Yöntem makalesi

Embriyonik Fare Beyin Dilimlerinde Göç Eden Nöronların ve Glial Progenitörlerin Hızlandırılmış Görüntülenmesi

1.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/66631

⸱

8 Mart 2024

 ,  , 
1Department of Anatomy, Keio University School of Medicine, 2Department of Molecular Neurobiology, Institute for Developmental Research, Aichi Developmental Disability Center

Bu makalede

Özet

Serebral korteksin gelişimi sırasında, nöronlar ve glial hücreler ventrikülü kaplayan ventriküler bölgeden kaynaklanır ve beyin yüzeyine doğru göç eder. Bu süreçte birçok gen yer alır. Bu protokol, göç eden nöronların ve glial progenitörlerin hızlandırılmış görüntüleme tekniğini tanıtır.

Özet

Serebral korteksin gelişimi sırasında, nöronlar ve glial hücreler ventrikülü kaplayan ventriküler bölgeden kaynaklanır ve beyin yüzeyine doğru göç eder. Bu süreç, uygun beyin fonksiyonu için çok önemlidir ve düzensizliği doğumdan sonra nörogelişimsel ve psikiyatrik bozukluklara neden olabilir. Aslında, bu hastalıklardan sorumlu birçok genin bu süreçte yer aldığı bulunmuştur ve bu nedenle, bu mutasyonların hücresel dinamikleri nasıl etkilediğini ortaya koymak, bu hastalıkların patogenezini anlamak için önemlidir. Bu protokol, fare embriyolarından elde edilen beyin dilimlerinde göç eden nöronların ve glial progenitörlerin hızlandırılmış görüntülenmesi için bir teknik sunar. Hücreler, ventriküler bölgeden yüksek bir sinyal-gürültü oranıyla göç eden tek tek hücreleri görselleştiren utero elektroporasyon kullanılarak floresan proteinlerle etiketlenir. Ayrıca, bu in vivo gen transfer sistemi, ekspresyonlarının veya knockdown/knockout vektörlerinin birlikte elektroporasyonu yoluyla verilen genler üzerinde fonksiyon kazancı veya fonksiyon kaybı deneylerini kolayca gerçekleştirmemizi sağlar. Bu protokol kullanılarak, tek tek hücrelerin göç davranışı ve göç hızı, sabit beyinlerden asla elde edilemeyen bilgiler analiz edilebilir.

Giriş

Serebral korteksin gelişimi sırasında, lateral ventrikülü kaplayan pallial ventriküler bölgedeki (VZ) (apikal) radyal glia, önce nöronları ve daha sonra bazı örtüşen periyotlarlaglial progenitörleri üretir 1. Nöronlar ayrıca, her ikisi de (apikal) radyal glia 2,3'ten kaynaklanan, VZ'ye bitişik subventriküler bölgedeki (SVZ) ara progenitörlerden veya bazal radyal gliadan üretilir. Farelerde, radyal glial hücreler embriyonik gün (E) 12-14'te sadece nöronlar, E15-16'da hem nöronlar hem de glial progenitörler ve E17'den itibaren glial progenitörlerüretir 4. Bu embriyonik aşamalar sırasında üretilen ana glial progenitör popülasyonu tercihen astrositlere farklılaşır, ancak bazı hücreler de oligodendrositlerefarklılaşır 5. Bu aşamalarda üretilen nöronlar ve astrosit progenitörleri beyin yüzeyine doğru göç eder ve kortikal plakaya (gelecekteki kortikal gri madde) girer. VZ'den kortikal plakaya nöronal göç çoklu fazlarda gerçekleşir. Nöronlar ilk olarak, çok kutuplu hücre birikim bölgesinin (MAZ) hemen üzerinde, SVZ veya ara bölge ile örtüşen çok kutuplu bir morfoloji benimserler, burada çok sayıda ince süreci kuvvetli bir şekilde uzatıp geri çekerler ve yavaşça göç ederler (çok kutuplu göç)6,7. Yaklaşık 24 saat sonra, nöronlar bipolar bir morfolojiye dönüşür, beyin yüzeyine doğru kalın bir öncü süreci ve geriye doğru ince bir takip sürecini uzatır ve radyal gliadan pial yüzeye uzanan radyal bir süreç kullanarak doğrusal olarak beyin yüzeyine doğru göç eder, buna lokomosyon modu 2,8 denir. Hareket modundaki nöronlar her zaman kortikal plakanın en dış yüzeyine ulaştıklarından, marjinal bölgenin hemen altındaki öncüllerinden geçtiğinden, nöronlar kortikal plaka 9,10,11'de doğum tarihine bağlı içten dışa bir şekilde hizalanır.

Buna karşılık, astrosit ataları, sık yön değişiklikleri ile ara bölgeye ve kortikal plakaya hızla göç eder. Bu göç davranışı, nöronal göçten tamamen farklıdır ve düzensiz göçolarak adlandırılır 5. Astrosit ataları ayrıca kan damarı güdümlü göç adı verilen bir süreçte kan damarları boyunca göç eder. Astrosit progenitörleri bu göç modları arasında geçiş yapar ve kortikal plakayaulaşır 5,12. Astrositlerin konumları üretim tarihlerine göre kesin olarak belirlenmese de, erken doğan astrositlerin kortikal plakanın yüzeysel kısmına yerleşmesi için hafif bir eğilim gözlenmiştir5. İlginç bir şekilde, kortikal plakaya yerleşen astrositler embriyonik aşamalarda üretilir ve sonunda protoplazmik astrositlere farklılaşırken, doğum sonrası üretilen astrositler aktif olarak göç etmez, beyaz cevherde kalır ve fibröz astrositlere farklılaşır5. Astrositik alt tiplerin bu aşamaya bağlı spesifikasyonunun nasıl oluştuğu belirsizliğini korumaktadır.

