Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Diyabetik Retinopati için Yeni Tanı Aracı olarak Gözyaşı Kaynaklı Ekzozomal MiR-15a

1.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66687

⸱

30 Aralık 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1UM Eye Research Centre (UMERC), Department of Ophthalmology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya, 2Department of Ophthalmology, Universiti Malaya Medical Centre, 3Department of Anaesthesiology and Department of Pathology, Johns Hopkins School of Medicine

Bu makalede

Özet

Bu makale, diyabetik retinopati için yeni bir tanı aracı olarak gözyaşlarından miR-15a'nın toplanması ve tespiti protokolünü açıklamaktadır.

Özet

Diyabetik retinopati (DR), diyabetin önemli bir komplikasyonudur ve diyabetli nüfusun önemli bir yüzdesini etkiler. Erken tanı ve müdahale, geri dönüşü olmayan görme kaybını önlemek için kritik öneme sahiptir. Mevcut tanı yöntemleri etkili olsa da sınırlamalar barındırmaktadır. miRNA, hedef mRNA'ların 3'-çevrilmemiş bölgelerine (3'-UTR) bağlanarak mRNA'nın stabilitesini ve/veya translasyonunu engelleyen küçük, kodlamayan bir RNA olup, giderek diyabetle anlamlı ilişkili olduğu ve gözyaşlarından elde edilebilen bir şekilde kabul edilmektedir. Bu çalışma, gözyaşı sıvısından kaynaklanan ekzozomal miR-15a'nın DR için yeni bir tanısal belirteç olarak potansiyelini araştırdı. Gözyaşı örnekleri 135 diyabetik hastadan (36'sı diyabetik retinopati [DR] ve 50'si DR olmadan) ve 49 sağlıklı kontrol ünitesinden alındı. Ekzozomlar izole edildi ve ekzozomal miR-15a'nın ifade seviyeleri damlacık dijital PCR (ddPCR) kullanılarak ölçüldü. Sonuçlar, diyabetli ve DR hastalarda ekzozomal miR-15a ekspresyonunun sağlıklı bireylere kıyasla değiştiğini gösterdi. Bu bulgular, gözyaşı sıvısından elde edilen ekzozomal miR-15a'nın diyabetin ve komplikasyonlarının altında yatan moleküler mekanizmalarda rol oynayabileceğini göstermektedir. Ayrıca, diyabetik retinopati için invaziv olmayan ve güvenilir bir tanı biyobelirteç olarak yüksek hassasiyet ve özgüllük sunma potansiyeline sahiptir.

Giriş

Diyabetik retinopati (DR), diyabetin en belirgin mikrovasküler komplikasyonlarından biridir ve dünya çapında milyonlarca insanın görüşünü tehdit etmektedir. IDP Atlas 2019'un nüfus verilerinden DR'nin küresel yaygınlığı, tüm diyabet nüfusunun %22,7'si olarak tahmin edilmiş, özellikle gelişmiş ve gelişmekte olan ülkelerde yeni vaka sayısı sürekliartmaktadır 1. Klinik olarak, DR erken evre DR veya proliferatif olmayan diyabetik retinopati (NPDR), geç evre DR veya proliferatif diyabetik retinopati (PDR) ve makula ödemi varlığı ile karakterize edilir. Artan damar geçirgenliği ve kapiller tıkanıklık, NPDR'de görülen iki yaygın patolojik değişimdir ve PDR 2,3 durumunda iris, makula, optik disk veya retinada anormal neovaskülerleşme gözlemlenir. PDR'ye ilerlemek, potansiyel olarak vitreus kanaması ve retina ayrılmasına yol açabilir ve önemli görmebozukluklarına yol açabilir 3. Tüm durumlarda, patolojik değişiklikler eğitimli oftalmologlar tarafından fundoskopi veya fundus fotoğraf muayenesi yoluyla tespitedilebilir 4. Standart fundus fotoğrafçılığı yöntemi kullanılarak, diyabetik retinopati %78-96 hassasiyet ve %86-%97 özbaşlılıkla tespit edilebilir5. Ancak bu yöntem retinada hasar oluştuğunda tespit edilir. Klinik olarak görülebilir retina belirtileri başlamadan önce DR'nin erken tespit edilmesine yönelik bir ihtiyaç vardır; örneğin blot retina kanamaları, mikroanevrizmalar, eksüdatlar ve yeni damar proliferasyonu.

