Yöntem makalesi

Ko-Kültürden Büyüyen Desmoplastik Üç Boyutlu Pankreas Kanseri Spferoidleri

2.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66625

⸱

27 Eylül 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, South Dakota State University

Bu makalede

Özet

Pankreas kanseri, tedavisi en zor kanserlerden biri olmaya devam ediyor. Bu nedenle, tedavi etkinliğini değerlendiren klinik öncesi modellerin tekrarlanabilir ve klinik olarak anlamlı olması kritik öneme sahiptir. Bu protokol, tekrarlanabilir, klinik olarak anlamlı desmoplastik sferoidler oluşturmak için basit bir ko-kültür prosedürünü tanımlar.

Özet

Pankreatik duktal adenokarsinom (PDAC) 5 yıllık sağkalım oranı %<12 ile en ölümcül kanserlerden biridir. Tedavinin önündeki en büyük engel, tümörü çevreleyen ve genellikle desmoplazi olarak adlandırılan vaskülarizasyonu azaltan yoğun desmoplastik hücre dışı matrikstir (ECM). Kanseri tedavi etmek için çeşitli ilaç kombinasyonları ve formülasyonları test edilmiştir ve bunların çoğu klinik öncesi başarı gösterse de klinik olarak başarısız olurlar. Bu nedenle, tümörün tedaviye yanıtını tahmin edebilecek klinik olarak ilgili bir modele sahip olmak önemli hale gelir. Bu model daha önce rezeke edilmiş klinik tümörlere karşı doğrulanmıştır. Burada, doğal olarak sağlam bir ECM oluşturabilen ve büyümelerini desteklemek için herhangi bir harici matris kaynağı veya iskele gerektirmeyen desmoplastik üç boyutlu (3D) kokültür sferoidlerini büyütmek için basit bir protokol açıklanmaktadır.

Kısaca insan pankreas yıldız hücreleri (HPaSteC) ve PANC-1 hücreleri, hücreleri sırasıyla 1:2 oranında içeren bir süspansiyon hazırlamak için kullanılır. Hücreler, poli-HEMA kaplı, 96 oyuklu düşük bağlantılı U-kuyucuklu bir plaka içinde kaplanmıştır. Plaka, hücrelerin bir başlangıç peleti oluşturmasına izin vermek için santrifüjlenir. Plaka, inkübatörde %5CO2 ile 37 °C'de saklanır ve ortam her 3 günde bir değiştirilir. Plakalar, küresel hacmi ölçmek için belirlenen aralıklarla görüntülenebilir. 14 günlük kültürden sonra, olgun desmoplastik sferoidler oluşur (ör. ortalama hacim 0.048 + 0.012mm3 (451 μm x 462.84 μm)) ve deneysel tedavi değerlendirmesi için kullanılabilir. Olgun ECM bileşenleri arasında kollajen-I, hyaluronik asit, fibronektin ve laminin bulunur.

Giriş

Pankreas kanserinin kötü prognozu, aralarında geç teşhise yol açan kolayca tespit edilebilir biyobelirteçlerin olmaması gibi çeşitli nedenlerle ilişkilidir. Bir diğer önemli neden, dokuyu çevreleyen kalın stromadır ve bu da kan akışının azalmasına neden olur. Büyük miktarlarda hücre dışı matriks (ECM), hücre-hücre etkileşimi, endotel hücreleri, çeşitli bağışıklık hücreleri, perisitler, proliferatif miyofibroblast ve fibroblast popülasyonunun birikmesi ve neoplastik olmayan hücrelerin varlığı (birlikte desmoplastik reaksiyonu oluşturur)1, PDAC'ın kemoterapisinden ve radyoterapötik direncinden sorumlu olan kalın stroma'yı oluşturur2. Kanser ve stromal hücreler karmaşık, dinamik ve çift yönlü bir etkileşime sahiptir. Bazı elementler hastalığın ilerlemesini azaltsa veya hızlandırsa da, çoğu süreç tümörüngelişimi sırasında uyarlanabilir 1. Bu, büyüme faktörleri, proanjiyojenik faktörler, proteazlar ve adezyon molekülleri açısından zengin bir ortam sağlar. Bu faktörler anjiyogenez, hücre proliferasyonu, metastaz ve invazyonu teşvik eder 3,4. Birlikte, tümör için bağışıklık ve ilaç ayrıcalıklı sığınaktırlar ve bu da ilaç direncine neden olur.

Desmoplazi, bağışıklık hücreleri ve pankreatik yıldız hücreleri (PSC) ile birlikte çeşitli ECM proteinlerinden oluşan karmaşık bir karışımdır. Bunlar birlikte, hücrelerin büyümesi için bir iskele oluşturma eğilimindedir. PSC'ler, stromal bölmenin5 en büyük bileşenlerinden biridir. Matriks metaloproteazlar (MMP), matriks metaloproteazların doku inhibitörleri (TIMP) ve kanserle ilişkili fibroblastlar (CAF)6 gibi enzimler üretme yetenekleri, desmoplastik reaksiyonun gelişiminde kritik bir rol oynayabileceklerini ima eder. ECM, kanserle ilişkili fibroblastlar (CAF) ve vaskülatür, PDAC'ın temel yönleridir. CAF'ler arasında, miyofibroblast ve inflamatuar CAF'lerin, pro-tümör özelliklerinden sorumlu aktif karışmada rol oynadığı tahmin edilmektedir7. Tümör üzerindeki fibroblastik oluşumlar ne kadar geniş olursa, prognoz o kadar kötü olur 8,9,10.