Nörogelişimsel ve psikiyatrik bozukluklarda yer alanlar da dahil olmak üzere, nöronal göçte yer alan artan sayıda gen tanımlanmıştır13,14. Bu nedenle, bu genlerdeki mutasyonların göç eden nöronların davranışları üzerindeki etkilerini aydınlatmak çok önemlidir. Daha önce de belirtildiği gibi, nöronal göç birden fazla aşamada gerçekleşir. Hızlandırılmış gözlemler, esas olarak etkilenen fazı doğrudan belirleyebilir (hücre döngüsü çıkışı, çok kutuplu-bipolar geçiş, hareketin göç hızı, vb.). Bununla birlikte, astrositlerin spesifikasyonu, göçü ve konumlandırılmasının altında yatan moleküler mekanizmalar büyük ölçüde bilinmemektedir. Astrositlerin sinaptogenezde15 ve beyin gelişimi sırasında kan-beyin bariyeri oluşumunda çok önemli roller oynadığı göz önüne alındığında16, astrositlerdeki gelişimsel kusurlar nörogelişimsel bozukluklara neden olabilir. Astrosit progenitörleri üzerinde yapılan hızlandırılmış çalışmalar, bu moleküler mekanizmaları ve bunların akıl hastalığı ile ilişkisini açıklığa kavuşturabilir.

Bu protokol, kortikal VZ'den türetilmiş hücrelerin hızlandırılmış gözlemi için bir yöntem sağlar. Nöronal göçün gözlemlenmesi için benzer bir video protokolü zaten yayınlanmıştır17. Burada, hem göç eden nöronlar hem de astrosit progenitörleri için yöntemi açıklıyoruz. Bu hücreleri yeşil ve kırmızı floresan proteinleri (GFP ve RFP) gibi floresan proteinlerle etiketlemek için, uygun bileşenleri içeren plazmit karışımları, uygun aşamalarda utero elektroporasyon ile kortikal VZ'yeverilir 18,19,20,21. Manipüle edilen embriyolar istenen aşamalarda çıkarılır ve beyinler dilimlenir ve bir lazer tarama mikroskobu kullanılarak hızlandırılmış gözlemler için kullanılır. Sabit beyin örnekleri kullanılarak asla ele alınmayan göç hızı, yönü ve diğer davranışlar bu yöntem kullanılarak incelenebilir. In utero elektroporasyon kullanımı, ekspresyon ve knockdown/knockout vektörleri, floresan protein vektörleri ile eş zamanlı olarak kolayca aktarılabilir, bu da belirli genlerin fonksiyon kazancı ve fonksiyon kaybı çalışmalarını yürütmemizi sağlar.

Protokol

Bu çalışma, Gelişimsel Araştırmalar Enstitüsü, Aichi Gelişimsel Engellilik Merkezi (#2019-013) ve Keio Üniversitesi (A2021-030) Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin onayı ve yönergeleri izlenerek gerçekleştirilmiştir. Zamanlanmış gebe ICR (vahşi tip) fareler ticari olarak elde edildi (bkz. Malzeme Tablosu). Göç eden hücreler ve kan damarları arasındaki ilişkiyi gözlemlemek için, endotel hücrelerinin DsRed22'yi eksprese ettiği Flt1-DsRed fareleri kullanıldı. Erkek Flt1-DsRed fareleri dişi ICR fareleri ile çaprazlandı (her iki fare de 8-24 haftalıktı). Tüm hayvanlar, numune alınana kadar belirli patojen içermeyen (SPF) koşullar altında barındırıldı ve manipüle edildi. Bu çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Rahim içi elektroporasyon

