileme ve çeşitli hücre soylarına farklılaşma kapasitesine sahip mezenkimal multipotent progenitör hücrelerdir. Bu hücreler, bir lipoaspirasyon prosedürü sırasında yağ dokusunun stromal vasküler fraksiyonundan (SVF) alınabilir¹. ADSC'ler, rejeneratif tıpta kullanmak için ideal bir kök hücre tipi olarak ortaya çıkmıştır, çünkü bu hücreler bol miktarda bulunur, hasat için minimal invazivdir, kolay erişilebilir ve iyi karakterize edilmiştir². Kök hücre tedavisi, hücre göçünü, proliferasyonu, neovaskülarizasyonu uyararak ve yaralardaki iltihabı azaltarak yara iyileşmesi için olası bir yol sunar ^3,4. ADSC'lerin rejeneratif kapasitesinin kabaca %80'i, sekretomları⁵ aracılığıyla parakrin sinyalizasyonuna atfedilebilir. Daha önce, kök hücrelerin veya büyüme faktörlerinin hasarlı dokuya doğrudan lokal enjeksiyonunun in vivo onarım mekanizmalarını yeterince yasadışı hale getirebileceği öne sürülmüştür ^6,7,8. Bununla birlikte, bu yaklaşım, enflamatuar ortamın bir sonucu olarak hasarlı dokularda zayıf sağkalım ve azalmış kök hücre aşılaması gibi çeşitli zorluklarla karşı karşıya kalmıştır ⁹. Ayrıca, belirtilen nedenlerden biri, nakledilen hücrelerin hayatta kalmasını ve işlevselliğini desteklemek için hücre dışı bir matrisin olmamasıydı¹⁰. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, kök hücre canlılığını ve işlevini desteklemek için biyomateryal taşıyıcıların geliştirilmesine önem verilmektedir.

Üç boyutlu (3D) hücre kültürü, in vivo ortama daha iyi benzeyen bir ortam sağlamak için in vitro olarak hücreden hücreye ve hücreden matrise etkileşimi geliştirir¹¹. Hidrojeller, kök hücre kültürü için 3 boyutlu bir ortam sağlayan bir biyomateryal taşıyıcı sınıfı olarak kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Bu yapılar su ve çapraz bağlı polimerlerden^{yapılmıştır 12}. ADSC'lerin hidrojel içinde kapsüllenmesi, hücrelerin canlılığını korurken kültür sırasında hücreler üzerinde neredeyse hiç sitotoksik etkiye sahip değildir⁶. 3D olarak kültürlenen kök hücreler, saplarının daha iyi tutulduğunu ve farklılaşma kapasitesinin arttığını gösterir¹³. Benzer şekilde, hidrojel tohumlu ADSC'ler, hayvan modellerinde artan canlılık ve hızlandırılmış yara kapanması göstermiştir¹⁴. Ayrıca, hidrojel kapsülleme, yaralarda ADSC'lerin aşılanmasını ve tutulmasını önemli ölçüde artırır^15,16. TrueGel3D, siklodekstrin veya polietilen glikol¹⁷ gibi bir çapraz bağlayıcı ile katılaştırılmış, polivinil alkol veya dekstran polimerden yapılmıştır. Jel, hücre dışı bir matrisi etkili bir şekilde taklit ederken, jelin bir hastaya nakli sırasında deneylere müdahale edebilecek veya bir bağışıklık reaksiyonunu tetikleyebilecek herhangi bir hayvansal ürün içermeyen sentetik bir hidrojeldir¹⁸. Jel, bileşimi ve tek tek bileşenleri değiştirerek tamamen özelleştirilebilir. Farklı kök hücreleri barındırabilir ve jelin sertliğini ayarlayarak çeşitli hücre tiplerinin farklılaşmasını destekleyebilir¹⁹. Bağlanma bölgeleri, peptitlerin²⁰ eklenmesiyle oluşturulabilir. Jel, metaloproteazların salgılanmasıyla parçalanabilir ve hücre göçüne^{izin verir 21}. Son olarak, açıktır ve görüntüleme tekniklerine izin verir.

