Yöntem makalesi

Boyut ve Desen Esnekliği ile Standart Altı Kuyulu Plakalarda Vasküler Geçirgenliğin Modellenmesi için Yüksek Verimli Biyobaskı Yöntemi

DOI:

10.3791/66676

⸱

16 Ağustos 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Convergence Biosystems Engineering, College of Agriculture and Life Sciences (CALS), Chonnam National University, 2Interdisciplinary Program in IT-Bio Convergence System, Chonnam National University, 3Advanced Bio and Healthcare Materials Research Division, Korea Institute of Materials Science (KIMS), 4Advanced Materials Engineering, Korea National University of Science and Technology (UST)

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plaka üzerinde damar (VOP) olarak adlandırılan 3D biyobaskı teknolojisini kullanarak standart altı oyuklu bir plaka üzerinde esnek boyutlara ve istenen desenlere sahip vasküler kanalların yüksek verimli üretimi için bir protokol sunuyoruz. Bu platform, riskli endotel ile ilişkili bozukluklar için terapötiklerin geliştirilmesini ilerletme potansiyeline sahiptir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vasküler geçirgenlik, koroner arterlerdeki endotel disfonksiyonu ve kan-beyin bariyerinin bozulmuş fonksiyonu gibi bozulmuş endotel ile ilişkili bozukluklar için tedavilerin geliştirilmesinde anahtar bir faktördür. Mevcut üretim teknikleri, insan vücudundaki vasküler ağlardaki geometrik varyasyonu yeterince kopyalamamaktadır ve bu da hastalığın ilerlemesini önemli ölçüde etkilemektedir; Ayrıca, bu teknikler genellikle farmakolojik testler için gerekli olan yüksek verimli üretimi engelleyen çok adımlı üretim prosedürlerini içerir. Bu makale, biyo-baskı teknolojisindeki mevcut çözünürlük ve üretkenlik zorluklarının üstesinden gelerek, doğrudan standart altı oyuklu plakalar üzerinde istenen desen ve boyutlara sahip çoklu vasküler dokular oluşturmak için bir biyo-baskı protokolü sunmaktadır. Bir hidrojel içinde altı içi boş, perfüze edilebilir kanal oluşturmak için basitleştirilmiş bir üretim yaklaşımı oluşturuldu ve bunlar daha sonra fonksiyonel ve olgun bir endotel oluşturmak için insan göbek veni endotel hücreleri ile kaplandı. 3D biyobaskının bilgisayar kontrollü doğası, yüksek tekrarlanabilirlik sağlar ve geleneksel yöntemlere göre daha az manuel üretim adımı gerektirir. Bu, VOP'un vasküler geçirgenliği modellemek ve ilaç keşfini ilerletmek için verimli, yüksek verimli bir platform olarak potansiyelini vurgulamaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan vücudundaki vasküler ağ, kan ve çevre dokular arasındaki molekül ve hücre alışverişini dinamik olarak düzenleyerek çok önemli bir taşıma bariyeri olarak işlev görür. Bu düzenleme, doku ödemini önlemek ve seçici besin ve hücre alışverişini sağlamak, böylece doku metabolizmasını ve homeostazı desteklemek için gereklidir1. Birçok sağlık durumunda bir faktör olan değişmiş endotel geçirgenliği, hem hastalık şiddetini hem de tedavi etkinliğini etkiler2. Vasküler endotel, damarlar, dokular ve organlar arasındaki transferi kolaylaştıran seçici bir bariyer görevi görür. Bu düzenleme, çözünen maddelerin ve küçük moleküllerin temel filtrelenmesi, vasküler bariyerin kasıtlı olarak bozulması ve prostaglandinler ve büyüme faktörleri gibi moleküllerin geçirgenlik seviyeleri üzerindeki etkisi gibi çeşitli mekanizmaları içerir3.

Bu düzenlemedeki anahtar faktörler arasında endotel hücre bağlantıları, lökositlerin göçü ve kan-beyin bariyerininişlevselliği 4 yer alır. Karmaşıklığı göz önüne alındığında, süreç, çeşitli kan damarı tiplerini içeren ve farklı anatomik yollar kullanan farklı ortamlara göre değişir. Vasküler geçirgenliğin biyolojik temellerini anlamak, anormal vasküler geçirgenlik ile ilişkili durumları tedavi etmek için terapötik yaklaşımlar geliştirmek için çok önemlidir. Vasküler geçirgenliğin korunması, vasküler sistemin ve çevre dokuların sağlığı için çok önemlidir; Sonuç olarak, bu fonksiyonun bozulması, endotelin normal işlevselliğini kaybettiği bir durum olan endotel disfonksiyonuna yol açar.

Endotel disfonksiyonu, hipertansiyon, koroner arter hastalığı, diyabet ve kanser dahil olmak üzere birçok yaygın insan hastalığının öncüsüdür 5,6,7. Bu durum, azalmış vazodilatasyon, artmış damar geçirgenliği ve proinflamatuar bir duruma eğilim dahil olmak üzere çeşitli şekillerde ortaya çıkabilir. Bu patolojik durum, Amerika Birleşik Devletleri'nde önde gelen mortalite nedenleri olmaya devam eden koroner arter hastalığı, felç ve periferik arter hastalığı8 gibi birkaç kritik kardiyovasküler sorunun en erken aşamasıdır1. Endotel disfonksiyonu, kardiyovasküler sağlığın yanı sıra kan-beyin bariyerini (BBB) etkiler ve çeşitli nörolojik bozuklukların ilerlemesinde önemli bir rol oynar. Disfonksiyon, BBB geçirgenliğini artırabilir, böylece toksinlerin, patojenlerin ve bağışıklık hücrelerinin merkezi sinir sistemine sızmasına izin verir ve inme, Alzheimer hastalığı, multipl skleroz ve beyin enfeksiyonları gibi nörolojik bozukluklara katkıda bulunur9.

Diyabette endotel disfonksiyonu, endotelin vasküler tonusu düzenleme ve nitrik oksit gibi vazodilatör mediatörler üretme yeteneğinin bozulması ile işaretlenir ve bu da vazodilatasyonun bozulmasına yol açar10. Bu durum, protein kinaz C aktivasyonu ve oksidatif stres gibi hipergliseminin neden olduğu yollarla daha da kötüleşir ve diyabetik vasküler hastalığın ilerlemesine önemli ölçüde katkıda bulunur11. Ayrıca, enflamatuar bir ortamın tümör hücresinin beyin mikrovasküler endotel hücrelerine yapışmasını arttırdığı bulunurken, sızdıran bir endotelin kanser metastazında önemli bir faktör olduğu bildirilmiştir12,13. Kan damarlarının geometrisinin beyin kanseri metastazını doğrudan etkilediği bulunmuştur. Tümör hücreleri tercihen daha büyük kan damarı eğriliği olan bölgelerebağlanır 7. Bu bulgu kanser metastazında vasküler geometrinin önemini vurgulamaktadır. Daha da önemlisi, fibrozis ve kanser gibi durumlarda, bozulmuş endotel bariyer fonksiyonu sadece hastalık gelişiminde rol oynamakla kalmaz, aynı zamanda yeterli ilaç dağıtımını engelleyerek tedavi etkinliğini de engeller14. Vasküler geçirgenlik üzerine yapılan araştırmalar, kardiyovasküler hastalık tedavisini ilerletmek ve vasküler fonksiyonun bozulmasını içeren diğer hastalıkların yönetimine ilişkin içgörüler sunmak için çok önemlidir.

Vasküler geçirgenliğin sağlık ve hastalıktaki kritik rolü göz önüne alındığında, önemli araştırmalar, geleneksel 2D ve 3D in vitro test platformlarının yanı sıra hayvan modelleri kullanarak terapötik gelişim için endotel bariyerinin seçici doğasını incelemeye odaklanmıştır. Bununla birlikte, hayvan modellerinin, türe özgü farklılıklar ve etik sorunların yanı sıra yüksek maliyetler nedeniyle sınırlamaları vardır15,16. Örneğin, Pfizer, 2004 yılında, son 10 yılda, hayvan modellerinde umut verici etkiler gösteren ilaç geliştirmelerine 2 milyar doların üzerinde harcama yaptığını, ancak sonunda gelişmiş insan testi aşamalarındabaşarısız olduğunu belirtti 17. Ayrıca, geleneksel 2B modeller, üç boyutlu (3B) mimariyi ve vasküler kanalların karmaşık geometrik yapısını doğru bir şekilde taklit etmez.

