Yöntem makalesi

Hasta Kaynaklı Tümör Organoidlerinde Hücresel Radyosensitiviteyi Ölçmek için Canlı Görüntüleme

DOI:

10.3791/66680

⸱

5 Nisan 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Radiation Oncology, Weill Cornell Medical College, 2Sandra and Edward Meyer Cancer Center, 3Department of Medicine, Weill Cornell Medical College, 4Caryl and Israel Englander Institute for Precision Medicine, 5Department of Pathology and Laboratory Medicine, Weill Cornell Medical College

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, hasta kaynaklı tümör organoidlerinin iyonlaştırıcı radyasyona duyarlılığını ölçmek için basit bir canlı görüntüleme yaklaşımını detaylandırıyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Radyasyon tedavisi (RT), modern klinik kanser yönetiminin temel dayanaklarından biridir. Bununla birlikte, tüm kanser türleri, kötü huylu hücrelerin iyonlaştırıcı ışınlar tarafından ortaya çıkan oksidatif DNA hasarını onarma yeteneğindeki farklılıklar nedeniyle, sıklıkla (ancak her zaman değil) ışınlamaya eşit derecede duyarlı değildir. Klonojenik tahliller, kültürlenmiş kanser hücrelerinin iyonlaştırıcı ışınlamaya duyarlılığını değerlendirmek için onlarca yıldır kullanılmaktadır, çünkü büyük ölçüde ışınlanmış kanser hücreleri genellikle kısa süreli akış sitometrisi veya mikroskopi destekli tekniklerle ölçülmesi zor olan gecikmeli bir şekilde ölür. Ne yazık ki, klonojenik tahliller, hasta kaynaklı tümör organoidleri (PDTO'lar) gibi daha karmaşık tümör modelleri için bu şekilde kullanılamaz. Gerçekten de, yerleşik PDTO'ların ışınlanması, gövde benzeri bölmeleri tamamen ortadan kaldırılmadıkça, çok hücreli birimler olarak büyümelerini mutlaka iptal etmeyebilir. Ayrıca, PDTO'dan türetilmiş tek hücreli süspansiyonların ışınlanması, yerleşik PDTO'lar bağlamında malign hücrelerin RT'ye duyarlılığını uygun şekilde özetleyemeyebilir. Burada, yerleşik PDTO'ların iyonlaştırıcı radyasyona maruz kalmasını, ardından tek hücreli ayrışmayı, uygun kültür koşullarında yeniden kaplamayı ve canlı görüntülemeyi içeren geleneksel klonojenik testlerin bir adaptasyonunu detaylandırıyoruz. Işınlanmamış (kontrol) PDTO'dan türetilmiş kök benzeri hücreler, doza bağımlı bir şekilde ışınlamadan olumsuz etkilenen PDTO'ya özgü bir verimlilikle büyüyen PDTO'ları yeniden şekillendirir. Bu koşullarda, PDTO oluşturma verimliliği ve büyüme hızı, kontrol PDTO'ları önceden tanımlanmış bir alan doluluğuna ulaşana kadar toplanan hızlandırılmış görüntülerdeki radyosensitivitenin bir ölçüsü olarak ölçülebilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksternal ışın radyasyon tedavisi (RT), modern onkolojinin temel dayanaklarından biridir ve yalnızca genel olarak yönetilebilir yan etkilerin iyi tanımlanmış bir spektrumu ile ilişkili belirgin bir antikanser aktivitesini1 değil, aynı zamanda son derece yaygın bir klinik kullanılabilirliği de yansıtır (gelişmiş ülkelerdeki çoğu kanser merkezi, harici ışın RT için modern lineer hızlandırıcılarla donatılmıştır)2. Bu düşünceye uygun olarak, RT, genellikle erken evre hastalık 3,4 bağlamında hem iyileştirici amaçlar hem de metastatik tümörlerdenkaynaklanan semptomları (örneğin ağrı) kontrol altına almak için palyatif uygulamalar için küresel olarak başarıyla kullanılmaktadır5. Bununla birlikte, tüm maligniteler RT'ye eşit derecede duyarlı değildir, bu da bir dizi kanser hücresine özgü ve mikroçevresel özelliği yansıtır6,7,8,9. Bağımsız bir örnek olarak, DNA onarımını ve redoks homeostazını etkileyen kanserle ilişkili çeşitli genetik ve epigenetik değişiklikler, büyük ölçüde RT'nin DNA ve diğer makromoleküllere doğrudan ve reaktif oksijen türlerine (ROS) bağlı hasara neden olarak kanser hücrelerini öldürme yeteneğini yansıtan artmış veya azalmış içsel radyosensitivite ile ilişkilendirilmiştir 10,11,12,13.