  1. Ticari olarak temin edilebilen 2x HBS'ye eşit hacimde otoklavlanmış su ekleyerek HEPES tamponlu tuzlu su (HBS) çözeltisi hazırlayın.
  2. Anesteziklerin iki seçeneği vardır; izofluran (soluma) ve MMB (enjeksiyon). MMB kullanılması durumunda, aşağıdaki gibi hazırlayın. 19.75 mL otoklavlanmış suya 0.75 mL medetomidin (1 mg / mL), 2 mL midazolam (5 mg / mL) ve 2.5 mL butorphanol (5 mg / mL) ekleyin23.
    NOT: Bu anestezik solüsyon 2 ay içinde daha az aktif hale gelir. Işık kalkanı ile 4 °C'de saklayın.
  3. Atipamezol çözeltisi hazırlayın. 0.75 mL atipamezolünü (5 mg / mL) 24.25 mL otoklavlanmış su ile seyreltin.
  4. Otoklavlanmış suda% 0.2 (a / h) Hızlı Yeşil çözelti hazırlayın. Bir filtre ile sterilize edin (gözenek boyutu 0,22 μm).
  5. Üreticinin talimatlarına göre alkali lizis ve kolon saflaştırmasına23 dayalı geleneksel bir plazmit saflaştırma kiti kullanarak plazmidi hazırlayın (bkz . Malzeme Tablosu). Plazmit stoğunu (3-5 μg/μL) hazırlamak için saflaştırılmış plazmiti 100 mL bakteri kültüründen 30-50 μL HBS içinde çözün (Ek Dosya 1).
    1. Plazmid stoklarını HBS ile karıştırın ve seyreltin ve enjekte ediciyi renklendirmek için 1/10 hacimce %0.2 Fast Green ekleyin. Plazmitlerin bileşenleri ve nihai konsantrasyonları amaçlarına göre belirlenir (Tablo 1).
  6. Bir pipet çektirme kullanarak cam kılcal damarları çekerek mikropipetleri yapın.
    NOT: Pipetin ucu ince forseps kullanılarak eğik olarak kesilir. Ucun dış çapı yaklaşık 70 μm'dir. Mikropipetleri 2 μL aralıklarla 2 μL su emerek işaretleyin.
  7. Uygun bir aşamada hamile bir fareye intraperitoneal olarak 10 μL / g vücut ağırlığı dozunda MMB anestezik enjekte edin (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek).
    NOT: Manipüle edilecek embriyonik aşamalar amaca göre belirlenmelidir. Gelecekteki II / III piramidal nöronları etiketlemek için E14.5 uygundur. Glial progenitörleri etiketlemek için E15-16 üzerinde elektroporasyon yapılmalıdır. Alternatif olarak, fareler izofluranın solunmasıyla (% 1 -% 2) uyuşturulabilir.
  8. Fare derin bir şekilde uyuşturulduktan sonra, 38 °C'de ılık bir tabağa koyun.
    NOT: Farenin kuyruğu sıkıştırmaya yanıt vermediğinden emin olun.
  9. Tüy dökücü krem kullanarak ameliyat bölgesinin etrafındaki tüyleri çıkardıktan sonra, cerrahi alanı hem iyot bazlı bir ovma hem de %70 alkol ile dairesel hareketlerle birkaç kez dezenfekte edin. En arkadaki 2. meme başı çifti seviyesinden öne doğru orta hat boyunca 2 cm uzunluğunda bir cilt insizyonu yapın, ardından karın duvarında linea alba boyunca 2 cm'lik bir orta hat insizyonu yapın (Şekil 1A).
    NOT: Karın duvarında kesi yapma sürecinde, iç organları kesmemek için ince forseps ile hafifçe kaldırın.
  10. Cildinize steril bir plastik tabaka ve üzerine bir parça steril kağıt mendil yerleştirin (Şekil 1A). Cerrahi alanı ortaya çıkarmak için merkezde bir delik oluşturun.
    NOT: Steril plastik tabaka ve steril kağıt mendil insizyon yapıldıktan sonra yerleştirilir çünkü meme uçlarının pozisyonuna göre insizyonu konumlandırmak için geniş bir görüş alanı gereklidir.
  11. Kağıdı steril PBS ile ıslatın, insizyondan uterus boynuzlarını dikkatlice gözlemleyin ve uterus boynuzunu plastik tabaka ve kağıdın deliklerinden dışarı çekin.
  12. Bir aspiratör tüpü tertibatına bağlı bir mikropipet kullanarak, 1 μL plazmit karışımını ekspiratuar basınçla uterus duvarından sol veya sağ lateral ventriküle enjekte edin (Şekil 1A).
    NOT: Alternatif olarak, plazmit bir mikroenjektör kullanılarak enjekte edilebilir.
  13. Embriyonun başını cımbız tipi bir elektrot ile sıkıştırın ve bir elektroporatör kullanarak elektronik darbeler uygulayın (E14-16 için 35 V, E17 için 50 V, 450 ms aralıklarla 50 ms kare darbeler, 5 kez) (Şekil 1A).
    NOT: Embriyoların başını güçlü bir şekilde sıkıştırmayın, bu embriyolara zarar verir. Gerçek akım 40-70 mA olmalıdır.
  14. Rahim boynuzunu karın boşluğuna geri yerleştirin.
  15. Karın duvarını 5-0 ipek iplik kullanarak dikin.
  16. Atipamezol solüsyonunu intraperitoneal olarak 10 μL / g vücut ağırlığı dozunda uygulayın.
  17. 5-0 ipek iplik kullanarak cildi dikin.
    NOT: Dış görünüm, bir otomatik klips kullanılarak kapatılabilir.
  18. Manipüle edilmiş fareleri en az 30 dakika ılık bir tabakta tutun. Fareler kafes içinde hareket etmeye başlayacaktır.
    NOT: In utero elektroporasyon prosedürü (1.7 ila 1.16 arasındaki adımlar arasında) 30 dakika içinde yapılmalıdır. Tipik ameliyat süresi 20 dakikadır.

2. Dilimlerin hazırlanması

NOT: Dilimlerin tazeliği bu deneyin başarısının anahtarıdır. Dilimler 2 saat içinde hazırlanmalıdır (2.5-2.12 adımlarından).