Biyofabrikasyon teknolojilerindeki gelişmelerle birlikte, 3D mimariyi özetlerken vasküler kanalların üretilmesi için kapsamlı çabalar sarf edilmiştir. Mikro ölçekli vasküler kanallar, yumuşak litografi kullanılarak mikroakışkan çipler içinde etkili bir şekilde üretilebilir, böylece gerçek zamanlı analiz avantajı sunar18,19. İstenilen çapa20,21 sahip bağımsız boru şeklinde yapılar oluşturmak için hidrojel döküm veya hücre tabakalarının bir kalıp veya mandrel etrafına sarılması gibi alternatif yöntemler kullanılabilir. Ancak bu yöntemlerin sınırlamaları vardır; Örneğin, mikroakışkan çipler, mikrokanal konfigürasyonlarıyla sınırlıdır ve bir kalıbın etrafındaki hidrojel dökümü, birden fazla geometriyi etkili bir şekilde kopyalamaz.

3D biyo-baskı teknolojisinin22 ortaya çıkmasıyla birlikte, çeşitli hücre dışı matris (ECM) bazlı hidrojel malzemeleri hassas bir şekilde biriktirerek karmaşık geometrileri çoğaltmak mümkün hale geldi23,24. Koaksiyel ve üç eksenli25,26 gibi eşmerkezli olarak düzenlenmiş nozullar kullananlar gibi bazı biyo-baskı yöntemleri, çatallı tüpler oluşturamaz; Bununla birlikte, kurban desenleme yöntemleri ile karmaşık yapılar elde edilebilir27. Bu biyo-baskı yöntemlerinin hiçbirinin, ilaç keşfinde farmakolojik araştırmalar için çok önemli bir gereklilik olan yüksek verimli in vitro modellemeyi mümkün kıldığı gösterilmemiştir. Burada, boyutlar üzerinde etkin kontrol ile endotelyalize vasküler kanalların verimli bir şekilde üretilmesi için bir yöntem sunuyoruz.

Ticari olarak temin edilebilen altı oyuklu plakaları, bir biyoyazıcının bir ECM hidrojeli içinde istenen boyut ve desenlerde vasküler kanallar ürettiği kurban modelleme yöntemiyle birleştirerek basit bir yaklaşım oluşturduk. İnsan göbek damarı endotel hücreleri (HUVEC'ler), bu kanalları endotelyalize etmek ve bir geçirgenlik testi ile endotelin işlevselliğini değerlendirmek için tohumlandı. Bu tasarım, kanalın her iki tarafında medya rezervuarları oluşturarak pompasız perfüzyonu mümkün kılar ve dinamik kültürü taklit etmek için yaygın olarak kullanılan bir 2D rocker yardımıyla yerçekimi güdümlü akışı kullanır. Bu yaklaşım, peristaltik pompalara olan ihtiyacı ortadan kaldırır ve yüksek verimli uygulamalar için bu platformun ölçeklenebilirliğini kolaylaştırır. 3D biyo-baskı teknolojisinin bilgisayar kontrollü doğası, üretim sürecini de kolaylaştırarak üretim sırasında hata olasılığını azaltır. VOP modeli, ilaç keşfinde farmakolojik testler için değerli bir araç olarak umut vaat etmektedir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Biyoyazıcı için G kodunun oluşturulması

  1. Yazdırma yolunu oluşturmak ve görselleştirmek için çevrimiçi bir G kodu simülasyon aracını (ör. NCviewer) ziyaret edin.
  2. Tıkla Yeni dosya Yeni bir G kodu dosyası oluşturmak için arayüzdeki simge.
  3. Kurban kanalı ve silikon odası için G kodu komutlarını manuel olarak yazarak bir yazdırma yolu oluşturun. Geometriyi oluşturmak için referans olarak standart altı kuyulu bir plakanın boyutlarını kullanın.
    NOT: Burada kullanılan G kodu, Bilgisayarlı Sayısal Kontrol (CNC) kodunu temel alır. Her komutun işlevleri Ek Tablo S1'de verilmiştir. Altı kuyulu plaka formatı, ticari mikroplaka okuyucular ve mikroskopi kurulumları ile uyumluluğu ve endotel olgunlaşmasını desteklemek için yeterli hacimde ortamı barındırması ve böylece sık sık ortam değişikliği ihtiyacını en aza indirmesi nedeniyle seçilmiştir. Bu üretim protokolü, diğer standart kuyu plakaları ile kullanım için de uyarlanabilir.
  4. G kodu tamamlandıktan sonra, .nc uzantılı dosyayı indirmek için arayüzdeki Dosyayı Kaydet simgesine tıklayın.
    NOT: Yazdırma yollarını oluşturmak için mevcut başka herhangi bir G kodu oluşturma algoritması kullanılabilir. Vasküler kanalın geometrisi bu G kodunda manipüle edilebilir.

2. Kurban ve silikon hazne mürekkeplerinin hazırlanması

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm materyaller için kaynaklar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

  1. SE1700 ve polidimetilsiloksan (PDMS) olmak üzere iki tür silikon polimerini 10:2 oranında birleştirin. Her polimerin sertleştirici maddesini 10:1 oranında, polimeri sertleştirici maddeye ekleyin.
  2. Polimer karışımını 2.000 rpm'de iyice karıştırmak ve gazını almak için bir planet karıştırıcı kullanın.
  3. Bir spatula ile karışık silikon polimeri 10 mL'lik tek kullanımlık bir şırıngaya aktarın. Düzgün bir tutarlılık sağlamak ve baskı sırasında kabarcıkları önlemek için yüklü şırıngayı 400 × g'da 5 °C'de 3 dakika santrifüjleyin.
    NOT: Hazne mürekkebi, optimum baskı kalitesini sağlamak için kürleme maddelerinin eklenmesinden sonraki 2 saat içinde kullanılmalıdır. Baskıya hazırlanırken şırıngayı 5 °C'de saklayın. Bu işlem, mürekkebin yavaş kürlenmesine yardımcı olur, aksi takdirde baskı parametrelerini değiştirebilir.
  4. Damıtılmış suda @ (a/h) PF127 stok çözeltisi hazırlamak için Pluronic F-127'yi (PF127) tartın.
  5. Homojenlik elde etmek için PF127 çözeltisini planet mikserde 400 × g'da 3 dakika karıştırın. PF127'nin tamamen çözünmesi için homojenize karışımı 4 °C'de tutun.
  6. Dulbecco'nun fosfat tamponlu salininde (DPBS) 1.000 birim / mL'lik bir trombin stok çözeltisi hazırlayın.
    NOT: Tekrarlanan donma-çözülme döngülerini önlemek için trombin stok solüsyonunu 100 μL'lik alikotlarda saklayın. Alikotlar -20 ° C'de 6 aydan fazla saklanmamalıdır.
  7. Yazdırmadan önce, trombini PF127 ile 1:10 seyreltmede PF127 için 6 (a/h) ve trombin için 100 birim/mL'lik bir nihai çalışma konsantrasyonuna karıştırarak kurban mürekkebi hazırlayın. 1 mL kurban mürekkebi hazırlamak için, 100 μL trombin stok çözeltisini 900 μL PF127 stok çözeltisi ile karıştırın.
    NOT: Kurban mürekkebini tek bir klişe basmak için hazırlarken, toplam 1 mL'lik bir hacim fazlasıyla yeterlidir.