PBM, hücre içi kromoforları uyarmak için kullanılan minimal invaziv ve kolayca gerçekleştirilen düşük seviyeli bir lazer tedavisi şeklidir. Farklı dalga boyları hücreler üzerinde farklı etkiler ortaya çıkarır²². Kırmızı ila yakın kızılötesi aralığındaki ışık, elektron taşıma zinciri²³ boyunca akıyı artırarak artan adenozin trifosfat (ATP) ve reaktif oksijen türleri (ROS) üretimini uyarır. Mavi ve yeşil aralıklardaki ışık, ışık kapılı iyon kanallarını uyararak, kalsiyum ve magnezyum gibi katyonların hücrelere spesifik olmayan akışına izin verir, bu da farklılaşmayı arttırdığı bilinmektedir²⁴. Net etki, göç, proliferasyon ve farklılaşma gibi aşağı akış hücresel süreçleri tetikleyen faktörlerin transkripsiyonunu uyaran ikincil habercilerin üretilmesidir²⁵. PBM, hücreleri olumsuz bir ortama, örneğin hasarlı dokuya nakletmeden önce hücrelerin çoğalmasını veya farklılaşmasını sağlamak için ön koşullandırmak için kullanılabilir²⁶. ADSC'lerin nakil öncesi ve sonrası PBM (630 nm ve 810 nm) maruziyeti, diyabetik sıçan modelinde in vivo olarak bu hücrelerin canlılığını ve işlevini önemli ölçüde arttırdı²⁷. Rejeneratif tıp, dokuların etkili bir şekilde onarılması için yeterli sayıda hücre gerektirir²⁸. 3D hücre kültüründe, ADSC'ler, iki boyutlu hücre kültürüne kıyasla daha yavaş proliferasyon oranları ile ilişkilendirilmiştir⁶. Bununla birlikte, PBM, canlılığı, proliferasyonu, göçü ve farklılaşmayı artırarak ADSC'lerin 3D hücre kültürü sürecini artırmak için kullanılabilir^29,30.

Protokol

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler ve yazılımlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın. Protokol, Şekil 1'de grafiksel olarak özetlenmiştir.

1. İki boyutlu (2D) hücre kültürü

NOT: Ölümsüzleştirilmiş ADSC'ler (1 x10⁶ hücreli), 1 mL hücre dondurma ortamı içeren bir kriyoprezervasyon şişesinde sıvı nitrojen içinde -195.8 °C'de saklanır.

1. 2D hücre geri kazanım ortamının ve 2D kültür şişesinin hazırlanması
   1. Bazal ortamın 39 mL'sini 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın
   2. Bazal ortamı% 20 fetal sığır serumu (FBS; 10 mL) ve antibiyotikler (1 mL) (0.5 mL Penisilin-Streptomisin ve 0.5 mL Amfoterisin B) ile zenginleştirin.
   3. Hücre geri kazanım ortamının 6 mL'sini şişeye aktararak bir T75 şişesini önceden koşullandırın ve 37 °C, %5_CO2
      
3. 3. 
      

1. 2. 
      
2. 9. 
      

1. 4. 
      
      
      
      
2. 2. 
      

1. 6. 
      

1. 
   
2. 5. 
      
3. 1. 
      
   7. 
      

Sonuçlar

Morfolojiyi değerlendirmek ve hidrojellerin hücre yoğunluğunu görsel olarak incelemek için ters mikroskopi kullanıldı (Şekil 2). ADSC'ler, tohumlama ve PBM maruziyetinden 24 saat sonra yuvarlak bir morfolojiyi korudu. Hücreler jel boyunca tek hücreler halinde veya üzüm benzeri kümeler halinde dağılmıştır. Morfoloji, 3D kültürde 10 gün sonra değişmedi. Deney grupları ve kontroller arasında veya farklı deney grupları arasında morfolojide kesin bir fark görülmedi.

PBM maruziyetinin ve hidrojel kullanılarak 3D kültürün sitotoksik etkilerini değerlendirmek için LDH sızıntısı ölçüldü (Şekil 3). Deney grupları ve kontroller arasında 24 saat veya 10 gün sonra anlamlı bir fark yoktu, bu da PBM maruziyetinin ve hidrojel kültürünün hücreler üzerinde zararlı bir etkisi olmadığını gösteriyordu.