Geçtiğimiz on yıllar boyunca, kültürlenmiş insan ve murin kanseri hücrelerinin radyosensitivitesini değerlendirmek için klonojenik testler rutin olarak kullanılmıştır 14,15,16. Gerçekten de, kemoterapötikler ve diğer stresörler genellikle kötü huylu hücreleri oldukça hızlı bir şekilde öldürürken, klinik olarak anlamlı dozlarda kullanılan RT, çoğunlukla, sitotoksik bir uyarana maruz kaldıktan 24-72 saat sonra hayati boyaların (ölü hücreleri seçici olarak boyayan) hücresel alımını ölçmek gibi kısa süreli akış sitometrisi veya mikroskopi destekli tekniklerle basitçe ölçülemeyen gecikmiş bir hücre ölümü şeklini ortaya çıkarır17. Basit olmanın ve oldukça ucuz reaktiflere güvenmenin yanı sıra, klonojenik tahliller, RT doz yanıtının kantitatif analizi için oldukça basit bir matematiksel araç olan "doğrusal kuadratik" modelin uygulanmasına izin verdikleri için özellikle uygun olmuştur18,19. Benzer şekilde, kültürlenmiş kanser hücreleri (yerleşik hücre dizilerinin yanı sıra birincil, hasta kaynaklı hücreler dahil), kanser biyolojisinin çeşitli yönlerini, tedaviye duyarlılığı oldukça basit ancak basitleştirilmiş bir şekilde test etmek için uygun bir platform sağlamıştır (ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere), önemli bir sınırlama, yapılandırılmış bir tümör mikro çevresinin (TME) olmamasıdır20, 21. Gerçekten de, iki boyutlu kanser hücre kültürleri, hücre-hücre iletişimini ve hücre dışı matris ile etkileşimleri özünde özetleyemez ve kanserde meydana geldikleri gibi22,23. Hasta kaynaklı tümör organoidleri (PDTO'lar), bu tür bir sınırlamayı en azından kısmen aşan tümör modelleri olarak ortaya çıkmıştır 24,25,26.

Ne yazık ki, PDTO'ların radyosensitivitesini değerlendirmek için geleneksel klonojenik testler kullanılamaz. Bir yandan, yerleşik PDTO'ların ışınlanması, PDTO'ların oluşumundan ve olgunlaşmasından sorumlu olan ancak daha farklılaşmış PDTO oluşturan hücrelere kıyasla DNA hasarına karşı daha fazla direnç gösteren kök benzeri bölmeleri olmadıkça, çok hücreli bir birim olarak büyümelerini tehlikeye atmayabilir27 - tamamen ortadan kaldırılır. Öte yandan, PDTO'dan türetilen tek hücreli süspansiyonların ışınlanması, oluşturulmuş PDTO'lar bağlamında sergilendiği gibi PDTO oluşturan (kök benzeri) hücrelerin radyosensitivitesini uygun şekilde özetleyemeyebilir. Burada, daha önce iyonlaştırıcı ışınlamaya maruz kalmış PDTO türevi hücrelerin ışınlanmamış muadillerine kıyasla PDTO oluşturma etkinliğini ve büyüme hızını izlemek için meme kanseri PDTO'larının canlı görüntülemesinden yararlanan bir tekniği detaylandırıyoruz. Bireysel PDTO'ların diferansiyel biyolojisini büyük ölçüde yansıtan gerekli varyasyonlarla (örneğin, kültür ortamı gereksinimleri, büyüme hızı), bu protokolün hem meme hem de meme dışı kökenli geniş bir PTDO panelinde radyosensitivite çalışması için uygun olmasını bekliyoruz.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Organoid kültürü

NOT: TBC#1 PDTO'lar, üçlü negatif meme kanseri (TNBC) olan ve bir biyobankacılık protokolüne (IRB21-06023682) katılmak için bilgilendirilmiş onam veren bir hastadan cerrahi olarak çıkarılan tümör dokusuna dayalı olarak laboratuvarımızda kurulmuştur. Histoloji ve RNA dizilimi (RNAseq) ile doğrulamadan sonra, TNBC # 1 PDTO'lar, zenginleştirilmiş DMEM / F12 kültür ortamında% 66 matrigel damlalarında ('kubbeler' olarak adlandırılır) kültürlenir ve her 2-3 haftada bir 1: 2-1: 10 oranında geçirilir28.

  1. Test edilen her radyasyon dozu için bir tane olmak üzere ayrı, yapışmayan 6 oyuklu plakalarda ışınlamadan yaklaşık 2 hafta önce 1: 2-1: 10 oranında tohum PDTO'ları (artı iyonlaştırıcı radyasyona maruz kalmayan PDTO'lar tarafından sağlanacak negatif kontroller).
  2. Her 3-4 günde bir PDTO'lara 3 mL taze zenginleştirilmiş DMEM / F12 kültür ortamı ekleyin.
    NOT: Tohumlama ve kültür koşulları, PDTO'ların mikroskop altında çekirdek nekrozunun göstergesi olan çok tanınabilir, halka benzeri bir görünüm elde etmesini önlemek ve ışınlamada optimum canlılığı sağlamak için bazı adaptasyonlar gerektirebilir.