Moleküler araçların ilerlemesi, kanser ve kardiyovasküler hastalıklar dahil olmak üzere çeşitli hastalıklar için potansiyel bir tanı aracı olarak ekzozomlarınkeşfedilmesine yol açtı 6,7. Ekzozomlar, hücrelerin çoğunun ekstraselüler vezikül (EV) alanına salgıladığı lipid çift katmanlı zarla bağlanan nano boyutlu parçacıklardır. Bu ekzosomlar kan, gözyaşı, tükürük ve idrar gibi biyosıvılarla taşınabilir, böylece invaziv olmayan veya minimal invaziv tanı işlemleri için kolayca erişilebilirolurlar8. Proteinler, lipidler ve nükleik asitler gibi çeşitli köken hücre belirteçleri taşırlar. Özellikle ilgi çekici olan, EV'lerde taşınan küçük, kodlamayan RNA'lardır. Bu RNA'lar proteinler için kodlanmamış olsa da, gen düzenlemesinde önemli roller oynar ve pankreas β hücreleri dahil olmak üzere birçok fizyolojik ve patolojik süreçte rol oynamıştır; bu hücrelerdiyabetin gelişiminde son derece önemlidir 9,10.

Özellikle, miR-15a'nın diyabet gelişimiyle güçlü bir ilişkisi olduğu gösterilmiştir; özellikle insülin üretiminin düzenlenmesi ve pankreas beta hücre fonksiyonları11. Grubumuz yakın zamanda miR-15a'nın diyabetik retinopati plazmasında değiştiğini göstermiştir. Ayrıca, miR-15a'nın pankreas beta hücreleri tarafından salgılandığı ve kan dolaşımıyla retina12'ye ulaştığı da gösterilmiştir. Gözyaşı sıvısı, gözden kolayca alınabilen, invaziv olmayan ve maliyet etkin bir şekilde kolayca elde edilebilen bir sıvıolarak kabul edilir 13. Çeşitli proteinler, lipidler, elektrolitler ve diğer moleküllerin karışımını içerir; bu karışım, göz yüzeyi ve çevresindeki dokuların, retina14 dahil olmak üzere fizyolojik durumunu yansıtır. Gözyaşı sıvısında, serum ve sulu humorçözeltisi 15,16'ya göre daha fazla miRNA tespit edilmiştir. Gözyaşı bileşimi, diyabet17 dahil olmak üzere çeşitli sistemik durumlara yanıt olarak değişir. Aslında, gözyaşı sıvısı analizinin multipl skleroz ve meme kanseri gibi göz ile ilişkili olmayan diğer hastalıkların izlenmesi ve teşhisi için umut verici bir potansiyele sahip olduğugösterilmiştir 18,19. Diyabetik retinopatinin gözle doğrudan bağlantısı göz olduğundan, bu hastalıkta gözyaşı sıvısının potansiyel tanısal özelliklerini araştırmak daha uygun olur. Diyabetik retinopati hastalarının gözyaşı sıvılarındaki IL-1RA, IL-8, IL-6 ve TNF-α seviyelerinin hastalığın şiddetine göre değişen değişiklikler yaşandığıgözlemlenmiştir 20,21. Geleneksel fundoskopi muayenesine kıyasla, diyabetik retinopati için gözyaşı sıvısı analizi erişilebilirlik, invaziv olmama ve özgüllük açısından potansiyel avantajlar sunar ve hastalığın başlangıcından önce erken teşhis imkanısağlar 22.

Bu nedenle, bu çalışmanın temel amacı, gözyaşı sıvısından kaynaklanan ekzozomal miR-15a'nın diyabetik retinopati için yeni bir tanısal belirteç olarak potansiyelini, diyabetik retinopati popülasyonunun gözyaşı sıvılarından miRNA izolasyonu ve nicelenmesi yoluyla araştırmaktır. Bununla birlikte, retina komplikasyonları başlamadan önce bile tespit edilebilen gözyaşı sıvısı taraması yoluyla diyabetik retinopati için yeni bir tespit yöntemi ortaya çıkar ve erken önleyici veya terapötik önlemler alınmasına olanak tanır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Çalışma, Universiti Malaya Tıp Merkezi Tıbbi Araştırma Etik Komitesi'nin onayı ile yürütüldü (Referans numarası: 20165-2446). Başvuru öncesi tüm insan deneklerden yazılı onay alındı. Kuala Lumpur'daki Universiti Malaya Tıp Merkezi'ndeki (UMMC) oftalmoloji kliniğine giden hastalar arasında toplam 135 denek dahil edildi. Dahil etme kriterleri arasında, UMMC kapsamında hizmet alan ve 20-80 yaş arası hastalar bulunuyordu. Son 3 ayda lazer veya anti-VEGF tedavisi geçmişi olan veya düzenli anti-trombositler veya kan sulandırıcılar kullanan aktif insülin tedavisi gören hastalar çalışmadan dışlandı. Katılımcılar üç gruba ayrıldı: (1) sağlıklı kontrol (Kontrol), (2) retinopati olmayan diyabetli (DM No DR) ve (3) retinopati olan diyabetik (DR). Protokolün özeti Şekil 1'de verilmiştir. Bu çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

