Method Article

Hipoksiye Duyarlı Kimerik Antijen Reseptörü-T Hücrelerinin Üretimi ve Fonksiyonel Doğrulaması

DOI:

10.3791/66697

⸱

June 14th, 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institutes of Biomedical Sciences, Fudan University, 2Clinical Center of Biotherapy at Zhongshan Hospital, Fudan University, 3Department of Oncology and Bio-therapeutic Center, Shenzhen Third People's Hospital, Southern University of Science and Technology, 4Shanghai Public Health Clinical Center, Fudan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, hipoksiye duyarlı kimerik antijen reseptörü (CAR)-T hücrelerinin üretilmesi ve fonksiyonel doğrulaması için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, hipoksiye bağlı CAR ekspresyonunun ve seçici sitotoksisitenin doğrulanması dahil olmak üzere lentivirüs bazlı hipoksiye duyarlı CAR-T hücrelerinin neslini ve bunların karakterizasyonunu sunar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kapsamlı çalışmalar, hematolojik malignitelerin tedavisinde kimerik antijen reseptörü T (CAR-T) hücre tedavisinin vaadini kanıtlamıştır. Bununla birlikte, CAR-T hücreleri hedef antijenleri eksprese eden normal hücrelere saldırdığında ortaya çıkan güvenlik endişeleri ile örneklendiği gibi, katı tümörlerin tedavisi zor olmaya devam etmektedir. Araştırmacılar, CAR-T hücre tedavisinin tümör seçiciliğini artırmak için çeşitli yaklaşımları araştırdılar. Bu hat boyunca temsili bir strateji, oksijene bağlı bir bozunma alanının CAR parçasına kaynaştırılmasıyla tasarlanan ve yalnızca hipoksik bir ortamda, tümör mikroçevresinde (TME) yüksek CAR ekspresyonu elde etmek için stratejilendirilen hipoksiye duyarlı CAR-T hücrelerinin inşasıdır. Bu makale, bir mobil inkübatör odası tarafından oluşturulan farklı oksijen seviyelerine yanıt olarak CAR ekspresyonundaki değişiklikleri ve öldürme kapasitesini analiz etme yöntemleri de dahil olmak üzere, bu tür CAR-T hücrelerinin üretilmesi ve bunların işlevsel karakterizasyonu için bir protokol sunmaktadır. Yapılandırılmış CAR-T hücrelerinin, oksijene duyarlı bir şekilde CAR ekspresyonu ve sitotoksisite göstermesi beklenir, böylece seçici aktivasyon için hipoksik TME ve normoksik normal dokular arasında ayrım yapma yeteneklerini destekler.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kimerik antijen reseptörü T hücresi (CAR-T) tedavisi, kanser tedavisinde önemli bir atılımı temsil etmiştir. Gıda ve İlaç Dairesi'nin (FDA) 2017'de ileri / dirençli lenfoma ve akut lenfoblastik lösemiyi tedavi etmek için ilk CAR-T tedavisini onaylamasından bu yana, CD19 veya B hücresi olgunlaşma antijenini (BCMA) hedefleyen 1,2,3, 10 CAR-T tedavisi küresel olarak onay almıştır4. Bununla birlikte, kapsamlı araştırmalara rağmen, hematolojik malignitelerin tedavisinde CAR-T tedavisinin dikkate değer etkinliğinin tekrarlanması, katı tümörlere uygulanması için zor olmaya devam etmektedir 5,6,7,8.

İmmünsüpresif tümör mikroçevresi (TME), katı tümör ortamında CAR-T'nin zayıf etkinliğine birincil katkıda bulunur. TME, yetersiz besin, hipoksi, asidik pH ve metabolik atık birikimi nedeniyle CAR-T hücrelerinin aktivitesini ve hayatta kalmasını engeller 9,10,11,12. Daha fazla düşmanlık, düzenleyici T hücreleri (Treg'ler), miyeloid türevli baskılayıcı hücreler (MDSC'ler) ve tümörle ilişkili makrofajlar (TAM) gibi immünosüpresif hücrelerin sızmasından kaynaklanır ve bunlar, tümör hücrelerinin yanı sıra, tümöre girdiklerinde CAR-T hücrelerinin ek inhibisyonuna neden olan immünosüpresif sitokinler salgılar13,14.

Yetersiz terapötik etkinliğin yanı sıra, güvenlik sorunları, katı tümörlerle uğraşırken CAR-T hücrelerinin bir başka Aşil topuğudur15,16. Güvenlik endişesi, şimdiye kadar tanımlanan tümöre özgü antijenlerin (TSA) hiçbirinin kesinlikle tümör hücreleriyle sınırlı olmamasından kaynaklanmaktadır. Başka bir deyişle, CAR'ın hedefi olarak seçilen tümörle ilişkili antijenler (TAA), tümör hücrelerinde daha yüksek ekspresyon göstermesine rağmen, sıklıkla normal dokular tarafından da eksprese edilir17. Bu nedenle, CAR'ın normal dokuları verimli bir şekilde tanıması üzerine CAR-T hücrelerinin beklenmedik aktivasyonundan hedef üzerinde, tümör dışı etkiler ortaya çıkabilir ve sitokin salınım sendromuna (CRS), CAR-T ile ilişkili ensefalopati sendromuna (CRES)18 ve diğer olumsuz sonuçlarayol açabilir 19.