2. Radyasyon

  1. PDTO'lar, ortalama boyuta (ölçek referanslı parlak alan mikroskobu altında önceden belirlendiği gibi yaklaşık 100 μm) ve kubbe doluluğuna (yaklaşık% 80) ulaştıklarında ışınlamaya hazırdır. Aşırı kalabalığı önlemek için bu aşamada PDTO'ları geçin.
  2. Küçük Hayvan Araştırma Radyasyon Platformu (SARRP) ışınlayıcısını (veya in vitro veya in vivo uygulamalar için alternatif bir ışınlayıcı) açık alan modunda (kolimatör yok) kullanarak PDTO içeren kubbeleri yayınlayın, 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy ve 10 Gy'lik tek dozlar verin. Işınlanmamış PDTO'lar uygun negatif kontrol koşulları sağlar.
    NOT: Matrigel ile kapatılmış PDTO'ların planlanan radyasyon dozunu aldığından emin olmak için her deneyden önce dozimetri testi kalibrasyonu yapılmalıdır. Bu dozlar, TNBC # 1 PDTO'ların radyosensitivitesinin ön değerlendirmelerine dayanarak seçilmiştir ve bu nedenle diğer PDTO'lar için ayarlamalar gerektirebilir.

3. Ayrışma

  1. Işınlamadan hemen sonra, PDTO içeren her matrigel kubbesini 2 mL zenginleştirilmiş DMEM / F12 kültür ortamı ile yıkayın ve bunları bir p1000 mikropipet kullanarak 1-3 mL TrypL-E içinde yeniden süspanse edin. Her kuyucuk için yaklaşık 30 kez tekrarlayın.
  2. Hücre süspansiyonunu 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın ve 37 ° C'de bir su banyosunda ~ 5 dakika inkübe edin.
  3. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyerek peletleyin.
  4. Tüpte ~ 1 mL bırakmak için fazla TrypL-E'yi çıkarın ve hücreleri yıkamak için zenginleştirilmiş DMEM / F12 ortamının orijinal enzim hacminin 3 katını (bkz. adım 3.1) ekleyin.
  5. 40 μm'lik bir ağ filtresi kullanarak hücre süspansiyonunu filtreleyin. Bu adım, kaplamada hiçbir hücre kümesinin kalmamasını ve her yeni PDTO'nun tek bir hücreden kaynaklanmasını sağlar.
  6. PBS'de %10 tripan mavisi ile boyandıktan sonra hücreleri otomatik bir hücre sayacında sayın ve 50 μL zenginleştirilmiş DMEM/F12 ortamında 800 hücre artı 4 ° C'de %66 matrigel olacak şekilde yeniden süspanse edin (1 kubbe için koşullar).
  7. Kabarcık oluşumundan kaçınırken, canlı görüntüleme uyumlu 48 oyuklu bir kültür plakasından her bir kubbeyi ayrı bir kuyucukta plakalayın. Her radyasyon dozu için teknik üçlüler önerilir.
  8. Matrijeli katılaştırmak için plakaları 30 dakika boyunca bir hücre kültürü inkübatörüne (37 °C,% 5 CO2) yerleştirin.
  9. 0.5-1 mL zenginleştirilmiş DMEM / F12 ortamı ekleyin, potansiyel kabarcıkları çıkarın ve plakaları bir hücre kültürü inkübatörü içindeki canlı görüntüleme sistemine yerleştirin. Görüntülemeden önce plakanın yaklaşık 30 dakika ayarlanan sıcaklığa dengelenmesine izin verin.
    NOT: Matrigel >4 °C sıcaklıklarda katılaşır, bu da bu sıcaklığın katılaşma gerekene kadar korunması gerektiği anlamına gelir.