  1. Hanks'in dengeli tuz çözeltisini Ca2+ ve Mg2+ ile hazırlayın; HBSS (+) olarak adlandırılır. 500 mL HBSS'ye (-) 5 mL CaCl2 (14 g / L, otoklavlanmış) ve 5 mL MgSO4.7H 2O (20 g / L, otoklavlanmış) ekleyin. 4 °C'de saklayın. Kullanmadan önce çözeltiyi %95 O2 +% 5 CO2 gazı ile 5 dakika buz üzerinde köpürtün.
  2. Kültür ortamını hazırlayın. En az 2,5 mL / tabak gereklidir. 2 mL fetal sığır serumu, 25 μL L-glutamin (200 mM), 200 μL B27 (50x), 50 μL penisilin + streptomisin (10 K birim / mL ve 10 mg / mL) ekleyin 8 mL Nörobazal ortama.
  3. % 3 düşük erime sıcaklığına sahip agaroz jeli hazırlayın. 50 mL HBSS (+) gözenek ekleyin, ardından 1.5 mg düşük erime sıcaklığına sahip agaroz ekleyin ve otoklavlayın. Agarozu bir mikrodalga fırında eritin ve kullanmadan önce bir su banyosu inkübatöründe 50 °C'de tutun.
  4. Bir cam taban kabına 1.9 mL kültür ortamı ekleyin. Hava ampullerini filtrenin altına sıkıştırmamak için üzerine dikkatlice bir hücre kültürü eki koyun, ardından filtrenin üzerine 500 μL kültür ortamı ekleyin (Şekil 1B). Buzun üzerine yerleştirin.
  5. Manipüle edilen fareleri %5 izofluran soluyarak uyuşturduktan sonra, gözlenecek uygun aşamalarda servikal çıkık (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek) ile kurban edin.
    NOT: E14.5'te elektroporasyondan iki gün (48 saat) ve 3 gün sonra, sırasıyla çok kutuplu-bipolar geçişi ve hareket modunu gözlemlemek için uygundur.
  6. Embriyoları çıkarın ve soğuk PBS ile bir Petri kabına yerleştirin.
  7. Mikroskop altında GFP veya diğer floresan proteinlerin ekspresyonu ile embriyoları seçin.
  8. Embriyoların dekapitasyonundan sonra, beyinleri6 diseksiyon mikroskobu altında inceleyin ve soğuk HBSS'de (+) tutun.
  9. Erimiş% 3 düşük erime sıcaklığındaki agaroz jeli bir kriyokalıba dökün ( Malzeme Tablosuna bakın) ve ardından beyinleri içine koyun ve birkaç kez yuvarlayın. Agaroz tamamen katılaşana kadar oda sıcaklığına koyun ve ardından buzun üzerine koyun.
  10. Titreşimli bir mikrotom kullanarak beyinleri 350 μm kalınlığında koronal olarak dilimleyin (bkz. Malzeme Tablosu).
  11. Dilimleri filtrenin üzerine yerleştirin (filtre başına en fazla 6 dilim).
  12. Kültür ortamını filtre kabının içinden ve dışından çekin (toplamda 600 μL). Bu adımda, dilimler preslenir ve bir filtreye sabitlenir. 5 dakika sonra, hücre kültürü ekinin içine 100 μL kültür ortamı ekleyin.

3. Hızlandırılmış görüntüleme

  1. Z kaymasını önlemek için görüntülemeden en az 37 dakika önce odanın ısıtıcısını veya mikroskobu çevreleyen bir başlık kullanarak 30 °C'de ters çevrilmiş bir lazer tarama mikroskobu tablasına monte edilmiş kültür odasını tutun. Kültür odasına nemlendirilmiş %5CO 2 + %40O2 gazı sağlayın.
  2. Yukarıda hazırlanan dilimleri içeren kültür kabını kültür haznesine yerleştirin.
  3. Uzun çalışma mesafeli 20x lens (NA = 0,45) kullanarak, 24 saat boyunca her 15-30 dakikada bir 5 μm'lik adımlarla yaklaşık 10 Z yığını görüntüsü elde edin.
    NOT: Motorlu bir XY aşamasının kullanılması şiddetle tavsiye edilir. Bu, birden fazla objektif alandan görüntü elde etmemizi sağlar. Tipik olarak, bir hızlandırılmış deneyde farklı objektif alanlarından 10-20 görüntü elde ederiz.

4. Görüntüleme analizi

  1. ImageJ veya başka bir yazılım kullanarak Z ekseninin maksimum projeksiyonu ile XYZT görüntülerini XYT'ye dönüştürün.
    NOT: Gözlem sırasında dilimler kayarsa, Katı Gövde dönüşümü işlevine sahip bir ImageJ eklentisi olan StackRed'i kullanarak hücrelerin görüntülerdeki konumunu ayarlayın (bkz.
  2. GFP veya diğer floresan protein pozitif hücrelerin yörüngesini manuel veya otomatik olarak izleyin. Manuel ve otomatik izleme, sırasıyla MTrackJ24 ve TrackMate 25,26 (ImageJ eklentileri) kullanılarak gerçekleştirilebilir. TrackMate kullanarak otomatik izleme, birçok hücreyi tarafsız bir şekilde analiz etmek için etkilidir. Bununla birlikte, MTrackJ kullanarak manuel izleme, tek tek hücrelerin doğru şekilde izlenmesi için yararlı olmaya devam etmektedir.

Sonuçlar

Palyal VZ'deki radyal glial hücreler sadece E14'e kadar nöronlar üretir ve E15 ve E16'da hem nöronlar hem de glial hücreler üretir. Nöronların ve glial hücrelerin göç davranışlarını aynı anda gözlemlemek için, nörona özgü bir promotör, Tα1 promotörü27 ve insan glial fibriler asidik protein (hGFAP) promotörü28 kullanarak, bunları sırasıyla gelişmiş GFP (EGFP) ve RFP ile etiketledik. Astrosit ataları, göç sırasında hücre bölünmelerini tekrarlayarak hücrelerde plazmitin seyrelmesine yol açar. Bunu önlemek için, bir donör plazmidi (pPB) ve bir transpozaz ekspresyon vektöründen (pCAG-hyPBase) oluşan bir transpozon vektör sistemi kullanıldı29,30. Burada kullanılan donör plazmidi (pPB-CAG-LNL-RFP) loxP-neo-loxP (LNL) kasetine sahiptir ve Cre rekombinaza bağlı olarak RFP'yi eksprese eder. ICR fareleri (vahşi tip; WT), E15'te Şekil 2A'da belirtilen plazmitlerle elektroporasyona tabi tutuldu ve dilimler 3 gün sonra hazırlandı. Bu süre zarfında, EGFP + nöronlarının ilk kohortu kortikal plakanın yüzeyine ulaştı (Şekil 2B), ancak birçok EGFP + nöronu hala göç ediyordu. 24 saat boyunca hızlandırılmış gözlem yapıldı. Bu gözlem sırasında, kalın bir öncü sürece sahip nöronlar, kortikal plakada nispeten sabit bir oranda (19.54 ± 6.21 μm/s, ortalama ± standart sapma, 70 hücre) beyin yüzeyine doğru doğrusal olarak göç etti. Göç yörüngeleri, TrackMate yazılımı kullanılarak otomatik olarak izlendi (Şekil 2B'deki macenta çizgiler). Aynı objektif alanda, astrosit progenitörleri RFP ile görüntülendi (Şekil 2C). hGFAP promotörü geç embriyonik aşamalarda radyal glial hücrelerde de aktif olduğundan, bu radyal glialardan türetilen bazı nöronlar da RFP'yi eksprese eder (Şekil 2B, C'deki mavi oklar). Bu nöronlar hemen hemen her zaman bir EGFP ekspresyon vektörü ile transfekte edilir. Bu nedenle, astrosit progenitörleri RFP tek pozitif hücreler olarak tanımlandı.

