Erken Yaşamın Kritik Bir Döneminde Juvenil Beyin Koku Alma Duyusal Nöron Sinaptik Bağlantısının Deneyime Bağlı Yeniden Modellenmesi

Özet

Burada, Drosophila juvenil beynindeki anten lobu sinaptik glomerüllerinin koku alma deneyimine bağlı yeniden şekillenmesini indükleme ve analiz etme yöntemlerini açıklıyoruz.

Özet

Erken yaşam koku alma duyusal deneyimi, Drosophila çocuk beyninde, deneyimsel olarak doza bağımlı, zamansal olarak kısıtlı ve yalnızca kısa, iyi tanımlanmış bir kritik dönemde geçici olarak geri dönüşümlü olan dramatik sinaptik glomerül yeniden şekillenmesine neden olur. Beyin devresi sinaptik bağlantı yeniden şekillenmesinin yönlülüğü, koku alma duyu nöronlarının yanıt veren reseptör sınıfına etki eden spesifik koku verici tarafından belirlenir. Genel olarak, her nöron sınıfı sadece tek bir koku reseptörünü eksprese eder ve tek bir koku alma sinaptik glomerulusunu innerve eder. Drosophila genetik modelinde, koku alma glomerüllerinin tam dizisi, koku verici duyarlılığı ve davranışsal çıktı ile tam olarak haritalanmıştır. Etil bütirat (EB) koku verici, VM7 glomerulusunu innerve eden Or42a reseptör nöronlarını aktive eder. Erken yaşam kritik döneminde, EB deneyimi, Or42a koku alma duyu nöronlarında doza bağlı sinaps eliminasyonunu yönlendirir. Dozlanmış EB koku maruziyetinin zamanlanmış periyotları, çocuk beyninde deneyime bağlı devre bağlantı budamasının araştırılmasına izin verir. Anten lob sinaptik glomerüllerinin konfokal mikroskopi görüntülemesi, sinaps sayısı ve innervasyon hacminin ölçülmesini sağlayan Or42a reseptörü güdümlü transgenik belirteçlerle yapılır. Gelişmiş Drosophila genetik araç seti, beyin devresinin yeniden şekillenmesine aracılık eden hücresel ve moleküler mekanizmaların sistematik olarak incelenmesini sağlar.

Giriş

Erken yaşamda genç beyin devrelerinin yeniden şekillenmesi, bir hayvanın doğduğu oldukça değişken, öngörülemeyen ortama uyacak şekilde büyük ölçekli sinaptik bağlantı değişiklikleri için son şansı temsil eder. En bol bulunan hayvan grubu olan böcekler, bu evrimsel olarak korunmuş, temel kritik dönem yeniden şekillenme mekanizmasını paylaşırlar¹. Kritik dönemler, duyusal girdinin başlamasıyla açılır, bağlantıyı optimize etmek için tersine çevrilebilir devre değişiklikleri sergiler ve ardından stabilizasyon kuvvetleri daha fazla yeniden şekillenmeye direndiğinde kapanır². Böcekler özellikle koku alma duyusal bilgisine bağımlıdır ve iyi tanımlanmış bir koku alma kritik periyodu gösterir. Drosophila, çocuk beynindeki bu deneyime bağlı kritik dönemi araştırmak için mükemmel bir genetik model sunar. Eklosyonu takip eden ilk birkaç gün boyunca koku deneyimi, bireysel olarak tanımlanan sinaptik glomerüllerde çarpıcı devre bağlantı değişikliklerine neden olur ^3,4. Yeniden şekillenme yönü, spesifik giriş koku verici deneyimine bağlıdır. Bazı koku vericiler, eklosiyon sonrası (dpe)3,5,6,7 sonrası birkaç gün boyunca sinaptik glomerulus hacminde bir artışa neden olurken, diğer koku vericiler 0-2 dpe kritik dönemde sinapsların hızlı bir şekilde elimine edilmesine neden olarak innervasyon hacminin azalmasına neden olur ^8,9,10. Spesifik olarak, etil bütirat (EB) koku verici deneyimi, Or42a koku alma reseptörü nöronlarının doza bağlı sinaptik budamasını yalnızca bu erken yaşam kritik döneminde⁸ yönlendirir. Sinaps eliminasyonu, kritik periyot içinde EB koku girdisini modüle ederek tamamen geri dönüşümlüdür, ancak kritik periyodun kapanmasını takiben kalıcı hale gelir. Bu koku alma deneyimine bağlı sinaptik budama, genç beyin devresinin yeniden şekillenmesinin altında yatan zamansal olarak kısıtlı mekanizmaları aydınlatmak için değerli bir deneysel sistem sağlar.