4. Canlı görüntüleme

  1. Incucyte yazılımında, Schedule to Aquire'ı seçin.
  2. Launch Add Vessel'in sol üst köşesindeki artı işaretine tıklayın.
  3. Tekrar tekrar veya bir kez taramak için Scan on Schedule'ı seçin ve ardından İleri'ye tıklayın.
  4. Gemi oluşturmak veya geri yüklemek için Yeni Gemi Oluştur'u seçin ve ardından İleri'ye tıklayın.
  5. Tarama Türünü seçmek için Organoid'i seçin ve ardından İleri'ye tıklayın.
  6. Tarama ayarları: QC < ' Faz + Parlak Alan Görüntü Kanalları'nı seçin. '4x Hedef' otomatik olarak seçilir. Ardından İleri'ye tıklayın.
  7. Gemi Seçimi: Katalog numarasına göre yazılım onaylı uygun plakayı seçin.
  8. Gemi Konumu: Düzene göre plakanın cihaz üzerindeki konumunu seçin ve ardından İleri'ye tıklayın.
  9. Tarama Deseni: Plaka düzenine göre kuyuları seçin, ardından İleri'ye tıklayın.
  10. Gemi Not Defteri: İsim plakası (İsteğe bağlı: Hücre Tipi ve Pasajı adı). Plaka düzeninin sağ üst köşesindeki artı işaretine tıklayarak bir plaka Haritası oluşturun, 'Plaka haritası oluştur'.
  11. Plaka Harita Düzenleyicisinde, Hücreler bölümündeki Yeni Hücre Oluştur simgesine tıklayarak hücre tipini belirtin, artı simgesine tıklayarak uygun kuyulara uygulayın ve uygun kuyuları seçin. İsteğe bağlı: Tohumlanan hücrelerin ve geçitlerin sayısı belirtilebilir. Her hücre satırı için tekrarlayın.
  12. Büyüme Koşulları bölümündeki Yeni Hücre Oluştur ikonuna tıklayarak tedaviyi belirtin, artı simgesine tıklayarak uygun kuyucuklara uygulayın ve uygun kuyuları seçin. Her deney koşulu için tekrarlayın. Ardından, Tamam > İleri'ye tıklayın.
  13. Analiz Kurulumu: 'Analizi daha sonraya ertele' otomatik olarak seçilir; İleri'ye tıklayın.
  14. Tarama Takvimi: Süresiz olarak günde iki kez taramayı seçin. İleri'ye tıklayın. Aşırı büyüdüklerinde çökme eğiliminde olduklarından, ideal uç nokta için kontrol PDTO'larının karanlığını izleyin.
  15. Özet: Özeti kontrol edin ve Programa Ekle'ye tıklayın.
    NOT: Tarama özellikleri görselleştirilebilir ve gerekirse tarama zaman çizelgesine sağ tıklanarak program düzenlenebilir.