Bu tür etkilerden kaçınmak için, CAR-T hücrelerinin hedeflenen TAA'nın ekspresyon seviyelerine dayalı olarak tümör hücrelerini normal hücrelerden ayırt etmesine izin vermek için CAR'ın afinitesini azaltmak da dahil olmak üzere birçok strateji araştırılmıştır; beklenmedik aktivasyon üzerine eliminasyonlarını teşvik etmek için CAR-T hücrelerinin bir intihar geni veya eliminasyon belirteci gibi bir kapatma anahtarı ile donatılması; CD3ζ ve yardımcı uyarıcı sinyallerin, sonuç olarak CAR-T hücrelerinin etkili aktivasyonu için eşzamanlı katılımı gerekli olan iki CAR parçasına bölünmesi; CAR-T hücrelerinin aktivitesini, iki farklı TAA'yı birlikte ifade eden hedeflenen hücrelerle sınırlayan sentetik bir Çentik (synNotch) tabanlı devre kullanarak; ve CAR ifadesini değişen çevresel ipuçlarına göre ayarlamak için bir mekanizma uygulayarak TME duyarlılığı elde etmek için CAR-T hücrelerinin mühendisliği 20,21,22,23,24,25,26.

Yukarıda özetlenen TME duyarlılık seçeneğinde önemli bir husus, tümör hücrelerinin hızlı çoğalması nedeniyle TME'deki düşük oksijen seviyesidir. Tümör hücrelerinin hipoksiye uyumu, indüklenebilir bir alt birim olan HIF-1α ve yapısal olarak eksprese edilen bir alt birim olan HIF-1β27'den oluşan heterodimerik bir transkripsiyonel faktör olan hipoksi ile indüklenebilir faktör-1'in (HIF-1) aktivasyonuna bağlıdır. Normodik koşullar altında, HIF-1α proteini, oksijene bağlı bozunma alanına (ODD)28 bağlı olarak her yerde bulunmaya ve hızlı proteazomal bozunmaya uğrar. Hücresel oksijen kaynağı sınırlandığında, HIF-1 stabilize edilir ve hipoksi-yanıt elemanlarına (HRE'ler) bağlanarak aşağı akış hedef genlerinin transkripsiyonunu aktive eder29. ODD ve HRE'nin oksijene duyarlı elementler olarak doğası göz önüne alındığında, hipoksik TME30 içindeki CAR'ların koşullu ifadesini gerçekleştirmek için araştırılmıştır. Burada, hipoksiye duyarlı CAR-T hücrelerinin fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonu için yöntemlere odaklanan bir protokol sunuyoruz, öncesinde CAR tasarımının kısa bir açıklaması ve bu hücrelerin hazırlama prosedürleri yer alıyor. Bu protokol, kısıtlanmış tümör dışı toksisiteye sahip CAR-T hücreleri oluşturmak için hipoksiye duyarlı CAR'dan yararlanmak için yararlı bir kılavuz sağlamayı amaçlamaktadır.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, HER2'yi (Gen Kimliği: 2064) hedefleyen hipoksiye duyarlı bir CAR olan HER2-BBz-ODD, normal muadili HER2-BBz ile karşılaştırıldı. İki CAR'ın şemaları Şekil 1A'da gösterilmiştir, bu da HER2-BBz-ODD'nin, ODD dizisinin CD3ξ'nin C-terminaline eklenmesiyle HER2-BBz'den türetildiğini göstermektedir. İki CAR'ı ifade eden lentiviral vektörlerin inşası ve 293T hücre transfeksiyonu ile karşılık gelen lentivirüsün üretilmesi daha önce tarif edilmiştir31.