3. İmalat süreci

  1. Üretim işlemine başlamadan önce, altı oyuklu bir plakayı 1 dakika boyunca 100 watt gücünde oksijen (O2) plazması ile işlemden geçirin.
  2. Hem kurban hem de silikon mürekkepleri hazırlamak için bölüm 2'de özetlenen prosedürü izleyin, mürekkeplerin kabarcık içermediğinden ve tutarlı baskı için homojen bir şekilde karıştırıldığından emin olun. Mürekkepleri biyoyazıcının yazıcı kafasına dikkatlice yerleştirin. Biyoyazıcının kafasının sıcaklığını kurban mürekkebi için 37 °C'ye ve silikon mürekkep için 5 °C'ye ayarlayın.
  3. Silikon şırıngaya 22 G çift vidalı dişli konik bir nozul takın. Kurban mürekkebi için, istenen kanal çapına göre nozul boyutunu seçin.
    NOT: Burada, üç boyutta nozul gösterdik: 18 G, 20 G ve 22 G. Baskı basıncı ve yazıcı kafası hızı dahil olmak üzere optimum baskı parametreleri Tablo 1'de özetlenmiştir.
  4. İstenen G kodunu yükleyin ve biyoyazıcının yazılım arayüzündeki servo hazır fonksiyonuna 3 saniye boyunca basın. Kalıbı G kodunun başlangıç noktasındaki sahneye yerleştirin ve yazdırma işlemini başlatmak için başlat'a tıklayın.
    NOT: Tipik olarak, altı hazne içeren bir plakanın imalatı yaklaşık 1 saat ve 10 dakika gerektirir. G kodunun yüklenmesini ve yürütülmesini içeren Adım 3.4, kullanılan spesifik biyoyazıcıya bağlı olarak değişebilir. Kontaminasyonu önlemek için biyoyazıcıyı kullanırken steril koşulların korunduğundan emin olun.
  5. Plakanın üzerine bir kapak yerleştirin ve silikon odalarını sertleştirmek için plakayı 72 saat boyunca 37 ° C'de nemlendirilmiş bir CO2 inkübatöre aktarın.
    NOT: Silikon kürleme inkübatörün içinde daha yavaş bir hızda gerçekleşebilse de, plaka kuru bir fırının içine yerleştirilmemelidir.

4. Hidrojel hazırlama ve kanal gömme

  1. 20 mL 1x PBS içeren 50 mL'lik bir konik tüp hazırlayın. % 0.05 (a / h) LAP çözeltisi yapmak için 0.01 g lityum fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinat (LAP) konik tüpe yerleştirin. Toz tamamen eriyene kadar girdaplayın.
    NOT: Işığa maruz kalmayı önlemek için konik boruyu folyoya sarın. LAP stok çözeltisini 4 °C'de saklayın.
  2. GelMA ve %1 fibrinojen (GelFib olarak adlandırılır) nihai konsantrasyonunu elde etmek için 20 mL LAP çözeltisine 3 g jelatin metakrilat (GelMA) ve 0.2 g fibrinojen ekleyin. Karışımı 37 ° C'lik bir su banyosuna koyun ve çözelti tamamen eriyene kadar periyodik olarak karıştırın.
  3. Bölüm 3'te belirtildiği gibi imalattan sonra, kurban desenini gömmek için her bir hidrojel odasına 300 μL önceden ısıtılmış GelFib ekleyin. GelMA'yı 120 s boyunca 85 mW/cm2 yoğunlukta 405 nm dalga boyunda ultraviyole (UV) ışıkla hızla çapraz bağlayın. Bu işlemi diğer tüm kuyucuklar için tekrarlayın.
    NOT: Fibrinojen, trombin içeren kurban paterni ile temas ettiğinde hızla çapraz bağlanır. GelMA'nın oda sıcaklığında istenmeyen jelleşmesini önlemek için hidrojel eklemenizi ve her kuyucuk için ayrı ayrı UV çapraz bağlama yapmanızı öneririz. Ek olarak, UV kürleme işlemi sırasında kontaminasyonu önlemek için steril koşullar korunmalıdır.
  4. Her oyukta vasküler kanalın her iki tarafına 1 mL DPBS ekleyin ve PF127'yi sıvılaştırmak için plakayı 15 dakika boyunca 4 ° C'de tutun.
  5. 15 dakika sonra DPBS'yi emdirin ve PF4.5'nin tamamen yıkanması için adım 3 127x'i tekrarlayın.
  6. Hücreleri kanallara sokmadan önce, hücre bağlanmasını arttırmak için kanallardan 30 dakika boyunca %1 Matrigel içeren DMEM F12'yi perfüze edin.

5. HUVEC kültürü

  1. Endotel hücre büyüme ortamını (EKGM) 37 ° C'lik bir su banyosunda 30 dakika önceden ısıtın.
  2. Bu arada, nitrojen tankından bir şişe dondurularak saklanmış HUVEC alın, şişenin kapağını nazikçe gevşetin ve ardından dişlerden nitrojeni serbest bırakmak için yeniden sıkın. Şişeyi 37 ° C'lik bir su banyosunda 2 dakika bekleterek hücreleri hemen çözün ve şişenin içinde az miktarda buz kalmasını sağlayın. Kontaminasyonu önlemek için şişeyi% 70 etanol ile durulayın.
    NOT: Nitrojen tankından hücreleri alırken koruyucu gözlük takın. Bu işlem sırasında şişenin kapağı su seviyesinin üzerinde tutulmalıdır.
  3. 5 mL önceden ısıtılmış EKGM içeren 15 mL'lik bir konik tüp hazırlayın. Bir mikropipet ile, çözülmüş hücreleri flakondan konik tüpe dikkatlice aktarın. Geride hiçbir hücre kalmadığından emin olmak için, kriyoviyal için 1 mL taze önceden ısıtılmış ortam ekleyin, içini durulayın ve kalan hücreleri konik tüpe aktarın.
  4. Bir hücre peleti elde etmek için konik tüpü 200 × g'da 3 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın, hücreleri 10 mL taze ortamda yeniden süspanse edin, hücreleri bir T75 şişesine aktarın ve şişeyi 37 °C nemlendirilmiş bir CO2 inkübatörüne yerleştirin.
    NOT: Bu adım, kriyoviyaldeki dondurma ortamında bulunan dimetil sülfoksitin santrifüjleme yoluyla uzaklaştırılması için önemlidir.
  5. Hücreler% 80-90 birleşmeye ulaşana kadar ortamı her gün yenileyin.

6. Kanalların endotelizasyonu

  1. EKGM, DPBS, tripsin nötralize edici solüsyon ve tripsin etilendiamintetraasetik asidi (TE) 37 ° C'lik bir su banyosunda 30 dakika önceden ısıtın.
  2. % 90 birleşmede, hücreleri 10 mL DPBS ile bir T75 şişesinde durulayın, şişeye 1 mL %0.25 TE ekleyin ve 3 dakika inkübe edin.
  3. Şişenin kenarlarına hafifçe vurun ve TE'yi nötralize etmek için 5 mL tripsin nötralize edici çözelti ekleyin. Hücreleri 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Kalan hücreleri toplamak ve bunları konik tüpe eklemek için 5 mL taze EKGM kullanın.
  4. Hücre peletini toplamak için konik tüpü 250 × g'da 3 dakika santrifüjleyin.
  5. Süpernatanı atın ve hücre peletini 1 mL taze EKGM'de yeniden süspanse edin. Hücreleri bir hemositometre ile sayın ve bir hücre peleti elde etmek için Adım 6.4'ü tekrarlayın. 90 μL taze EKGM'de 3 milyon hücreyi yeniden süspanse edin.
  6. Hücre süspansiyonunu kanala sokmadan önce, lümeni temizlemek için kanalı kısa bir süre vakumla emin.
    NOT: Bütünlüğüne zarar vermemek için kanalın uzun süre emilmesinden kaçının.
  7. Kanalı, kuyu başına 0,5 milyon hücre tohumlama yoğunluğunda bir hücre süspansiyonu ile yavaşça yükleyin. Kanalı doldurmak için bu süspansiyondan ~ 15 μL eklemek için bir mikropipet kullanın.
    NOT: Tohumlama yoğunluğu kanalın büyüklüğüne göre değişiklik gösterebilir. Bu yoğunluk, 20 G nozul ve yaklaşık 900 μm iç çap ile basılmış bir kanal için optimize edilmiştir.
  8. Plakayı 2 saat boyunca inkübatörün içine düz bir şekilde yerleştirin. Ardından, plakayı 180°'ye ters çevirin ve sonraki 2 saat boyunca düz bir konumda tutun.
  9. 4 saat sonra, yapışmayan ve ölü hücreleri çıkarmak için kanalı DPBS ile yıkayın. Her oyuğa 2 mL taze EKGM ekleyin (kanalın her iki tarafına 1 mL). Plakayı, kanallar sallanma yönüne paralel olacak şekilde külbütör üzerine yerleştirerek 10° eğim açısında ve 5 rpm'de bir külbütör üzerinde dinamik kültürü başlatın. Büyüme ortamını her gün yenileyin.
    NOT: Dinamik kültür, rezervuarlar ve kanallar arasındaki ortam alışverişini artırır ve hücrelerin gece boyunca çoğalmasına yardımcı olur.