Hücresel proliferasyon hızları, ADSC'lerin ATP içeriği ölçülerek ölçüldü (Şekil 4). PBM maruziyeti, kontrollere kıyasla tüm deney gruplarında proliferasyon oranlarının artmasına neden oldu. PBM'ye maruz kaldıktan 24 saat sonra, 525 nm dalga boyu en yüksek proliferasyon oranlarını uyardı. Bununla birlikte, 10 günlük işarette, 825 nm dalga boyu, 525 nm dalga boyuna kıyasla üstün çoğalma oranları gösterdi. 10 günlük kültür periyodunun sonunda 825 nm, 10 J/^cm2 grubu en yüksek proliferasyon oranını göstermiştir.

Şekil 1: Protokole genel bakış. 96 oyuklu plakalarda hidrojelin hazırlanmasını, PBM maruziyetini ve PBM maruziyetinden 24 saat ve 10 gün sonra morfoloji ve biyokimyasal testlerin ölçümünü vurgulayan özet protokol. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: ADSC'ler tohumlamadan sonra kendi kendine toplanır. Hücreler yuvarlak-oval bir morfolojiyi korudu ve hidrojel içinde tek hücreler veya tohumlama ve PBM maruziyetinden 10 gün sonra (A) 24 saat ve (B) üzüm benzeri salkım görünümüne sahip agregalar olarak dağıtıldı. 10 günlük inkübasyondan sonra kesin bir değişiklik gözlenmedi. Kontrolleri (1 ve 4) kullanarak, sırasıyla 5 J/cm² (2) ve 10 J/cm^2'de (5) 525 nm veya 5 J/cm² (3) ve 10 J/cm² (6)'da 825 nm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Hidrojelde 525 nm ve 825 nm diyot (5 J/^cm2 ve 10 J/^cm2) kullanılarak, PBM maruziyetinden 24 saat ve 10 gün sonra sitotoksisite ölçümü olarak hücresel LDH sızıntısı. Deneysel kontrole kıyasla sitotoksisitede anlamlı bir artış gözlenmedi. Pozitif kontrol, tam hücre ölümünü temsil ediyordu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Hidrojelde 525 nm ve 825 nm diyot (5 J/^cm2 ve 10 J/^cm2) kullanılarak, PBM maruziyetinden 24 saat ve 10 gün sonra proliferasyon ölçümü olarak hücresel ATP. PBM maruziyeti, tüm deney gruplarında hem zaman noktalarında hem de her iki akıcılıkta artan proliferasyon oranlarını uyardı. Anlamlı farklılıklar (P < 0.001) *** ile gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Parça	Kuyucuk başına hacim (μL)
SLO-Dekstran polimer (30 mmol/L)	0.7
Hücre süspansiyonu	2
Arabellek	0.8
Su	5.5
Çapraz bağlayıcı	1
Toplam hacim	10

Tablo 1: Hidrojel (10 μL) reaktif hacimleri.

Lazer Parametreleri	Yeşil (G)	Yakın kızılötesi (NIR)
Işık kaynağı	Diyot Lazer	Diyot Lazer
Dalga boyu (nm)	525	825
Güç Çıkışı (mW)	553	515
Güç Yoğunluğu (mW/cm2)	57.48	53.53

Tablo 2: Lazer parametreleri.

Tartışma

ADSC'ler, yara iyileşmesine yardımcı olmak için çeşitli süreçleri uyardıkları için rejeneratif tıp için ideal bir hücre tipidir ^3,4. Bununla birlikte, aşılması gereken birkaç zorluk vardır, örneğin, zayıf hayatta kalma oranları ve bir yaralanma bölgesindeki hücrelerin etkisiz aşılanması⁹. Ölümsüzleştirilmiş hücreler, birincil hücrelere kıyasla daha fazla nesil boyunca geçebildikleri, hasat edilmeleri gerekmediği, iyi karakterize edildikleri ve tutarlı sonuçlar sağlayan homojen popülasyonlar oldukları için ticari olarak temin edilebilen bir hücre hattı olarak kullanılmıştır³¹. Bu çalışmanın amacı, 3D hücre kültürü kullanarak PBM'nin ADSC'lerin proliferasyonu ve sitotoksisitesi üzerindeki artırıcı potansiyelini belirlemektir. Üreticinin 30 μL'lik bir hidrojel protokolü, maliyetten tasarruf etmek için 10 μL'ye uyarlanmıştır³². Bununla birlikte, bu azaltılmış hacim, jelin hazırlanmasını ve işlenmesini daha zor hale getirdi.