Burada, erken yaşam kritik döneminde Or42a reseptörü koku alma duyu nöronlarının EB deneyimine bağlı sinaptik budamasını indüklemek ve analiz etmek için kullanılan ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Anten lob VM7 glomerulusundaki Or42a sinaptik terminallerinin, doğrudan Or42a promotörüne (Or42a-mCD8::GFP)¹¹ kaynaşmış veya Gal4/UAS ikili ifade sistemi (Or42a-Gal4 kullanan UAS-mCD8::GFP)¹² kullanılarak, membrana bağlı bir mCD8::GFP işaretleyicisinin transgenik olarak sürülmesiyle spesifik olarak etiketlenebileceğini gösteriyoruz. Bireysel Or42a nöron sinapsları, bir dizi floresan etikete (örneğin, Bruchpilot::RFP)⁸ kaynaşmış presinaptik aktif bölge belirteçlerinin hedeflenmiş transgenik ekspresyonu veya ultrastrüktürel sinaps analizleri için elektron yoğun bir sinyal (örneğin, miniSOG-mCherry)⁸ kullanılarak benzer şekilde etiketlenebilir. OR42a sinaptik terminalleri, lazer taramalı konfokal mikroskopi ve transmisyon elektron mikroskobunun bir kombinasyonu ile görüntülenebilir. Or42a sinaptik glomerül budamasının EB dozuna bağımlı olduğunu ve zamanlanmış koku verici deneyiminin konsantrasyonuna ölçeklendiğini gösteriyoruz. Bir araç olarak kullanılan mineral yağda çözünen EB koku maddesinin yüzdesi, gelişimsel olarak evrelenmiş hayvanlarda koku maddesine maruz kalmanın zamanlanmış süresi gibi değişebilir. Son olarak, VM7 innervasyon floresan yoğunluğunu ve hacmini ölçerek sinaptik glomerül budamasının kapsamını analiz etmek için kullanılan yöntemleri gösteriyoruz. Sinaps sayısı ayrıca etiketli sinaptik punkta sayılarak ve transmisyon elektron mikroskobu⁸ kullanılarak sinaptik yapı parametreleri ölçülerek de ölçülebilir. Genel olarak, burada gösterilen protokol, genç kritik bir dönemde Drosophila koku alma devresi sinaptik bağlantı budamasına aracılık eden hem hücresel hem de moleküler mekanizmaların sistematik olarak diseksiyonunu sağlayan güçlü bir yaklaşımdır. Bu çalışmada açıklanan genel koku maruziyeti kurulumu, diğer kokular kullanılarak ve diğer glomerüller ^3,7 kullanılarak önceki çalışmalarda kullanılmıştır.

Protokol

1. Koku maruziyeti

1. İnce bir boya fırçası kullanarak, gelişimsel olarak evrelenmiş 40-50 hayvanı, standart mısır unu pekmezi yemi içeren 25 mm x 95 mm polistiren Drosophila şişelerine fazat koyu pupa (25 ° C'de 90+ saat sonra) olarak sıralayın (Şekil 1A).
2. Sinekleri tutmak ve aynı zamanda iyi hava akışı sağlamak için Drosophila şişelerinin ucuna ince paslanmaz çelik tel örgü yerleştirin. Bantlanmış şeffaf film ile tel örgü kapakları Drosophila şişelerinin yan tarafına sabitleyin.
3. 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne, 1 mL %100 mineral yağ (araç kontrolü) yerleştirin veya istenen konsantrasyonu elde etmek için mineral yağda etil bütirat (EB) kokusunu çözün (örn., %15 (150 μL) veya %25 (250 μL)).
4. Araç kontrol veya koku verici mikrosantrifüj tüplerini hava geçirmez 3700 mL Glasslock kabına dik olarak yerleştirin. Bant kullanarak, tüpleri Drosophila şişeleri ile birlikte koku odalarının ortasına güvenli bir şekilde sabitleyin (Şekil 1B).
5. Aşamalı Drosophila pharate pupa şişelerini içeren kapalı araç kontrol ve EB koku verici odalarını, 12 saat/12 saat aydınlık/karanlık döngüsünde nemlendirilmiş (%70), sıcaklık kontrollü (25 °C) bir inkübatöre yerleştirin.
6. 4 saatlik koku haznesi maruziyetinden sonra yeni kapatılan sinekleri çıkarın ve 20-25 sineği taze yapılmış koku verici içeren odalardaki taze Drosophila şişelerine hızla aktarın (Şekil 1A, B). Kapatılmamış pupaları atın.
7. Sinekleri kapalı koku odalarında, inkübatörlerde toplam 24 saat bekletin. Daha uzun koku verici dozu için, sinekleri her 24 saatte bir yeni yapılmış koku verici odalarındaki yeni Drosophila şişelerine hızla aktarın.
8. Gelişimsel olarak evrelenmiş sinekleri, acil beyin diseksiyonu ve immünositokimya işlemine hazırlık olarak 1 dakika boyunca% 70 etanol içeren bir tabağa batırarak uyuşturun.