Yerleşik hücre hatları aracılığıyla tek katmanlı hücre kültürü, ilaç toksisitesini analiz etmek için yararlı bir araç olmaya devam etmektedir ve kavram kanıtı ve keşif çalışmaları için iyi bir başlangıç noktasıdır. Bununla birlikte, yerleşik hücre kültürü hatları, germ hattı DNA'sından ve klinik ilişkilendirilebilirlikten yoksundur11. Düz yüzeylerde büyüdükleri için, tümörün bir parçası oldukları, anormal şekilde bölündükleri ve farklılaşmış fenotiplerini kaybettikleri zamana kıyasla farklı in vitro seçim kriterlerine tabi tutulurlar12. Genel olarak, tek hücreli kültürler tümör heterojenliğini sınırlar ve bu nedenle klinik önemini kaybeder. Tümörün mikro çevresinin karmaşıklığını doğru bir şekilde temsil edemezler (örneğin, ECM). 3D kültür, karmaşık tümör mikro ortamını daha yakından kopyalayabilir.

3D kültür, 1970'lerde sağlıklı hücreler ve neoplastik muadilleri için tanıtıldı13. Spheroidler14 aracılığıyla malign dokuların morfolojisini ve mimarisini incelemek için çeşitli teknikler kullanılmıştır. Stromal hücrelerle ko-kültürler TME sinyallerini modelleyebilir. Hücreler yıldız hücreleri15 ile birlikte kültürlendiğinde EMT belirteçlerinde bir yukarı regülasyon görülmüştür. PDAC sferoidleri ve bunların stroma ile etkileşimleri, ECM bileşenleri ile birlikte kültürlenerek modellenebilir. Spesifik olarak PSC'lerle birlikte kültürlemenin klinik olarak anlamlı ilaç sitotoksisite verileri ürettiği bildirilmiştir 16,17,18. PSC'ler ayrıca apoptozdan kaçarak ve çeşitli parakrin faktörler19 yoluyla kanser hücrelerinin proliferasyonunu uyararak ve EMT geçişini indükleyerek ilaç direncine yardımcı olur. Bu nedenle, PSC'leri bir ilacın veya ilaç dağıtım sisteminin başarısını değerlendirmek için kullanılan kriterlere erken bir aşamadan itibaren dahil etmek kritik hale gelir. PSC'nin, tek başına pankreas kanseri hücrelerine kıyasla, proliferasyonu artırma ve kombinasyon halinde daha hızlı büyümeyi destekleme yeteneği, immün sistemi baskılanmış farelerde20 iki hücre hattının deri altı yan enjeksiyonları değerlendirildiğinde in vivo olarak da görülmüştür.

Bir hücre tipinin ECM bileşenleri ile etkileşime girme yeteneği, birlikte kültürlenmiş sferoidler yetiştirilirken de dikkate alınması gereken kritik öneme sahiptir. BxPC-3 ve PANC-1'in kollajene bağlanmada eşit afiniteye sahip olduğu bildirilmiştir. BxPC-3'ün 21,22,23,24,25 daha iyi bağlandığına dair raporlar olmasına rağmen, iki hücre hattı da laminine eşdeğer olarak bağlanır. Migrasyon açısından, Stahle ve ark.26, PANC-1 hücreleri için BxPC-3'e kıyasla 5 kat daha hızlı bir motilite göstermiştir. PANC-1 hücrelerinin ayrıca esas olarak tek hücreler olarak göç ettiği, BxPC-3 hücrelerinin ise sıkıca paketlenmiş bir tabaka olarak göç ettiği bildirilmiştir. Hücrelerin seçimi aynı zamanda tümörün boyutunu da etkiler25. BxPC-3 tümörlerinin PANC-1'den elde edilenleregöre 27,28 daha büyük olduğu gösterilirken, bir çalışmada bunun tersi29 olgu gösterilmiştir. Boyut ve hareketlilikteki farklılıklarına rağmen, her iki hücrenin de farelerde tümör oluşturmak için uzun gecikme sürelerine ihtiyaç duyduğu bildirilmiştir. Bu süre özellikle BxPC-3 için 4 hafta ile 4 ay25 arasında değişen uzun olabilir. Bununla birlikte, BxPC-328 veya BxPC-3 kanser kök hücrelerinin30'un daha hızlı görünür tümörler oluşturduğu literatür de vardır, bu da tümör büyüme sürelerinde görülen varyasyonlar olabileceğini ima eder. Bu nedenle, burada belirtilen süreler, tümör büyüme oranları için yalnızca bir başlangıç kılavuzu olarak hizmet etmelidir.

BxPC-3 hücreleri, yüzeyde gevşek hücreler ve yoğun çekirdekler ile sferoidler oluştururken, PANC-1 hücrelerinin hem gözenekli ancak sağlam sferoidler31 hem de kompakt sferoidler oluşturduğu bildirilmiştir. PANC-1 hücrelerinin ayrıca daha az farklılaşmış ve daha agresif olduğu bildirilmiştir32. PANC-1 hücrelerinin daha yüksek motilitesi, kompakt sferoidler oluşturma yeteneği ve ECM bileşenleri ile etkileşime girme yeteneği ile birlikte agresif doğayı32 ön planda tutarak, sferoid çalışmaları için PANC-1 hücreleri seçildi.