1. Lentiviral enfeksiyon ile hipoksiye duyarlı CAR-T hücrelerinin üretilmesi

  1. Dondurularak korunmuş insan periferik kan mononükleer hücrelerini (PBMC'ler) bir su banyosunda 37 ° C'de hızla çözün. Çözülmüş PBMC'leri, 400 IU IL-2, 5 ng / mL IL-7 ve 10 ng / mL IL-15 (insan T hücresi büyüme ortamı, daha sonra TGM olarak anılacaktır) ile takviye edilmiş 9 mL serumsuz lenfosit kültür ortamı içeren 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
  2. Hücre sayımı için bir alikot aldıktan sonra, tüpü 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin. Peletlenmiş PBMC'leri TGM ile 4 × 106 hücre/mL yoğunlukta yeniden süspanse edin ve süspansiyonu 6 oyuklu bir plakaya aktarın.
  3. Anti-hCD3 / hCD28 kaplı immünoboncuklar hazırlayın.
    1. 100 μL fare IgG manyetik boncuklarını 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve PBS'li manyetik bir stand kullanarak 2 kez yıkayın.
    2. Boncukları 100 μL PBS'de yeniden süspanse edin ve 0.2 μg fare anti-İnsan CD3 antikoru ve 2 μg fare anti-İnsan CD28 antikoru ekleyin. Karışımı bir pipet kullanarak nazikçe karıştırın ve gece boyunca 4 °C'de sallayın.
    3. Boncukları PBS'li manyetik bir stand kullanarak 2 kez yıkayın ve 100 μL PBS'de yeniden süspanse edin.
  4. Anti-hCD3 / hCD28 kaplı immünoboncukları, 1.2. adımda, 1: 1'lik bir boncuk-hücre oranında plakaya ekleyin. Plakayı 37 °C'de% 5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin.
  5. 48 saatlik inkübasyondan sonra, hücreleri bir pipetle hafifçe karıştırdıktan sonra hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Tüpü 3 dakika boyunca manyetik bir stand üzerine yerleştirin, ardından PBMC'lerden immünoboncukları çıkarmak için süpernatanı dikkatlice 15 mL'lik yeni bir tüpe aktarın.
  6. Hücre sayımı için bir alikot alın, ardından PBMC'leri 300 μL TGM içinde 5 ×10 5 hücre / kuyuda 48 oyuklu düz bir plakaya tohumlayın. İlgili oyuklara 200 μL lentiviral stok ekleyin ve 10 μg/mL'lik bir nihai konsantrasyona kadar protamin sülfat ekleyin.
  7. Plakayı 1,5 saat boyunca 32 ° C'de 1.000 × g'da santrifüjleyin ve bir pipet kullanarak her bir kuyucuktan 300 μL süpernatanı dikkatlice çıkarın ve atın. Ardından, bir pipet kullanarak 1 mL taze TGM ekleyin ve plakayı 37 °C'de %5CO2 içeren nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin.
  8. Hücre yoğunluğunu her 2-3 günde bir 0.5-2 × 106 hücre / mL'ye ayarlamak için taze TGM ekleyin. Hücreleri önce 12 oyuklu bir plakaya ve ardından 6 oyuklu bir plakaya aktararak başlayın. Toplam sayı 4 mL'lik bir hacimde 6 × 106'ya ulaşana kadar hücreleri kültürlemeye devam edin.
    NOT: Paralel olarak, TGM'nin% 10 fetal sığır serumu (FBS) içeren RPMI1640 besiyeri ile değiştirilmesi dışında, yukarıda açıklanan prosedürlerin aynısını izleyerek Jurkat T hücrelerinin CAR transdüksiyonunu gerçekleştirin.

2. Akış sitometrisi kullanılarak CAR-T hücrelerinde oksijene bağımlı CAR ekspresyonunun değerlendirilmesi

  1. CAR ile dönüştürülmüş T hücrelerini adım 1.8'den 2 mL TGM'de 2.5 × 106 hücre / kuyu yoğunluğunda iki adet 12 oyuklu plakaya yerleştirin. Bir plakayı doğrudan 37 ° C'de% 5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin (normoksik durum, hücrelerin kültürlenmesi için standart koşul% 21O2'ye sahiptir) ve diğer plakayı mobil bir CO2 / O2 / N2 inkübatör odasına yerleştirin O2 seviyesi %1'de önceden ayarlanmış (hipoksik durum) ve ardından odayı nemlendirilmiş bir yerde tutun, 37 °C'de %5 CO2



  7. figure-protocol-1



Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HIF-1α'nın ODD alanını CAR parçasına kaynaştırmak, hipoksiye duyarlı bir CAR oluşturmak için birincil stratejiyi temsil eder. Bu çalışmada analiz edilen ve HER2-BBz-ODD olarak adlandırılan hipoksiye duyarlı HER2 hedefleme CAR, ODD dizisinin geleneksel HER2-BBz'ye entegre edilmesiyle bu strateji kullanılarak oluşturulmuştur (Şekil 1A). Bu çalışmada, HER2-BBz-ODD CAR veya HER2-BBz CAR'ı eksprese etmek için lentiviral transdüksiyon kullandık ve daha sonra oksijen duyarlılıklarını iki hücre tipinde inceledik: insan PBMC'leri ve Jurkat T hücreleri.

İlk inceleme, hem CAR'dan dönüştürülmüş PBMC'den türetilmiş T hücrelerinde akış sitometrisi ile hem de CAR'dan dönüştürülmüş Jurkat T hücrelerinde western blotlama ile gerçekleştirilen normoksik koşullara karşı hipoksik koşullar altında CAR'ın ekspresyonudur. CAR ile transdüksiyonlu PBMC'den türetilmiş T hücrelerinin ortamında, HER2-BBz-ODD CAR'ın hem CAR-pozitif hücrelerin yüzdesi hem de medyan floresan yoğunluğu (MFI) açısından %1O2'nin altında !'in altında anlamlı derecede daha yüksek ekspresyona sahip olduğunu gözlemledik (Şekil 1B). CAR ile transdüksiyonlu Jurkat T hücrelerinin immünoblotlama analizi, HER2-BBz-ODD'nin hipoksiye bağlı indüksiyonunu da doğruladı.