2. Beyin diseksiyonu

1. Şişeleri etiketleyerek araç kontrolü (yalnızca %100 mineral yağ) veya EB'ye maruz kalan (% EB) olarak işaretleyin ve bu tanımlamaları tüm beyin diseksiyonu ve sonraki işlem süresi boyunca koruyun. Her genotip/koku verici durumu için 10-20 hayvanı işleyin.
2. Forseps kullanarak, anestezi uygulanmış tek bir sineği yeni yapılmış fosfat tamponlu salin (PBS) içeren küçük bir tabağa ^aktarın13. Sineği PBS'ye daldırın ve sinek tamamen suya batırılmış halde tam beyin diseksiyonuna devam edin.
3. Her iki elinizde ince (# 5) keskinleştirilmiş forseps ile, sinek ventral tarafı yukarı gelecek şekilde yerleştirin ve bir forseps ile üst toraksı ve diğer forseps ile hortumun altındaki başı kavrayın. Beyne nüfuz etmemeye dikkat edin.
4. İki elinizle zıt yönlerde hafifçe çekerek başı vücudun geri kalanından çıkarın. Baş, torakstan kolayca ayrılmalıdır; diseksiyon için izole edilmiş başlığı bırakın (Şekil 1C).
5. Daha önce göğüs kafesi kavramak için kullanılan forsepsleri hortumun karşı tarafının altına kaydırın. Dış iskelet kütikülünü zıt yönlerde nazikçe çekmeye başlayın, böylece beyni ortaya çıkarmak için gözler arasında yırtılır.
6. Çekerken, beyin optik lobları dış iskelet ile birlikte ayrılabilir. Bunu önlemek için, dış iskelet kütikülünü çıkarırken iki forseps ile yavaş, sabit bir çekme kullanın (Şekil 1C, orta).
7. Dış iskelet kütikülünü baştan çıkarmaya devam edin. Dış iskeletin tüm parçalarının çıkarıldığından emin olun. Yağ gövdesi ve çıkıntılı trakea dahil olmak üzere beyne bağlı tüm dokuları çıkarın.
8. Yapışmayı önlemek için P20 pipet ucunu PBS + %0,2 Triton-X 100 (PBST) ile durulayın. Diseksiyondan hemen sonra, beyinleri kapaklı bir tüpte sabitleme solüsyonuna (% 4 paraformaldehit (PFA) +% 4 sükroz) aktarın (Şekil 1C, D).

3. Beyin immünositokimyası

1. Beyni, uçtan uca döndürme ile oda sıcaklığında (RT) 30 dakika sabitleyin. Beyinleri tüpte tutarken, pipetleyin ve tehlikeli sabitleyiciyi uygun şekilde atın. Sabit beyinleri PBS ile 3x hızlı bir şekilde yıkayın (Şekil 1D).
2. Beyinler genellikle rotasyondan sonra tüplerin kapağına sıkışmış olarak bulunabilir. Tüm transferlerde sürekli bir tehlike olan kazara beyin kaybını önlemek için, sıvıları pipetlerken bir diseksiyon mikroskobu kullanın.
3. Antikor etiketlemesine hazırlanırken, sabit beyinleri PBST +% 1 sığır serum albümini (BSA) +% 0.5 normal keçi serumu (NGS) ve sabit uçtan uca rotasyon ile RT'de 1 saat bloke edin (Şekil 1D).
4. Bloğu çıkarın ve beyinleri PBST +% 0.2 BSA +% 0.1 NGS'de uygun şekilde seyreltilmiş seçilen primer antikor ile inkübe edin. Beyni gece boyunca (14-16 saat) 4 ° C'de sabit rotasyonla inkübe edin.
   NOT: Kullanılan örnek antikorlar: sinaptik glomerülleri etiketlemek için sıçan anti-CadN (seyreltme 1:50)¹⁴ ve Or42a-mCD8::GFP'yi etiketlemek için tavuk anti-GFP (1:1000)⁸ (Şekil 1D).
5. Birincil antikoru pipetleyin. Beyinleri PBST ile her biri 3 dakika boyunca 20 kez yıkayın. PBST'de %0.2 BSA + %0.1 NGS ile seyreltilmiş ikincil antikorlarla beyinleri, sabit rotasyonla RT'de 2 saat boyunca inkübe edin.
   NOT: Alternatif olarak, beyinleri gece boyunca (14-16 saat) 4 ° C'de kuluçkaya yatırın. PBST'deki antikorları% 0.2 BSA +% 0.1 NGS ile seyreltin; Burada kullanılan ikincil antikorlar: 488 keçi anti-tavuk (1:250) ve 546 keçi anti-sıçan (1:250).
6. İkincil antikorları pipetleyin. Beyinleri PBST ile her biri 3 dakika boyunca 20 kez yıkayın. Beyinleri PBS ile 20 dakika yıkayarak bitirin (Şekil 1D).
7. Slayta birbirinden ~ 25 mm aralıklarla iki ince çift taraflı yapışkan bant şeridi ekleyerek cam mikroskop slaytlarını (25 mm x 25 mm) hazırlayın. Bu, beyinlerin ezilmesini önlemek için bir ara parça sağlar.
8. Beyni monte etmek için iki bant şeridi arasına ~ 10-15 μL montaj ortamı pipetleyin. PBST ile önceden durulanmış bir P20 pipet ucu ile, etiketli beyinleri mikroskop lamına aktarın (Şekil 1E).
9. Beyinler aktarıldıktan sonra, anten loblarının yukarı baktığından emin olarak hizalamak için ince bir boya fırçası kullanın. Anten loblarını içerecek olan kemerli kambura sahip tarafı arayın.
10. Beyinler düzgün bir şekilde yönlendirildikten sonra, lamellerin bant üzerinde sağlam olduğundan emin olmak için onları bir cam lamel (No. 1.5H) ile örtün. Ardından, lamel kenarlarını ek montaj ortamı ile doldurun (Şekil 1E).
11. Lamelin kenarlarını şeffaf oje ile kapatın. Slaytın iyice kurumasını bekleyin ve ardından sonraki görüntüleme için buzdolabında saklayın.