Son birkaç yılda, sferoid kültür, iki boyutlu (2D) kültürlere kıyasla klinik alaka düzeyinde bir avantaj göstermede çok başarılı olmuştur. Alaka düzeyi, bu tekniğin hayvan çalışmalarının yerine kullanılması ve tümörlerin biyolojisinin daha iyi anlaşılması için kullanılmıştır. Spheroidlerin klinik önemi, özellikle PSC'lerle birlikte kültürlendiğinde, sertlik33, TGF-βekspresyonu 34,35,36,37,38, E-kaderin, F-aktin 18,34,36,37, α-SMA 34,35,37 gibi sferoidin çeşitli fonksiyonlarını incelemek için kullanımlarını sağlamıştır.38, laktat dehidrojenaz (LDHA)32, HIF-1α35,39, ilaç direnci 16,37,40, hücre göçü41, hücre istilası37, fibroz35, radyasyon direnci42, fenotipik değişiklikler18, heterojenlik36, hücresel etkileşim seviyeleri39 ve ECM bileşenlerini gösterir37,38,39. Açıklanan verileri elde etmek için kullanılan protokollerin çoğu, küresel ve ECM büyümesini desteklemeye yardımcı olmak için Matrigel'e, asılı bırakma yöntemine, baskılı kalıplara veya diğer iskelelere dayanır. Çalışmalar ayrıca genellikle insan olmayan fibroblastik hücrelerin veya hastalardan yeni izole edilmiş yıldız hücrelerinin kullanımını da içerir. Yıldız hücrelerinin kullanılması, tümörlerin in vivo koşullara benzemesi için kritik öneme sahipken, taze ekstraksiyonlarla ilişkili hastalar arası değişkenlik bu çalışmaların tekrarlanmasını zorlaştırır.

Bu protokol, geliştirilmesi kolay, tekrarlanabilir, klinik olarak anlamlı ve iskele içermeyen bir model göstermeyi amaçlamaktadır, böylece yalnızca ECM'yi doğal olarak oluşturmak için ortak kültürlerin yeteneklerine güvenir. Bunu yapmak için, insan pankreas yıldız hücreleri (HPaSteC) ile birlikte PANC-1 hücrelerinin (tek hücreler olarak göç etme eğilimleri nedeniyle) bir karışımını içeren basit bir ko-kültür yöntemi, kök hücreler gibi davranma yetenekleri nedeniyle seçildi ve ilaca yüksek dirençli olmaları. Durymanov ve ark.38tarafından yapılan çalışmaları temel alarak, aşağıda ayrıntıları verilen protokol, hücre oranları ve ortam değişiklikleri arasındaki süreler gibi parametrelerin daha da optimize edilmesinden sonra oluşturulmuştur. Bu protokol sonucunda ortaya çıkan sferoidler, yeni ilaç adayı değerlendirmesi için model bir sistem olarak kullanılabilir40.

Ek olarak, küresel kültüre aşina olmayan kullanıcılar için, MISpheroID bilgi tabanının gelişimini tartışan Peirsman ve ark.43çalışması yardımcı olabilir. Laboratuvar protokolleri arasındaki heterojenlikle başa çıkmaya yardımcı olabilecek bazı minimum bilgi yönergeleri oluşturur. Bazı sınırlamalara rağmen, çalışma, kültür ortamının seçiminin, hücre hatlarının, küresel oluşum yönteminin ve nihai küresel boyutun, sferoidlerin fenotipik özelliklerinin belirlenmesinde kritik olduğunu göstermiştir.

Protokol

1. 2D hücre kültürü

  1. Steril koşullar altında% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamında (DMEM) PANC-1 hücrelerini büyütün. Pasajlardan önce% 70 -% 80'e kadar birleşin ve 20.pasajdan sonra kullanmayın. Adım 4.2.1'de açıklanan işleme bakın.
    NOT: Bir referans noktası olarak, 20 mL ortamdaki 1 x 106 hücrenin% 70-80 birleşmeye ulaşması için yaklaşık 2-3 güne ihtiyacı vardır.
  2. HPaSteC hücrelerini, steril koşullar altında üretici tarafından sağlanan kiti kullanarak %2 FBS, %1 PenStrep ve %1 Yıldız Hücre Büyüme Takviyesi (SteCGS) ile desteklenmiş yıldız hücre ortamında büyütün. Poli-L-Lizin kaplı bir şişede adım 4.2.2'de gösterildiği gibi üreticinin talimatlarına göre (bazı değişikliklerle) büyütün.
    1. Tripsin nötralizasyon çözeltisi (TNS) kullanıldığından, üreticinin protokolünden tripsinizasyon sırasında FBS nötralizasyon adımını atlayın. Hücre süspansiyonunu, adım 4.2.2.2'de açıklandığı gibi toplam 10 mL TNS hacmi ile nötralize edin.
      NOT: Bir referans noktası olarak, 20 mL ortamdaki 0,5 x 106 hücre ve 1 x 106 hücrenin% 90 birleşme elde etmek için sırasıyla 3 gün ve 2 güne ihtiyacı vardır.
    2. Hücreleri% 90 birleşimde hasat edin. Pasaj 7'nin ötesindeki hücreleri kullanmayın.
  3. Hücreleri 37 ° C'de,% 5 CO2 ile% 90 -% 95 bağıl nem oranına sahip steril inkübatörlerde koruyun. Tüm hücre kültürü çalışmalarını bir T-75 şişesinde gerçekleştirin.