figure-protocol-1
Şekil 1: Protokolün genel özeti. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

1. Malzemelerin hazırlanması    

  1. İki penseps, altı pamuk topu, dört gazlı bez, bir tepsi ve bir biyolojik tehlike torbası içeren steril temel bir pansuman seti yerleştirin.
  2. Bir tepsiye %0,9 w/v sodyum klorür sulama çözeltisi 5,9 ml dökün.
  3. Bir paket göz kapağı temizleyici mendil açın ve steril alana koyun.
  4. 250 μL koruyucu çözelti içeren bir tüp hazırlayın.
  5. Steril şeridi steril alana yerleştirmeden önce, ambalajında hala kama seviyesinde bir Schirmer şeridi katlayın.
  6. Cerrahi eldivenleri aseptik şekilde giyin.
  7. Steril forseps kullanarak, pamuk toplarını %0,9 w/v steril sodyum klorür sulama çözeltisi ile nemlendirin.

2. İnsan deneklerin hazırlanması    

  1. Kişinin rahat oturmasına izin verin ve gözlerini kapatmasını istesin.
  2. Periorbital cildi, sulama çözeltisine batırılmış pamuk toplarıyla dört kez silin.
  3. Periorbital cildi göz kapağı temizleyici mendil ile silin.

3. İnsan gözyaşı sıvısının toplanması

  1. Demsal alt fornix'e yerleştirilen Schirmers şeridi kullanarak gözyaşı sıvılarını toplayın.
  2. Kısmen katlanmış şeridi sağ göze yerleştirirken, deneğin sola bakmasını iste. Alt kapağı aşağı çekerek alt fornixi ortaya çıkarın.
  3. Steril forseps çifti kullanarak, alt konjonktival forniksin dış üçte ikisine bir Schirmer şeridi yerleştirin. Numunenin ter veya ciltte başka maddelerle kontaminasyonunu önlemek için şeridin cilde temas etmesini engelleyin.
  4. Cilt temasını önlemek için şeridin altına bir gazlı bez koyun.
  5. Yırtıkların şeride 20 mm ya da en fazla 5 dakika boyunca emilmesine izin verin, hangisi önce gelirse.
  6. 20 mm seviye işaretine ulaşılmazsa, gözyaşı sıvısı hacminin standartlaştırılması için işaretlere göre yırtık seviyesini belgeleyin.
  7. Steril forseps kullanarak, Schirmer şeridini dikkatlice çıkarın ve şeridi 1x fosfat tampon tuzlu (PBS) çözeltisi içeren bir tüpün içine yerleştirin.
  8. Tüpü laboratuvara taşımak için bir soğutucu kutusuna yerleştirin.
  9. Periorbital yüzeyi ciltteki kalıntı çözeltiyi silerek temizleyin.

4. Gözyaşı örneklerinin ön işlemesi    

  1. Schirmer şeridinin bulunduğu tüpü oda sıcaklığında 5 dakika PBS'de bekletiltildi.
  2. Tüpü oda sıcaklığında bir sallanan üzerinde 5 dakika boyunca çaltın.
  3. Tüpü 2000 x g ile 15 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın.
  4. Çözeltiyi yeni bir tüpe aktarın, etiketleyin ve -80 °C'de tutun, sonra işleme yapılana kadar.
  5. Kalan şeridi at.

5. Ekzosom izolasyonu

NOT: RNA izolasyonu, üretici protokolüne uygun ticari olarak mevcut bir kit kullanılarak gerçekleştirilir ( bkz. Malzeme Tablosu).

