Yöntem makalesi

Zebra Balığı Ölçeklerinde Hücresel Dinamikleri İncelemek için İn Vitro Kültür Tekniği

DOI:

10.3791/66619

⸱

10 Ocak 2025

 , 
1Department of Biology, Mount Saint Vincent University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, basit bir in vitro kültür tekniği kullanarak hücresel dinamikleri incelemek için bir yöntem sunar. Zebra balığı araştırmacıları ve eğitimcileri, ölçeklerdeki floresan çekirdekleri ve apoptotik hücreleri görselleştirerek kemik homeostazı ve temel hücre biyolojisi ile ilgili olanlar gibi hücresel süreçleri inceleme fırsatı sunar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebra balığı pulları, eğitim ve araştırma amaçlı standart laboratuvarlarda kullanım için çeşitli avantajlar sunar. Pullar ötenaziye ihtiyaç duymadan kolayca toplanır, birkaç hafta içinde yenilenir ve yarı saydam ve küçüktür, bu da standart bir mikroskop kullanılarak görüntülenmelerine olanak tanır. Zebra balığı pulları, öğrencilerin özellikle hücresel dinamikleri ve in vitro kültür yöntemlerini anlama konusunda uygulamalı öğrenme deneyimlerine katılmaları için eşsiz bir fırsat sağladıkları için özellikle eğitim ortamlarında kullanışlıdır. Bu protokolün temel amacı, temel laboratuvar ekipmanı kullanılarak çeşitli biyolojik çalışmalarda kullanılmak üzere zebra balığı pullarının kültürde toplanması ve bakımı için bir yöntemi tanımlamaktır. Ek olarak, protokol, kemik rezorpsiyonu ve birikiminde rol oynayan kemik hücrelerinin aktivitesini inceleyerek kemik homeostazını anlamada kullanımlarını detaylandırır. Ayrıca, çekirdeklerin ve apoptotik hücrelerin görselleştirilmesi gibi genel teknikler için ek protokoller içerir. İn vitro kültür protokolü, minimum reaktif ve ekipmanla güvenilir sonuçlar verir. Bu makale, bilimsel araştırmayı teşvik etmek için zebra balığı pullarının in vitro kültürlerini kullanmanın faydalarını tartışmakta ve bunların eğitim ortamlarına entegrasyonunu desteklemek için gereken kaynakları özetlemektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son yıllarda, zebra balığı (Danio rerio) genetik, gelişim biyolojisi ve toksikoloji dahil olmak üzere çeşitli bilimsel alanlarda değerli bir model organizma olarak ortaya çıkmıştır 1,2,3. Zebra balığı, Güneydoğu Asya nehirlerine özgü küçük tropikal tatlı su balıklarıdır4. Kolay bakımları, küçük boyutları, hızlı üreme döngüleri ve yarı saydam embriyoları nedeniyle biyolojide popüler bir model organizma haline gelmişlerdir1. Bu, iç gelişimlerinin kolayca gözlemlenmesini sağlar ve bu da onları gelişim biyolojisindeki çeşitli biyolojik süreçleri incelemek için ideal hale getirir. Zebra balığı insanlarla genetik benzerlikler paylaşır; İnsan genlerinin yaklaşık% 70'inin en az bir zebra balığı muadili vardır, bu da onları insanlarda genetik bozuklukları ve hastalıkları incelemek için mükemmel bir model haline getirir 5,6. Araştırmacılar, zebra balıklarındaki belirli genleri manipüle ederek, genlerin işlevi ve davranışı hakkında değerli bilgiler edinebilir ve bu daha sonra insan sağlığı araştırmalarına6, gen düzenlemeye ve transgenik hatlarınoluşturulmasına 7,8 uygulanabilir.

Zebra balığı pullarıçıkarıldıktan sonra yeniden doğar 9,10 ve deneyler için kullanılırken bazik (CO2 olmayan) bir inkübatör ile bir ila üç gün boyunca kültürlenebilir11. Zebra balığı pullarının kullanımı, anestezi uygulanmış balıklardan ötenaziye gerek kalmadan çıkarılabildiği için temel laboratuvarlarda avantajlıdır. Zebra balığı pulları, esas olarak iki katmandan oluşan dermal iskeletin bir bileşenidir: kalın ve kollajen fibril katmanları tarafından oluşturulan kısmen mineralize dokudan yapılmış iç katman ve yüksek oranda mineralize olan ve iç içe geçmiş kollajen fibrillerinden oluşan bir ağ içeren dış katman12,13 (Şekil 1A-C). Ölçeğin bu morfolojik ve hücresel özellikleri, standart bir bileşik mikroskop altında kolayca gözlemlenebilir. Bu özellikler, zebra balığı pullarını hücresel ve moleküler incelemek için iyi bir model haline getirir. Örneğin, zebra balığı pulları, kemik hücresi aktivitesi11,12 dahil olmak üzere kemik homeostazını incelemek için kullanılmıştır. Ayrıca doku rejenerasyonunu 9,14,15, gen yollarını ve sinyalleşmeyi14,16, metabolizmayı17, mikrobiyota çalışmalarını18 vb. anlamak için de kullanılmıştır. Zebra balığı, diğer teleostlara benzer şekilde, kirleticiler ve toksinler gibi çevresel faktörlere karşı da oldukça hassastır 19,20,21,22. Bu nedenle, balık popülasyonlarındaki toksinlere maruz kalmayı incelemek için balık pulları kullanılır. Bu özellikler, ölçekleri öğrencilere çevresel faktörlerin canlı organizmalar üzerindeki etkilerini öğretmek için mükemmel bir model haline getirir. Ek olarak, Tg(osterix:mCherry) ve Tg(runx2a:GFP) gibi transgenik zebra balığı hatlarından elde edilen ölçekler, öğrenci deneylerine başka bir karmaşıklık düzeyi ekleyebilir.