2. 96 oyuklu plaka için poli (2-hidroksietil metakrilat (poli-HEMA) çözelti kaplaması

  1. 37 ° C'de ısıtılmış bir karıştırıcı kullanılarak gece boyunca karıştırılmasına izin vererek% 95 etanol kullanarak 5 mg / mL'de poli-HEMA çözeltisi hazırlayın (örneğin, 500 mL çözelti 2.5 g poli-HEMA'ya ihtiyaç duyar)
    1. Karıştırıcıyı eklemeden önce başlangıç ses konumunu işaretleyin. Ertesi gün çözeltideki herhangi bir kaybı telafi etmek için% 95 etanol kullanın.
  2. Nihai çözeltiyi 0,22 μm'lik bir filtre kullanarak steril bir başlıkta filtreleyin ve buzdolabında 4 °C'de saklayın.
    NOT: Poly-HEMA, hücrelerin yapışması için caydırıcı bir rol oynayan bir yüzeyin hidrofobikliğini artırmak için kullanılır. Bu çalışma, hücrelerin kuyucuklara yapışmamasını ve tek tabaka olarak büyümesini gerektirdiğinden, poli-HEMA, plakaların doğal düşük bağlanma özelliğine ek bir caydırıcı olarak kullanılır ve böylece onları ultra düşük bağlantı plakaları haline getirir.
  3. Plakayı kaplamak için bir hücre kültürü davlumbazının içindeki 96 oyuklu yuvarlak polistiren tabanlı mikro kuyu plakasının her bir oyuğuna 50 μL soğuk çözelti ekleyin.
  4. Plakaların tamamen kuruduğundan emin olmak için kuyuları kapağı kapalı olarak 37 °C'de 3 gün sıcak hava fırınında bırakın.
  5. Hücre tohumlamadan önce plakaları hücre kültürü davlumbazında 30 dakika boyunca UV ile sterilize edin. Uzun süreli saklama için sıkıca kapalı bir kilitli kilitte saklayın ve kullanmadan önce sterilize edin.

3. 2D hücre kültürü planlaması




figure-protocol-1

figure-protocol-2


Sonuçlar

Sferoidlerin büyümesinde yer alan en kritik adımlardan üçü, ilk hücre sayımı, sferoidleri tohumlarken karıştırma adımları ve sferoidlerin büyümesine izin vermek için zamanında ortam değişikliklerinin gerçekleştirilmesidir (Şekil 1). Ek olarak, 3. günden sonraki medya değişikliklerine ilişkin Şekil 2'ye aşina olmak, kuyu başına artan medya hacmi nedeniyle etkili medya değişikliklerine izin vermek için kritik öneme sahiptir. Tüm bu adımlar verilen talimatlara göre gerçekleştirildiğinde, sferoidlerin (Şekil 3) ortalama 0,048 ± 0,012mm3 (451 μm x 462,84 μm) hacme kadar büyüdüğü bulunmuştur (Şekil 4). Hücrelerin daha iyi büyüyebileceği durumlarla karşılaşılmıştır, bu da 14. günde 0,096 ± 0,014mm3 (611 μm x 560 μm) gibi daha büyük başlangıç ortalama hacimlerine yol açmıştır. Çeşitli nedenler, inkübatörün sıcaklığının ve neminin korunması veya daha sonraki pasajlara kıyasla biraz daha iyi bir canlılığa sahip olan daha önceki hücre pasajlarının kullanılması gibi sferoidlerin daha büyük başlangıç hacimlerine sahip olmasına neden olabilir.

figure-results-1
Şekil 3: 14. günde görüldüğü gibi temsili bir küre (boyut: 451.59 μm x 462.84 μm). Ölçek çubuğu = 200 μm. Her sferoid, sırasıyla en uzun ve en kısa ekseni boyunca ölçülür ve hacmi hesaplamak için yöntemler bölümünde açıklanan denklem kullanılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 4: 17 gün boyunca sferoid büyüme ilerlemesi. Plaka 1 ve 2 kopyadır. Hata çubukları standart sapmayı temsil eder. Şekil, 6, 10, 14 ve 17. günlerde görülebilecek küresel hacimlerin yaklaşık bir tahmini olarak kullanılabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ancak hücrelerin doğru sayılmadığı ya da hücre süspansiyonunun tam olarak karıştırılmadığı ya da son kültürün bakımının düzenli yapılmadığı ya da bu hataların bir kombinasyonunun meydana geldiği durumlarda, daha küçük sferoidlerin gelişmesine veya tam büyümemiş sferoidlerin gelişmesine yol açabilir. Benzer görünüme sahip sferoidler, ilk optimizasyon çalışmaları sadece 3. günde plakanın çevresi etrafındaki kuyucuklarda tüm plaka yerine ortamı desteklediğinde de görülmüştür (Şekil 5). Alternatif olarak, hücrelerin iyi karıştırılmadığı veya ilk sayım/seyreltme hatalarının oyuk başına önerilenden daha fazla hücrenin tohumlanmasına yol açtığı durumlarda, oyuk başına birden fazla sferoid görülebilir. PANC-1:HPaSteC hücreleri 240:120 oranında kullanıldığında da benzer bir bulgu görülmüştür (Şekil 6). Bu, bazen sferoidler yöne göre büyütüldüğünde de görülebilir, ancak bu tür sferoidlerin sayısı daha azdır (örneğin, 4/96 kuyucuk, kuyu başına bir yerine iki sferoid içerebilir). Birden fazla sferoid ile karşılaşıldığı durumlarda, ya kuyucukları birden fazla sferoid ile kullanmaktan kaçının ya da bu sferoidler tedavi edilirken hacimlerdeki değişiklikleri not edin. Pipet ucunun halenin altına düştüğü durumlarda (Şekil 1) uygun olmayan ortam değişiklikleri de sferoidlerin kazara kaybolmasına neden olabilir.