5. Analiz

  1. Uyumlu yazılımda Görüntüle'yi seçin. Bu, intranet aracılığıyla sisteme bağlı bir bilgisayardan da çalıştırılabilir.
  2. Üzerine çift tıklayarak istediğiniz deneyi seçin.
  3. Analizi Başlat simgesini seçin.
  4. Yeni Analiz Tanımı Oluştur'u seçin ve ardından İleri'ye tıklayın.
  5. Analiz Türü: Organoid'i seçin ve İleri'ye tıklayın.
  6. Görüntü Kanalları: 'Faz + Parlak Alan' varsayılan olarak seçilidir, 'İleri'yi tıklayın.
  7. Analiz için bir dizi temsili görüntü seçin. İleri'ye tıklayın. Erken ve geç zaman noktalarının ve farklı tedavi koşullarının, örneğin kontrol ve farklı radyasyon dozlarının seçilmesi önerilir.
  8. Aşağıdaki adımları izleyerek TNBC#1 için Analiz Tanımı gerçekleştirin:
    1. Görüntü üzerinde: Geçerli veya seçili görüntülerin varsayılan maskesini görselleştirmek için Geçerli Olanı Önizle veya 'Tümünü Önizle'yi seçin. Maskeyi güncellemek için analiz parametreleri değiştikçe tekrarlayın.
    2. Segmentasyon: Yarıçapı 300, Duyarlılık Arka Planı'nı 80, Kenar Bölme'yi AÇIK ve Kenar Hassasiyeti'ni 70 olarak ayarlayın.
    3. Temizleme: Delik Dolgusunu 5E+05μm2 olarak ayarlayın ve Boyutu 0 piksel olarak ayarlayın.
    4. Filtre: Minimum veya maksimum Alan yok, minimum Eksantriklik 0.19 olarak ayarlandı ve maksimum Eksantriklik yok. İleri'ye tıklayın.
  9. Tarama süreleri ve kuyucukları: İstenen tüm tarama zaman noktalarını ve kuyularını seçin. İleri'ye tıklayın. İsteğe bağlı: Gelecekteki Taramaları Analiz Et'i seçin.
  10. Analiz Tanımını Kaydedin ve Uygulayın: Tanım Adını girin ve İleri'ye tıklayın.
  11. Özeti görselleştirin ve Bitir'e tıklayın.
  12. Kullanıcıya analizin Analiz Kuyruğuna girdiğini bildirmek için bir açılır pencere görünür. Tamam'a tıklayın. Analiz Kuyruğu penceresi açıldıktan sonra, kalan görevler görselleştirilebilir.
  13. Gerekirse, Analizler sütununda, Gemi Adı'nın yanındaki mavi oku seçerek ve Analiz Tanımı Adı'na sağ tıklayarak tamamlanan analizi Görünüm'de alın. Ardından, Grafik analizi Metrikleri'ne tıklayarak yazılımdaki ham verileri görselleştirin veya Analiz Tanımını Dışa Aktar'ı seçerek daha fazla analiz için dışa aktarın.
    NOT: Ham veri dışa aktarma, Grafik analizi Metrikleri penceresinde özelleştirilebilir. Organoid Sayısı, Toplam Alan, Ortalama Eksantriklik ve Koyuluk ayrı ayrı dışa aktarılabilir ve veriler, Hiçbiri, Sütunlar, Satırlar veya plaka Haritası Çoğaltılır'a tıklanarak Gruplandırma Seç açılır menüsünde düzenlenebilir. TNBC#1 için, ham veri dışa aktarma, Grafik Analizi Ölçümleri ve Gruplandırma Seç aşağı çekme seçeneği için Yok seçeneği belirlendi. Bu ithalat parametreleri, TNBC#1 PDTO'ları ile yapılan ön değerlendirmelere dayanarak seçilmiştir. Bu nedenle, "Önizleme" özelliklerine dayalı olarak yazılımda mümkün olan diğer PDTO'lar için ayarlamalar gerektirebilirler. Büyük PDTO'ların hem kontrol hem de tedavi edilen koşullarda da elde edilmesini sağlamak için (1) çoğunlukla tek hücreli veya küçük PDTO'lar içeren erken görüntülerde ve (2) geç zaman noktalarında toplanan görüntülerde içe aktarma parametrelerinin uyarlanmasını öneririz.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TNBC # 1 PDTO'lar, 0. günde 0 (ışınlanmamış kontroller), 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy veya 10 Gy'lik tek bir radyasyon dozuna maruz bırakıldı. Bundan hemen sonra, her deneysel koşul için tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için PDTO'lar ayrıldı. PDTO'dan türetilen hücreler daha sonra, kuyucukların merkezinde biriktirilen f matrigel kubbeleri (her biri 50 μL) içinde 48 oyuklu plakalara, koşul başına 3 teknik kopya halinde ekildi. Plakalar canlı bir görüntüleme sistemine yerleştirildi ve toplam 30 gün boyunca organoid modül 4X objektifi kullanılarak her 6 saatte bir görüntülendi. TNBC # 1 PDTO'ların RT ile tek bir 2 Gy dozunda ışınlanması, PDTO'nun yeniden büyümesini önemli ölçüde geciktirirken, tamamlanan radyasyon dozları ≥4 Gy (10 Gy'ye kadar) büyüyen PDTO'ların rejenerasyonunu engelledi (Şekil 1).

figure-results-1
Şekil 1: Hasta kaynaklı tümör organoidlerinin (PDTO'lar) canlı görüntülenmesi. Meme kanseri TNBC # 1 hasta kaynaklı tümör organoidleri (PDTO'lar) tedavi edilmeden bırakıldı veya belirtilen radyasyon dozuna maruz bırakıldı, kısa bir süre sonra canlı hücre görüntüleme sistemi ile ayrışma, yeniden kaplama ve görüntüleme yapıldı. Kontrast ayarlaması (A) ve kantitatif değerlendirmeler (B, ortalama ± SEM) üzerine temsili görüntüler rapor edilir. Görüntü ölçeği: 1,19 x 1,16 mm (1,38 mm2). Ölçek çubuğu: 400 μm; iç kısımlar: 200 μm. ****p < 0,001 (0 Gy'ye kıyasla iki yönlü ANOVA); ####p < 0.001 (2 Gy ile karşılaştırıldığında iki yönlü ANOVA). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

ParçaKonsantrasyon
DMEM F/121 katı
GlutaMax (GlutaMax)1 katı
Hepes Belediyesi10 milyon
PenStrep Makinası100 U/mL
B27 Sertifikası1 katı
nAc1,25 milyon
Nikotinamid10 milyon
TGFbeta Reseptör İnhibitörü A83-010,5 μM
p38 MAP inhibitörü p38i SB2021901 μM
Kafa10%
Rspondin Medya10%
FGF10 Serisi20 ng/mL
FGF75 ng/mL
NR (Heregulin)5 nM
Çuha çiçeği100 μg/mL
Y-27632 (RhoKi)5 μM
Epidermal Büyüme Faktörü hEGF5 ng/mL