Özetle, araştırmacılar zebra balığı pullarını kullanarak, hücresel mekanizmalardan çevresel değişikliklere kadar biyolojinin çeşitli yönlerini incelemek için deneyler tasarlayabilir ve yürütebilirler. Zebra balığı, deneysel tasarım, veri toplama ve analizde uygulamalı deneyimler sağlayabildikleri için yüksek öğrenimde de değerli bir kaynaktır. Zebra balığı, belirli ilgi alanlarını keşfetmek için ileri düzey kurslarda ve araştırma odaklı programlarda da kullanılabilir. Bu makale, zebra balığı pullarını araştırma ve sınıf öğrenme ortamlarında kullanmak için bir protokol açıklamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan tüm protokoller Kanada Hayvan Bakımı Konseyi yönergelerini takip eder ve Saint Mary's Üniversitesi / Mount Saint Vincent Üniversitesi Hayvan Bakımı komitesi tarafından 20-14 ve 21-12 protokol numaraları altında yıllık olarak onaylanmıştır. Bu protokolü gerçekleştirmeden önce, kullanıcılar hayvanların araştırma veya öğretimde kullanılmasına ilişkin federal ve eyalet yönergelerine uyulduğundan emin olmalıdır23. Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Ölçek kültürü için reaktiflerin hazırlanması

  1. DMEM ortamını HEPES (10 g DMEM tozu, 5.95 g HEPES, 1 L damıtılmış su veya dH2O, pH: 6.91) ile hazırlayın ve 4 ° C'de saklayın.
  2. Deneyin yapıldığı gün ihtiyaç duyulan hacme ayarlanmış kültür ortamı çalışma solüsyonunu (HEPES ile% 88 DMEM ortamı,% 10 fetal sığır serumu ve% 2 penisilin-streptomisin [mL başına 5000 ünite penisilin ve 5 mg streptomisin] hazırlayın.
    NOT: Çalışma solüsyonu günlük olarak taze olarak hazırlanmalıdır ve saklanamaz. Kültür ortamı kullanılana kadar soğuk tutulmalıdır (4 °C'de veya buz üzerinde).
  3. Kültür ortamı çalışma solüsyonunu, deneyin gerçekleştirileceği kaplara alikot edin. Bu durumda, 0.2 mL'lik tüpler veya 96 oyuklu bir plaka kullanıldı. Bu alikotları gerekene kadar buz üzerinde tutun.
    NOT: Bu çözelti taze olarak hazırlanmalı ve 1 günden fazla saklanamaz. Tüm reaktifler için Tablo 1'e bakın.