figure-results-3
Şekil 5: 14. günde zayıf büyümüş bir sferoidin temsili bir görüntüsü. Ölçek çubuğu = 200 μm. Burada, hücreler iyi bir şekilde toplanmamıştır, bu nedenle sferoidin uzunluğunu ve genişliğini ölçmek zorlaşır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 6: 14. günde görüldüğü gibi iki zayıf büyümüş sferoid içeren bir kuyunun temsili bir görüntüsü. Ölçek çubuğu = 200 μm. Burada sferoidlerden biri 246.61 μm x 178.31 μm ve diğeri 289.13 μm x 252.35 μm boyutlarındadır. Bu, ilk seyreltmeler veya deneyi başlatmak için kullanılan hücrelerin kalitesi ile ilgili bir sorun olduğu bir örnektir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sferoidler ayrıca dört ana ECM bileşeninden oluşan bir ECM geliştirir: kollajen-I, laminin, hyaluronik asit ve fibronektin. Laboratuvarın daha önce yayınladığı çalışmalarda, ko-kültürün tek başına PANC-1'e göre avantajı, yaygın kollajen, fibronektin içermeyen ve daha az hyaluronik asit birikimi gösteren homo PANC-1 sferoidleri açısından gösterilmiştir.

figure-results-5
Şekil 7: Tedavi edilmemiş sferoidlerde 17. günde görüldüğü gibi dört ana ECM bileşeninin temsili görüntüsü: Kollajen I, laminin, hyaluronik asit ve fibronektin. Bu görüntüler, sferoidin immün boyamalı kriyokesitlerinden sonra elde edilir. Bu görüntülerin parlaklığı, görünümdeki farklılıkları vurgulamaya yardımcı olmak için eşit şekilde artırılmıştır. Yoğunluk ölçümleri yapılırken dokunun hasar gördüğü veya eksik olduğu alanlar ayarlanmalıdır. Ölçek çubukları = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Sferoidleri büyütmek için seçilen süre ve hücre oranları, daha önce38 bildirildiği gibi çalışmalara dayanıyordu. HPaSteC hücreleri için NIH3T3 hücrelerini ikame ederek bu çalışmaları optimize etmeye çalışırken, sferoid hacimleri ve apoptoz paternlerinin, PANC-1: HPaSteC oranları 120: 60 iken, bildirilen optimize edilmiş parametrelere (PANC-1: NIH3T3 :: 120: 120) çok benzer olduğu bulundu. Bu çalışmalar sadece 14. güne kadar apoptozu ölçse de, bu süreçte açıklanan protokol, 14. gün ile 17. gün arasında enkaz oluşumunda gözle görülür bir artış gözlenmediği için 17. güne kadar sferoidleri kullanmaya devam eder. Bir kontrol olarak, 17. günde değerlendirilen tüm sferoidler, sferoidlerin hacmindeki ve apoptozdaki doğal artışlar için bir temel olarak hizmet etmek üzere her zaman tedavi edilmemiş bir kol içerir.

Sferoidlerin tohumlanması ve büyütülmesi sürecinin 3 kritik adımı vardır: Uygun sayım, hücrelerin eklenmesinden önce karıştırma ve kültürlerin bakımı. İşlem, az sayıda PANC-1 ve HPaSteC hücresinin kullanılmasına dayandığından, doğru sayıma ve doğru seyreltmelere sahip olmak kritik hale gelir. Bu özellikle HPaSteC hücreleri için önemlidir, çünkü bu hücreler PANC-1 hücrelerinden daha küçüktür ve hücre sayısını hafife almak kolaydır. Bu nedenle, hücreleri dikkatli bir şekilde saymak çok önemlidir. Sayımı küçümsemek birden fazla sferoidin oluşmasına neden olurken, fazla tahmin etmek kötü oluşmuş sferoidlere yol açabilir.