4. Konfokal görüntüleme

1. Daha sonra kod çözme için slaydı kodlanmış bir etiketle işaretleyerek görüntülemeden önce tüm beyin slaytlarını hem genotip hem de deneyim koşullarına kör edin.
2. 63x yağa daldırma objektifine sahip lazer taramalı konfokal mikroskop kullanın. Burada gösterilen tüm resimlerde bir Zeiss 510 META mikroskobu kullanıyoruz (Şekil 1F).
3. Kullanılan floroforlar için uygun lazer çizgileri kullanın. Burada, anten lobu sinaptik glomerül ve Or42a koku alma duyusal nöron görüntülemesi için bir Argon 488 ve HeNe 543 lazer kullanın (Şekil 2).
4. Her iki kanal için en uygun kazancı ve ofseti belirleyin, ideal olarak her iki kanal için kazancı <750 ve ofset ≈0 tutun. Bu, arka planı sınırlarken sinyal-gürültünün optimum olmasını sağlamak için yapılır.
5. Görüntülemeyi beynin merkezine yerleştirin. Görüntüleme yapılırken VM7 glomerülleri, diseksiyon sırasında özofagusun çıkarılmasını takiben beynin ortasında kalan deliğe proksimalde yerleşir (Şekil 2A).
   NOT: VM7 glomerülleri her zaman yemek borusunun açıklığına yakın olacaktır. Bununla birlikte, tam konum ve boyut, beyin diseksiyonu ve montaj farklılıklarına bağlı olarak biraz değişir, bu nedenle görüntüleme yaparken bunu göz önünde bulundurun.
6. Görüntüleme çözünürlüğünü ve optik dilim kalınlığını seçin. Burada, 0,37 μm'lik bir Z-yığını dilim kalınlığına sahip 1024 x 1024 çözünürlük kullanılır.
7. VM7 glomerüllerinin tam Or42a nöron innervasyonunun yakalanmasını sağlamak için anten lobu boyunca tüm bir konfokal Z-yığını projeksiyonunu alın.

5. Sinaptik ölçümler

1. Genotip/durum körü görüntüyü Fiji'ye (1.54f) yükleyin. Image > Color (Renk) > Split Channel (Kanalları Böl) seçeneğini tıklatarak lazer çizgi kanallarını bölün.
2. Or42a koku alma duyu kanalında, floresansın nerede başladığını ve bittiğini belirleyerek, Z yığınının tamamı boyunca kaydırarak hangi dilimlerin Or42a innervasyonunu içerdiğini belirleyin.
3. Görüntü > Yığınları > Z Projesi > Dilimleri Topla'ya tıklayarak ve istenen aralığı girerek yalnızca Or42a nöron innervasyonu içeren dilimleri içeren bir toplam dilim projeksiyonu oluşturun.
4. Fiji'de, VM7 glomerulusundaki Or42a nöron innervasyonunun ana hatlarını izlemek için üst çubuktaki Kement aracına tıklayın ve her bir beyin tarafı glomerulusunu bağımsız olarak tedavi edin (Şekil 3).
5. VM7 sinaptik glomerulus innervasyon hacmini elde etmek için çevreyi Z-yığın dilimlerinin sayısı ve her dilimin kalınlığı ile çarpın. Sinaps sayısını ölçmek için, maksimum bul aracı, belirtilen ^8,15 bölgesindeki sinaps punktasını saymak için maksimum yığınları bul makrosu ile birlikte kullanılabilir.

Sonuçlar

Şekil 1 , koku alma deneyimine bağlı kritik dönem, koku verici maruziyeti ve beyin görüntüleme yöntemleri için iş akışını göstermektedir. Protokol, eklosiyondan hemen önce fazat koyu pupaların yaş eşleştirmesi ile başlar (Şekil 1A). Pupalar 4 saat boyunca koku verici odalara yerleştirilir ve daha sonra yeni kapatılmış yetişkinler ya araç kontrolünde ya da dozlanmış EB koku verici odalarında taze şişelere dönüştürülür (Şekil 1B). Koku maddesine tipik olarak 24 saat maruz kalırız, ancak herhangi bir süre mümkündür. Koku maruziyetinden sonra, beyin diseksiyonu, başın torakstan çıkarılması ve ardından kütikül dış iskeletinin ince forseps ile çıkarılmasıyla başlar (Şekil 1C). İzole edilen beyin, görüntülemeye müdahale edebilecek herhangi bir ilişkili dokudan temizlenir ve daha sonra PBS'de hemen% 4 paraformaldehit ve% 4 sükroz içinde sabitlenir. Beyin dokusunun iyi bir bütünlüğü için 30 dakikalık kısa bir düzeltme yeterlidir. İmmünositokimyasal protokol 1 saatlik bir blok ile başlar (ör., BSA, NGS), primer antikorlarda gece boyunca inkübasyon (ör., anti-GFP, -CadN) ve daha sonra ikincil antikorlarda kısa bir 2 saatlik inkübasyon (Şekil 1D). Etiketli beyinler, anten loblarının en iyi görüntülenmesi için beyin sırt yüzeyi yukarı bakacak şekilde kapalı lameller altında cam slaytlara monte edilir (Şekil 1E). Tüm örneklerin, daha sonra kod çözme için slaydı kodlanmış bir atama ile işaretleyerek hem genotipe hem de deneyim koşullarına kör olduğunu unutmayın. Merkezi beyin anten loblarını görüntülemek için 63x yağa daldırma objektifine sahip bir lazer taramalı konfokal mikroskop kullanılır (Şekil 1F). Kullanılan floroforlar için en uygun lazer çizgileri seçilir (örneğin, Argon 488 ve HeNe 543), çevredeki glomerüller bağlamında VM7'nin Or42a koku alma duyusal nöron innervasyonunu görüntülemek için.