  1. Gözyaşı çözeltiyi buz üzerinde 10 dakika erit.
  2. Kullanmadan önce spin kolonunu oda sıcaklığında 15 dakika dengede tutun.
  3. Kolonun alt çıkışını çıkarın ve verilen atık toplama plakasına yerleştirin.
  4. Üst sızdırmazlık matını çıkarın ve depolama tamponunun yerçekimiyle kolonun içinden geçmesine izin verin.
  5. 250 μL PBS ekleyin ve kolonun içinden geçmesine izin verin.
  6. 5.5. adımı tekrarlayın.
  7. Her sütunun üstüne 110 μL bir örnek uygulayın ve numunenin kolona girmesine izin verin.
  8. Kolonu verilen örnek toplama plakasına aktarın.
  9. 100 μL PBS ekleyin ve kolonun içinden numune toplama plakasına geçmesine izin verin.
  10. Kolonu atık toplama plakasına aktarın.
  11. Kolona 4x 200 μL PBS ekleyin ve ilk yüklemeden serbest protein fraksiyonunu çıkarmak için kolona girmesine izin verin.
  12. Sütuna 110 μL örnek ekleyin. Sütuna girmenize izin verin.
  13. Sütunu örnek toplama plakasına yerleştirin. 100 μL PBS ekleyin ve kolonun içinden geçmesine izin verin.
  14. Örnek toplama plakasını 100 x g ile 30 saniye boyunca kısa süreliğine santrifüj yapın. İzole ekzosomlar artık RNA izolasyonuna hazırdır.

6. RNA izolasyonu

NOT: RNA izolasyonu, üretici protokolüne uygun ticari olarak mevcut bir kit kullanılarak gerçekleştirilir ( bkz. Malzeme Tablosu).

  1. İzole ekzosomların 200 μL'si RNA izolasyonuna uygulandı.
  2. İzole ekzosomlara 60 μL lizis tamponu ekleyin. 5 saniyelik vortex.
  3. Oda sıcaklığında 3 dakika kuluçka yapın.
  4. 20 μL inhibitör çökeltme tamponu ekleyin, 20 saniye girdap ekleyin ve oda sıcaklığında 3 dakika kuluçka yapın.
  5. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 12.000 x g santrifüj yapın.
  6. Berrak, renksiz süpernatantı yeni bir tüpe aktarın.
  7. 1 hacim izopropanol ekleyin.
  8. 5 saniye girdabı yapın ve çözümü kitte sağlanan mini spin kolonuna aktarın.
  9. Oda sıcaklığında 15 saniye boyunca 8000 x g sıcaklıkta santrifüj yapın. Akışı at.
  10. Kolonu 700 μL RWT yıkama tamponu ile yıkayın.
  11. 8000 x g hassasiyetinde 15 saniyelik santrifüj. Akışı at.
  12. Kolonu 500 μL RPE yıkama tamponu ile yıkayın.
  13. 8000 x g hassasiyetinde 15 saniyelik santrifüj. Akışı at.
  14. Örnek mini spin kolonuna %80 etanol 500 μL ekleyin.
  15. 8000 x g hassasiyetinde 2 dakika santrifüj yapın. Akış ve toplama tüpünü atın.
  16. Mini spin kolonunu yeni 2 mL'lik toplama tüpüne yerleştirin.
  17. Kolon ve tüpü 18.000 x g ile 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Akışı ve toplama borusunu at.
  18. Mini spin kolonunu yeni bir 1.5 mL tüpün içine yerleştirin ve spin kolon membranının ortasına 15 μL RNase içermeyen su ekleyin.
  19. Oda sıcaklığında 3 dakika kuluçka yapın.
  20. RNA'yı elütasyon etmek için 18.000 x g hassasiyetinde 1 dakika boyunca santrifüj yapın. RNA, aşağı akış işleme için hazırdır.
  21. Kalite kontrolü ve RNA veriminin doğrulanması için Nanopartikül takip analizi yap.