2. Canlı balıklardan pulların çıkarılması

  1. Zebra balığı için 4-5 yetişkin balık için yaklaşık 2 L su hacmine sahip bir kap veya tank hazırlayın.
    NOT: Zebra balığı için uygun olan suyun tipik parametreleri pH 7.5, sıcaklık 28.5 °C, iletkenlik 640-781 μS ve 12-12 saatlik karanlık ışık döngüsüdür. Tankta sıcaklığın sürekli olarak korunduğundan emin olun.
  2. 4-5 yetişkin zebra balığını yakalamak için bir balık ağı kullanın ve bunları yukarıda hazırlanan zebra balığı tutma tankına yerleştirin.
  3. Balığın uyuşturulacağı en az 60 mL su içeren bir kap hazırlayın.
    NOT: Balıklar kabın içinde hareket edebilmeli ve dışarı atlamalarını önleyecek kadar derin olmalıdır. Bu kap, zebra balığı suyundan oluşması gereken tamponlu %0.01 trikain metan-sülfonat (MS222) içermelidir (300 mL zebra balığı su sisteminde 0.3 g MS222, 615 μL 1 M NaOH ile hazırlanan %0.1 MS222'yi on kez seyreltin).
    DİKKAT: Bu deneyleri yapan kişiler, zebra balıklarını yakalamak, uyuşturmak ve işlemek için kurumsal hayvan etik kurulunun onayına sahip olmalıdır. Benzer şekilde, kullanılan anestezik, balık biyolojisinde yaygın olarak kullanılan ancak tek kullanımlık nitril eldivenler, koruyucu gözlükler/sıçrama gözlükleri ve laboratuvar önlüğü dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman gibi uygun kullanım gerektiren bir kimyasal olan düşük konsantrasyonda trikain metan-sülfonattır (MS222) (Daha fazla bilgi için MS222 güvenlik veri sayfasına bakın).
  4. Daha önce 1. adımda kullanılanla aynı özelliklere sahip bir geri kazanım kabı hazırlayın (en az 2 L su), kireç çıkarıldıktan sonra balığın yerleştirileceği yer. Bu kap, yukarıda belirtildiği gibi yeterli alana ve doğru su parametrelerine sahip olmalıdır.
  5. Bir ağ kullanarak, tek bir yetişkin zebra balığını dikkatlice %0,01 MS222 içeren kaba aktarın. Balık tamamen hareketsiz olana ve minimum operküler harekete sahip olana kadar bekleyin (bu genellikle 10 dakikadan az sürer).
    NOT: Bu adımın tamamı her seferinde bir balık tarafından gerçekleştirilir. Pullar işlenmekte olan balıktan başarılı bir şekilde çıkarılana ve bu balık kurtarma kabına aktarılana kadar bir sonraki balığı uyuşturmayın.
  6. Yetişkin zebra balığını ıslak bir kağıt havluyla kaplı ters çevrilmiş bir Petri kabına ayrı ayrı yerleştirin.
  7. Diseksiyon stereomikroskopu altında ve ince forseps kullanarak, tek bir balıktan en fazla 10-12 pul çıkarın. Pullar, pulların vücudun diğer kısımlarına kıyasla daha büyük ve daha sabit bir boyuta sahip olduğu balığın yan bölgesinden çıkarılır (Şekil 2). Balığın her iki tarafı da kullanılabilir.
    1. Ölçeğin doğal yönünde (yani önden arkaya doğru yönde) hafifçe çekerek ölçekleri birer birer çıkarın. Bu mümkün olduğunca çabuk yapılmalıdır.
  8. Ölçeklerin bozulmasını önlemek için her bir ölçeği, ölçek kültürü ortam işleme solüsyonunu (adım 1.1'de hazırlanan) içeren ayrı bir 0,2 mL'lik tüpe yerleştirin. Alternatif olarak 96 oyuklu bir plaka kullanılabilir.
    NOT: Ayrı ölçeklerin ayrı tüplerde veya kuyucuklarda izole edilmesi, ölçeklerin birbirine yapışmasını önler ve birden fazla deney için gerekli olabilecek bireysel ölçeklerin izlenmesine olanak tanır.
  9. Spesifik deney bir ölçek tedavisi gerektiriyorsa, bu adımda uygulayın. Bazı protokollerin örnekleri için adım 4 ve 5'e bakın.
  10. Tüpleri terazilerle birlikte 28 °C'de bir inkübatörün içine koyun. Kültür ortamı her 24 saatte bir değiştirilmelidir (kültür ortamı çalışma çözümü ile). Burada özetlenen deneyler için CO2 olmayan bir inkübatör kullanıldı.
  11. Kireci çıkardıktan sonra, zebra balığını dikkatlice kurtarma tankına geri koyun ve hareket devam edene kadar izleyin. Geri kazanımı hızlandırmak için tankta hava sağlamak için bir pipet veya havalandırma taşı kullanılır.
  12. Hareket yeniden sağlandığında, zebra balığını normal bir yetiştirme tankına geri koyun. Kullanılan balıkları diğer balıklardan ayrı tutmayı unutmayın, böylece ayrı ayrı iyileşebilirler ve hangi balıkların pullarını aktif olarak yenilediğini takip edebilirsiniz.
  13. Aynı balıklardan pul çıkarma işlemini tekrarlamadan önce ~ 2 hafta bekleyin. Bu, pullarını doğal olarak yenilemeleri için zaman tanır.

3. Ölçeklerin sabitlenmesi

  1. Terazileri 10x PBS'den hazırlanan 200 μL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile üç kez yıkayın (1 L için 80 g NaCl, 2 g KCl ve 11.2 g Na2HPO4 ekleyin, 1 L'ye kadar dH2O ekleyin).
  2. 1x PBS'yi çıkarın ve gece boyunca 4 °C'de 200 μL %4 paraformaldehit (PFA) ekleyin. 100 ml PFA için 4 g paraformaldehit ve 0.1 g NaOH ekleyin, ardından 100 mL'ye kadar 1x PBS ekleyin. Düşük ısıya ayarlanmış sıcak bir plaka üzerinde karıştırın ve çözelti berraklaşana kadar karıştırın, ardından çözeltinin soğumasını bekleyin ve pH'ı 7.4'e sabitleyin. -20 °C'de saklayın. Ayrıntılar için lütfen Ek Dosya 1'e (Tablo 1) bakın.
  3. Fiksasyondan sonra, teraziyi 200 μL 1x PBS ile üç kez yıkayın. Tartıları 4 °C'de saklayın.
    DİKKAT: PFA zararlıdır. Daha fazla bilgi için güvenlik bilgi formuna bakın. Tüm bu işlemler, tek kullanımlık nitril eldivenler, güvenlik gözlükleri/sıçrama gözlükleri ve laboratuvar önlüğü dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman gibi uygun kullanım gerektirir.