7. Endotel olgunlaşma değerlendirmesi

  1. EKGM ve DPBS'yi 37 °C su banyosunda 30 dakika ve Hücre Sayma Kiti-8 (CCK8) reaktifini oda sıcaklığında önceden ısıtın.
  2. Her kuyucuk için 100 μL CCK8 reaktifini 1 mL taze EKGM ile karıştırarak çalışan bir CCK8 çözeltisi yapın. Bir plaka / 6 kanalı için çalışırken, 6 μL CCK8 reaktifini 6 mL taze EKGM ile birleştirerek hazırlayın.
  3. Büyüme ortamını emerek çıkarın ve kanalları DPBS ile durulayın. Her oyuğa 1 mL CCK8 çalışma solüsyonu ekleyin ve plakanın inkübatörün içinde 30 dakika boyunca düz kalmasına izin verin. Daha sonra, dinamik kültürü adım 6.9'da açıklandığı gibi bir rocker'da başlatın ve bu işleme sonraki 3 saat boyunca devam edin.
  4. 3 saat sonra, plakayı bir tarafa eğerek içeriği her bir kuyucuktan çıkarın ve bunları yeni bir altı kuyulu plakaya aktarın. Kanalları DPBS ile durulayın ve taze ortam ekleyin.
    NOT: Absorbans ölçümüne kadar plakayı alüminyum folyo ile örtün. Tek tip okumalar sağlamak için tüm kuyucuklarda tutarlı bir reaktif hacmini koruyun. Pipetleme sırasında, optik yoğunluk okumalarının doğruluğunu bozabilecek hava kabarcıkları oluşturmaktan dikkatli bir şekilde kaçının.
  5. Renklerin eşit şekilde karışmasını sağlamak için plakayı 15 saniye boyunca hafifçe salladıktan sonra, 450 nm'de emiciliği ölçmek için bir mikroplaka okuyucu kullanın.
  6. Bu prosedürü önceden tanımlanmış zaman aralıklarında tekrarlayın. Her zaman noktası için ortalama optik yoğunluğu hesaplayın ve grafik yazılımında bir büyüme eğrisi çizin. Bu eğri, endotelin zaman içinde nispi olgunlaşmasını gösterir.

8. Geçirgenlik deneyi

  1. Ortamı ilgilendiğiniz bir kuyudan çıkarın.
    NOT: Geçirgenlik testi için, vasküler geçirgenliklerini değiştirebilecek diğer kanalların kurumasını önlemek için her bir kuyucuğun ayrı ayrı işlenmesi önerilir.
  2. 70 kDa FITC dekstranı DPBS'de çözerek 6 mL 0.1 mg / mL FITC konjuge dekstran çözeltisi hazırlayın.
    NOT: 100 mg FITC dekstranı 5 mL DPBS içinde çözerek 20 mg / mL'lik bir FITC dekstran stok çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi nazikçe girdapladıktan sonra, tekrarlanan donma-çözülme döngülerini önlemek için 500 μL'yi 1.5 mL'lik tüplere alikotlayın. Bu alikotlar -20 °C'de en fazla 6 ay saklanabilir. Tahlili gerçekleştirmeden önce, stok çözeltisini 0.1 mg / mL'lik bir çalışma konsantrasyonuna seyreltin.
  3. Plakayı mikroskop tablasına sıkıca yerleştirin ve görüş alanı içinde yakınlarda bulunan jel ile birlikte ilgili bölgedeki kanal duvarının net bir şekilde görünmesini sağlamak için objektifin büyütmesini faz kontrast modunda ayarlayın.
    NOT: Etkili geçirgenlik değerlendirmesi için, görüş alanındaki ilgili bölgeyi çevreleyen jel alanını en üst düzeye çıkarmaya çalışın; Bu husus, dekstran taşımacılığının doğru bir şekilde izlenmesinin anahtarıdır.
  4. İstenilen alana odaklandıktan sonra, faz kontrastından floresan moduna geçin. Görüntü alma sekmesi altında, geniş alan kanalına FITC ekleyin ve arka plan floresan yoğunluğunu hesaplamak için dekstran çözeltisi eklemeden önce bir görüntü elde edin. Daha sonra, kanalın bir tarafına 1 mL FITC dekstran çalışma çözeltisi ekleyin ve çözeltinin hidrostatik basınç farkı tarafından yönlendirilen kuyunun diğer tarafına doğru akmasına izin verin.
  5. Görüntüleri önceden belirlenmiş zaman aralıklarında elde edin - yüksek geçirgenliğe sahip kanallar için daha sık ve daha düşük geçirgenliğe sahip olanlar için daha az sıklıkta.

9. ImageJ'de floresan yoğunluğu ölçümü

  1. ImageJ görüntü analiz yazılımında, aşağıda belirtildiği gibi ilk zaman noktasındaki yoğunluğu (It1), daha sonraki zaman noktasında gözlemlenen ortalama yoğunluğu (It2) ve arka plan gürültüsünden kaynaklanan yoğunluğu (Ib) ölçün. Geçirgenlik katsayısını (Pd) hesaplamak için denklemi (1) kullanın. T1 ve T2, görüntü alımının ilk ve sonraki zaman noktalarını ifade eder.
    figure-protocol-1(1)
    1. ImageJ'yi başlatın ve ilk zaman noktasında alınan görüntüyü açın.
    2. ImageJ'de ölçeği ayarlayın. Analize gidin | Ölçeği ayarlayın. Bilinen ölçeği ve ölçü birimini girin.
    3. Dikdörtgen aracını seçin ve floresan yoğunluğu ölçümünün gerekli olduğu jel alanı üzerine bir dikdörtgen çizin.
    4. Analize gidin | Ölçümler'i ayarlayın ve Ortalama gri değerinin işaretli olduğundan emin olun.
      NOT: Bu seçenek, seçilen alandaki ortalama yoğunluğu ölçer. Verilen analiz için gerektiği gibi diğer parametreler de seçilebilir.
    5. Alan seçili durumdayken Analiz | Ölçün veya sadece M'ye basın. Ortalama floresan yoğunluğunu ve seçilen diğer parametreleri gösteren bir sonuç penceresinin açılmasını bekleyin.
    6. Üç ölçüm yapın ve bir elektronik tablodaki ortalama floresan yoğunluğu değerini hesaplayın.
    7. Arka plan floresansını belirlemek için, sonraki zaman noktası t2'de yakalanan görüntüler ve daha sonraki zaman noktasında floresan yoğunluğunun hesaplanması için dekstran çözeltisinin eklenmesinden önce çekilen görüntüler için bu prosedürü tekrarlayın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Boyut ve desen esnekliğine sahip VOP platformu, çok kafalı bir biyo-baskı sistemi ile üretildi. Hem içi boş hem de perfüzyon yapabilen kanallar, endotelizasyonu kolaylaştırmak için HUVEC'lerle tohumlandı ve daha sonra bir geçirgenlik testi ile değerlendirildi (Şekil 1A). Bu yöntemin çok ölçekli üretim kapasitesini göstermek için üç farklı konfigürasyon yazdırdık: düz, çatallı ve kıvrımlı (Şekil 1B). Basit bir üretim yaklaşımıyla, bir hidrojel matrisi içine gömülü altı içi boş, perfüze edilebilir vasküler kanal, standart altı oyuklu bir plaka içinde üretilebilir. Bu kanallar daha sonra HUVEC'ler ile endotelyalize edilebilir (Şekil 2A). Hücreler, vasküler kanalın luminal yüzeyini kaplamak için hızla bağlanır ve çoğalır (Şekil 2B). Hem alt hem de üst luminal yüzeylere yapışan hücreler, lümen içinde düzgün bir dağılım sergiler (Ek Şekil S1).