Nöronların aksine, astrosit ataları, ara bölge ve kortikal plaka (düzensiz göç) içinde sık yön değişiklikleriyle hızlı ve rastgele göç eder5. Astrosit progenitörlerinin göçü, yüksek motilitelerini (88.37 ± 33.61 μm/s, 5 hücre) ortaya çıkaran MTrackJ yazılımı ( Şekil 2C'deki macenta çizgiler) ile manuel olarak izlendi. Astrosit progenitörleri ve kan damarları arasındaki ilişkiyi gözlemlemek için, endotel hücrelerinde bir RFP olan DsRed'i eksprese eden Flt1-DsRed fareleri kullanıldı. Bu deneyde, astrosit atalarının sadece EGFP tarafından tanımlanması gerekiyordu. Bu amaçla, hGFAP-Cre'ye bağlı EGFP ekspresyonunun bir Dcx promotörü (erken nörona özgü bir promotör) kullanılarak nöronlarda elimine edilebildiği rDIO sistemi5 geliştirilmiştir.31 başka bir DNA rekombinaz setinin ve tanıma dizisinin (Dre-rox) bağlı aktivasyonu (Şekil 2D, pPB-CAG-rDIO-EGFP dizisi Ek Dosya 1'de verilmiştir)32, 33. rDIO sistemi, in utero elektroporasyon ile E15'te Flt1-DsRed fareye tanıtıldı ve dilimler 24 saat sonra hazırlandı. Sonuç olarak, EGFP pozitif astrosit progenitörlerinin kan damarları boyunca aktif olarak göç ettiği gözlenmiştir (kan damarı güdümlü göç)5 (Şekil 2E).

figure-results-1
Şekil 1: In utero elektroporasyon ile işaretlenen hücrelerin hızlandırılmış gözlemlerinin akışı. (A) Uygun bir aşamada hamile bir fare uyuşturulur ve karın boşluğu kesilerek açılır. Ameliyat alanı steril plastik ve steril kağıt tabakalar ile kaplanır. Rahim boynuzları açığa çıkarılır ve embriyolara 1 μL plazmit karışımı enjekte edilir ve elektronik darbeler uygulanır. Karın duvarı ve cildi dikilir ve manipüle edilen fareler ev kafesine geri yerleştirilir. (B) Elektroporasyonlu beyinlerden hazırlanan dilimler, bir cam taban kabında hücre kültürü ekinin süzgecine (en fazla 6 dilim) yerleştirilir. Dilimler içeren cam taban tabakları bir kültür odasına monte edilir. Bu hızlandırılmış sistem, sıcaklığı 37 °C'de tutmak için tüm mikroskobu kaplayan bir akrilik başlığa sahiptir. Nemlendirilmiş karışık gazın sağlandığı kültür odası, davlumbazın içinde bir mikroskop aşaması ile donatılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Nöronların ve astrosit progenitörlerinin hızlandırılmış gözlemleri. (A) Nöronların (EGFP, yeşil) ve astrosit progenitörlerinin (RFP, kırmızı) diferansiyel etiketleme yöntemi ve hızlandırılmış görüntülemenin başlamasından 2 saat sonra elektroporasyondan 2 gün sonra hazırlanan bir dilimin temsili bir görüntüsü (sağda). (B,C) EGFP + (B) ve RFP + hücrelerinin (C) (A) - sağında gösterilen aynı objektif alan üzerinde 2 saat ila 21 saat arasında hızlandırılmış görüntüleri. (B) TrackMate yazılımı tarafından otomatik olarak algılanan EGFP+ göç eden hücrelerin yörüngeleri macenta olarak gösterildi. (C) RFP+ hücrelerinin yörüngeleri, MTrackJ yazılımı kullanılarak manuel olarak izlendi. Nöron olduğu düşünülen EGFP/RFP çift pozitif hücreler mavi oklarla gösterilir. (D) Flt1-DsRed fare embriyolarında rDIO sistemi kullanılarak astrosit progenitörlerinin etiketleme stratejisi. (E) Kan damarı güdümlü göçün temsili sonucu. Bir hücre (ok) önde gelen bir süreci (ok ucu) dışarı çıkardı ve DsRed eksprese eden kan damarı (macenta) boyunca piyal yüzeye doğru göç etti. CP; kortikal plaka. IZ; ara bölge. VZ; ventriküler bölge. Ölçek çubukları: 200 μm (A–C), 50 μm (E). Bu şekil Tabata H. ve ark.5'ten uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Nöronlar (katman II/III)Astrosit atalarırDIO sistemi
(astrosite özel etiketleme)
pCAG-EGFP0,5 μg/μLpPB-CAG-LNL-EGFP0,5 μg/μLpPB-CAG-rDIO-EGFP0,5 μg/μL
veya Ta1-EGFP (nöronlar için daha spesifik)0,5 μg/μLhGFAP-Cre0,75 μg/μLhGFAP-Cre0,75 μg/μL
pCAG-hyPBase0,5 μg/μLpDcx-Dre0,5 μg/μL
pCAG-hyPBase0,5 μg/μL