4. Kemik homeostazı

NOT: Aşağıda iki kemik homeostazı prosedürü açıklanmıştır. Tartarat dirençli asit fosfataz (TRAP) ve alkalin fosfat (AP) boyaması tipik olarak sırasıyla aktif osteoklastları ve osteoblastları tanımlamak için kullanılır. Osteoklastlar kemik matrisini emerken osteoblastlar kemik matrisini biriktirir. AP, kemik oluşumu sırasında osteoblastlar tarafından salınan ana enzimdir, TRAP ise osteoklastlar tarafından osteoklast ve kemik matrisi arasındaki asidik boşluğa salgılanır ve kemik parçalanmasına ve emilimine yardımcı olur 24,25,26. Bu protokol Zebra Balığı Bilgi Ağı27'dede mevcuttur ve daha önceyayınlanmıştır 28. Alkalin fosfataz, metabolik sürecin bir parçası olarak birden fazla hücre tipi tarafından üretilen bir enzimdir. Bu işlem tamamen osteoblastlara özgü değildir, ancak kemik dokusunda osteoblast fonksiyonu için bir belirteç olarak kullanılır.

  1. Tartarat dirençli asit fosfataz (TRAP) boyaması
    1. Her sabit teraziyi 0.2 mL'lik bir tüpe veya 200 μL dH2O içeren 96 oyuklu bir plakaya yerleştirin. Ayrıntılar için lütfen Ek Dosya 1'e (Tablo 2) bakın.
    2. Ölçekleri 0.2 mL'lik tüpten veya kuyucuktan çıkarın ve 200 μL 50 mM tartrat tamponu içeren yeni bir tüpe yerleştirin. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
      1. 100 mM tartrat tamponu için bir cam kap hazırlayın, 2.3 g tartarik asit ekleyin ve 100 mL çözeltiye kadar 0.2 M asetat tamponu (pH 5.5) ile karıştırın. İyice karıştırın ve 4 °C'de saklayın. 50 mM tartrat tamponu hazırlamak için eşit hacimlerdedH2Ove 100 mM tartrat tamponu ekleyin. Ayrıntılar için lütfen Ek Dosya 1'e bakın (Tablo 3 ve Tablo 4).
    3. Tartarat tamponunu tüpten çıkarın ve 200 μL TRAP substrat çözeltisi ekleyin. Numuneleri oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Numunelerin karanlıkta kaldığından emin olun.
      1. Koyu renkli bir cam kap hazırlayın ve 30 mL 100 mM tartrat tamponu, 1 mL heksazotize PRS (Pararosanilin hidroklorür çözeltisi) ve 2 mL enzim substrat çözeltisi ekleyin. İyice karıştırın.
        NOT: Bu çözüm saklanamaz; Kullanırken karanlıkta oda sıcaklığında tutun. TRAP substrat çözeltisini hazırlamak için gereken çözümler için lütfen Ek Dosya 1'e (Tablo 5-9) bakın.
    4. TRAP substrat solüsyonunu çıkarın ve üç kez 15 dakika boyunca yaklaşık 150 μL dH2O ekleyip çıkararak pulları yıkayın.
    5. Pulları tüpten çıkarın ve solmayı önlemek için alüminyum folyoya sarılmış 200 μL %80 gliserol (100 mL için, 80 mL gliserol ile 20 mL dH2O karıştırın) ile yeni bir tüpe veya kuyuya yerleştirin ve 4 °C'de saklayın.
    6. Ölçekleri mikroskop altında görselleştirmek için bir çöküntü veya içbükey slayt kullanın.
  2. Alkali fosfat (AP) boyama
    1. Her bir sabit ölçeği 200 μL dH2O içeren 0.2 mL'lik bir tüpe veya 96 oyuklu bir plakaya yerleştirin ve üç kez 15 dakika boyunca yaklaşık 150 μL dH2O ekleyip çıkararak yıkayın. Ayrıntılar için lütfen Ek Dosya 1'e (Tablo 2) bakın.
    2. Ölçekleri 0.2 mL'lik tüplerden veya kuyulardan çıkarın ve 200 μL tris-maleat tamponu içeren yeni bir tüpe yerleştirin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
      1. Bu tampon için bir cam kap hazırlayın ve 0.605 g tris tamponu ve 0.55 g maleik asit ekleyin. 25 mL'ye kadar dH2O ekleyin ve iyice karıştırın. PH 8.3'e stabilize edin. 4 °C'de saklayın. Ayrıntılar için lütfen Ek Dosya 1'e (Tablo 10) bakın.
    3. Tris-maleat tamponunu tüpten çıkarın ve 200 μL AP substrat çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Numunelerin karanlıkta kaldığından emin olun.
      1. Bu çözelti için koyu renkli bir cam kap hazırlayın, 8 mg diazonyum tuzu ekleyin ve N, N-dimetilformamid içinde 0.1 mL naftol-AS-TR-fosfat ve 10 mL tris-maleat tamponu (pH 8.3) ile karıştırın, iyice karıştırın. Bu çözeltiyi taze olarak hazırlayın. Ayrıntılar için lütfen Ek Dosya 1'e (Tablo 11) bakın.
    4. AP substrat solüsyonunu çıkarın ve 200 μL dH2Oekleyip çıkararak 15 dakika boyunca üç kez pulları yıkayın.
    5. Pulları tüpten çıkarın ve solmayı önlemek için alüminyum folyoya sarılmış 200 μL %80 gliserol ile yeni bir tüpe veya kuyuya yerleştirin. 4 °C'de saklayın.
    6. Ölçekleri bir mikroskop kullanarak görselleştirmek için, ölçekleri içbükey veya çöküntü slaytına yerleştirin.
      DİKKAT: TRAP ve AP boyamada kullanılan reaktiflerin çoğu zararlı olabilir. Her kimyasal için güvenlik bilgi formuna bakın. Tüm bu prosedürler, tek kullanımlık nitril eldivenler, güvenlik gözlükleri/sıçrama gözlükleri ve laboratuvar önlüğü dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman gibi uygun kullanım gerektirir.