Tablo 1: PDTO kültür ortamı bileşimi.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, (1) in vitro PDTO ışınlaması üzerine PTDO oluşturan kök benzeri hücrelerin kalıcılığına ve (2) bu hücrelerin üretebileceği PDTO'ların büyüme hızına dayalı olarak PDTO radyosensitivitesini ölçmek için meme kanseri PDTO'larından ve canlı görüntülemeden yararlanan geleneksel klonojenik testlerin bir adaptasyonunu açıklıyoruz. Bu protokolün kritik adımları şunları içerir: (1) PDTO'ların iyi canlılık sağlayan bir kubbe doluluğuna kurulması, (2) sahte ışınlanmış kontrol koşulları dahil olmak üzere farklı dozlarda iyonlaştırıcı ışınlamaya PDTO'ya maruz kalma; (3) PDTO'nun tek hücrelere ayrışması; (4) PDTO'dan türetilmiş tek hücrelerin yeniden kaplanması; ve (5) kontrol koşullarında önceden tanımlanmış bir kubbe doluluğuna kadar canlı görüntüleme.

Çoğunlukla PDTO oluşturma verimliliği ve kontrol koşullarında (farklı PDTO'lar arasında önemli ölçüde değişmesi muhtemel) PDTO büyüme oranı ile bağlantılı minimal modifikasyonlarla, bu protokolün ticari olarak mevcut birden fazla canlı görüntüleme platformuna ve hem meme hem de meme dışı türetme çok sayıda PDTO'ya uyarlanabilir olmasını bekliyoruz. Bir yandan, tek hücreli dispersiyon üzerinde temel PDTO oluşturma verimliliğinin, yalnızca görüntü tabanlı PDTO nicelleştirmesini değil, aynı zamanda tedavi edilmemiş PDTO'ların normal büyümesini de sağlayan bir yoğunlukta yeni PDTO'lar elde etmek için yeniden tohumlanacak tek hücrelerin sayısını etkilemesi beklenmektedir. Öte yandan, optimal analitik kapasiteleri korumak için bitişik PDTO'ların birleşmesinden kaçınılması gerektiğinden, PDTO büyüme oranının testin süresini etkilemesi beklenmektedir. Bu nedenle, her bir PDTO için kontrol koşullarında PDTO oluşturma verimliliğinin ve PDTO büyüme oranının belirlenmesi, bu protokolün doğru uygulanması için kritik öneme sahiptir.

Bu yöntemin oldukça basit olduğu görülse de, bazı sınırlamaları vardır. İlk olarak, aşırı düşük sayıda PDTO oluşturan hücre, tek hücreli ayrışma üzerine normal olarak büyüyen PDTO'ların rejenerasyonunu bozabilir. Gerçekten de, rutin PDTO geçişi eksik ayrışma ile elde edilebilirken, bu protokol tarafından sunulan kantitatif değerlendirmeler, tek hücreli bir süspansiyonun oluşturulmasına dayanır (bu, sayım sırasında görsel olarak doğrulanabilir). İkincisi, aşırı yavaş bir büyüme hızı, testin süresini önemli ölçüde uzatabilir ve potansiyel olarak kesin olmayan bir radyosensitivite tahminine neden olabilir. Yavaş büyüyen PDTO'ların uç nokta uyumlu bir boyuta ulaşması için gereken uzatılmış bir kültür süresinin, subleölümcül olarak ışınlanmış PDTO oluşturan hücrelerin stresten kurtulması ve saptanabilir (yavaş büyüyen) PDTO'ları geri kazanması için ekstra şanslar sunabileceği gerçekten düşünülebilir. Son olarak, ışınlamadan kısa bir süre sonra PDTO'ların ayrılmasının, PDTO oluşturan hücreler üzerinde ek stres oluşturması ve iyileşmenin erken aşamalarında değişen hücre-hücre iletişiminin bir sonucu olarak potansiyel olarak radyosensitiviteyi artırması beklenmektedir. 24-72 saatlik ayrışmanın geciktirilmesi, korunmuş hücre-hücre iletişiminin, PDTO oluşturan hücrelerin RT tarafından empoze edilen makromoleküler hasardan kurtulma yeteneğine göreceli katkısı hakkında fikir verebilir.

Canlı görüntüleme platformları, PDTO oluşumunu ve büyümesini uzunlamasına izlemek için uygun bir yöntem sunarken, tek uç nokta görüntüleri de aynı amaç için kullanılabilir. Bu durumda, görüntülemeden önce bitişik PDTO'ların birleşmemesini sağlamak için dikkat edilmelidir ve büyüme hızı, test süresine normalize edilmiş PDTO boyutunun bir fonksiyonu olarak değerlendirilebilir.