Tablo 1: Her hedef için plazmit karışımının temsili bileşenleri. EGFP vektörleri, eşdeğer RFP veya diğer floresan protein ekspresyon vektörleri ile değiştirilebilir. Astrosit progenitörlerini etiketlemek için bir transpozon vektör sistemi kullanılır. pPB vektörleri, genom entegrasyonu için PiggyBac transpozon vektörleridir. pCAG-hyPBase, bir PiggyBac transpozaz ekspresyon vektörüdür. LNL, Cre'ye bağımlı ifade için bir loxP-neo-loxP kasetidir. rDIO-EGFP, EGFP ekspresyonunun açma/kapama kasetine bağlı Cre-loxP ve Dre-roxP'dir. İstenen genlerin fonksiyon kazancı veya fonksiyon kaybı fenotipini gözlemlemek için, 1 μg/μL'de ekspresyon vektörleri veya devirme vektörleri eklenebilir. Bu vektörlerin konsantrasyonu her durumda ayarlanmalıdır.

Ek Dosya 1: Plazmid dizileri. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu protokol, pallial (kortikal) VZ'den türetilen hücrelerin hızlandırılmış gözlemi için bir yöntem tanıttı. VZ'den göç eden hücreleri etiketlemek için, tek tek hücrelerin viral vektör aracılı etiketlemeden daha yüksek bir sinyal-gürültü oranıyla açıkça etiketlendiği utero elektroporasyonda kullandık. Utero elektroporasyon kullanılarak, herhangi bir kombinasyondaki herhangi bir vektör türü, canlı embriyolardaki radyal glial hücrelere (nöral kök hücreler) kolayca sokulabilir. Nöronlar ve glial progenitörler, farklı promotörler kullanılarak seçici olarak etiketlenebilir. İn utero elektroporasyon ile sokulan plazmitlerin kopya sayısı yüksek olduğundan, GFP ekspresyon vektörlerinin ve ekspresyon vektörleri ve knockdown/knockout vektörleri gibi ilgilenilen genlerle ilgili çeşitli vektörlerin ko-elektroporasyonu ile fonksiyon kazancı ve fonksiyon kaybı çalışmaları kolayca gerçekleştirilebilir. Ayrıca, in utero elektroporasyon, plazmit vektörlerini kortikal VZ dışındaki çeşitli beyin bölgelerinin VZ'sine sokmak için kullanılabilir, bu da inhibitör nöronlar, oligodendrosit progenitörleri gibi diğer hücre tiplerinin ganglionik üstünlüklerden 34,35,36 ve hipokampal piramidal nöronlardan göçünü gözlemlememizi sağlar37.

Hızlandırılmış çalışmalarda, fonksiyon kazancı ve fonksiyon kaybı deneylerinin hücre davranışı üzerindeki etkileri TrackMate ve MTrackJ yazılımı kullanılarak değerlendirilebilir. Nörogelişimsel bozukluklardan ve zihinsel engellerden sorumlu olanlar da dahil olmak üzere birçok gen, nöronal göçte rol oynar. Hızlandırılmış çalışmalar, bu genlerin hücre davranışını nasıl düzenlediğini doğrudan ortaya çıkarabilir. Nöronal göç ile karşılaştırıldığında, glial hücre göçünün moleküler mekanizmaları iyi anlaşılmamıştır. Bu yöntem sadece glial hücrelerin normal gelişimini değil, aynı zamanda glial gelişimi etkileyebilecek genetik ve çevresel faktörleri ve bunun akıl hastalığı ile ilişkisini de ortaya çıkarabilir.

Bu yöntemin sınırlılığı, kaçınılmaz olarak in vitro dilim kültür yöntemine bağlı olmasıdır. İlginç bir şekilde, göç eden nöronlar, in vitro olarak yetiştirilen dilimlerde bile, beyin yüzeyine doğru göç için yönlü ipuçlarını kaybetmezler. Ancak, araştırmacılar eserler konusunda dikkatli olmalıdır. Yüzeye yakın hücreler filtreye tutturulur ve dilimlerin kenarları kolayca deforme olur. Bu hücreler analizden çıkarılmalıdır. Mümkünse kontrol deneyleri düşünülmelidir. Beyin dilimlerinin yaklaşık 24 saat içinde normal gelişimi özetlediğine dikkat etmek önemlidir. Bu nedenle, elektroporasyondan dilim hazırlamanın zamanlaması, analiz edilecek olayların bu zaman penceresinde meydana geleceği şekilde belirlenmelidir. Çok kutuplu-bipolar geçişi gözlemlemek için, elektroporasyondan 2 gün sonra dilimler hazırlanmalıdır. Hareket modunda göçü analiz etmek için 3 gün sonra uygundur. Kan damarı güdümlü göçün gözlemlenmesi, diğer deneylerden daha zor bir iştir. Endotel hücreleri, kan akışı olmadan dilimler halinde kolayca bozunur. Kan damarı bozulmasını en aza indirmek için, dilimler mümkün olduğunca çabuk hazırlanmalı ve% 20 serum ve% 40 O2 gazı içeren bir ortamda tutulmalıdır. Sabit beyinlerin histolojik analizleri veya iki foton mikroskobu kullanılarak in vivo canlı görüntüleme gibi diğer tamamlayıcı deneyler, dilim hızlandırılmış analizlerde bulunan gözlemleri güçlendirebilir.