5. Hücre dinamiğinin zebra balığı pullarında görselleştirilmesi

NOT: Ölçekler arasındaki farkları görselleştirmek ve ölçek içindeki hücreleri etiketlemek için bir dizi boyama yöntemi kullanılabilir (Şekil 3B). Örneğin, ölçeğin hücreleri içindeki çekirdekleri ve lizozomları boyama yöntemleri aşağıda özetlenmiştir.

  1. Hücre çekirdeği görselleştirmesi için DAPI boyama
    NOT: DAPI, DNA'yı etiketleyerek tüm hücrelerin çekirdeklerini işaretlemek için kullanılır. DAPI, DNA dizilerinde adenin ve timin açısından zenginleştirilmiş bölgelere güçlü bir şekilde bağlanan bir floresan belirteçtir.
    1. DAPI'yi kullanmadan önce, ölçeklerin %4 paraformaldehit içinde sabitlendiğinden emin olun (adım 3). Sabitledikten sonra tartıları 200 μL 1x PBS ile 5 dakika yıkayın.
    2. Aşağıdaki gibi 1:10 seyreltmede bir DAPI çalışma çözeltisi hazırlayın. Toplam hacmi 10 μL elde etmek için 1 μL DAPI'yi 9 μL 1x PBS ile karıştırın.
    3. DAPI çözeltisini hazırladıktan sonra, teraziyi içbükey bir lam üzerine koymak için forseps veya plastik bir pipet kullanın, fazla PBS'yi çıkarın ve hazırlanan DAPI çözeltisinden yaklaşık 10 μL ekleyin.
      NOT: DAPI, ölçeği hemen lekeleyecektir, böylece 352-402 nm uyarma dalga boyuna ve 417-477 nm emisyon dalga boyuna sahip bir floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilebilir. DAPI, tüm hücre çekirdeklerini parlak mavi renkte boyayacaktır. Görüş alanındaki ölçeğin tamamını görebilmek için 4x objektif kullanılmıştır. Tek lekeli çekirdekler, 20x objektif kullanılarak görülebilir.
    4. Ölçekteki hücre sayısını belirlemek için DAPI ile boyanmış çekirdeklerin sayısını sayın.
  2. Canlı örneklerde hücre ölümü görselleştirmesi için apoptotik boyama
    NOT: Floresan lekeler apoptotik hücreleri etiketlemek için kullanılabilir. Örneğin, burada kullanılan floresan işaretleyici protokolü asidik ortamlar içindir ve lizozomlar gibi asidik organelleri etiketlemek ve izlemek için kullanılabilir. Bu organellerin sayısındaki artış, artan hücre ölümü ile ilişkilidir. Bu leke, yeni çekilmiş veya 2 güne kadar kültürlenmiş sabitlenmemiş pullara uygulanmalıdır.
    1. Seyreltici olarak kültür ortamını kullanarak üreticinin talimatlarına göre apoptoz takibi için bir floresan lekesi çözeltisi hazırlayın.
      NOT: Floresan lekenin konsantrasyonu, kullanılan apoptoz yöntemine bağlı olarak büyük ölçüde değişebilir. Önerilen konsantrasyonlarla ilgili özel ayrıntılar için tercih edilen leke için ticari protokole bakın.
    2. Ölçekler daha önce kültürlenmişse, kültür ortamını her 0.2 mL'lik tüpten veya 96 oyuklu bir plakadan dikkatlice çıkarın.
    3. Tüm ölçeği kaplayacak kadar floresan boyama solüsyonu ekleyin (yaklaşık 50 μL).
    4. Solmayı önlemek için tüm tüpleri alüminyum folyo ile örtün ve 30 dakika bekletin.
    5. Floresan boyama solüsyonunu tüplerden veya kuyucuklardan çıkarın.
    6. Tüplere veya kuyucuklara 200 μL 1x PBS ekleyerek numuneleri 5 dakika boyunca yıkayın.
    7. PBS'yi çıkarın ve numuneleri oda sıcaklığında 1 saat sabitlemek için tüplere veya kuyucuklara 200 μL %4 PFA ekleyin.
    8. Tüplere veya kuyucuklara 200 μL 1x PBS ekleyerek numuneleri 5 dakika boyunca yıkayın.
    9. Ölçekleri yeni bir 0.2 mL tüpe veya kuyuya aktarın ve 200 μL taze 1x PBS ekleyin. Solmayı önlemek için bu tüpleri/kuyuları alüminyum folyo ile örtün. 4 °C'de saklayın.
    10. Ölçekleri bir floresan mikroskobu ile görselleştirmek için içbükey veya çöküntü lamı ve doğru filtreyi kullanın. Burada kullanılan floresan sinyali, maksimum 577-590 nm'lik bir uyarma ve emisyona sahiptir. Floresan boya, kırmızı renkte lizozom içeren apoptotik hücreleri gösterir.
    11. Apoptoz geçiren hücrelerin sayısını belirlemek için lekeli hücrelerin sayısını sayın.
      NOT: Alüminyum folyo, solmayı önlemek için boyama ve saklama sırasında kullanılır. Numuneler, hangi floresan lekenin kullanıldığına bağlı olarak karanlıkta birkaç saat hatta günlerce saklanabilir. Floresan numuneleri daha uzun süre saklamak için, floresan leke ile uyumlu bir sabitleme ve montaj protokolü kullanın. Tüm floresan boyama, en az 20x büyütmeli bir floresan mikroskobu kullanılarak görüntülendi. Kullanılan filtre şu şekildeydi: DAPI 417-477 nm için; apoptoz takibi için 577-590 nm.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son zamanlarda, bu ölçek kültür protokolü kemik homeostazını incelemek için kullanıldı11. Ölçekler kültür ortamında en az 2 gün hayatta kalabilir. Apoptotik hücrelerin sayısı, etiketli hücreler sayılarak, kültürün her gününde, en fazla üç güne kadar analiz edildi. Bu sonuçlar, apoptotik hücrelerin kültürlemenin üçüncü gününde önemli ölçüde arttığını gösterdi, bu da kültür süresinin burada açıklanan yöntem kullanılarak iki gün ile sınırlandırılması gerektiğini gösterdi.