Süspansiyonu tüm adımlarda iyi bir şekilde karıştırmak da kritik hale gelir. Hücrelerin çökelebileceği beklentisiyle çalışmak, yetersiz karışmayı önlemeye yardımcı olur ve düzgün hücre dağılımı sağlar. Sferoidleri birden fazla plaka (örneğin iki plaka) için hazırlarken, ileri geri karışımların sayısının (adım 4.4.1) her bir kuyucuk arasında en az 20 olması önerilir. Bu, ilk plakanın yarısı bittiğinde 15'e, ardından bir sonraki plakaya başlarken 10'a ve ikinci plakanın ikinci yarısına doğru ilerledikçe 5'e düşürülebilir. Pipet ile ileri geri karıştırmaya paralel olarak bir karıştırma hareketi gerçekleştirmek, karıştırma derecesini artırmaya yardımcı olur. Dikkate alınması gereken bir fikir, iki tabak hazırlarken ikinci bir kişiyi dahil etmektir, çünkü bu, hızı ve karıştırma verimliliğini artırır. Bu senaryoda, iki kişi davlumbazın zıt köşelerinde çalışarak davlumbazı kendi süspansiyonları ve plakaları ile aynı anda kullanabilir.

Hücre kültürlerinin bakımı, sferoidlerin her zaman yeterli bir besin kaynağına sahip olmasını sağlamak için gereklidir. 3. ve 6. günlerdeki medya takviyeleri en kritiktir, çünkü hücrelerin büyüdüğü ve iyi beslenmesi gereken yer burasıdır. 6. ve 10/11. günlerdeki medya değişiklikleri de yanıltıcı olabilir, çünkü eski medyayı atmak için bazı süpernatantların toplanmasını içerirler. Bu adım, medyayı "hale" ye kadar nazikçe dışarı çekerek ve asla ötesine geçmeyerek dikkatlice yapılmalıdır. Bu, ortamın sferoide çok yakın emmesini ve ortam değişimi sırasında kasıtsız olarak sferoid kaybını önlemeye yardımcı olur.

Yöntem, daha önce bahsettiğimiz yöntemlerden farklı olarak kolayca tekrarlanabilir olması ve herhangi bir kalıp veya iskele malzemesi gerektirmemesi açısından büyük bir avantaja sahiptir 32,34,35,36,37,39. Ek olarak, kullanılan ortam, hücre tiplerine34 bağlı olarak EGM-2 ortamı, yıldız hücre ortamı ve DMEM-FBS35karışımları veya tek başına her iki ortamın aksine nispeten ucuz olan standart hücre kültürü ortamıdır. Bu avantaj, laboratuvarlar arasında çeviri kolaylığı ve kurulum kolaylığı açısından kritik hale gelir. İşlem aynı zamanda birden fazla plaka için ölçeklendirilebilir, ancak muhtemelen her iki plaka için bir kişi gerektirecektir. Sferoidlerin sağlam yapısı, karıştırma koşulları altında değerlendirilmelerine de olanak tanır. Bu adım, özellikle sferoidlerin dahil olduğu hücresel farmakokinetik veya kazılmış salım ve absorpsiyon çalışmalarının gerçekleştirilmesinde yararlıdır.

Avantajlarına rağmen, yöntemin bir sınırlaması, tohumlama adımı sırasında çok kapsamlı bir şekilde karıştırılması gerektiğidir. Bu zaman alıcı ve fiziksel olarak yorucu olabilir. Bunu atlamanın olası bir yolu, tohumlama işlemi sırasında sürekli karıştırma koşullarını korumak için iyi sterilize edilmiş bir manyetik boncuk kullanmayı içerebilir. Sferoidleri toplamak da zordur ve biraz pratik gerektirir. Sferoidlerin de büyümek için zamana ihtiyacı vardır ve bu nedenle, medya değişiklikleri için personel ve tedarik mevcudiyetini sağlamak için dikkatli bir planlama gerektirir.

Sonuç olarak, klinik olarak anlamlı desmoplastik 3D sferoidler üretmek için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem geliştirilmiştir. Sferoidler sağlamdır ve ECM bileşenleri üretebilir: kollajen I, laminin, hyaluronik asit ve fibronektin. Bu sferoidlerin üretilmesinde yer alan basitlik, kolayca tekrarlanabilir olma ve üçüncü bir hücre hattının dahil edilmesi gibi değişikliklere kolayca uyarlanabilme konusunda benzersiz bir avantaj taşır. Modelin bir diğer benzersiz avantajı da terapiye40 dirençli olmasıdır. Bu, klinik alaka düzeyine katkıda bulunmaya yardımcı olur ve pankreas kanserini tedavi etmek için yalnızca en etkili ilaçların seçilmesini ve kullanılmasını sağlar. Ayrıca, bu sferoidler, in vivo analiz38için tekrarlanabilir desmoplastik tümörler vermek üzere farelerde toplanabilir ve implante edilebilir ve ayrıca daha önce tarif edildiği gibi çeşitli boyutlarda nanopartiküllerin44penetrasyonunu incelemek için kullanılabilir.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Açıklanan çalışma, Güney Dakota Valiliği Ekonomik Kalkınma Ofisi, Güney Dakota Mütevelli Heyeti Rekabetçi Araştırma Hibe Programı (SD-BOR-CRGP) ve Güney Dakota Eyalet Üniversitesi Farmasötik Bilimler Bölümü tarafından destekleri için desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Axio Observer ters mikroskopCarl Zeiss0450-354
Cellometer Auto T4Nexcelom Bioscience LLCAuto-T4
DMEM, toz, yüksek glikozGibco12100046
Abcamab175712ile konjuge eşek anti-koyun
 CytivaSH3091003HI
Alexa Fluor 488  ile etiketlenmiş keçi antirabbit IgG;Abcamab150077
Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) Gibco14175145
İnsan Pankreatik Yıldız Hücreleri (HPaSteC)ScienCell3830
Mikroskop NikonNikonEclipse Ts 100
Nunc 96 Kuyulu Polistiren Yuvarlak Tabanlı Mikro Kuyu PlakalarıThermo Scientific12-565-331
Olympus Fluoview FV1200 konfokal lazerOlympusN/A Üretimidurdurulan ürün
PANC-1ATCCCRL-1469
Poli-HEMASigmaP3932
Tavşan poliklonal anti-laminin antikorları Abcamab11575
Tavşan poliklonal anti-tip I kollajen antikorları Abcamab34710
Koyun poliklonal anti-hyaluronik asit antikorlarıAbcamab53842
Yıldız hücre ortamı komple kit ScienCell5301
Tripsin MP Biomedicals, LLC153571Üretici protokolüne göre hazırlanan ve %0,25 w 'de kullanılan tripsin solüsyonu;
Tripsin Nötralizasyon Çözeltisi (TNS)ScienCell103
Alexa Fluor 568 Fetal Sığır Serumu