VM7 glomerüllerindeki Or42a nöron innervasyonunun tüm Z-yığını projeksiyonunu yakalamak için optimum kazancı, ofseti, görüntüleme çözünürlüğünü ve optik dilim kalınlığını seçmek önemlidir. Karşılaştırılacak tüm genotipler ve deneyim koşulları aynı mikroskop ayarları ile görüntülenir. Z yığınları, ImageJ yazılımı kullanılarak işlenir ve deneyime bağlı değişiklikler öncelikle innervasyon hacmi ^7,14 tarafından değerlendirilir. Hacimsel ölçümlerin hesaplanmasının iki yolu vardır. ImageJ kement fonksiyonu kullanılarak innervasyon alanı dilim dilim hesaplanır ve ardından her değer her dilimin kalınlığı (μm) ile ^{çarpılır8,9}. Diğeri, toplam dilim Z projeksiyonlarını kullanır ve ortalama hacmi belirlemek için Z yığını dilimlerinin sayısını dilim kalınlığıyla çarpar. Her iki yöntem de tutarlı sonuçlar verir. Hacim ölçümlerine ek olarak, floresan yoğunluğu, VM7 glomerülleri^16'nın maksimum yoğunluk projeksiyonu ile de değerlendirilebilir. Tüm piksellerin ağırlıklı toplamı, toplam yoğunluğu ^8,9 hesaplamak için her yoğunluk düzeyindeki piksel sayısı toplanarak ImageJ toplam dilim maksimum projeksiyonu aracılığıyla değerlendirilir. Arka plan, aynı büyüklükte bir ekstra glomerüler bölge nicelleştirilerek çıkarılabilir. Bu çıkarma yöntemi daha zaman alıcıdır, ancak daha doğrudur, çünkü innervasyon floresan yoğunluğu değerlerinin daha temsili bir nicelleştirmesini üretmek için her beyin örneğinde değişen seviyelerde arka plan antikor etiketlemesini hesaba katar. Yoğunluk ölçümleri, her bir beyin¹⁶ için ortalama olarak, bir Z-yığını içinde 18-30 optik dilim (0.37 μm / dilim) tipik bir aralıkta yapılır. Neredeyse tüm vakalarda, innervasyon floresan yoğunluğu ve hacim ölçümleri tutarlı sonuçlar verir.

Tüm ölçüm modalitelerinde, temsili sonuçlar değişmez kalır; Yaşamın erken dönemlerinde EB koku verici deneyimi, Or42a nöron innervasyonunun önemli bir kaybına neden olur. VM7 glomerulusu, diğer hassas bir şekilde haritalanmış anten loblu koku alma glomerülleri arasında boyut, şekil ve konum ile güvenilir bir şekilde tanımlanabilir (Şekil 2A) ve anti-nöral kaderin (CadN; Şekil 2B). Kokulu araç kontrolüne (mineral yağ) zamanlanmış maruz kalma, tedavi edilmemiş, normal bir hayvandan ayırt edilemeyen Or42a nöron innervasyonuna neden olur. Yine de, eklosyondan sonraki ilk birkaç gündeki EB koku deneyimi (dpe) sinaptik glomerül budamasına neden olur (Şekil 2C). Bu budama mekanizması tamamen kısa erken yaşam kritik dönemi ^8,10 ile sınırlıdır. Artık VM7 glomerül sinaptik budamasını ve bunun sonucunda juvenil Drosophila beynindeki innervasyon hacmindeki azalmayı değerlendirmek için tipik olarak 24 saatlik koku verici maruziyetleri kullanıyoruz. Kokulu araç kontrolüne (mineral yağ) 24 saatlik bir maruz kalma (0-1 dpe), her iki beyin yarımküre anten lobunda VM7 sinaptik glomerüllerinde (beyaz kesikli daireler) normal, yoğun Or42a-mCD8::GFP innervasyonunu (yeşil) korur (Şekil 2D, solda). Çarpıcı bir kontrast olarak, mineral yağda çözünen % EB koku maddesine 24 saat maruz kalma (0-1 dpe), Or42a-mCD8::GFP innervasyonunun (yeşil) güçlü bir şekilde budanmasına ve sinaptik glomerüler hacmin kaybına neden olur (Şekil 2D, sağ). Bu sonuçlar hem görsel olarak açık hem de tutarlı bir şekilde nettir. Bu koku verici deneyim protokolünün en büyük özelliklerinden biri, aynı zamanda basit innervasyon floresan yoğunluğu ve hacim ölçümlerine son derece uygun olan beyin görüntüleme sonuçlarının netliğidir.