...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebra balığı pulları, doğal ortamlarını simüle etmek için bir kültür yöntemi ve bir kuluçka makinesi kullanılarak 2 güne kadar sürdürülebilen çeşitli farklı biyolojik süreçleri incelemek için kolayca erişilebilir bir in vitro modeldir11. Ölçekler, araştırmacıların hücreleri görüntülemesine, saymasına ve etiketlemesine ve temel laboratuvar ekipmanını kullanarak basit hücre biyolojisi deneyleri yapmasına olanak tanıyan düzenli ve orantılı bir hücre dağılımı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Mount Saint Vincent Üniversitesi Su Tesisi personeline ve Franz-Odendaal Kemik Geliştirme laboratuvarının tüm üyelerine gerekli balık bakımını sağladıkları için teşekkür eder. Bazı protokollerin optimize edilmesine yardımcı oldukları için Alisha McNeil, Keely A. MacLellan ve Shirine Jeradi'ye özellikle teşekkür ederiz. Bu araştırma, Kanada Uzay Ajansı (CSA) [19HLSRM01] ve Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) tarafından finanse edilerek desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.2 mL tüplern/an/a
%37 HCl EMDHX0603-4pH stabilizasyonu ve PRS'nin hazırlanması için
İçbükey slaytn/an/a
DAPIVectashieldH-1200Hücre çekirdeği görselleştirmesi için
Diazonyum tuzu (Fast Blue B)SigmaD9805AP substrat çözeltisi için
Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium (DMEM) tozu Sigma D5523Ölçek kültürü ortamı için 
Etil 3-aminobenzoat metansülfonat (MS222) Sigma E10521% 0.1 MS222
Fetal sığır serumu hazırlanması için Sigma F4135Ölçek kültürü ortamı için 
Floresan mikroskobun/an/a
Buzlu asetik asit Balıkçı A38 212Asetat tamponu için
GliserolVWRBDH1172-4LP%80 gliserol için - depolama terazileri
HEPES ThermoFisher 15630106Ölçek kültürü ortamı için 
Sıcak plakan/an/a
KCl SigmaP217-10PBS
LysotrackerThermoFisherL7528'iniçin Lizozomlar için  görselleştirme
Maleik asitSigmaM0375Tris-Maleat tamponu için 
Mikropipetn/an/a
N,N-dimetilformamidSigma319937AP substrat çözeltisi
N,N-dimetilformamid Enzim Substrat Çözeltisi içinSigma319937
Na2HPO4 EMDSX0720-1PBS
NaCl 'ninSigma S9888PBS
NaNO2SigmaS-2252%4 NaNO2
NaOH SigmaS5881%4 PFA
NaOH Sigma S5881Ölçek fiksasyonu ve pH stabilizasyonu için
Napthol-AS-TR-fosfatSigmaN6125AP substrat çözeltisi için
Napthol-AS-TR-fosfat Enzim Substrat Çözeltisi içinSigmaN6125
Pararosanilin hidroklorür &PRS içinSigmaP3750
Penisilin-streptomisin 5000 ünite penisilin ve 5mg streptomiyosin/mlThermoFisher 15140122Ölçek kültürü ortamı için 
Kişisel koruyucu ekipman (KKD): tek kullanımlık nitril eldivenler, koruyucu gözlükler/sıçrama gözlükleri ve laboratuvar önlüğü.n/an/a
PFA Sigma P6148Kireç fiksasyonu için
Sodyum asetat Sigma Asetat tamponu içinS2889
Standart bileşik mikroskopn/an/a
Karıştırma plakasın/an/a
Tartarik asitSigmaT6521Tartarat tamponu için
Tris tabanıRoche03 118 142 001Tris-Maleat tamponu için 
hazırlanması hazırlanması için; hazırlanması için;