7. cDNA sentezi

  1. Üretici protokollerine uygun ticari olarak sunulan kitlerle cDNA sentezi yapmak ( bkz. Malzeme Tablosu).
  2. Ana karışımı Tablo 1'e göre 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünde hazırlayın.
  3. Çözeltiyi pipetle yukarı aşağı karıştırın.
  4. Ana karışımın 5.1 μL pipetini 0.1 μL PCR tüplerine koyun.
  5. Ana karışımı içeren tahsis tüpüne 9,9 μL örnek ekleyin.
  6. PCR tüplerini termosiklere yerleştirin ve Tablo 2'ye göre çalıştırın.
    NOT: cDNA daha fazla analiz için hazırdır.
BileşenHacim/tepki
10x RT Buffer1.5 μL
100M dNTP karışımı0.15 μL
RNAse İnhibörü (200U/μL)0.19 μL
Multiscribe RT Enzimi (50U/μl)1 μl
20x RT Primer0.75 μL
RNAssız Su1.51 μL
Örnek9.9 μL
Toplam Hacim15 μL

Tablo 1: İzole RNA'dan cDNA sentezi için kullanılan PCR ana karışımının hazırlanması.

AdımSıcaklıkSüre
Ters Transkripsiyon16 °C30 dakika
42 °C30 dakika
Dur85 °C5 dakika
Bekle4 °C

Tablo 2: cDNA sentezi için termodöngü koşulları.

8. Dijital damla PCR

NOT: Dijital damlacık PCR (ddPCR), üretici protokollerine uygun ticari olarak mevcut kitler kullanılarak yapılır (bkz. Malzeme Tablosu).

  1. Master karışımı 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünde Tablo 3'e göre ddPCR için hazırlayın.
  2. 19.8 μL ana karışımı 0.1 μL PCR tüplerine pipet yapın. 2.2 μL numune ekleyin ve karışımı 10 kez yukarı aşağı pipetle iyice karıştırın.
  3. Örnek karışımından 20 μL ddPCR kartuşunun örnek hattına aktarın.
  4. Kartuşun yağ hattına 50 μL yağ ekleyin.
  5. Plakadaki kanca kullanarak kartuşa bir conta takın.
  6. Kartuşu damla üretim makinesine yerleştirin. Bir tık sesi, kartuşun damla üretim makinesine doğru şekilde yerleştirildiğini gösterir.
  7. Oluşan tüm damlaları dikkatlice 96 kuyuyla bir plakanın kuyularına aktarın. En az bir şablon kontrolü olmayan bir kuyu ekleyin, negatif bir kontrol de ekleyin.
  8. Plakayı, delinebilir bir folyo ile plaka sızdırdırma makinesinde (bkz. Malzemeler Tablosu).
  9. Plakayı bir termosikleye koyun ve Tablo 4'e göre çalıştırın.
  10. Plakayı damla okuyucu makinesine aktararak pozitif ve negatif damlacıkları sayın.
  11. Kopya sayısını/mL'yi koşudan elde edilen kopya numarası/20 μL değeriyle nicelikle ölçün.
BileşenHacim/tepki
Problar için 2x ddPCR Supermix (dUTP yok)10 μL
20x Primer/prob1 μL
Örnek7 μL
RNAssız Su2 μL
Toplam Hacim20 μL

Tablo 3: ddPCR için kullanılan PCR ana karışımının hazırlanması.

AdımSıcaklıkSüreRampaDöngü
Enzim Aktivasyonu95 °C10 dakikaHer basamak için ~2 °C/ s1
Denatürasyon94 °C30 s40
Tavlama60 °C1 dakika40
Enzim deaktivasyonu98 °C10 dakika1
Bekle4 °CYokYok

Tablo 4: ddPCR için termodöngü koşulları.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Standart eğri
Her hastadan toplanan tam gözyaşı hacmini belirlemek için standart bir eğri oluşturuldu. Temelde, 3 μL ile 25 μL arasındaki farklı koruyucu hacimleri Schirmer şeritlerine maruz kaldı. Ve Schirmer'deki ıslak alanın mesafesi gözlemlendi. İşlem her işlem için üç kez tekrarlandı ve ortalama okuma hesaplandı. Toplanan gözyaşı hacmi ile Schirmer'in ıslak alanlarının mesafesi arasında standart bir eğri oluşturuldu (Şekil 2) ve topl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Funduskopi, optik koherens tomografi ve floresken anjiyografi, diyabetik retinopati tespiti için mevcut tespit teknikleridir. Bu üç teknik, çeşitli retinal ve koroidal hastalıkların kapsamlı bir değerlendirmesini sağlamak için sıklıkla birlikte kullanılır. Funduskopi, diyabetik retinopati değerlendirmesi sırasında rutin olarak yapılan bir klinik muayenedir. Bu yöntem, eğitimli göz doktorları tarafından uygulanmakta olup, diyabetik retinopatinin tanısında altın standarttır. Bu yöntem, ret...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden çıkarları olmadığını belirtirler.