Özetle, bu yöntem 24 saat boyunca hücre davranışını gözlemlemek için tek seçenektir. Yeni plazmit vektörlerinin geliştirilmesiyle, bu yöntemin uygulama yelpazesi gelecekte daha da genişleyecektir.

Açıklamalar

Yazarların herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Tα1 destekçisi, P. Barker ve F.D. Miller'ın hediyesidir. Dcx organizatörü, Q. Lu'nun bir hediyesidir. hGFAP-Cre, Albee Messing'in bir hediyesiydi. PiggyBac transpozon vektör sistemi Sanger Enstitüsü tarafından sağlandı. Flt1-DsRed fareleri M. Ema (Shiga Üniversitesi) tarafından sağlandı. Bu çalışma JSPS KAKENHI (H. Tabata'ya JP21K07309 numaralı hibe JP20H05688 ve K. Nakajima'ya JP22K19365) ve Takeda Bilim Vakfı, Keio Gijuku Fukuzawa Eğitim ve Araştırmanın İlerlemesi Anma Fonu, K. Nakajima'ya Keio Gijuku Akademik Gelişim Fonları tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Aspiratör borusu tertibatıDrummond2-040-000
Atipamezol (5 mg/mL)MeijiMepatia
AutoclipBecton Dickinson4276309 mm
B27 takviyesiGibco17504-044
Butorphanol (5 mg/mL)MeijiVetorphale
Hücre kültürü ekiMilliporePICM ORG 50
Konfokal mikroskopNikonA1RHD25Uzun çalışma mesafeli lens ile donatılmıştır (S Plan Fluor ELWD 20XC)
CryomoldTissue-Tek4566
Kültür odasıTokkenTK-NBCMPÖzel yapım
ElektroporatörNEPA GeneNEPA21
Hızlı YeşilSigma-AldrichF7258
Gaz karıştırıcıTokkenTK-MIGM01-02
Cam taban kabıIwaki3910-035Cam taban çapı 27 mm'dir
Cam kılcal damarlarNarishigeGD-1
HBS (2x)Sigma-Aldrich51558
HBSS(-)Wako084-08345
Isıtıcı ÜnitesiTokkenTK-0003HU20Davlumbaz ve ısıtıcı dahil özel yapım
hGFAP-CreAddgene#40591Albee Messing'den bir hediye
ImageJhttps://imagej.net/ij/
L-glutamin (200 mM)Gibco25030
Düşük erime sıcaklığında agarozLonza50100
Medetomidin (1 mg/mL)MeijiMedetomin
MikroenjektörNarishigeIM-300
Midazolam (5 mg / mL)SandozMidazolam
MTrackJhttps://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/
Nörobazal ortamGibco21103-049
pCAG-hyPBasepCMV-hyPBase'den (Sanger Enstitüsü'nden bir hediye) hyPBase cDNA'sı, pCAGGS'nin (J. Miyazaki'den bir hediye) CAG promotörünün, aşağı akışına yerleştirildi.
pDcx-DreDcx4kbEGFP70'ten (Q. Lu'dan bir hediye) Dcx promotörü, pCAG-NLS-HA-Dre34'ün CAG promotörü (Pawel Pelczar, Addgene #51272'den bir hediye) ile değiştirildi.
Penisilin + StreptomisinGibco15140122
Plazmid saflaştırma kitiInvitrogenPureLink HiPure plazmid midiprep kiti (K210005)
pPB-CAG-LNL-RFPCAG-LNL kaseti pCALNL-DsRed'den (Connie Cepko, Addgene #13769'dan bir hediye) ve TurboRFP cDNA (Evrogen, FP232) pPB-CAG.EBNXN'nin (Sanger Enstitüsü'nden bir hediye) klonlama alanına yerleştirildi.
pPB-CAG-rDIO-EGFPTers yönde pEGFP-N1'den (Clontech, U55762) sentetik rox bölgeleri, sentetik DIO kaseti ve EGFP cDNA içeren dizi  pPB-CAG.EBNXN'nin (Sanger Enstitüsü'nden bir hediye) klonlama bölgesine yerleştirildi. Sıra, Ek Dosyada verilmiştir.
ÇektirmeNarishigePN-31
StackRedhttp://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/
Sütür iğnesiNazmeC-24-521-R No.11/2 daire, uzunluk 14 mm
Sütür ipliğiNazmeC-23-B2İpek, boyut 5-0
Zamanlanmış hamile ICR (vahşi tip) farelerJaponya SLCICR fare
TrackMatehttps://imagej.net/plugins/trackmate/index
Cımbız tipi elektrotBEX veya NEPA GeneCUY650P5 
T & alfa; pEGFP-N1'denEGFP cDNA, T & alfa'nın aşağı akışına yerleştirildi; Plazmid 253'te 1 promotör (P. Barker ve F.D.Miller'dan bir hediye)
Titreşimli mikrotomLeica veya ZeissTitreşimli bıçak mikrotomu VT1000S veya Hyrax V50.
, ImageJ için bir eklenti (Clontech, U55762) 1-EGFP