Bu bağlamda, hipoksik durumun, kültür ortamına kimyasal bir hipoksi indükleyicisi olan CoCl2 eklenerek uygun bir şekilde taklit edilebileceğini belirtmek önemlidir. Şekil 1C'de gösterildiği gibi, immünoblotlama sonuçlarımız, 50 veya 200 μM CoCl2'ye maruz kalmanın,% 1O2'ye maruz kalmanın etkisini özetlediğini ve HER2-BBz-ODD CAR'ın ekspresyonunu belirgin bir şekilde indüklediğini, ancak HER2-BBz CAR'ınkini indüklemediğini göstermiştir. Hipoksiye duyarlı CAR'ın fonksiyonel karakterizasyonu PBMC'den türetilen CAR-T hücreleri ile gerçekleştirildi. Çalışmada, hedef hücre hattı olarak ateşböceği lusiferaz taşıyan bir SKOV-3 hücre hattı kullanıldı. Bu kurulum, ko-kültürlenmiş CAR-T hücrelerinin aracılık ettiği sitotoksisiteyi değerlendirmek için bir vekil olarak hedef hücre ile ilişkili lusiferaz aktivitesini ölçmemize izin verdi.

Şekil 1D'de gösterildiği gibi, ölçümler, atmosferin normoksik veya hipoksik olmasına bakılmaksızın, HER2-BBz CAR-T hücrelerinin hedef hücreleri etkili bir şekilde öldürdüğünü göstermiştir. Buna karşılık, HER2-BBz-ODD CAR-T hücreleri, incelenen üç E: T oranının tümü için normoksik koşullar altında önemli ölçüde daha zayıf sitotoksisite göstermiştir. Bununla birlikte, hipoksik koşullara maruz kaldıklarında sitotoksisiteleri önemli ölçüde artmıştır. IL-2 ve IFN-γ'nin süpernatan seviyeleri, CAR-T hücrelerinin hedef hücrelerle 24 saat boyunca birlikte kültürlenmesinden sonra ELISA ile ölçüldü. Her iki sitokin için, sitotoksisite verileriyle tutarlı olan HER2-BBz-ODD CAR-T hücreleri için !O2'ye kıyasla %1O2'nin altında daha yüksek sekresyon gözlenmiştir. Buna karşılık, HER2-BBz CAR-T hücreleri, ! O2'ye kıyasla %1O2'nin altında iki sitokinin daha düşük salgılandığınıgösterdi, bu da hipoksinin hücresel aktivite üzerinde olumsuz bir etkisini gösterir (Şekil 1E). Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar HER2-BBz-ODD CAR'ın hipoksiye duyarlı doğasını ikna edici bir şekilde doğruladı.

figure-results-1
Şekil 1: Hipoksiye duyarlı CAR-T hücrelerinin yapımı ve karakterizasyonu. (A) Hipoksiye duyarlı bir CAR, HER2-BBz-ODD ve geleneksel muadili HER2-BBz'nin tasarımlarının şematik gösterimi. Her iki CAR da bir N-terminal CD8α sinyal peptidi, bir FLAG etiketi, bir insan HER2 hedefleme scFv, bir CD8 menteşe ve transmembran alanı ve 4-1BB'den bir kostimülatör alandan oluşan bir hücre içi kısım, bir CD3ξ sinyal alanı, bir IRES ve bir EGFP'den oluşur. HER2-BBz-ODD, bir ODD alanının CD3ξ sinyal alanının C-terminaline füzyonunda HER2-BBz'den farklıdır ve normoksik koşullar altında ubikitine bağımlı bozunmasını teşvik ederek hipoksik bağımlı ifadesine izin verir. (B,C) HER2-BBz-ODD CAR'IN oksijene bağlı ekspresyonunun değerlendirilmesi. (B) Akış sitometrisi kullanılarak 24, 48 veya 72 saat boyunca% 1 veya% 21 O2'nin altında kültürlendikten sonra insan PBMC'den türetilen CAR-T hücreleri ile bir değerlendirme yapıldı. (C) Diğer değerlendirme, hücre lizatlarının ! O2, 50 veya 200 μM CoCl2 veya %1 O2 altında kültürlendikten 24 saat sonra hasat edildiği ve HER2-BBz CAR ile dönüştürülmüş hücreler kontrol olarak dahil edilerek western blotlama kullanılarak CAR ekspresyonu için analiz edildiği CAR ile dönüştürülmüş Jurkat T hücreleri ile yapıldı. (D,E) Farklı oksijen koşulları altında CAR-T hücrelerinin in vitro sitotoksisitesi ve sitokin salgılanması. (D) CAR-T hücreleri, %1 veya !O2'nin altında belirtilen E:T oranlarında ateşböceği lusiferaz eksprese eden SKOV3 hücreleri ile birlikte kültürlendi. 24 saatlik birlikte kültürlemeden sonra, hedef hücre öldürme verimliliği, hücre ile ilişkili ateşböceği lusiferaz aktivitesindeki değişimin, transdüksiyon yapılmamış T hücrelerine göre ölçülmesiyle belirlendi. (E) Süpernatanlar, salgılanan IL-2 ve IFN-γ'nin tespiti için toplandı. Sonuçlar ortalama ± SEM (n = 3 sağlıklı donör) (****p < 0.0001) olarak görüntülenir. Kısaltmalar: scFv = tek zincirli parça değişkeni; CAR = kimerik antijen reseptörü. C ve D panelleri Liao ve ark.31'den uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Güvenlik endişeleri, herhangi bir CAR-T hücre tedavisinin klinik kullanıma ilerlemesi için ele alınması gereken önemli konulardır. Tümör hücrelerinin veya TME'nin benzersiz özelliklerinden yararlanmak, tümör dokularını seçici olarak hedef alan CAR-T hücrelerinin geliştirilmesine odaklanan birincil araştırma yönü haline gelmiştir. Hipoksiye duyarlı bir CAR-T tasarlamak, bu yönde çekici bir stratejidir ve bu çalışmada sunulanlar da dahil olmak üzere, CAR parçasını doğal olarak oluşan hipoksi algılayıcı ODD protein alanı ile birleştiren çeşitli yaklaşımlar araştırılmaktadır. Alternatif bir yaklaşım, CAR ekspresyonunu sürmek için yaygın olarak kullanılan bir kurucu promotörün, önceki çalışmalarda umut vaat eden bir hipoksi yanıt elemanı (HRE) ile değiştirilmesini içerir. HRE ve ODD elemanlarının (ifadenin daha sıkı kontrolünü sunan vahşi tip veya mühendislik versiyonları) birleştirilmesinin, hipoksi ile indüklenebilir bir CAR için en uygun tasarımı temsil ettiğine inanılmaktadır.