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. New York. (2002).
  2. Linney, E., Upchurch, L., Donerly, S. Zebrafish as a neurotoxicological model. Neurotoxicol Teratol. 26 (6), 709-718 (2004).
  3. Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. Evaluation of embryotoxicity using the zebrafish model. Drug Safety Eval: Met Prot. , 271-279 (2011).
  4. Aleström, P., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Lab Anim. 54 (3), 213-224 (2020).
  5. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  6. Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish as a model for the study of human cancer. Methods Cell Biol. 105, 309-337 (2011).
  7. Choe, C. P., et al. Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research. Lab Anim Res. 37, 1-29 (2021).
  8. Brito, R. S., Canedo, A., Farias, D., Rocha, T. L. Transgenic zebrafish (Danio rerio) as an emerging model system in ecotoxicology and toxicology: Historical review, recent advances, and trends. Sci Total Environ. 848, 157665(2022).
  9. Bergen, D. J. M., et al. Regenerating zebrafish scales express a subset of evolutionary conserved genes involved in human skeletal disease. BMC Biol. 20 (1), 1-25 (2022).
  10. Sire, J., Girondot, M., Babiar, O. Marking zebrafish, Danio rerio (Cyprinidae), using scale regeneration. J Exp Zool. 286 (3), 297-304 (2000).
  11. Carvajal-Agudelo, J. D., McNeil, A., Franz-Odendaal, T. A. Effects of simulated microgravity and vibration on osteoblast and osteoclast activity in cultured zebrafish scales. Life Sci Space Res. 38, 39-45 (2023).
  12. Pasqualetti, S., Banfi, G., Mariotti, M. Osteoblast and osteoclast behavior in zebrafish cultured scales. Cell Tissue Res. 350, 69-75 (2012).
  13. Pasqualetti, S., Banfi, G., Mariotti, M. The zebrafish scale as model to study the bone mineralization process. J Mol Histol. 43, 589-595 (2012).
  14. De Vrieze, E., et al. Prednisolone induces osteoporosis-like phenotype in regenerating zebrafish scales. Osteoporos Int. 25, 567-578 (2014).
  15. Iwasaki, M., Kuroda, J., Kawakami, K., Wada, H. Epidermal regulation of bone morphogenesis through the development and regeneration of osteoblasts in the zebrafish scale. Dev Biol. 437 (2), 105-119 (2018).
  16. Aman, A. J., Fulbright, A. N., Parichy, D. M. Wnt/β-catenin regulates an ancient signaling network during zebrafish scale development. Elife. 7, e37001(2018).
  17. Carnovali, M., Luzi, L., Banfi, G., Mariotti, M. Chronic hyperglycemia affects bone metabolism in adult zebrafish scale model. Endocr. 54, 808-817 (2016).
  18. Burns, A. R., Guillemin, K. The scales of the zebrafish: Host-microbiota interactions from proteins to populations. COMICR. 38, 137-141 (2017).
  19. Vieira, E. F. S., et al. The use of freshwater fish scale of the species Leporinus elongatus as adsorbent for anionic dyes: An isothermal calorimetric study. J Therm Anal Calorim. 109 (3), 1407-1412 (2012).
  20. Ighalo, J. O., Eletta, O. A. A. Recent advances in the biosorption of pollutants by fish scales: A mini-review. Chem Eng Commun. 208 (9), 1301-1312 (2021).
  21. Eletta, O. A. A., Ighalo, J. O. A review of fish scales as a source of biosorbent for the removal of pollutants from industrial effluents. J Res Inf Civ Eng. 16 (1), 2479-2510 (2019).
  22. Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicol. Sci. 86 (1), 6-19 (2005).
  23. CCAC Canadian Council of Animal Care (CCAC). , https://ccac.ca/ (2024).