Kaynaklar

  1. Hingorani, S. R. Epithelial and stromal co-evolution and complicity in pancreatic cancer. Nat Rev Cancer. 23 (2), 57-77 (2023).
  2. Laklai, H., et al. Genotype tunes pancreatic ductal adenocarcinoma tissue tension to induce matricellular fibrosis and tumor progression. Nat Med. 22 (5), 497-505 (2016).
  3. Binker, M. G., Binker-Cosen, M. J., Binker-Cosen, A. A., Cosen-Binker, L. I. Microenvironmental factors and extracellular matrix degradation in pancreatic cancer. J Pancreas. 15 (4), 280-285 (2014).
  4. Spano, D., Zollo, M. Tumor microenvironment: a main actor in the metastasis process. Clin Exp Metastasis. 29 (4), 381-395 (2012).
  5. Ware, M. J., et al. Generation of an in vitro 3D PDAC stroma rich spheroid model. Biomaterials. 108, 129-142 (2016).
  6. Sunami, Y., Häußler, J., Kleeff, J. Cellular heterogeneity of pancreatic stellate cells, mesenchymal stem cells, and cancer-associated fibroblasts in pancreatic cancer. Cancers. 12 (12), 3770(2020).
  7. Öhlund, D., et al. Distinct populations of inflammatory fibroblasts and myofibroblasts in pancreatic cancer. J Exp Med. 214 (3), 579-596 (2017).
  8. Pandol, S., Edderkaoui, M., Gukovsky, I., Lugea, A., Gukovskaya, A. Desmoplasia of pancreatic ductal adenocarcinoma. Clin Gastroenterol Hepatol. 7 (11), S44-S47 (2009).
  9. Watanabe, I., et al. Advanced pancreatic ductal cancer: fibrotic focus and β-catenin expression correlate with outcome. Pancreas. 26 (4), 326-333 (2003).
  10. Hu, G., et al. Tumor-infiltrating podoplanin+ fibroblasts predict worse outcome in solid tumors. Cell Physiol Biochem. 51 (3), 1041-1050 (2018).
  11. Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures-a comparison of different types of cancer cell cultures. Arch Med Sci. 14 (4), 910-919 (2018).
  12. Monberg, M. E., et al. Occult polyclonality of preclinical pancreatic cancer models drives in vitro evolution. Nat Commun. 13 (1), 3652(2022).
  13. Emerman, J. T., Pitelka, D. R. Maintenance and induction of morphological differentiation in dissociated mammary epithelium on floating collagen membranes. In Vitro. 13 (5), 316-328 (1977).
  14. Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).
  15. Kikuta, K., et al. Pancreatic stellate cells promote epithelial-mesenchymal transition in pancreatic cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 403 (3-4), 380-384 (2010).
  16. Lee, J. -H., et al. Microfluidic co-culture of pancreatic tumor spheroids with stellate cells as a novel 3D model for investigation of stroma-mediated cell motility and drug resistance. J Exp Clin Cancer Res. 37 (1), 4(2018).
  17. Wong, C. -W., Han, H. -W., Tien, Y. -W., Hsu, S. -H. Biomaterial substrate-derived compact cellular spheroids mimicking the behavior of pancreatic cancer and microenvironment. Biomaterials. 213, 119202(2019).
  18. Liu, X., et al. 3D heterospecies spheroids of pancreatic stroma and cancer cells demonstrate key phenotypes of pancreatic ductal adenocarcinoma. Transl Oncol. 14 (7), 101107(2021).
  19. Vonlaufen, A., et al. Pancreatic stellate cells: partners in crime with pancreatic cancer cells. Cancer Res. 68 (7), 2085-2093 (2008).
  20. Bachem, M. G., et al. Pancreatic carcinoma cells induce fibrosis by stimulating proliferation and matrix synthesis of stellate cells. Gastroenterology. 128 (4), 907-921 (2005).
  21. Greco, E., et al. Pancreatic cancer cells invasiveness is mainly affected by interleukin-1β not by transforming growth factor-β1. Int J Biol Markers. 20 (4), 235-241 (2005).
  22. Arao, S., Masumoto, A., Otsuki, M. β1 integrins play an essential role in adhesion and invasion of pancreatic carcinoma cells. Pancreas. 20 (2), 129-137 (2000).
  23. Sawai, H., Yamamoto, M., Okada, Y., Sato, M., Akamo, Y., Takeyama, H., Manabe, T. Alteration of integrins by Interleukin-1alpha in human pancreatic cancer cells. Pancreas. 23 (4), 399-405 (2001).
  24. Chen, J., et al. Expression and function of the epidermal growth factor receptor in physiology and disease. Physiol Rev. 96 (3), 1025-1069 (2016).
  25. Deer, E. L., et al. Phenotype and genotype of pancreatic cancer cell lines. Pancreas. 39 (4), 425(2010).