ADSC'lerin bir 3B ortamda kendi kendine toplandığı gösterilmiştir³³. Bu çalışmada da benzer şekilde, hücreler üzüm benzeri bir görünüme sahip hücre agregatları oluşturdular. Bununla birlikte, tek yumurtlayan hücreler de tanımlandı. Hücre dökülmesi, hücrelerin ana sferoid veya agrega gövdesinden ayrıldığı ve kültür ortamına salındığı sferoidlerin bilinen bir özelliğidir. Hücre dökülmesi, mitoz sırasında canlı hücrelerin döküldüğü ve göçe izin verdiği hücresel proliferasyondan kaynaklanabilir³⁴. Alternatif olarak, dökülme, özellikle büyüyen bir nekrotik çekirdek nedeniyle çok büyük sferoidlerde, hücre ölümü ve sferoid veya agrega şeklinin³⁵ kaybı nedeniyle sonuçlanabilir. Hücreler, 2D kültürlerdeki bir iğ şekline kıyasla, 3D kültürde yuvarlak bir morfoloji benimsedi. Benzer çalışmaların bulgularına uygun olarak, bu sonuçlar, hücrelerin ^6,9'a yapışması için bağlanma yerlerinin veya hücre dışı matrisin eksikliğinden kaynaklanmaktadır. Ayrıca, hücreler jelde önemli bir göç göstermedi, bu da bağlanma bölgelerine ihtiyaç duyulduğunu ima etti³⁶. Bağlanmayı, yapışmayı ve göçü kolaylaştırmak için bir yapışma peptidi veya başka bir hücre dışı matris proteini eklenmesi önerilir. Çalışmanın bir sınırlaması, Z-istifleme yerine ADSC'lerin 3D morfolojisini gözlemlemek için ters ışık mikroskobunun kullanılmasıydı. PBM maruziyeti ve 3D kültürünün, maruziyetten 24 saat sonra ve 10 gün sonra ADSC'lerin sitotoksisitesi üzerinde önemli bir etkisi olmamıştır, bu da hidrojel kültürünün ve PBM'nin güvenli olduğunu ve hücreler üzerinde olumsuz bir etkisi olmadığını gösterir ^6,26. 3D hücre kültüründe, ADSC'ler 2D hücre kültürüne kıyasla daha yavaş proliferasyon oranları ile ilişkilendirilmiştir. Bu, mevcut çalışmada normal kontrollerin düşük proliferasyon oranları ile desteklenmektedir⁶. PBM (525 nm ve 825 nm), 3D kültürde ADSC'lerin proliferasyon oranlarını önemli ölçüde artırdı. Başlangıçta, hem 5 J/^cm2 hem de 10 J/^cm2 akıcılığındaki yeşil ışık (525 nm), yakın kızılötesi ışığa (825 nm) kıyasla en yüksek proliferasyon oranlarını ortaya çıkardı. Bununla birlikte, 10 günlük işarette, yakın kızılötesi ışık (825 nm) hem 5 J / cm² hem de 10 J / cm² akıcılığında en yüksek proliferasyon oranlarına sahiptir. Benzer şekilde, PBM'nin (525 nm ve 825 nm) 2D kültürlerde proliferasyon oranlarını arttırdığı gösterilmiştir³⁷. Diğer çalışmalar yeşil ve yakın kızılötesi ışığın sinerjik bir etkisini bildirdiğinden, bir dalga boyu kombinasyon grubunun da dahil edilmesi önerilir.