Bu protokol, hipoksiye duyarlı CAR-T hücrelerinin üretilmesi ve doğrulanması için deneysel prosedürleri özetlemektedir. Bu protokolün uygulanması birkaç önemli hususu içerir. Birincil düşünce, hipoksik koşulların yaratılmasıdır. İki yaklaşım arasında, CoCl2'nin kültür ortamına eklenmesi, büyük ölçüde rahatlığı sayesinde, hipoksi ile ilgili önceki çalışmalarda yaygın olarak kullanılmıştır32,33. Bununla birlikte, bu yaklaşımla taklit edilen hipoksi derecesini ölçmek mümkün değildir. Buna karşılık, mobil bir CO2 / O2 / N2 inkübasyon odasının kullanılması, O2 seviyelerinin hassas bir şekilde ayarlanabilmesi ve bu nedenle CAR-T hücrelerinin hipoksi duyarlılığının ince bir analizi için uygun olması açısından avantajlıdır. Bu bağlamda, tümörlerdeki hipoksi seviyesi, farklı katı tümör tipleri ve tümör ilerlemesinin farklı dönemleri arasında değişir34, protokolde sadece %1 O2 örneklendirilmiştir. Araştırmacıların oksijen seviyesini gerçek talebe göre ayarlaması en uygun uygulamadır. CoCl2 yöntemi mevcut tek yaklaşımsa, çeşitli oksijen seviyelerini simüle etmek için teste bir dizi CoCl2 konsantrasyonu eklemenizi öneririz.

Hipoksiye bağlı CAR ekspresyonunu incelemek için uygun bir yöntem seçmek bir diğer önemli husustur. CAR ile transdüksiyonlu Jurkat T hücrelerinin immünoblotlama analizi, CAR yapı optimizasyonu sırasında uygun bir seçenek olsa da, CAR ile transdüksiyonlu insan PBMC'lerinde oksijen seviyelerinin yüzey CAR ekspresyonu üzerindeki etkisinin akış sitometrisi ile analiz edilmesi, nihai doğrulama görevi görür. Daha önce hipoksiye duyarlı CAR'ın geliştirilmiş bir versiyonu olan HiTA-CAR35 ile yaptığımız gibi, hipoksikten normoksik koşullara geçişe yanıt olarak CAR ekspresyonunun dinamiklerini incelemek en uygunudur. Bu, hipoksi kısıtlı CAR ifadesini daha da gösterecektir.

Hipoksiye duyarlı CAR-T hücrelerinin fonksiyonel doğrulaması için, protokolde özetlenen sitotoksisite testi, ateşböceği lusiferaz taşıyan hedef hücrelerin kullanılmasını içerir. Bu raportör tabanlı tahlil, CCK8 yöntemi ve modifiye edilmemiş tümör hücrelerinin kullanılabileceği gerçek zamanlı hücresel analiz (RTCA) yöntemi gibi diğer öldürme değerlendirme yöntemleriyle değiştirilebilir. RTCA analizi, CAR-T hücrelerinin gerçek zamanlı öldürme kinetiğini ölçmek için de avantajlıdır. CAR-T hücrelerinin neden olduğu spesifik sitotoksisiteyi ölçmek için, transdüksiyonsuz PBMC'ler kontrol olarak dahil edilmelidir. PBMC'lerin yüksek transdüksiyon verimliliği, deney ve kontrol grupları arasında tespit edilen sitotoksisitedeki farklılıkların, eklenen değişen miktarlarda efektör hücrelerin aracılık ettiği spesifik olmayan öldürmeden kaynaklandığına dair endişeleri önlemek için arzu edilir.