Teşekkürler

Bu araştırma, Alcon Araştırma Enstitüsü (IF011-2020) ve FOM UMSC Bakım Doktora Sonrası Araştırma Hibesi 2021 tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%0,9 v/v/v. Sodyum klorürAin Medicare Sdn BhdGB16165967618
1x Fosfat Tampon SalinThermo Fisher Scientific10010-023
Applied Biosystems  TaqMan MicroRNA Ters Transkripsiyon KitiUygulamalı Biyosistemler4366596
ddPCR Problar için Supermix (dUTP yok)BioRad Laboratuvarları1863024
ddPCR 96-Kuyulu PlakalarBioRad Laboratuvarları12001925
DG8 KartuşlarıBioRad Laboratuvarları1864008
DG8 ContalarıBioRad Laboratuvarları1863009
Problar için Damla Üretim YağıBioRad Laboratuvarları1863005
Exospin-96 Ekzozom İzolasyon KitiHücre Yönlendirme SistemleriEX07-96
miRNeasy Serum/Plazma İleri KitiQiagen  217204
PX1 PCR Plaka KapatıcıBioRad Laboratuvarları1814000
QX100 damlalı dijital PCR SistemiBioRad LaboratuvarlarıQX100
QXDx Damla Jeneratörü BioRad Laboratuvarları12001049
Schirmer ŞeridiOptitechSCH-100
T100 Termal DöngücüBioRad Laboratuvarları1861096
Taqman MikroRNA Testi MTOMED 20 (Test Kimliği: 000389)Uygulamalı Biyosistemler4440887Hedef Dizisi: UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG

Kaynaklar

  1. Teo, Z. L., et al. Global prevalence of diabetic retinopathy and projection of burden through 2045: Systematic review and meta-analysis. Ophthalmology. 128 (11), 1580-1591 (2021).
  2. Sayin, N., Kara, N., Pekel, G. Ocular complications of diabetes mellitus. World J Diabetes. 6 (1), 92-108 (2015).
  3. Wang, W., Lo, A. C. Y. Diabetic retinopathy: Pathophysiology and treatments. Int J Mol Sci. 19 (6), 1816(2018).
  4. Yang, Z., Tan, T. E., Shao, Y., Wong, T. Y., Li, X. Classification of diabetic retinopathy: Past, present and future. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 1079217(2022).
  5. Goh, J. K. H., et al. Retinal imaging techniques for diabetic retinopathy screening. J Diabetes Sci Technol. 10 (2), 282-294 (2016).
  6. Parizadeh, S. M., et al. Circulating exosomes as potential biomarkers in cardiovascular disease. Curr Pharm Des. 24 (37), 4436-4444 (2018).
  7. Nair, S., Tang, K. D., Kenny, L., Punyadeera, C. Salivary exosomes as potential biomarkers in cancer. Oral Oncol. 84, 31-40 (2018).
  8. Dellar, E. R., Hill, C., Melling, G. E., Carter, D. R. F., Baena-Lopez, L. A. Unpacking extracellular vesicles: RNA cargo loading and function. J Extracell Biol. 1 (5), e40(2022).
  9. Fluitt, M. B., Kumari, N., Nunlee-Bland, G., Nekhai, S., Gambhir, K. K. miRNA-15a, miRNA-15b, and miRNA-499 are reduced in erythrocytes of pre-diabetic African-American adults. Jacobs J Diabetes Endocrinol. 2 (1), 014(2016).
  10. Belgardt, B. F., et al. The microRNA-200 family regulates pancreatic beta cell survival in type 2 diabetes. Nat Med. 21 (6), 619-627 (2015).
  11. Sun, L. L., et al. MicroRNA-15a positively regulates insulin synthesis by inhibiting uncoupling protein-2 expression. Diabetes Res Clin Pract. 91 (1), 94-100 (2011).
  12. Kamalden, T. A., et al. Exosomal microRNA-15a transfer from the pancreas augments diabetic complications by inducing oxidative stress. Antioxid Redox Signal. 27 (13), 913-930 (2017).
  13. Posa, A., et al. Schirmer strip vs. capillary tube method: Non-invasive methods of obtaining proteins from tear fluid. Ann Anat. 195 (2), 137-142 (2013).
  14. Ohashi, Y., Dogru, M., Tsubota, K. Laboratory findings in tear fluid analysis. Clin Chim Acta. 369 (1), 17-28 (2006).
  15. Nakagawa, A., Nakajima, T., Azuma, M. Tear miRNA expression analysis reveals miR-203 as a potential regulator of corneal epithelial cells. BMC Ophthalmol. 21 (1), 377(2021).
  16. Chan, H. W., et al. A pilot study on microRNA profile in tear fluid to predict response to anti-VEGF treatments for diabetic macular edema. J Clin Med. 9 (9), 2920(2020).
  17. Barmada, A., Shippy, S. A. Tear analysis as the next routine body fluid test. Eye (Lond). 34 (10), 1731-1733 (2020).
  18. Tomečková, V., et al. Experimental analysis of tear fluid and its processing for the diagnosis of multiple sclerosis. Sensors (Basel). 23 (11), 5251(2023).
  19. Daily, A., et al. Development and validation of a short-term breast health measure as a supplement to screening mammography. Biomark Res. 10 (1), 76(2022).
  20. Quevedo-Martínez, J. U., et al. Pro-inflammatory cytokine profile is present in the serum of Mexican patients with different stages of diabetic retinopathy secondary to type 2 diabetes. BMJ Open Ophthalmol. 6 (1), e000717(2021).
  21. Sorkhabi, R., Ahoor, M. H., Ghorbani Haghjo, A., Tabei, E., Taheri, N. Assessment of tear inflammatory cytokines concentration in patients with diabetes with varying severity of involvement. Exp Eye Res. 224, 109233(2022).
  22. Adigal, S. S., et al. Human tear fluid analysis for clinical applications: Progress and prospects. Expert Rev Mol Diagn. 21 (8), 767-787 (2021).
  23. Mackay, D. D., Garza, P. S., Bruce, B. B., Newman, N. J., Biousse, V. The demise of direct ophthalmoscopy: A modern clinical challenge. Neurol Clin Pract. 5 (2), 150-157 (2015).
  24. Saeedi, P., et al. Global and regional diabetes prevalence estimates for 2019 and projections for 2030 and 2045: Results from the International Diabetes Federation Diabetes Atlas, 9th edition. Diabetes Res Clin Pract. 157, 107843(2019).
  25. Kong, L., et al. Significance of serum microRNAs in pre-diabetes and newly diagnosed type 2 diabetes: A clinical study. Acta Diabetol. 48, 61-69 (2011).
  26. Baldeón, R. L., et al. Decreased serum level of miR-146a as sign of chronic inflammation in type 2 diabetic patients. PLoS One. 9 (12), e115209(2014).
  27. Liang, Y. Z., et al. Identification of neuroendocrine stress response-related circulating microRNAs as biomarkers for type 2 diabetes mellitus and insulin resistance. Front Endocrinol (Lausanne). 9, 132(2018).
  28. Wan, S., et al. Increased serum miR-7 is a promising biomarker for type 2 diabetes mellitus and its microvascular complications. Diabetes Res Clin Pract. 130, 171-179 (2017).
  29. Santovito, D., et al. Plasma microRNA signature associated with retinopathy in patients with type 2 diabetes. Sci Rep. 11 (1), 4136(2021).