Kişiselleştirilmiş kanser tıbbı çağında, bireysel tümörlerin tedaviye duyarlılığını değerlendirmek, geliştirilmiş etkinliğe sahip bireyselleştirilmiş terapötik stratejilerin tasarımı için bazı ipuçları sağladığı için son derece önemlidir29. Burada tarif edilen protokol, bireysel PDTO'ların iyonlaştırıcı radyasyona (tek başına veya diğer terapötik modalitelerle birlikte) hücresel duyarlılığını tahmin etmek için uygun bir yaklaşım sağlayarak bu çabaya uyar. Bununla birlikte, PDTO'lardan kanser hücresi radyosensitivitesinin ölçülmesinin, kanserli bireysel hastaların fokal RT'ye tepkisini doğru bir şekilde tahmin edip etmediği gösterilmeye devam etmektedir. Farklı PDTO'ların ışınlamaya karşı radyosensitivitesini, ilgili donörlerinin RT'ye klinik yanıtı ile ilişkilendirmek, bu olasılığa ilişkin önemli bilgiler sağlayacaktır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmayla ilgisi olmayan SCF, Merck, Varian, Bristol Myers Squibb, Celldex, Regeneron, Eisai ve Eli-Lilly ile araştırma sözleşmeleri yürütmektedir ve Bayer, Bristol Myers Squibb, Varian, Elekta, Regeneron, Eisai, AstraZeneca, MedImmune, Merck US, EMD Serono, Accuray, Boehringer Ingelheim, Roche, Genentech, AstraZeneca, View Ray ve Nanobiotix'ten danışmanlık/danışmanlık onuru almıştır. Bu çalışmayla ilgili olmayan SD, Lytix Biopharma, EMD Serono, Ono Pharmaceutical, Genentech ve Johnson & Johnson Enterprise Innovation Inc.'den danışmanlık/danışmanlık onuru almıştır ve Lytix Biopharma, Nanobiotix ve Boehringer-Ingelheim ile araştırma sözleşmeleri yürütmektedir/sürdürmektedir. Bu çalışmayla ilgisi olmayan LG, Lytix Biopharma, Promontory ve Onxeo ile araştırma sözleşmeleri yürütüyor, Boehringer Ingelheim, AstraZeneca, OmniSEQ, Onxeo, The Longevity Labs, Inzen, Imvax, Sotio, Promontory, Noxopharm, EduCom ve Luke Heller TECPR2 Vakfı'ndan danışmanlık/danışmanlık onuru aldı ve Promontory hisse senedi opsiyonlarına sahip.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolün geliştirilmesindeki yardımları için Raymond Briones ve Wen H. Shen'e (Weill Cornell Medical College, New York, NY, ABD) teşekkür ederiz. Bu çalışma, ABD Savunma Bakanlığı BCRP'den (#W81XWH2120034, PI: Formenti) Dönüştürücü Meme Kanseri Konsorsiyumu Hibesi ile desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
40 ve mikro; m örgü filtreThomas Scientific1164H35
B27Invitrogen17504-044
Cellometer Otomatik T4 Parlak Alan Hücre SayacıNexcelom
DMEM F /12 Corning 12634-010
Epidermal Büyüme Faktörü hEGFPeprotechAF-100-15
EVOS FL Dijital Ters Floresan Mikroskobu Thermo Fisher Scientific12-563-460
FGF10Peprotech100-26
FGF7Peprotech 100-19
GlutaMax Canlandırıcı 
HepesInvitrogen 15630-080
IncuCyte yazılımı 2021ASartoriusversiyonu: 2021A
Incucyte SX1Sartoriusmodeli SX1
Incucyte onaylı 48 kuyulu plakaCorning 3548
MatrigelKeşif Laboratuvarı354230
nAcSigma Aldrich A9165-5G
NikotinamidSigma-AldrichN0636
Noggin, Englander Hassas Tıp Enstitüsü, Weill Cornell, NY, ABD'den Satın
Alındı İşlenmemiş 6 kuyulu plakaCellstar657 185
NR (Heregulin)Peprotech100-03
p38 MAP inhibitörü p38i SB202190Sigma Aldrich S7067
PBSCorning 21-040-CV
PenStrepInvitrogen15140-122
PrimocinInvivogenant-pm-1
Rspondin MediaEnglander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell, NY, ABD'den Satın Alındı
Küçük Hayvan Radyasyonu Araştırma Platformu (SARRP) Xstrahl Ltd
TGFbeta Reseptör İnhibitörü A83-01Tocris2939
Tripan mavisi Leke (% 0.4)Gibco15250-61
TrypLEGibco112605-028
Y-27632 (RhoKi)SelleckS1049
35050061