Bu protokolde çeşitli sınırlamalar vardır. Hipoksik koşullar hem hedef hücrelerin hem de T hücrelerinincanlılığını etkileyebilir 36,37, bu da CAR-T hücre aracılı sitotoksisite ile ilişkili olmayan hücre ölümünün tahlil sonuçlarının yorumlanmasını karıştırabileceği endişesini ortaya çıkarır. Bu tür endişeleri önlemek veya en aza indirmek için tahlil önerilmeden hemen önce hem CAR-T hücrelerinin hem de hedef hücrelerin mükemmel canlılığa sahip olmasını sağlamak. Ayrıca, in vitro doğrulamanın in vivo çevirinin başarılı olmasını garanti etmediğine de dikkat edilmelidir. Hipoksiye duyarlı CAR-T adayının, hedeflenen antijeni ifade eden normal dokuları hedeflemekten kaçınıp kaçınamayacağını doğrulamak için in vivo değerlendirmelere her zaman ihtiyaç vardır

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2016YFC1303402), Önemli Bulaşıcı Hastalıklar Ulusal Mega Projesi (2017ZX10202102, 2017ZX10304402-002-007) ve Şanghay Belediye Sağlık Komisyonu Genel Programı (201740194) tarafından sağlanan hibelerle desteklenmiştir.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL Santrifüj tüpüQSP509-GRD-QSüpernatanlar ve hücreler cellection
Protokolü Adım 2,3,4
%10 ExpressCast PAGENCM biotechP2012İmmünoblotlama
Protokolü Adım 3
10x PBSNCM biyoteknoloji20220812Hücre kültürü
Protokolü Adım 4
10 mL pipetYueyibioYB-25HPipetleme
Protokol Adım 1
10xTRIS-Glisin-SDS elektroforez tamponuEpizyme3673020İmmünoblotlama
Protokol Adım 3
15 mL Santrifüj tüpüThermo Scientific339650Süpernatanlar ve hücreler cellection
Protokolü Adım 1
25 cm2 EasYFlaskThermo Scientific156367Hücre kültürü
Protokol Adım 3,4
4x Protein SDS SAYFASI Yükleme TamponuTakara9173İmmünoblotlama
Protokolü Adım 3
6 oyuklu düz tabanlı doku kültürü plakalarıThermo Scientific140675T Hücre kültürü
Protokolü Adım 1
96 oyuklu siyah düz tabanlı doku kültürü plakalarıGreiner655090Sitotoksisite testi
Protokolü Adım 4
96 oyuklu ELISA plakalarıCorning3590ELISA
Protokolü Adım 5
96 kuyulu plaka çalkalayıcıQILINBEIERMH-2Shake
Protokolü Adım 4
96 oyuklu U-alt doku kültürü plakalarıThermo Scientific268200Süpernatanlar cellection
Protokolü Adım 4,5
anti-FLAG antikoruSigmaF1804-50UGİmmünoblotlama
Protokolü Adım 3
KarbinolSinopharm10010061İmmünoblotlama
Protokolü Adım 3
Karbondioksit inkübatörüThermo Scientific360Hücre kültürü
Protokolü Adım 1,2,3,4
Hücre sayma plakasıHausser scientific1492Hücre sayımı
Protokolü Adım 1,3,4
CELLection Pan Mouse IgG KitiThermo Scientific11531DFare IgG manyetik boncuk
Protokol Adım 1
SantrifüjThermo Scientific75002432Hücre kültürü
Protokol Adım 1,3,4
Kemilüminesans jel görüntüleme sistemiBIO-RAD12003154İmmünoblotlama
Protokolü Adım 3
Kobalt klorür çözeltisi (0.5 M)biyosıçrayıcıBR4000203Hipoksik durum
Protokol Adım 2,3,4
DMEMCorning10-103- CVHücre kültürü
Protokolü Adım 4
Elektronik teraziSartoriusPRACTUM612-1CNtartım
Protokolü Adım 5
FBSBI04-001-1ACSHücre kültürü
Protokolü Adım 3,4
GAPDH Fare mAbABklonalAC002İmmünoblotlama
Protokolü Adım 3