Plaka, silikon mürekkebin kürlenmesine izin vermek ve kurban deseninin kurumadan uzak kalmasını sağlamak için 3 gün boyunca nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirildi (Şekil 3A). Bu kanallardan geçen akışı değerlendirmek için, kanalların etkili bir şekilde perfüze edilebilir olduğunu gösteren yeşil mikro boncuklar tanıtıldı (Ek Video S1). Kanalların çapı 558 μm ± 1094 μm ± 45 μm arasında değiştirildi ve kurban desen baskısı sırasında nozul boyutu 22 G'den 18 G'ye değiştirildi. Ek olarak, kanalların geometrik konfigürasyonu, kıvrımlı ve çatallı desenlerin yazdırılmasını sağlamak için biyoyazıcının G kodunun (Ek Dosya 1) değiştirilmesiyle manipüle edildi (Şekil 3B).

UV ile çapraz bağlama süresi 120 s'ye optimize edilmiştir, bu da etkili hücre proliferasyonunu destekler (Ek Şekil S2). Bu çapraz bağlanma süresi, muhtemelen hidrojelin dengeli mekanik özellikleri ve gözenekliliği nedeniyle, daha iyi hücre bağlanmasını ve müteakip proliferasyonu kolaylaştıran, endotel hücre proliferasyonunu destekleyen fizyolojik olarak daha ilgili bir ortamla sonuçlandı. HUVEC'ler luminal yüzeyde etkili bir şekilde çoğaldı ve tohumlamadan sonraki 5. güne kadar parke taşı benzeri bir morfoloji gösterdi. Endotelin olgunlaşması 1, 3 ve 5. günlerde yapılan CCK8 testi ile değerlendirildi (Şekil 4A,B). Endotelin olgunlaşması, hücre tohumlamasından 5 gün sonra CD31 için immün boyama ile doğrulandı, bu da CD31'in sıkı bağlantılarda lokalizasyonunu gösterdi (Şekil 4D).

Endotelin bariyer fonksiyonunu değerlendirmek için, olgunlaşmanın 5. gününde kanallardan 70 kDa'lık bir dekstran solüsyonu perfüze ettik. Karşılaştırma için endotelsiz (çıplak) bir kontrol kanalı seçildi. Endotelyalize kanal, zaman içinde perivasküler jel bölgesi içinde floresanda minimal değişiklikler sergiledi, bu nedenle endotelin bariyer fonksiyonunu etkili bir şekilde sürdürdüğünü düşündürdü. Bununla birlikte, çıplak kanallar perivasküler jel bölgesinde floresansta bir artış sergiledi, bu nedenle endotel yokluğuna bağlı olarak daha yüksek geçirgenliğe işaret etti (Şekil 4C ve Şekil 4E).

figure-results-1
Şekil 1: Basılı vasküler kanalların hazırlanması ve konfigürasyonları. (A) Basılı vasküler kanalların üretimi, endotelyalizasyonu ve geçirgenlik testinin şeması. (B) Bu yöntemde gösterilen üç konfigürasyonun şeması: düz, çatallı ve kıvrımlı. Kısaltma: VOP'lar = bir plaka üzerindeki kaplar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Kurban deseni ve silikon odasının yanı sıra vasküler kanal endotelizasyonunun basılması için üretim zaman çizelgesi. (A) Çizim, kuyu plakasının tek bir kuyusunu temsil eder ve AA', enine kesit düzlemi boyunca görünümü ifade eder. (B) İmalat sürecinde yer alan adımların temsili görüntüleri. Ölçek çubukları = 5 mm (B1), 200 μm (B2-4). Kısaltmalar: GelFib =% 0.05 w/v lityum fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinat çözeltisi içinde% 15 jelatin metakrilat ve% 1 fibrinojen; HUVEC'ler = İnsan göbek damarı endotel hücreleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Bir plaka üzerindeki kaplar. (A) Kurban deseni ve silikon odasının basılmasından sonra bir plaka üzerindeki kapların brüt görüntüsü. (B) Yeşil mikro boncuklarla perfüze edilmiş, çeşitli konfigürasyon ve boyutlarda vasküler kanalların çok ölçekli imalatının gösterilmesi. Ölçek çubukları = 200 μm (düz kanallar), 1.000 μm (kıvrımlı ve çatallı kanallar). Kısaltmalar: ID = iç çap. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Vasküler kanallar ve endotelyal olgunlaşması ve geçirgenliği. (A) Yeşil floresan proteini etiketli HUVEC'lerle tohumlamadan sonra 1, 3 ve 5. günlerde vasküler kanalların floresan mikroskobik görüntüleri, 5. günde HUVEC'lerin proliferasyonunu ve parke taşı morfolojisini gösterir. (B) Endotel olgunlaşması, hücre tohumlamasından sonraki 1, 3 ve 5. günlerde CCK-8 testi ile değerlendirildi. (C) Endotelyalize (endotel +) ve çıplak (endotel -) vasküler kanalların geçirgenlik testi. (D) CD31 boyamanın temsili görüntüleri, CD31'in 5. gündeki sıkı bağlantılarda lokalizasyonunu göstermektedir. (E) Difüzyonel geçirgenliğin ölçülmesi. Ölçek çubukları = 200 μm (A, C, D). Kısaltmalar: HUVEC'ler = İnsan göbek damarı endotel hücreleri; GFP = yeşil floresan proteini; GFP HUVEC'ler = GFP etiketli HUVEC'ler; CCK-8 = hücre sayma kiti 8; DAPI = 4'6-diamidino-2-fenilindol. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Baskı MürekkebiYazdırma parametreleri
Meme ölçerSıcaklık (°C)Hava basıncı (kPa)Kafa hızı (mm / dak)
Kurban mürekkebi183740-48200
20
22
Silikon mürekkep225100

Tablo 1: Kurban ve silikon mürekkepler için baskı parametreleri.

Ek Dosya 1: Altı oyuklu bir plaka içinde kurban desenini ve silikon odasını 3D yazdırma komutlarını içeren G-Kodu komut dosyası. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S1: Hem alt hem de üst odak düzlemlerinde GFP-HUVEC ekini gösteren hücre tohumlamasından sonra alt ve üst luminal yüzeyin temsili görüntüleri. Ölçek çubukları = 200 μm. Kısaltmalar: UU' = üst odak düzlemi; LL' = alt odak düzlemi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S2: UV (405 nm) ile farklı çapraz bağlanma süreleri altında GFP-HUVEC proliferasyonu. Ölçek çubukları = 200 μm. Kısaltmalar: HUVEC'ler = İnsan göbek damarı endotel hücreleri; GFP = yeşil floresan proteini; GFP HUVEC'ler = GFP etiketli HUVEC'ler. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S1: Düz, kıvrımlı ve çatallı kanallardan etkili perfüzyonu gösteren yeşil mikro boncuklu perfüzyon. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo S1: G kodu ve M kodu komutlarının işlevleri. NOT: G kodunda, X, Y ve Z, sırasıyla X ekseni, Y ekseni ve Z ekseni boyunca hareket koordinatlarını gösterir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3D biyo-baskı teknolojisinin hassasiyeti, otomasyonu ve bilgisayar kontrollü doğasından yararlanarak, ticari mikroplaka okuyucuları ve mikroskop görüntüleme kurulumları ile uyumlulukları nedeniyle seçilen standart altı oyuklu plakalarda vasküler kanallar üretmek için aerodinamik bir yöntem oluşturduk. Plakanın tasarımı, gerekli medya değiştirme sıklığını azaltırken daha büyük kanalların büyümesi için çok boyutlu kanalları ve yeterli miktarda medyayı barındırabilir. Bu tasarımın gelecekteki uyarlamaları, ticari olarak temin edilebilen diğer standart kuyu plakalarına uyarlanabilir, böylece deneysel verimi artırabilir ve malzeme kullanımını azaltabilir.