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. De Ruysscher, D., et al. Radiotherapy toxicity. Nat Rev Dis Primers. 5 (1), 13(2019).
  2. Bates, J. E., Sanders, T., Arnone, A., Elmore, S. N. C., Royce, T. J. Geographic density of linear accelerators and receipt of radiation therapy for prostate cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 111, 3, Supplement e351-e352 (2021).
  3. Harmenberg, U., Hamdy, F. C., Widmark, A., Lennernäs, B., Nilsson, S. Curative radiation therapy in prostate cancer. Acta Oncol. 50, Suppl 1 98-103 (2011).
  4. Nakano, T., Ohno, T., Ishikawa, H., Suzuki, Y., Takahashi, T. Current advancement in radiation therapy for uterine cervical cancer. J Radiat Res. 51 (1), 1-8 (2010).
  5. Spencer, K., Parrish, R., Barton, R., Henry, A. Palliative radiotherapy. BMJ. 360, k821(2018).
  6. Price, J. M., Prabhakaran, A., West, C. M. L. Predicting tumour radiosensitivity to deliver precision radiotherapy. Nat Rev Clin Oncol. 20 (2), 83-98 (2023).
  7. McLaughlin, M., et al. Inflammatory microenvironment remodelling by tumour cells after radiotherapy. Nat Rev Cancer. 20 (4), 203-217 (2020).
  8. Rodriguez-Ruiz, M. E., Vitale, I., Harrington, K. J., Melero, I., Galluzzi, L. Immunological impact of cell death signaling driven by radiation on the tumor microenvironment. Nat Immunol. 21 (2), 120-134 (2020).
  9. Cytlak, U. M., et al. Immunomodulation by radiotherapy in tumour control and normal tissue toxicity. Nat Rev Immunol. 22 (2), 124-138 (2022).
  10. Hanahan, D. Hallmarks of Cancer: New Dimensions. Cancer Discov. 12 (1), 31-46 (2022).
  11. Groelly, F. J., Fawkes, M., Dagg, R. A., Blackford, A. N., Tarsounas, M. Targeting DNA damage response pathways in cancer. Nat Rev Cancer. 23 (2), 78-94 (2023).
  12. Renaudin, X. Reactive oxygen species and DNA damage response in cancer. Int Rev Cell Mol Biol. 364, 139-161 (2021).
  13. Klapp, V., et al. The DNA damage response and inflammation in cancer. Cancer Discov. 13 (7), 1521-1545 (2023).
  14. Constanzo, J., Garcia-Prada, C. D., Pouget, J. P. Clonogenic assay to measure bystander cytotoxicity of targeted alpha-particle therapy. Methods Cell Biol. 174, 137-149 (2023).
  15. Serrano-Mendioroz, I., Garate-Soraluze, E., Rodriguez-Ruiz, M. E. A simple method to assess clonogenic survival of irradiated cancer cells. Methods Cell Biol. 174, 127-136 (2023).
  16. Petroni, G., et al. Radiotherapy delivered before CDK4/6 inhibitors mediates superior therapeutic effects in ER(+) breast cancer. Clin Cancer Res. 27 (7), 1855-1863 (2021).
  17. Alvarez-Abril, B., et al. Cytofluorometric assessment of acute cell death responses driven by radiation therapy. Methods Cell Biol. 172, 17-36 (2022).
  18. Bodey, R. K., Evans, P. M., Flux, G. D. Application of the linear-quadratic model to combined modality radiotherapy. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 59 (1), 228-241 (2004).
  19. Unkel, S., Belka, C., Lauber, K. On the analysis of clonogenic survival data: Statistical alternatives to the linear-quadratic model. Radiat Oncol. 11, 11(2016).
  20. Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillère, R., Smyth, M. J., Kroemer, G. Mouse models in oncoimmunology. Nat Rev Cancer. 16 (12), 759-773 (2016).
  21. Buqué, A., Galluzzi, L. Modeling Tumor immunology and immunotherapy in mice. Trends Cancer. 4 (9), 599-601 (2018).
  22. Lee, S. Y., Bissell, M. J. A Functionally robust phenotypic screen that identifies drug resistance-associated genes using 3D cell culture. Bio Protoc. 8 (22), e3083(2018).
  23. Mina, J. Bissell: Context Matters. Trends Cancer. 1 (1), 6-8 (2015).
  24. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nat Rev Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  25. Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: Model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
  26. van Renterghem, A. W. J., van de Haar, J., Voest, E. E. Functional precision oncology using patient-derived assays: Bridging genotype and phenotype. Nat Rev Clin Oncol. 20 (5), 305-317 (2023).
  27. Vitale, I., Manic, G., De Maria, R., Kroemer, G., Galluzzi, L. DNA damage in stem cells. Mol Cell. 66 (3), 306-319 (2017).
  28. Sachs, N., et al. A Living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  29. Zhou, Z., et al. Harnessing 3D in vitro systems to model immune responses to solid tumours: A step towards improving and creating personalized immunotherapies. Nat Rev Immunol. 24, 18-32 (2024).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Cellular RadiosensitivityTumor OrganoidsLive ImagingClonogenic AssayRadiation TherapyPatient Derived OrganoidsIonizing IrradiationOrganoid Growth RateStem Like CellsPersonalized Medicine

İlgili makaleler