  24. Suzuki, N., Hattori, A. Melatonin suppresses osteoclastic and osteoblastic activities in the scales of goldfish. J. Pineal Res. 33 (4), 253-258 (2002).
  25. Suzuki, N., et al. Effect of vibration on osteoblastic and osteoclastic activities: Analysis of bone metabolism using goldfish scale as a model for bone. ASR. 40 (11), 1711-1721 (2007).
  26. Kawakami, K., et al. z Trap: zebrafish gene trap and enhancer trap database. BMC Dev Biol. 10, 1-10 (2010).
  27. ZFIN The Zebrafish Model Organism Database.. , https://zfin.org/ (2024).
  28. Edsall, S. C., Franz-Odendaal, T. A. A quick whole-mount staining protocol for bone deposition and resorption. Zebrafish. 7 (3), 275-280 (2010).
  29. Howe, D. G., et al. the Zebrafish Model Organism Database: Increased support for mutants and transgenics. Nucleic Acids Res. 41 (D1), D854-D860 (2012).
  30. Singleman, C., Holtzman, N. G. Growth and maturation in the zebrafish, Danio rerio: A staging tool for teaching and research. Zebrafish. 11 (4), 396-406 (2014).
  31. Barresi, M. J., et al. Zebrafish in the Classroom. Zebrafish. 5 (3), 205-208 (2008).
  32. Ghods, S., et al. On the regeneration of fish scales: Structure and mechanical behavior. J Exp Biol. 223 (10), jeb211144(2020).
  33. Krishnan, S., Sekar, S., Katheem, M. F., Krishnakumar, S., Sastry, T. P. Fish scale collagen-A novel material for corneal tissue engineering. Artif Organs. 36 (9), 829-835 (2012).
  34. Zhao, S., et al. A novel porous nanocomposite of sulfur/carbon obtained from fish scales for lithium-sulfur batteries. J Mater Chem. 1 (10), 3334-3339 (2013).
  35. Kumar, R., et al. A noninvasive technique for rapid extraction of DNA from fish scales. IJEB. 45 (11), 992-999 (2007).
  36. Hutchinson, J. J., Trueman, C. N. Stable isotope analyses of collagen in fish scales: Limitations set by scale architecture. J Fish Biol. 69 (6), 1874-1880 (2006).
  37. Kumari, S., Rath, P. K. Extraction and characterization of chitin and chitosan from (Labeo rohit) fish scales. Procedia Mater Sci. 6, 482-489 (2014).
  38. Stepnowski, P., Ólafsson, G., Helgason, H., Jastorff, B. Preliminary study on chemical and physical principles of astaxanthin sorption to fish scales towards applicability in fisheries waste management. Aquac. 232 (1-4), 293-303 (2004).
  39. Ghods, S., Murcia, S., Ossa, E. A., Arola, D. Designed for resistance to puncture: The dynamic response of fish scales. J Mech Behav Biomed Mater. 90, 451-459 (2019).
  40. Yang, W., et al. Protective role of Arapaima gigas fish scales: Structure and mechanical behavior. Acta Biomater. 10 (8), 3599-3614 (2014).
  41. Zhu, D., Zhang, C., Liu, P., Jawad, L. A. Comparison of the morphology, structures and mechanical properties of teleost fish scales collected from New Zealand. J. Bionic Eng. 16, 328-336 (2019).
  42. Witzmann, F. Morphological and histological changes of dermal scales during the fish-to-tetrapod transition. Acta Zool. 92 (3), 281-302 (2011).
  43. Ibañez, A. L., Cowx, I. G., O'Higgins, P. Geometric morphometric analysis of fish scales for identifying genera, species, and local populations within the Mugilidae. Can J Fish Aquat Sci. 64 (8), 1091-1100 (2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kemik HomeostazKemik H cre AktivitesiPul ToplamaKemik ResorpsiyonuKemik DepozisyonuDiseksiyon Mikroskobuevresel Bozulma

İlgili makaleler