Mikroakışkan platformlar, toksik olmaması, gaz geçirgenliği ve yüksek şeffaflığı nedeniyle genellikle PDMS adı verilen bir silikon polimer kullanır28. Bununla birlikte, PDMS'nin düşük şekil doğruluğu, yüksek şekil doğruluğuna sahip çip üretimi için mikroekstrüzyon bazlı biyobaskıda kullanımını sınırlar. Başka bir silikon polimer olan SE170029, doku üretimi için odalar oluşturmada daha yüksek hassasiyet sunar, ancak yüksek viskozitesi daha büyük nozullar ve önemli miktarda pnömatik basınç gerektirir. Daha küçük nozullarla kullanılabilen bir SE1700 ve PDMS karışımı formüle ettik, böylece sınırlı alanlarda yüksek hassasiyet ve şekil doğruluğu ile üretim yapılmasını sağladık. Polikaprolakton (PCL) veya Polietilen Vinil Asetat (PEVA) gibi diğer polimer türleri de yüksek şekil doğrulukları30 göz önüne alındığında hazne baskısı için kullanılabilir.

GelMA'nın optik şeffaflığı da çok önemlidir31. Çapraz bağlandıktan sonra opak hale gelen kollajen gibi diğer ECM bazlı hidrojellerin aksine, GelMA şeffaflığı korur, böylece kanal boyutu artsa bile kanallar içinde gerçek zamanlı hücresel analize izin verir. Bu özellik, yapının boyutu arttığında gözlem için ince kesitler gerektiren yöntemlere göre büyük bir avantaj sağlar32. GelMA'nın biyolojik olarak parçalanabilirliği, ECM iskelesinin parçalanırken yeni, fonksiyonel doku ile değiştirilmesini kolaylaştırır ve böylece yeni oluşan fonksiyonel dokunun büyümesi için gerekli alanı sağlar33,34. Ek olarak, kanıtlanmış düşük sitotoksisitesi, onu doku mühendisliği uygulamaları için son derece uygun hale getirir35,36. GelMA'nın mükemmel mekanik özellikleri, onu vasküler doku mühendisliği uygulamaları için iyi bir aday haline getirir37. HUVEC'lerle vasküler kanalların endotelizasyonunu kolaylaştırmadaki etkinliği iyi belgelenmiştir38.

Bu çalışmada endotelizasyon için kullanılan hücreler, HUVEC'ler, yüksek bir izolasyon başarı oranı sergiler ve çok çeşitli kardiyovasküler ve metabolik hastalıkların incelenmesi için istisnai bir modeldir39. Bununla birlikte, bu yaklaşım, arterlerden veya doğrudan hastalardan türetilenler de dahil olmak üzere farklı endotel hücresi tiplerini barındıracak şekilde uyarlanabilir. Bu uyarlanabilirlik, hastaya özgü vasküler doku modellerinin oluşturulmasını sağlayarak belirli ilaçlara verilen bireysel yanıtların değerlendirilmesini kolaylaştırır.

Bu protokolün okuyucuların akılda tutması gereken bazı kritik adımları vardır. İlk olarak, plazma işlemi, plakanın yüzey özelliklerini değiştirmek, özellikle hidrofilikliği arttırmak için kritik öneme sahiptir, çünkü çoğu ticari kuyu plakası hidrofobiktir. Plazma işlemi, yüzeyde polar fonksiyonel gruplar oluşturur, böylece silikon odası ve hidrojel ile bağlanma kabiliyetini geliştirir. İkincisi, sıcaklık kontrolü çok önemlidir, çünkü kurban mürekkep daha düşük sıcaklıklarda sıvılaşır ve silikon mürekkep, erken kürlenmeyi önlemek için daha düşük sıcaklıklar gerektirir, bu da mürekkebin nozülden ekstrüzyonunu engelleyebilir. Üçüncüsü, PF127'nin tüm izlerinin tamamen çıkarılması çok önemlidir, çünkü herhangi bir kalıntı PF127, hücre yapışmasına40 müdahale etmek gibi hücresel süreçleri olumsuz etkileyebilir. Dördüncüsü, hücre kültürü sırasında, hücreler %90'ı aşan bir birleşme noktasına kadar büyürse, alan ve besin maddeleri için rekabet nedeniyle stres yaşayabilirler. Bu stres, hücre davranışının değişmesine, hücre canlılığının azalmasına ve hücresel mikro çevrede değişikliklere neden olabilir. Hücre sağlığını ve uygun proliferasyonu korumak için, kültürlerin %90'ın altında tutulması önerilir. Beşincisi, kanal içinde homojen hücre yapışması ve sonuçta üniform endotelizasyon elde etmek için plakayı inversiyondan önce ve sonra inkübatörün içinde düz tutmak önemlidir. Son olarak, görüntü elde etme sırasında tutarlı pozlama süresini, uyarma lazer yoğunluğunu ve mikroskop odağını korumak çok önemlidir, çünkü bu parametrelerdeki değişiklikler emisyon sinyalinin yoğunluğunu değiştirebilir ve böylece sonuçların doğruluğunu potansiyel olarak etkileyebilir.

Yaklaşımımız, burada gösterilen düz, çatallı ve kıvrımlı desenler gibi birden çok konfigürasyonda kanalların oluşturulmasına izin verir. Bu uyarlanabilirlik, insan vücudundaki çeşitli vasküler ağ geometrilerini çoğaltmak için gereklidir ve bir kalıp etrafında hidrojel döküm veya tüp benzeri yapılar için kullanılan eşmerkezli nozul bazlı biyobaskı teknikleri gibi geleneksel yöntemlerin yeteneklerini aşar 30,41,42. Bununla birlikte, bu yöntemin bir sınırlaması, kurban deseni düz bir yüzeye yerleştirildiği için kanalların daireselliğini sağlamamasıdır.

Kanalları birden fazla boyutta oluşturmanın avantajı, genellikle mikrokanallarla sınırlı olan mikroakışkan platformların sınırlamalarının üstesinden gelmenin anahtarıdır. Bu kısıtlama, geleneksel biyokimyasal tahlillerde bir dezavantaj olabilir. Örneğin, western blotlama gibi standart protein ekspresyon tahlilleri için yeterli materyal elde etmek için, birkaç mikroakışkan cihazdan elde edilen çıktıların birleştirilmesi gerekir. Ek olarak, içi boş kanallar oluşturulduğunda, hidrojel, iğne çıkarma işlemine dayanmak için yeterli sertliği korumalıdır. Yaklaşımımız, sıcaklık düştüğünde sıvı hale gelen, böylece jelin bütünlüğüne zarar vermeden bu işlemi kolaylaştıran, ısıyla geri dönüşümlü bir kurban malzeme kullanır. Ayrıca, jelatin43 gibi diğer ısıyla tersinir jelleştirici malzemeler de bu yöntemde kurban malzemeleri olarak kullanılabilir.

Bu yaklaşım, plaka üzerindeki doku yapılarının kolayca özelleştirilmesini sağlar, böylece ilaç keşfinde farmakolojik testler için umut verici bir araç sağlar. Bu yöntem, vasküler disfonksiyon ile ilişkili hastalıklar için tedavilerin geliştirilmesinde önemli bir faktör olan vasküler geçirgenlik üzerindeki etkilerini değerlendirerek ilaçların taranmasını kolaylaştırabilir. Modelimiz, inflamasyon gibi belirli koşullar altında vasküler geçirgenliği incelemek ve anormal vasküler geçirgenliği içeren çeşitli hastalıkların tedavisi ile ilgili vasküler normalizasyon için stratejiler geliştirmekiçin kullanılabilir 44, bu sürecin anlaşılmasını ilerletmek ve potansiyel klinik uygulamalar geliştirmek45.

Vasküler geçirgenliği değerlendirmek için vasküler kanaldan 70 kDa dekstran perfüze ettik. Tipik olarak, sağlıklı bir vasküler endotel, bu moleküler ağırlığasahip dekstran moleküllerine karşı etkili bir bariyer görevi görür 46. Bununla birlikte, iltihaplanma varlığında, sıkı bağlantıların bozulması meydana gelir, bu da bu moleküllerin sızmasına izin verir, böylece vasküler geçirgenliği arttırır30. Ek olarak, ilaçların mühendislik dokuları içindeki dağılımını değerlendirmek için floresan etiketli dekstran kullanılır47. Kanal içindeki çift yönlü akış ve sınırlı kontrol taşma dinamikleri bu modelin sınırlamaları olsa da, son kullanıcıların kanallar içindeki akış dinamiklerini kontrol etmek için özelleştirilmiş külbütörler kullanarak sistemi gereksinimlerine göre uyarlayabileceklerini öngörüyoruz. Bu uyarlama, pompasız tek yönlü akışın48 uygulanmasını içerebilir.