Sonuç olarak, kullanılan hidrojel, çeşitli uygulamaların ihtiyaçlarına uyacak şekilde muazzam özelleştirme kapasitesine sahip sentetik bir hidrojeldir. Mevcut çalışma, jelin 10 günlük bir süre boyunca kültürdeki hücreler üzerinde sitotoksik etkisi olmadığını göstermiştir. Ayrıca, PBM, bir 3D kültür ortamında olmasına rağmen, ADSC'lerin proliferasyon oranlarını önemli ölçüde artırarak pozitif bir artırıcı potansiyel göstermiştir. Bu nedenle, bu hidrojel, yaralara transplantasyon için olası bir biyomateryal taşıyıcı görevi görebilir. Gelecekteki araştırmalar, hayvan çalışmaları kullanarak jelin yara iyileşmesine yardımcı olma potansiyelini test etmeyi amaçlamalıdır. Hayvan deney sonuçları olumluysa, klinik uygulamalarda yara iyileşmesine yardımcı olmak için hasta kaynaklı ADSC'lerin yaralara transplantasyondan önce PBM ile hasat edilebileceği, kapsüllenebileceği ve çoğaltılabileceği öngörülmektedir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
525 nm diyot lazer	Güney Afrika Ulusal Lazer Merkezi	EN 60825-1: 2007
825 nm diyot lazer	Güney Afrika Ulusal Lazer Merkezi	SN 101080908ADR-1800
96 Kuyu Şerit Plakaları	Sigma-Aldrich	BR782301
Amfoterisin B	Sigma-Aldrich	A2942	Antibiyotik (% 0.5; 0.5 mL)
CellTiter-Glo 3D Hücre Canlılığı Tahlil	Promega	G9681	ATP reaktifi, Proliferasyon tahlil Kiti
Corning 2 mL Dış Dişli Polipropilen Kriyojenik Flakon	Corning	430659	kriyoviyal
CryoSOfree	Sigma-Aldrich	C9249	Hücre dondurma ortamı
CytoTox96 Radyoaktif Olmayan Sitotoksisite Testi	Promega	G1780	Sitotoksisite reaktifi
Dulbecco' s Modifiye Eagle Media	Sigma-Aldrich	D5796	Bazal ortam (39 mL / 44 mL)
FieldMate Lazer Güç Ölçer	Tutarlı	1098297
Düz tabanlı Corning 96 iyi şeffaf polistiren plaka	Sigma-Aldrich	CLS3370
Fetal sığır serumu	Biochrom	S0615	Kültür ortamı zenginleştirme (5 mL;% 10 / 10 mL;% 20)
Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)	Sigma-Aldrich	H9394	Durulama çözeltisi
Heracell 150i CO2 inkübatörü	Thermo Scientific	51026280
Heraeus Labofuge 400	Thermo Scientific	75008371	96 kuyulu plakalar için plaka döndürücü
Heraeus Megafuge 16R santrifüj	ThermoFisher	75004270
Ölümsüzleştirilmiş ADSC'ler	ATCC	ASC52Telo hTERT, ATCC SCRC-4000	Passage 37
Invitrogen Countess 3	Invitrogen	AMQAX2000	Trypan Blue
Julabo TW20 su banyosu	Sigma-Aldrich	Z615501	Su banyosu, ortamı 37 ° C'ye kadar ısıtmak için kullanılır; C
Olympus CellSens Giriş Seviyesi	Olympus	Versiyon 3.2 (23706)	Görüntüleme yazılımı: dijital görüntü elde etme
Olympus CKX41	Olympus	SN9B02019	Ters ışık mikroskobu
Olympus SC30 fotoğraf makinesi	Olympus	SN57000530	Ters çevrilmiş ışık mikroskobuna bağlı kamera
Opak duvarlı Corning 96 kuyulu katı polistiren mikroplakalar	Sigma-Aldrich	CLS3912	ATP lüminesansı için kullanılan opak kuyu
Penisilin-Streptomisin	Sigma-Aldrich	P4333	Antibiyotik (% 0.5; 0.5 mL)
SigmaPlot 12.0	Systat Yazılımı Dahil
TrueGel3D – True3	Sigma-Aldrich	TRUE3-1KT	10 ve mikro; L
TrueGel3D Enzimatik Hücre Geri Kazanım Çözeltisi	Sigma-Aldrich	TRUEENZ	01:20
Tripan Mavi Leke	Thermo Fisher - Invitrogen	T10282	%0.4 çözelti
TrypLE Select Enzyme (1x)	Gibco	12563029	Hücre ayırma çözümü
Victor Nivo Plaka Okuyucu	Perkin Elmer	HH3522019094	Spektrofotometrik plaka okuyucu