Bu koku verici deneyim protokolünün en büyük avantajı, kritik dönem sinaptik budama sırasında zamansal kısıtlama ve koku verici doza bağlı mekanizmaların incelenmesi için onu kullanma yeteneğidir. VM7 glomerulusunda EB güdümlü Or42a nöron sinaps eliminasyonu için, yeniden şekillenme mekanizması öncelikle erken gençlik (0-2 dpe) ile sınırlıdır ve en yüksek EB maruziyet seviyelerinde küçük modülasyon dışında olgunlukta (7-9 dpe) saptanabilir deneyime bağlı sinaptik budama yoktur⁸. Bu tür bir zamansal kısıtlama kritik bir dönemi tanımlar ve bu zamanlama mekanizmasının anlaşılması önemli bir amaçtır. Bu protokolün bir başka özelliği de deneyime bağlı sinaptik budamanın EB dozuna bağımlı olmasıdır (Şekil 3). % 0 EB koku maddesi ile koku verici araç kontrolüne (mineral yağ) zamanlanmış maruz kalma, tedavi edilmemiş bir hayvandan ayırt edilemeyen VM7 sinaptik glomerulusunun normal Or42a nöron innervasyonu ile sonuçlanır. Or42a nöron innervasyonu 3 boyutlu hacminin hesaplanması, normal bir genç beynin tipik bir boyutunu gösterir (2260 μm³; Şekil 3A, solda). Temsili sonuçlar, artan EB koku konsantrasyonunun giderek daha fazla sinaptik glomerül budamasına neden olduğunu göstermektedir. Örneğin, EB koku maddesine 24 saatlik bir maruz kalma (0-1 dpe) net ve tutarlı innervasyon kaybına neden olur (Şekil 3A, orta). 3D innervasyon hacminin ölçülmesi, araç kontrollerine kıyasla çarpıcı bir azalma gösterir (760 μm^3'e karşı 2260 μm³). % 25 EB koku maddesine 24 saatlik bir maruziyet (0-1 dpe) daha da fazla innervasyon kaybına neden olur (281 μm³; Şekil 3A, sağda). Bu EB koku konsantrasyonu aralığı için temsili nicelikler, floresan yoğunluğu (Şekil 3B) ve innervasyon hacmi (Şekil 3C) için tutarlı sonuçlar göstermektedir. Bu doz bağımlılığı, sinaptik budamayı önleme araçlarının incelenmesine ve ayrıca artan sinaptik glomerül yeniden şekillenmesini göstermek için daha düşük koku maruziyetleri ile budamayı geliştirmeye izin verir. Önceki bazı çalışmalar, bu protokol¹⁰ ile diğer koku vericiler kullanılarak artan glomerüler hacmin ters etkisini göstermiştir. Kritik dönemde EB koku maruziyeti her zaman çarpıcı ve kolayca tespit edilebilir sinaptik glomerül budaması ile sonuçlanır.

Şekil 1: Drosophila çocuk beynindeki koku verici maruziyet çalışmalarının akış şeması. (A) Fazat koyu pupalar (25 ° C'de pulajdan 90+ saat sonra) toplanır ve koku odalarına yerleştirilir. Kokulu koşullar altında, eklosiyon için 4 saate izin verilir ve daha sonra yavru sinekler taze bir şişeye aktarılır. (B) Yaşa uygun sinekler, araç kontrolü (0 mineral yağ) veya etil bütirat (EB; mineral yağda % v/v) deneyim koşullarına ayrılır. İnce bir tel örgü (iç kısım) koku maddesine erişim sağlar. Sinekler tipik olarak, eklosiyondan 0-1 gün sonra (dpe) olmak üzere toplam 24 saatlik maruziyet için 20 saat daha maruz kalır. (C) Sinekler önce kafa çıkarılarak disseke edilir ve daha sonra kütikül dış iskeletini hassas bir şekilde çıkarmak ve genç beynini izole etmek için ince forsepsler kullanılır. İzole edilen beyin, çevresindeki tüm dokulardan ve çıkıntılı trakeadan temizlenir. (D) İzole edilmiş beyinler sabitlenir, bloke edilir ve daha sonra birincil ve ikincil antikorlarda sırayla inkübe edilir. Kullanılan antikor yelpazesi tipik olarak anten lobunu ortaya çıkarmak için genel bir membran probu içerir: sinaptik glomerüller ve Or42a koku alma duyu nöronları için spesifik bir membran probu. (E) Etiketli beyinler, kapalı bir lamel altında bant ara parçaları olan bir cam mikroskop lamı üzerine bir montaj ortamına yerleştirilir. Doğru beyin oryantasyonu (dorsal yüzey yukarı), anten loblarının optimal görüntülenmesi için kritik öneme sahiptir. (F) Beyinler, lazer taramalı konfokal floresan mikroskobu kullanılarak görüntülenir. Tüm numuneler, görüntüleme ve müteakip niceliksel analizlerden önce genotip ve deneyim koşullarına körleştirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Koku verici deneyime bağlı kritik dönem sinaptik glomerül budaması. (A) Anten lobu (AL) koku alma glomerülleri tam olarak haritalanmıştır. Birkaç temsili sinaptik glomerül gösterilmiştir. Or42a reseptörü koku alma duyusal nöron (OSN) sınıfı, VM7 glomerüllerini spesifik olarak innerve eder. (B) Or42a-mCD8::GFP etiketli nöronlar (yeşil), beynin sol (L) ve sağ (R) taraflarındaki eşleştirilmiş VM7 glomerüllerini yoğun bir şekilde innerve eder ve tüm AL sinaptik glomerüllerinin (macenta) N-Cadherin (CadN) antikor etiketlemesi ile. Sinek hattı w^1118'dir; VEYA42a-mCD8::GFP/+. (C) Araç kontrol koşulunda (% 100 mineral yağ; solda) VM7 sinaptik glomerüllerinin Or42a OSN innervasyonunun ve etil bütirat maruziyetinin (mineral yağda % EB v / v; sağda) juvenil kritik dönem boyunca şematik grafiksel gösterimi. Deneyime bağlı innervasyon budaması, yalnızca erken yaşam EB maruziyeti ile gerçekleşir, sinapslar elimine edilir ve aksonlar kaybolur, bu da innervasyon hacminin azalmasına neden olur. (D) Eşleştirilmiş VM7 sinaptik glomerüllerinin Or42a OSN innervasyonunun temsili konfokal görüntüleri (kesikli beyaz anahat daireleri; OR42a-mCD8::GFP, yeşil) petrollü araç kontrolünü (solda) ve 24 saat boyunca (0-1 dpe) % EB maruziyetini (sağda) takiben. EB koku verici deneyimi, sinaptik budamayı ve innervasyon hacminin kaybını tetikler. Bu deneyime bağlı mekanizma zamansal olarak sınırlıdır ve yalnızca eklosiyondan sonraki ilk birkaç gün içinde iyi tanımlanmış bir koku alma kritik döneminde geçici olarak geri döndürülebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: EB dozuna bağlı sinaptik glomerül innervasyon floresan yoğunluğu ve hacminin ölçülmesi. (A