Gelecekte, bu üretim yöntemi karmaşık dokular oluşturmak için ölçeklendirilebilir. Diğer hücre türlerini vasküler kanalların yakınına hassas bir şekilde yerleştirerek, perfüze edilebilir, vaskülarize dokular oluşturulabilir ve böylece hacimsel dokuların biyo-baskısında büyük bir zorluğun üstesinden gelinebilir. Ayrıca, bu yöntemin, lenfatik damarlar ve bağırsaklar gibi diğer içi boş, sızabilir doku türlerini, çeşitli biyomedikal uygulamalar için yüksek verimli bir şekilde simüle etmek için uyarlanabileceğine inanıyoruz.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar rekabet eden hiçbir mali çıkar beyan etmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Kore hükümeti (Bilim ve BİT Bakanlığı, MSIT) tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) hibeleri tarafından desteklenmiştir. NRF-2019R1C1C1009606; Hayır. 2020R1A5A8018367; ve Hayır. RS-2024-00423107]. Bu araştırma, MSIT tarafından finanse edilen NRF hibelerinin Biyo ve Tıbbi Teknoloji Geliştirme Programı tarafından desteklenmiştir [No. NRF-2022M3A9E4017151 ve No. NRF-2022M3A9E4082654]. Bu çalışma, Ticaret, Sanayi ve Enerji Bakanlığı (MOTIE, Kore) tarafından finanse edilen Teknoloji İnovasyon Programı [No. 20015148] ve Simyacı Projesi [No. 20012378] tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma aynı zamanda Kore Gıda, Tarım ve Ormancılıkta Teknoloji Planlama ve Değerlendirme Enstitüsü (IPET) tarafından, Tarım, Gıda ve Köy İşleri Bakanlığı (MAFRA) tarafından finanse edilen Araştırma İnsan Gücü Geliştirme için Tarım ve Gıda Yakınsama Teknolojileri Programı aracılığıyla desteklenmiştir. RS-2024-00397026].

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10 mL Serolojik PipetSPLSPL 91010
10 mL şırınga Shinchang Medical
15 mL konik tüpSPL50015
3D Biyoyazıcı T & R Biofab3DX-Yazıcı
6 kuyulu plaka SPL37206
Biyolojik Güvenlik KabinleriCHC LABPCHC-777A2-04, 
Brightfield Ters MikroskoplarLeicaDMi1
Hücre Sayma Kiti (CCK8)GlpBioGK10001
Hücre Sayma Kiti (CCK8)GlpBioGK10001
Hücre Kültürü Şişesi 75TSPL70075
Corning Matrigel Büyüme Faktörü Azaltılmış (GFR) Bazal Membran Matrisi, LDEV içermez, 10 mLCorning354230
Damıtılmış su
DMEM/F12Gibco11320033
DMSO, Hücre Kültürü SınıfıSigma aldrichD2438
Dow-Corning, PDMS-Sylgard 184a KitiDOWDC-184
DOWSIL SE 1700 Şeffaf W/C 1.1 KG Kiti DOW2924404
D-PBS - 1xWelgeneLB001-01
Endotel Hücre Büyüme Ortamı MV 2 (Kullanıma hazır)PromocellC-22022
Eppendorf Mikro pipet(1000,200,100,20,10)eppendorf
Etil Alkol %99,9DuksanD5
ExcelMicrosoft
Sığır plazmasından fibrinojenSigma AldrichF8630-1G
FITC Dextran 70 kDaSigma Aldrich46945-100MG-F
Floresan boncuklar (1.0 & m, yeşil)Sigma AldrichL1030-1ML
GelMA tozu (Jelatin metakrilat) 50 g3D Malzemeler 20JT29
Gibco, Geri Kazanım Hücre Kültürü Dondurma Ortamı, 50 mLGibco
HUVEC'ler (İnsan Umbillical Ven Endotel Hücreleri)Promocell
ImageJ yazılımıNIH
İnkübatörThermo SCIENTIFICForma STERI-CYCLE i160 CO2 İnkübatör
İnvitrojen, Canlı / ölü canlılık / sitotoksisite Kiti (memeli hücreleri için)Thermo FisherL3224
Lityum Fenil (2,4,6-trimetilbenzoil) fosfat tozu Tokoyo Kimya Sanayi A.Ş.85073-19-4 
Marienfeld Superior, Sayım odası kapağıMarienfeld Superior
Marienfeld Superior, Hemositometre, hücre sayma odasıMarienfeld SuperiorHSU-0650030
Mikrosantrifüj eppendorfSantrifüj 5920 R
NCViewer.com
Azot tankıWORTHINGTON ENDÜSTRILERILS750
Omnicure UV LazerEXCELITASSERİSİ 1500
Parafilm MamcorPM-996
Penisilin-Streptomisin Çözeltisi (100x)GenDEPOTCA005-010
Planet MikserTHINKY CORPORATION, JaponyaARE-310
Plazma işleme makinesiFEMTO SCIENCECUTE-1MPR
Pluronic F-127Sigma aldrichP2443-250G
Önceden hazırlanmış tampon, (P2007-1) 10x PBSBiosesangPR4007-100-00
Reaktif saklama dolabıZIO FILTER TECHSC2-30F-1306D1-BC
Gerçek zamanlı Canlı hücre Görüntüleme MikroskobuCarl ZEISS
BuzdolabıSAMSUNGRT50K6035SL
ROCKER 2D dijitalIKA4003000
Kepçe-SpatulaÖnbelleğiSL-SCO7001-EA
sigma tarafından, Tripsin-EDTA solition,% 0.25Sigma aldrichT4049-100ML
Sodyum Dodesil Sülfat (SDS)Thermo Fisher scientific151-21-3
Şırınga Namlu Ucu KapağıFISNAR3051806
Uyarı Sinyali SayacıKontrol Şirketi  C23-147-050
Konik Nozul (18 G)MushashiTPND-18G-U
Konik Nozul (22 G)MushashiTPND-22G-U
Konik nozul 20 GMusashiTPND-20G-U
Sığır plazmasından trombinSigma AldrichT7326-1KU
Zamanlayıcı, 4 kanallıETLSL. Tim3005
Tripan Mavi Çözelti% 0.4Gibco15250061
Tripsin Nötralize Edici ÇözeltiPromocellC-41120
UG 24 mL UG merhem kavanozuYamayuNo. 3-53
UG 58 mL UG merhem kavanozuYamayuNo. 3-55
Su BanyosuDAIHAN ScientificWB-11
Ağırlık makinesiSartoriusbce2241-1skr