  30. Smit-McBride, Z., et al. Unique molecular signatures of microRNAs in ocular fluids and plasma in diabetic retinopathy. PLoS One. 15 (7), e0235541(2020).
  31. Sun, Y., Liu, W., Zuo, C. Regulatory role of miRNA-23a in diabetic retinopathy. Exp Ther Med. 22 (6), 1-9 (2021).
  32. Wong, W. K. M., et al. MicroRNA profiling from tears as a potential non-invasive method for early detection of diabetic retinopathy. Methods Mol Biol. 2678, 117-134 (2023).
  33. Amorim, M., et al. Putative biomarkers in tears for diabetic retinopathy diagnosis. Front Med (Lausanne). 9, 873483(2022).
  34. Arroyo, C. A. -D., et al. Diurnal variation on tear stability and correlation with tear cytokine concentration. Cont Lens Anterior Eye. 45 (6), 101705(2022).
  35. Patel, S., Mittal, R., Kumar, N., Galor, A. The environment and dry eye: Manifestations, mechanisms, and more. Front Toxicol. 5, 1173683(2023).
  36. Benito, M. J., et al. Intra- and inter-day variation of cytokines and chemokines in tears of healthy subjects. Exp Eye Res. 120, 43-49 (2014).
  37. Bachhuber, F., Huss, A., Senel, M., Tumani, H. Diagnostic biomarkers in tear fluid: From sampling to preanalytical processing. Sci Rep. 11 (1), 10064(2021).
  38. Shoji, J., Aso, H., Inada, N. Clinical usefulness of simultaneous measurement of the tear levels of CCL17, CCL24, and IL-16 for the biomarkers of allergic conjunctival disorders. Curr Eye Res. 42 (5), 677-684 (2017).
  39. Gijs, M., et al. Pre-analytical sample handling effects on tear fluid protein levels. Sci Rep. 13 (1), 1317(2023).
  40. Vandermeid, K. R., Su, S. P., Krenzer, K. L., Ward, K. W., Zhang, J. Z. A method to extract cytokines and matrix metalloproteinases from Schirmer strips and analyze using Luminex. Mol Vis. 17, 1056-1063 (2011).
  41. Benlloch-Navarro, S., et al. Lipid peroxidation is increased in tears from the elderly. Exp Eye Res. 115, 199-205 (2013).
  42. Li, K., Chen, Z., Duan, F., Liang, J., Wu, K. Quantification of tear proteins by SDS-PAGE with an internal standard protein: A new method with special reference to small volume tears. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 248 (6), 853-862 (2010).
  43. Grigor'eva, A. E., et al. Exosomes in tears of healthy individuals: Isolation, identification, and characterization. Biochem (Moscow) Suppl B Biomed Chem. 10 (2), 165-172 (2016).
  44. Hu, L., et al. Discovering the secret of diseases by incorporated tear exosomes analysis via rapid-isolation system: iTEARS. ACS Nano. 16 (8), 11720-11732 (2022).
  45. Ter-Ovanesyan, D., et al. Framework for rapid comparison of extracellular vesicle isolation methods. eLife. 10, e70725(2021).
  46. Guo, J., et al. Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications. J Extracell Vesicles. 10 (11), e12145(2021).
  47. Aqrawi, L. A., et al. Proteomic and histopathological characterisation of sicca subjects and primary Sjögren's syndrome patients reveals promising tear, saliva and extracellular vesicle disease biomarkers. Arthritis Res Ther. 21 (1), 181(2019).
  48. Aqrawi, L. A., et al. Identification of potential saliva and tear biomarkers in primary Sjögren's syndrome, utilizing the extraction of extracellular vesicles and proteomics analysis. Arthritis Res Ther. 19 (1), 14(2017).
  49. McKay, T. B., Hutcheon, A. E. K., Zieske, J. D., Ciolino, J. B. Extracellular vesicles secreted by corneal epithelial cells promote myofibroblast differentiation. Cells. 9 (5), 1080(2020).
  50. Atienzar-Aroca, S., et al. Oxidative stress in retinal pigment epithelium cells increases exosome secretion and promotes angiogenesis in endothelial cells. J Cell Mol Med. 20 (8), 1457-1466 (2016).
  51. Liu, J., et al. Roles of exosomes in ocular diseases. Int J Nanomedicine. 15, 10519-10538 (2020).
  52. Kenny, A., et al. Proteins and microRNAs are differentially expressed in tear fluid from patients with Alzheimer's disease. Sci Rep. 9 (1), 15437(2019).
  53. Wijesinghe, P., et al. MicroRNAs in tear fluids predict underlying molecular changes associated with Alzheimer's disease. Life Sci Alliance. 6 (6), e202201757(2023).
  54. Urbizu, A., Arnaldo, L., Beyer, K. Obtaining miRNA from saliva-Comparison of sampling and purification methods. Int J Mol Sci. 24 (3), 2386(2023).
  55. Cirillo, P. D. R., Margiotti, K., Mesoraca, A., Giorlandino, C. Quantification of circulating microRNAs by droplet digital PCR for cancer detection. BMC Res Notes. 13 (1), 351(2020).
  56. Sangalli, E., et al. Circulating microRNA-15a associates with retinal damage in patients with early stage type 2 diabetes. Front Endocrinol (Lausanne). 11, 254(2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Gözyaşı EksozomlarıGözyaşı Sıvısı BiyobelirteçleriDamlacık Dijital PCREksozom İzolasyonuMikroRNA ProfillemeNanoparçacık İzlemeNon-invaziv TanıGörme Kaybının Önlenmesi
Diyabetik Retinopati için Yeni Tanı Aracı olarak Gözyaşı Kaynaklı Ekzozomal MiR-15a
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.