Tartışma

Burada sunulan koku verici maruziyeti ve beyin görüntüleme protokolü, erken yaşamda kritik bir dönemde deneyime bağlı koku alma duyusal nöron sinaptik glomerül budamasını güvenilir bir şekilde indüklemek ve ölçmek için kullanılabilir. Koku alma devresinin yeniden şekillenmesini araştırmak için bu tedavi paradigmasını kullanan daha önceki çalışmalar, eklosiyondan 2^{. gün} sonra koku maruziyetine^{başladı 3,4,5}. Buna karşılık, yetişkin eklosyonundan önce fazat pupalarında koku maruziyetine başlıyoruz ve yeniden şekillenmenin büyük çoğunluğunun eklosiyondan sonraki ilk 24 saat içinde gerçekleştiğini görüyoruz ^8,9. Bu nedenle, bu koku verici maruziyet protokolünde önemli bir adım, aşamalı koyu pupaları eklosiyondan önce koku odalarına yerleştirmektir (Şekil 1). Bu, kendi başına pupa kokulu maruziyet için değil, yetişkin eklosyonundan hemen sonra kokulu maruziyeti sağlamak içindir. Sıkı bir zamansal pencere içinde yaşları senkronize etmek ve koku verici maruz kalma sürelerindeki farklılıkları önlemek için evrelemeden 4 saat sonra kapalı genç yetişkinleri seçtik. Bu erken deneyim aralığı, EB koku alma alışkanlığının eklosiyondan sadece 2 gün sonra kapandığını gösteren son çalışmalarla uyumludur¹⁰. Bununla birlikte, kritik dönem içindeki koku maruziyeti zamanlama farklılıklarının sonuçları (örneğin, 0-1 ve 1-2 gün) iyi karakterize edilmemiştir. Or42a koku alma duyusal nöronları, anten lobundaki VM7 glomerulusunu seçici olarak innerve eder, bu da kesin glomerüler haritalara ve hedeflenen innervasyon etiketlemesine dayalı olarak kolayca tanımlanır (örneğin, Or42a-mCD8::GFP; Şekil 2). Kritik dönemde EB koku maruziyeti Or42a promotör ekspresyonunu veya raportör seviyeleri^8'i değiştirmez. Zamanlanmış koku verici maruziyeti, Or42a reseptör nöronlarından sıralı sinaps eliminasyonuna ve akson innervasyon kaybına neden olur. Bu budama, erken yaşam kritik döneminde (0-2 dpe) tamamen geri dönüşümlüdür, ancak kokulu ortamdaki değişikliklerin artık innervasyonu değiştirmediği yetişkin olgunluğunda (7-9 dpe) değildir. Bu duyusal deneyime bağlı mekanizmanın sıkı zamansal kısıtlaması, bu alanda öne çıkan önemli bir sorudur. Olgunlukta kritik dönem benzeri plastisiteyi yeniden açmak için birçok girişimde bulunulmaktadır. Burada verilen protokol, soruşturma için güçlü bir yoldur.

Burada açıklanan koku maruziyeti ve beyin görüntüleme protokolünün kolaylığı, geniş erişilebilirlik ve geniş uyarlanabilirlik sağlar. Koku maddesine maruz kalma deneyiminin başlangıcı, sonlandırılması ve süresi, kritik dönem özelliklerinin, yeniden şekillenebilirliğin yeniden şekillendirilmesinin ve kritik dönem benzeri plastisitenin yeniden açılmasının hedefli çalışmalarına izin vermek için tamamen araştırmacının takdirine bağlıdır. Benzer şekilde, koku verici deneyiminin gücü, doza bağlı sinaptik glomerül budama çalışması için kolayca manipüle edilebilir (Şekil 3). Daha da önemlisi, daha düşük EB konsantrasyonları (örneğin,% 15 EB) kullanan çalışmalar, sinaptik glomerüllerin yeniden şekillenme oranını veya kapsamını artırabilecek manipülasyonları test etmek için kullanılabilir. Örneğin, sonuçlar daha düşük EB seviyelerinde (örneğin, %15) sinaptik budamanın daha yüksek EB seviyelerinden (örneğin, %25) ayırt edilemez olduğunu gösterebilir. Farklı manipülasyonlarda sonuçlar, kokulu araç kontrollerinin tutarlı bir şekilde innervasyonu ve %25 EB'de meydana gelen sağlam sinaptik glomerül budaması ile karşılaştırılabilir (Şekil 3). Bu yöntemin bir sınırlaması, koku verici maruziyetinin tamamen çözünmüş koku maddesinin uçuculuğuna dayanmasıdır. Sıcaklık ve bağıl nem gibi değişken faktörler koku verici maruziyet etkinliğini etkiler⁸. Koku verici odalarındaki sinek yoğunluğu, örneğin sinek türevi koku maddelerinin üretimi yoluyla koku verici maruziyetini de potansiyel olarak etkileyebilir. Flakon başına 20-25 sinekten fazla olmayan bir yoğunluk önerilir. Çok güçlü sinaptik glomerül budamasını indüklemek için gereken koku konsantrasyonu, muhtemelen doğada tipik olarak deneyimlenenden daha yüksektir^10,17. Daha düşük koku konsantrasyonlarında sinaps eliminasyonunu test etmek için çok daha yüksek çözünürlüklü görüntüleme teknikleri gerekecektir. Bununla birlikte, mevcut protokol, bir dizi manipülasyon için tutarlı ve güvenilir çalışmalara izin vermektedir.