  26. Stahle, M., et al. Mechanisms in LPA-induced tumor cell migration: critical role of phosphorylated ERK. J Cell Sci. 116, Pt 18 3835-3846 (2003).
  27. Aubert, M., et al. Decrease of human pancreatic cancer cell tumorigenicity by α1, 3galactosyltransferase gene transfer. Int J Cancer. 107 (6), 910-918 (2003).
  28. Miknyoczki, S. J., Chang, H., Klein-Szanto, A., Dionne, C. A., Ruggeri, B. A. The Trk tyrosine kinase inhibitor CEP-701 (KT-5555) exhibits significant antitumor efficacy in preclinical xenograft modelsof human pancreatic ductal adenocarcinoma. Clin Cancer Res. 5 (8), 2205-2212 (1999).
  29. Fukasawa, M., Korc, M. Vascular endothelial growth factor-trap suppresses tumorigenicity of multiple pancreatic cancer cell lines. Clin Cancer Res. 10 (10), 3327-3332 (2004).
  30. Hernández-Camarero, P., et al. Pancreatic (pro) enzymes treatment suppresses BXPC-3 pancreatic Cancer Stem Cell subpopulation and impairs tumour engrafting. Sci Rep. 9 (1), 11359(2019).
  31. Ware, M. J., et al. Generation of homogenous three-dimensional pancreatic cancer cell spheroids using an improved hanging drop technique. Tissue Eng Part C Methods. 22 (4), 312-321 (2016).
  32. Longati, P., et al. 3D pancreatic carcinoma spheroids induce a matrix-rich, chemoresistant phenotype offering a better model for drug testing. BMC Cancer. 13, 95(2013).
  33. Kpeglo, D., et al. Modeling the mechanical stiffness of pancreatic ductal adenocarcinoma. Matrix Biol Plus. 14, 100109(2022).
  34. Jang, S. -D., et al. Anti-cancer activity profiling of chemotherapeutic agents in 3D co-cultures of pancreatic tumor spheroids with cancer-associated fibroblasts and macrophages. Cancers. 13 (23), 5955(2021).
  35. Pednekar, K. P., Heinrich, M. A., van Baarlen, J., Prakash, J. Novel 3D µtissues mimicking the fibrotic stroma in pancreatic cancer to study cellular interactions and stroma-modulating therapeutics. Cancers. 13 (19), 5006(2021).
  36. Kim, S. -K., et al. Phenotypic heterogeneity and plasticity of cancer cell migration in a pancreatic tumor three-dimensional culture model. Cancers. 12 (5), 1305(2020).
  37. Hwang, H. J., Oh, M. -S., Lee, D. W., Kuh, H. -J. Multiplex quantitative analysis of stroma-mediated cancer cell invasion, matrix remodeling, and drug response in a 3D co-culture model of pancreatic tumor spheroids and stellate cells. J Exp Clin Cancer Res. 38 (1), 258(2019).
  38. Durymanov, M., et al. Subcutaneous inoculation of 3D pancreatic cancer spheroids results in development of reproducible stroma-rich tumors. Transl Oncol. 12 (1), 180-189 (2019).
  39. Giustarini, G., Teng, G., Pavesi, A., Adriani, G. Characterization of 3D heterocellular spheroids of pancreatic ductal adenocarcinoma for the study of cell interactions in the tumor immune microenvironment. Front Oncol. 13, 1156769(2023).
  40. Alseud, K., et al. Synthesis and biological activity of 11-oxygenated and heterocyclic estrone analogs in pancreatic cancer monolayers and 3D spheroids. Bioorg Med Chem. , (2024).
  41. Fitzgerald, A. A., et al. Fibroblast activation protein regulates natural killer cell migration, extravasation and tumor infiltration. bioRxiv. , 429622(2021).
  42. Wishart, G., Gupta, P., Schettino, G., Nisbet, A., Velliou, E. 3D tissue models as tools for radiotherapy screening for pancreatic cancer. Br J Radiol. 94 (1120), 20201397(2021).
  43. Peirsman, A., et al. MISpheroID: a knowledgebase and transparency tool for minimum information in spheroid identity. Nat Methods. 18 (11), 1294-1303 (2021).
  44. Durymanov, M., Kroll, C., Permyakova, A., Reineke, J. Role of endocytosis in nanoparticle penetration of 3D pancreatic cancer spheroids. Mol Pharm. 16 (3), 1074-1082 (2019).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Desmoplastik SferoidlerÜç Boyutlu Ko-KültürHücre Dışı MatriksPankreatik Stellat HücrelerPANC-1 HücreleriSferoid KültürüPoly-HEMA KaplamaTümör MikroçevresiECM Bariyeri
Ko-Kültürden Büyüyen Desmoplastik Üç Boyutlu Pankreas Kanseri Spferoidleri
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.