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. O'Connor, C., Brady, E., Zheng, Y., Moore, E., Stevens, K. R. Engineering the multiscale complexity of vascular networks. Nat Rev Mater. 7 (9), 702-716 (2022).
  2. Claesson-Welsh, L., Dejana, E., McDonald, D. M. Permeability of the Endothelial Barrier: Identifying and Reconciling Controversies. Trends Mol Med. 27 (4), 314-331 (2021).
  3. Claesson-Welsh, L. Vascular permeability-the essentials. Ups J Med Sci. 120 (3), (2015).
  4. Wautier, J. -L., Wautier, M. -P. Vascular Permeability in Diseases. Int. J. Mol. Sci. 23 (7), (2022).
  5. Higashi, Y., Kihara, Y., Noma, K. Endothelial dysfunction and hypertension in aging. Hypertens Res. 35 (11), (2012).
  6. Gallo, G., Volpe, M., Savoia, C. Endothelial dysfunction in hypertension: current concepts and clinical implications. Front Med (Lausanne). 8, 798958(2022).
  7. Park, W., Lee, J. -S., Gao, G., Kim, B. S., Cho, D. -W. 3D bioprinted multilayered cerebrovascular conduits to study cancer extravasation mechanism related with vascular geometry. Nat Commun. 14 (1), 7696(2023).
  8. Sun, H. -J., Wu, Z. -Y., Nie, X. -W., Bian, J. -S. Role of endothelial dysfunction in cardiovascular diseases: the link between inflammation and hydrogen sulfide. Front Pharmacol. 10, 1568(2020).
  9. Yuan, Y., Sun, J., Dong, Q., Cui, M. Blood-brain barrier endothelial cells in neurodegenerative diseases: Signals from the "barrier.". Front Neurosci. 17, 1047778(2023).
  10. Hadi, H. A., Suwaidi, J. A. Endothelial dysfunction in diabetes mellitus. Vasc Health Risk Manag. 3 (6), 853-876 (2007).
  11. De Vriese, A. S., Verbeuren, T. J., Van de Voorde, J., Lameire, N. H., Vanhoutte, P. M. Endothelial dysfunction in diabetes. Br J Pharmacol. 130 (5), 963-974 (2000).
  12. Wang, K., et al. Inflammatory environment promotes the adhesion of tumor cells to brain microvascular endothelial cells. Front Oncol. 11, 691771(2021).
  13. Tiwary, S., et al. Metastatic brain tumors disrupt the blood-brain barrier and alter lipid metabolism by inhibiting expression of the endothelial cell fatty acid transporter Mfsd2a. Sci Rep. 8 (1), 8267(2018).
  14. Chauhan, V. P., Stylianopoulos, T., Boucher, Y., Jain, R. K. Delivery of molecular and nanoscale medicine to tumors: transport barriers and strategies. Annu Rev Chem Biomol Eng. 2 (1), 281-298 (2011).
  15. Van Norman, G. A. Limitations of animal studies for predicting toxicity in clinical trials: Is it time to rethink our current approach. JACC Basic Transl Sci. 4 (7), 845-854 (2019).
  16. Morgan, S. J., et al. Use of animal models of human disease for nonclinical safety assessment of novel pharmaceuticals. Toxicol Pathol. 41 (3), 508-518 (2013).
  17. Rotman, D. Can Pfizer deliver. MIT Technology Review. , Available from: https://www.technologyreview.com/2004/02/01/233321/can-pfizer-deliver/ (2004).
  18. Raasch, M., et al. Microfluidically supported biochip design for culture of endothelial cell layers with improved perfusion conditions. Biofabrication. 7 (1), 015013(2015).
  19. Xu, Z., et al. Design and construction of a multi-organ microfluidic chip mimicking the in vivo microenvironment of lung cancer metastasis. ACS Appl Mater Interfaces. 8 (39), 25840-25847 (2016).
  20. Strobel, H. A., et al. Assembly of tissue-engineered blood vessels with spatially controlled heterogeneities. Tissue Eng Part A. 24 (19-20), 1492-1503 (2018).
  21. Atchison, L., Zhang, H., Cao, K., Truskey, G. A. A Tissue engineered blood vessel model of Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome using human iPSC-derived smooth muscle sells. Sci Rep. 7 (1), 8168(2017).
  22. Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-Chip: A fast track for engineered human tissues in drug development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
  23. Gold, K. A., et al. 3D bioprinted multicellular vascular models. Adv Healthc Mater. 10 (21), 2101141(2021).
  24. Tabriz, A. G., Hermida, M. A., Leslie, N. R., Shu, W. Three-dimensional bioprinting of complex cell laden alginate hydrogel structures. Biofabrication. 7 (4), 045012(2015).
  25. Gao, G., et al. Tissue engineered bio-blood-vessels constructed using a tissue-specific bioink and 3D coaxial cell printing technique: a novel therapy for ischemic disease. Adv. Funct. Mater. 27 (33), 1700798(2017).
  26. Cho, W. -W., Ahn, M., Kim, B. S., Cho, D. -W. Blood-lymphatic integrated system with heterogeneous melanoma spheroids via in-bath three-dimensional bioprinting for modelling of combinational targeted therapy. Adv Sci (Weinh). 9 (29), 2202093(2022).
  27. Kolesky, D. B., et al. 3D bioprinting of vascularized, heterogeneous cell-laden tissue constructs. Adv Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).
  28. Polacheck, W. J., Kutys, M. L., Tefft, J. B., Chen, C. S. Microfabricated blood vessels for modeling the vascular transport barrier. Nat Protoc. 14 (5), 1425-1454 (2019).
  29. Li, H., et al. Expanding sacrificially printed microfluidic channel-embedded paper devices for construction of volumetric tissue models in vitro. Biofabrication. 12 (4), 045027(2020).
  30. Gao, G., Park, J. Y., Kim, B. S., Jang, J., Cho, D. Coaxial cell printing of freestanding, perfusable, and functional in vitro vascular models for recapitulation of native vascular endothelium pathophysiology. Adv Healthc Mater. 7 (23), 1801102(2018).
  31. Farasatkia, A., Kharaziha, M., Ashrafizadeh, F., Salehi, S. Transparent silk/gelatin methacrylate (GelMA) fibrillar film for corneal regeneration. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 120, 111744(2021).
  32. Duong, V. T., et al. Double-layered blood vessels over 3 mm in diameter extruded by the inverse-gravity technique. Biofabrication. 15 (4), 045022(2023).
  33. Luo, L., et al. Application of bioactive hydrogels combined with dental pulp stem cells for the repair of large gap peripheral nerve injuries. Bioact Mater. 6 (3), 638-654 (2021).
  34. Zhu, M., et al. Gelatin methacryloyl and its hydrogels with an exceptional degree of controllability and batch-to-batch consistency. Sci Rep. 9 (1), 6863(2019).
  35. Wang, Y., et al. Development of a photo-crosslinking, biodegradable GelMA/PEGDA hydrogel for guided bone regeneration materials. Materials. 11 (8), 1345(2018).
  36. Han, Y., et al. Biomimetic injectable hydrogel microspheres with enhanced lubrication and controllable drug release for the treatment of osteoarthritis. Bioact Mater. 6 (10), 3596-3607 (2021).
  37. Bupphathong, S., et al. Gelatin methacrylate hydrogel for tissue engineering applications-a review on material modifications. Pharmaceuticals. 15 (2), 171(2022).
  38. Wu, Z., et al. Microfluidic printing of tunable hollow microfibers for vascular tissue engineering. Adv Mater Technol. 6 (8), 2000683(2021).
  39. Medina-Leyte, D. J., Domínguez-Pérez, M., Mercado, I., Villarreal-Molina, M. T., Jacobo-Albavera, L. Use of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) as a model to study cardiovascular disease: a review. Appl. Sci. 10 (3), 938(2020).
  40. Khattak, S. F., Bhatia, S. R., Roberts, S. C. Pluronic F127 as a cell encapsulation material: utilization of membrane-stabilizing agents. Tissue Eng. 11 (5-6), 974-983 (2005).
  41. Jia, W., et al. Direct 3D bioprinting of perfusable vascular constructs using a blend bioink. Biomaterials. 106, 58-68 (2016).
  42. Kim, S. -J., et al. Bioprinting methods for fabricating in vitro tubular blood vessel models. Cyborg Bionic Syst. 4, 0043(2023).
  43. Maji, S., Lee, M., Lee, J., Lee, J., Lee, H. Development of lumen-based perfusable 3D liver in vitro model using single-step bioprinting with composite bioinks. Mater Today Bio. 21, 100723(2023).
  44. Pauty, J., et al. A vascular permeability assay using an in vitro human microvessel model mimicking the inflammatory condition. Nanotheranostics. 1 (1), 103-113 (2017).
  45. van Duinen, V., et al. 96 perfusable blood vessels to study vascular permeability in vitro. Sci Rep. 7 (1), 18071(2017).
  46. Pink, D. B. S., Schulte, W., Parseghian, M. H., Zijlstra, A., Lewis, J. D. Real-time visualization and quantitation of vascular permeability in vivo: implications for drug delivery. PLoS ONE. 7 (3), e33760(2012).
  47. Filippi, M., et al. Perfusable biohybrid designs for bioprinted skeletal muscle tissue. AAdv Healthc Mater. 12 (18), 2300151(2023).
  48. Zhang, F., Lin, D. S. Y., Rajasekar, S., Sotra, A., Zhang, B. Pump-less platform enables long-term recirculating perfusion of 3D printed tubular tissues. Adv Healthc Mater. 12 (27), 2300423(2023).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

3D BioprintingVascular Tissue ModelsEndothelial CellsHydrogel ChannelsPerfusable VesselsImmunostaining CD31Blood Vessel Modeling

İlgili makaleler