Bu koku verici maruziyetinin ve beyin görüntüleme protokolünün çok büyük faydaları vardır. Drosophila, kritik dönem koku alma devresinin yeniden modellenmesinde gen-çevre etkileşimlerinin geniş bir şekilde incelenmesi için sistematik olarak kullanılabilen, kapsamlı ve sofistike bir genetik araç seti üzerine kurulmuş, son derece avantajlı bir hayvan modelidir. Burada gösterilen örnekler arasında Or42a-Gal4 transgenik sürücü hattı, UAS-mCD8::GFP membran markörü ve Or42a-mCD8::GFP doğrudan füzyon yer alır. Or42a doğrudan füzyonu ile sinaptik glomerül budaması ile Gal4/UAS dolaylı etiketleme yaklaşımları arasında ayırt edilebilir bir fark yoktur ^8,9. Or42a-Gal4 sürücüsü, hem hedeflenen koku alma reseptörü nöronlarını manipüle etme hem de VM7 innervasyonundaki deneyime bağlı değişiklikleri görselleştirme yeteneği sağlarken, doğrudan füzyon hattı, diğer hücre hedefli manipülasyonlar için ikili UAS-Gal4 transgenik sistemini serbest bırakır. Kapsamlı Drosophila araç setinden diğer birçok mutant ve transgenik hat, sinaptik budamaya aracılık eden hücrelerin tanımlanması, koku alma deneyimi bilgisini ileten hücreler arası sinyal yolları ve hedeflenen sinaps eliminasyonu için gerekli hücre içi mekanizmalar dahil olmak üzere zamansal kısıtlama ve deneyime bağlı mekanizmaları test etmek için kullanılabilir. Genel olarak, bu protokol, koku alma deneyimine bağlı beyin devresinin yeniden şekillenmesini sağlayan birçok mekanizmanın sistematik olarak sorgulanmasına izin verir. Bu koku verici maruziyeti ve beyin görüntüleme protokolü, kritik döneme özgü koku alma deneyimini, davranış değişikliklerini, kritik dönem benzeri plastisitenin olgunlukta yeniden açılmasını sağlayabilecek genetik ve farmasötik manipülasyonları ve sinaptik glomerül budamasının ötesinde koku alma devresi plastisitesinin diğer yönlerini araştırmak için de kullanılabilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Kokuya Maruz Kalma İçin
Drosophila flakonlar	Genesee Scientific	32-110
Etil bütirat	Sigma Aldrich	E15701
Mikrosantrifüj tüpleri	Fisher Bilimsel	05-408-129
Mineral yağ	Sigma Aldrich	M3516
Koku odaları	Glasslock
Boya fırçaları	Winsor & Newton	Serisi 233
Parafilm	Thermofisher	S37440
Hasır	Scienceware	378460000
Beyin Diseksiyonu
Etanol, 190 kanıt	Decon Labs	2801	%70'e Seyreltilmiş
Forseps	Güzel Bilim Araçları	11251-30	Dumont # 5
Paraformaldehit	Elektron Mikroskobu Bilimleri	157-8	%4'e seyreltilmiş
Petri kapları	Fisher Scientific	08-757-100B
Fosfat tamponlu salin	Thermo Fisher Scientific	70011-044	1x
Sucrose	Fisher Scientific'e	BP220-1
Sylgard Elektron	Mikroskobu Bilimleri	24236-10
Triton-X 100	Fisher Scientific	BP151-100
Beyin İmmünositokimyası< / güçlü >
488 keçi anti-tavuk	Invitrogen	A11039
546 keçi anti-sıçan	Invitrogen	A11081
Sığır serum albümini	Sigma Aldrich	A9647
Tavuk anti-GFP	Abcam	13970
Lameller	Avantor	48366-067	25 x 25 mm
Çift taraflı bant	Scotch	34-8724-5228-8
Fluoromount-G	Elektron Mikroskobu Bilimleri	17984-25
Mikroskop slaytları	Fisher Scientific	12-544-2	75 x 25 mm
Oje	Sally Hansen	109	Xtreme Aşınma, Görünmez
Normal keçi serumu	Sigma Aldrich	G9023
Sıçan anti-CadN	Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası	AB_528121
Konfokal/Analiz
Herhangi bir bilgisayar/dizüstü bilgisayar
Konfokal mikroskop	Carl Zeiss		Zeiss 510 META
Fiji yazılımı	Fiji		Sürüm 2.14.0/1.54f