Jel elektroforez cihazıBIO-RAD1645070İmmünoblotlama
Protokolü Adım 3
GloMax Mikroplaka OkuyucularPromegaGM3000lusiferaz aktivite ölçümü
Protokolü Adım 4
Keçi anti-Fare IgG (H+L)YeasenP1126151İmmünoblotlama
Protokolü Adım 3
Yüksek hızlı mikrodondurma santrifüjüeppendorf5810  RHücre kültürü
Protokolü Adım 1
İnsan IFN-&gama; ELISA SetBD555142ELISA
Protokolü Adım 5
Öğeler: Rekombinant İnsan IFN-&gama; Liyofilize Standart, Tespit Antikoru, Biyotin, Anti-İnsan IFN-&gama; , Yakalama Antikoru Saflaştırılmış Anti-İnsan IFN-&gama;, Enzim Reaktifi Streptavidin-yaban turpu peroksidaz konjugatı (SAv-HRP)
İnsan IL-2 ELISA SetiBD555190ELISA
Protokolü Adım 5
Öğeler: Rekombinant İnsan IL-2 Liyofilize Standart, Tespit Antikoru Biyotin Anti-İnsan IL-2, Yakalama Antikoru Saflaştırılmış Anti-İnsan IL-2, Enzim Reaktifi Streptavidin-yaban turpu peroksidaz konjugatı (SAv-HRP)
IL-15Ar-Ge D sistemleriP40933T Hücre kültürü
Protokolü Adım 1
IL-21NovoproteinGMP-CC45T Hücre kültürü
Protokolü Adım 1
IL-7R& D sistemleriP13232T Hücre kültürü
Protokolü Adım 1
Ters mikroskopOlympusCKX41Hücre kültürü
Protokolü Adım 1,3,4
JurkatATCCTIB-152CAR-Jurkat yapı
Protokolü Adım 3
LSRFortessaBDLSRFortessaAkış sitometrisi
Protokolü Adım 2
Lusiferaz Test SistemiPromegaE1501lusiferaz raportör testi
Protokolü Adım 4
Öğeler: Pasif lizis tamponu, ateşböceği lusiferaz substratı
Mikroplaka okuyucuBioTekHTXELISA
Protokolü Adım 5
mobil CO2< / sub> / O2< / sub> / N2< / sub> Kuluçka OdasıÇin İnovasyon Instrument Co., ve Tic. Ltd. ŞtiSmartor118Hipoksik durum
Protokolü Adım 2, 3, 4
Fare Anti-Hexa Histidin etiketiSigmaSAB2702218İmmünoblotlama
Protokolü Adım 3
NcmBlot Hızlı Transfer TamponuNCM biyoteknolojiWB4600İmmünoblotlama
NcmECL UltraNCM biyoteknolojiP10300İmmünoblotlama
Protokolü Adım 3
Öğeler: NcmECL Ultra Luminol/Arttırıcı Reaktif (A), NcmECL Ultra Stabilize Peroksit Reaktifi (B) 
NovoNectin kaplı 48 oyuklu düz plakalarNovoproteinGMP-CH38CAR-T hücreleri yapısı
Protokolü Adım 1
OPD (o-fenilendiamin dihidroklorür) tablet setiSigmaP9187Substrat Reaktifi
Protokolü Adım 5
Öğeler: OPD tablet (gümüş folyo), üre hidrojen peroksit tableti (altın folyo),
PE konjuge anti-DYKDDDDKBiolegend637310Akış sitometrisi
Protokolü Adım 2
Protamin sülfatSigmaP3369-1OGLentivirus enfeksiyonu
Protokolü Adım 1
Protein Marker 10 Kda-250 KDaEpizymeWJ102İmmünoblotlama
Protokolü Adım 3
  Saflaştırılmış NA/LE Fare Anti-İnsan CD3BD566685T Hücreleri kültürü
Protokolü Adım 1
Saflaştırılmış NA/LE Fare Anti-İnsan CD28BD555725T Hücreleri kültürü
Protokolü Adım 1
PVDF membranKırlangıç168627İmmünoblotlama
Protokolü Adım 3
RPMI 1640Corning10-040-CVRCHücre kültürü
Protokolü Adım 3
Yağsız süt tozuYeasenS9129060İmmünoblotlama
Protokolü Adım 3
SKOV3-LucATCCHTB-77Sitotoksisite testi
Protokolü Adım 4
Tripsin-EDTANCM biyoteknolojiC125C1Hücre kültürü
Protokolü Adım 4
Tween 20Sinopharm30189328Immunoblotting
Protokolü Adım 3
Su banyosukeelreinNB014467Isıtma
Protokolü Adım 1
X-VIVO 15 LONZA04-418QSerumsuz lenfosit kültürü ortamı
Protokolü Adım 1