Kaynaklar

  1. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32 (1), 149-184 (2009).
  2. Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7 (2), 136-144 (2004).
  3. Haubensak, W., Attardo, A., Denk, W., Huttner, W. B. Neurons arise in the basal neuroepithelium of the early mammalian telencephalon: A major site of neurogenesis. P Natl Acad Sci USA. 101 (9), 3196-3201 (2004).
  4. Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).
  5. Tabata, H., et al. Erratic and blood vessel-guided migration of astrocyte progenitors in the cerebral cortex. Nat Commun. 13 (1), 6571(2022).
  6. Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar Migration: The third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 23 (31), 9996-10001 (2003).
  7. Tabata, H., Kanatani, S., Nakajima, K. Differences of migratory behavior between direct progeny of apical progenitors and basal progenitors in the developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19 (9), 2092-2105 (2009).
  8. Rakic, P. Mode of cell migration to the superficial layers of fetal monkey neocortex. J Comp Neurol. 145 (1), 61-83 (1972).
  9. Sekine, K., Honda, T., Kawauchi, T., Kubo, K., Nakajima, K. The outermost region of the developing cortical plate is crucial for both the switch of the radial migration mode and the Dab1-dependent "inside-out" lamination in the neocortex. J Neurosci. 31 (25), 9426-9439 (2011).
  10. Shin, M., et al. Both excitatory and inhibitory neurons transiently form clusters at the outermost region of the developing mammalian cerebral neocortex. J Comp Neurol. 527 (10), 1577-1597 (2019).
  11. Sekine, K., et al. Reelin controls neuronal positioning by promoting cell-matrix adhesion via inside-out activation of integrin α5β1. Neuron. 76 (2), 353-369 (2012).
  12. Morimoto, K., Tabata, H., Takahashi, R., Nakajima, K. Interactions between neural cells and blood vessels in central nervous system development. BioEssays. 230091, (2023).
  13. Tabata, H., Nagata, K. Decoding the molecular mechanisms of neuronal migration using in utero electroporation. Med Mol Morphol. 49 (2), 63-75 (2016).
  14. Ishii, K., Kubo, K., Nakajima, K. Reelin and neuropsychiatric disorders. Front Cell Neurosci. 10, 229(2016).
  15. Bosworth, A. P., Allen, N. J. The diverse actions of astrocytes during synaptic development. Curr Opin Neurobiol. 47, 38-43 (2017).
  16. Tabata, H. Crosstalk between blood vessels and glia during the central nervous system development. Life. 12 (11), 1761(2022).
  17. Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. Time-lapse confocal imaging of migrating neurons in organotypic slice culture of embryonic mouse brain using in utero electroporation. J Vis Exp. (125), e55886(2017).
  18. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient Gene Transfer into the Embryonic Mouse Brain Using in Vivo Electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
  19. Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Dev Growth Differ. 50 (6), 507-511 (2008).
  20. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  21. Fukuchi-Shimogori, T. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).
  22. Matsumoto, K., et al. Study of normal and pathological blood vessel morphogenesis in Flt1-tdsRed BAC Tg mice. Genesis. 50 (7), 561-571 (2012).
  23. Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice. Exp Anim. 60 (5), 481-487 (2011).
  24. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
  25. Ershov, D., et al. TrackMate 7: Integrating state-of-the-art segmentation algorithms into tracking pipelines. Nat Methods. 19 (7), 829-832 (2022).
  26. Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  27. Gloster, A., et al. The T alpha 1 alpha-tubulin promoter specifies gene expression as a function of neuronal growth and regeneration in transgenic mice. J Neurosci. 14 (12), 7319-7330 (1994).
  28. Zhuo, L., et al. hGFAP-cre transgenic mice for manipulation of glial and neuronal function in vivo. Genesis. 31 (2), 85-94 (2001).
  29. Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. P Natl Acad Sci USA. 108 (4), 1531-1536 (2011).
  30. Chen, F., LoTurco, J. A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition. J Neurosci Meth. 207 (2), 172-180 (2012).
  31. Wang, X., Qiu, R., Tsark, W., Lu, Q. Rapid promoter analysis in developing mouse brain and genetic labeling of young neurons by doublecortin-DsRed-express. J Neurosci Res. 85 (16), 3567-3573 (2007).
  32. Sauer, B. DNA recombination with a heterospecific Cre homolog identified from comparison of the pac-c1 regions of P1-related phages. Nucleic Acids Res. 32 (20), 6086-6095 (2004).
  33. Hermann, M., et al. Binary recombinase systems for high-resolution conditional mutagenesis. Nucleic Acids Res. 42 (6), 3894-3907 (2014).
  34. Kanatani, S., et al. The COUP-TFII/Neuropilin-2 is a molecular switch steering diencephalon-derived GABAergic neurons in the developing mouse brain. P Natl Acad Sci USA. 112 (36), E4985-E4994 (2015).
  35. Yozu, M., Tabata, H., Nakajima, K. The caudal migratory stream: A novel migratory stream of interneurons derived from the caudal ganglionic eminence in the developing mouse forebrain. J Neurosci. 25 (31), 7268-7277 (2005).
  36. Kanatani, S., Yozu, M., Tabata, H., Nakajima, K. COUP-TFII is preferentially expressed in the caudal ganglionic eminence and is involved in the caudal migratory stream. J Neurosci. 28 (50), 13582-13591 (2008).
  37. Kitazawa, A., et al. Hippocampal pyramidal neurons switch from a multipolar migration mode to a novel "climbing" migration mode during development. J Neurosci. 34 (4), 1115-1126 (2014).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Utero ElektroporasyonFloresan Protein EtiketlemeBeyin Dilimi K lt rN ronal MigrasyonAstrosit Progenit rleriGen Susturma

İlgili makaleler