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Boardman, A. P., Salles, G. CAR T-cell therapy in large B cell lymphoma. Hematol Oncol. 41 (S1), 112-118 (2023).
  2. Chen, Y. -J., Abila, B., Mostafa Kamel, Y. CAR-T: What is next. Cancers. 15 (3), 663(2023).
  3. Barsan, V., et al. Tisagenlecleucel utilisation and outcomes across refractory, first relapse and multiply relapsed B-cell acute lymphoblastic leukemia: A retrospective analysis of real-world patterns. eClinicalMedicine. 65, 102268(2023).
  4. Liu, Y., et al. Oncolytic herpes simplex virus delivery of dual CAR targets of CD19 and BCMA as well as immunomodulators to enhance therapeutic efficacy in solid tumors combined with CAR-T cell therapy. Front Oncol. 12, 1037934(2022).
  5. Liu, C., Qi, T., Milner, J. J., Lu, Y., Cao, Y. Speed and location both matter: Antigen stimulus dynamics controls CAR-T cell response. Front Immunol. 12, 748768(2021).
  6. Li, N., et al. Improving the anti-solid tumor efficacy of CAR-T cells by inhibiting adenosine signaling pathway. Oncoimmunology. 9 (1), 1824643(2020).
  7. Derenzo, C., Gottschalk, S. Genetic modification strategies to enhance CAR T cell persistence for patients with solid tumors. Front Immunol. 10, 218(2019).
  8. Fu, R., et al. Delivery techniques for enhancing CAR T cell therapy against solid tumors. Advanced Functional Materials. 31 (44), 2009489(2021).
  9. Johnson, A., Townsend, M., O'Neill, K. Tumor microenvironment immunosuppression: A roadblock to CAR T-cell advancement in solid tumors. Cells. 11 (22), 3626(2022).
  10. Liu, Z., et al. Immunosuppression in tumor immune microenvironment and its optimization from CAR-T cell therapy. Theranostics. 12 (14), 6273-6290 (2022).
  11. Luo, Z., et al. Modulating tumor physical microenvironment for fueling CAR-T cell therapy. Adv Drug Deliv Rev. 185, 114301(2022).
  12. Martinez, M., Moon, E. K. CAR T cells for solid tumors: New strategies for finding, infiltrating, and surviving in the tumor microenvironment. Front Immunol. 10, 128(2019).
  13. Zhang, X., et al. The immunosuppressive microenvironment and immunotherapy in human glioblastoma. Front Immunol. 13, 1003651(2022).
  14. Tie, Y., Tang, F., Wei, Y. Q., Wei, X. W. Immunosuppressive cells in cancer: Mechanisms and potential therapeutic targets. J Hematol Oncol. 15 (1), 61(2022).
  15. Wu, Y., et al. Engineering CAR T cells for enhanced efficacy and safety. APL Bioeng. 6 (1), 011502(2022).
  16. Al-Haideri, M., et al. cell combination therapy: The next revolution in cancer treatment. Cancer Cell Int. 22 (1), 365(2022).
  17. Fuca, G., Reppel, L., Landoni, E., Savoldo, B., Dotti, G. Enhancing chimeric antigen receptor T-cell efficacy in solid tumors. Clin Cancer Res. 26 (11), 2444-2451 (2020).
  18. Neelapu, S. S., et al. Chimeric antigen receptor T-cell therapy - assessment and management of toxicities. Nat Rev Clin Oncol. 15 (1), 47-62 (2018).
  19. Mi, J., Ye, Q., Min, Y. Advances in nanotechnology development to overcome current roadblocks in CAR-T therapy for solid tumors. Front Immunol. 13, 849759(2022).
  20. Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: Current limitations and potential strategies. Blood Cancer J. 11 (4), 69(2021).
  21. Yu, S., Yi, M., Qin, S., Wu, K. Next generation chimeric antigen receptor T cells: Safety strategies to overcome toxicity. Mol Cancer. 18 (1), 125(2019).
  22. Dana, H., et al. CAR-T cells: Early successes in blood cancer and challenges in solid tumors. Acta Pharm Sin B. 11 (5), 1129-1147 (2021).
  23. Van Der Schans, J. J., Van De Donk, N., Mutis, T. Dual targeting to overcome current challenges in multiple myeloma CAR T-cell treatment. Front Oncol. 10, 1362(2020).
  24. Andrea, A. E., Chiron, A., Bessoles, S., Hacein-Bey-Abina, S. Engineering next-generation car-t cells for better toxicity management. Int J Mol Sci. 21 (22), 8620(2020).
  25. Flugel, C. L., et al. Overcoming on-target, off-tumour toxicity of CAR T cell therapy for solid tumours. Nat Rev Clin Oncol. 20 (1), 49-62 (2023).
  26. Rababah, F., et al. Chimeric antigen receptor T cells therapy in solid tumors. Clin Transl Oncol. 25 (8), 2279-2296 (2023).
  27. Masoud, G. N., Li, W. Hif-1alpha pathway: Role, regulation and intervention for cancer therapy. Acta Pharm Sin B. 5 (5), 378-389 (2015).
  28. Semenza, G. L. Targeting hif-1 for cancer therapy. Nat Rev Cancer. 3 (10), 721-732 (2003).
  29. Harris, A. L. Hypoxia--a key regulatory factor in tumour growth. Nat Rev Cancer. 2 (1), 38-47 (2002).
  30. Juillerat, A., et al. An oxygen sensitive self-decision making engineered CAR T-cell. Sci Rep. 7, 39833(2017).
  31. Liao, Q., et al. Engineering T cells with hypoxia-inducible chimeric antigen receptor (HiCAR) for selective tumor killing. Biomark Res. 8 (1), 56(2020).
  32. Ivan, M., et al. Hifα targeted for vhl-mediated destruction by proline hydroxylation: Implications for o2 sensing. Science. 292 (5516), 464-468 (2001).
  33. Wang, G. L., Semenza, G. L. Purification and characterization of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 270 (3), 1230-1237 (1995).
  34. D'alonzo, R. A., et al. In vivo noninvasive preclinical tumor hypoxia imaging methods: A review. Int J Radiat Biol. 97 (5), 593-631 (2021).
  35. He, H., et al. Conditioned car-t cells by hypoxia-inducible transcription amplification (hita) system significantly enhances systemic safety and retains antitumor efficacy. J Immunother Cancer. 9 (10), e002755(2021).
  36. Barsoum, I. B., Smallwood, C. A., Siemens, D. R., Graham, C. H. A mechanism of hypoxia-mediated escape from adaptive immunity in cancer cells. Cancer Res. 74 (3), 665-674 (2014).
  37. Kroemer, G., Pouyssegur, J. Tumor cell metabolism: Cancer's achilles' heel. Cancer Cell. 13 (6), 472-482 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CAR T CellsHypoxia Sensitive CARTumor MicroenvironmentSolid TumorsCancer ImmunotherapyOxygen Dependent DegradationCAR ExpressionCytotoxicity AssayHypoxia ModelTumor Selectivity

Related Articles