Yöntem makalesi

Dikenli Fare Modelinden Fibro-Adipojenik Progenitör İzolasyonu, Genişlemesi ve Farklılaşması

DOI:

10.3791/66717

⸱

15 Kasım 2024

 ,  ,  , 
1School of Biomedical Engineering and Department of Medical Genetics, University of British Columbia, 2Aspect Biosystems

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, iskelet ve kalp kası fibro-adipojenik progenitörlerinin (FAP'ler) dikenli fareden (Acomys) enzimatik ayrışma ve floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması yoluyla izolasyonunu ana hatlarıyla belirtir. Bu protokolden elde edilen FAP'lar etkili bir şekilde genişletilebilir ve miyofibroblastlara ve adipositlere farklılaştırılabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Olağanüstü onarım programı nedeniyle, dikenli fare, rejeneratif tıp için gelişmekte olan bir araştırma modelidir. Fibro-adipojenik progenitörler, adipositlere, fibroblastlara ve kondrositlere farklılaşabilen dokuda yerleşik hücrelerdir. Fibro-adipojenik progenitörler, yaralanma sonrası hücre dışı matris yeniden şekillenmesinden sorumlu oldukları için doku rejenerasyonunu düzenlemek için temeldir. Bu çalışma, fibro-adipojenik progenitörlerin dikenli fare kardiyak onarımı ve iskelet kası rejenerasyonundaki spesifik rolünü araştırmaya odaklanmaktadır. Bu amaçla, enzimatik olarak ayrışmış iskelet ve kalp kasından akış sitometrisi ile dikenli fare fibro-adipojenik progenitörlerinin saflaştırılması için bir protokol optimize edilmiştir. Bu protokolden elde edilen popülasyon in vitro olarak genişleyebilir ve miyofibroblastlar ve adipositlere farklılaşabilir. Bu protokol, araştırmacıların dikenli farenin ayırt edici özelliklerini incelemeleri ve bunları Mus musculus ile karşılaştırmaları için değerli bir araç sunmaktadır. Bu, bu ilgi çekici modelde rejeneratif mekanizmaların anlaşılmasını ilerletebilecek içgörüler sağlayacaktır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Başlangıçta son derece kırılgan cildi ve cilt yaralanmalarını onarma konusundaki olağanüstü yeteneği ile tanınan dikenli fare, Mus musculus 1,2 ile karşılaştırıldığında kas-iskelet sistemi, böbrek, merkezi sinir sistemi ve kardiyovasküler gibi çeşitli organ sistemlerinde üstün rejeneratif kapasite göstermiştir.

Fibro-adipojenik progenitörler (FAP'ler), iskelet ve kalp kası dahil olmak üzere çeşitli dokularda yerleşik olan stromal hücrelerin bir alt kümesidir. Bu hücreler, in vivo ve in vitro 3,4 fibrojenik ve adipojenik soylara bağlanmak için benzersiz bir kapasiteye sahiptir. FAP'lar, hücre dışı matrisi modüle ederek ve onarım sürecinde yer alan diğer hücre tiplerinin işlevlerini destekleyerek doku rejenerasyonunda çok önemli bir rol oynar. İskelet kasında, FAP'lar yaralanmaya yanıt olarak aktive olur ve kas kök hücre farklılaşmasını ve miyojenezi kolaylaştırır 5,6. Kalbin iskemik hasarında, FAP'lar miyokardın bütünlüğünü korumak için skar dokusu bırakır. Kasın aksine, kardiyak FAP'lar kronik olarak aktive olur ve patolojik yeniden şekillenmeye katkıda bulunur 7,8.

Önceki çalışmalar, dikenli fare hücre dışı matrisinin, Mus musculus9,10 ile karşılaştırıldığında rejenerasyonu destekleyen farklı bileşim, yapı ve özelliklere sahip olduğunu göstermiştir. Kas ve kalp yaralanmalarında, FAP'ların dikenli farelerde üstün iyileşmeye katkıda bulunduğu kaydedilmiştir 11,12,13. Dikenli fare FAP'lerinin ve stroma'nın davranışını ve düzenleyici kontrolünü anlamak, rejeneratif yeteneklerinin arkasındaki mekanizmaya ışık tutabilir. FAP'lar, mus musculus14,15 gibi diğer hayvan modellerinde kapsamlı bir şekilde incelenmiş olsa da, şu anda dikenli fare FAP'lerini izole etmek için yayınlanmış bir protokol bulunmamaktadır. Böyle bir protokolün geliştirilmesi, bu alandaki önemli bir boşluğu dolduracak ve araştırmacıların dikenli farenin rejeneratif potansiyelinin altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaları incelemelerini sağlayacaktır.

Bu protokol, iskelet ve kalp kası FAP'lerini dikenli fareden izole etmek, genişletmek ve ayırt etmek için sağlam ve tekrarlanabilir bir protokolü tanımlar. Burada açıklanan protokol, floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) için uygun olan yüksek kaliteli tek hücreli süspansiyonlar verir. Mus musculus FAP'larını16 ayırt etmek için yaygın olarak kullanılan iki yöntem olan rh-TGFβ1 veya ticari olarak temin edilebilen uyumlu bir ortam kullanılarak, sıralanan dikenli FAP'lar sırasıyla fibrojenik soy ve adipojenik soy boyunca farklılaşma kapasitelerini korurlar (Şekil 1).

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan bakım ve deney işlemleri, British Columbia Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi'nin onayına ve British Columbia Üniversitesi'ndeki düzenlemelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Hayvanlar, standart koşullar altında (12:12 aydınlık-karanlık döngüsü, 21-23 °C ve %40-%60 nem seviyesi) patojen içermeyen kapalı bir tesiste barındırıldı ve protein açısından zengin bir fare diyeti ve su ad libitum sağlandı. Bu çalışma için erişkin (4-6 aylık, 50-60 g) dişi ve erkek Acomys dimidiatus fareleri kullanıldı. Kullanılan tüm reaktiflerin ve ekipmanların ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Çözelti ve tampon hazırlama

  1. 1x Fosfat Tampon Salin (PBS) hazırlayın.
  2. 4 mL 0.5 M EDTA (2 mM) ve 996 mL 1x PBS, pH = 7.4'ü karıştırarak PBS-EDTA'yı hazırlayın.
  3. 100 mL nükleaz içermeyen suya 2.7745 g CaCl 2 ekleyerek 250 mM CaCl2 hazırlayın.
  4. Sindirim tamponu hazırlayın: DMEM / F12'de 50 μg / mL liberaz, 2.5 mM CaCl2 ve% 5 fetal sığır serumu (FBS) karıştırın.
  5. 488 mL 1x PBS, 2 mL 0.5M EDTA ve 10 mL FBS'yi karıştırarak FACS tamponu hazırlayın.
  6. FACS tamponunu propidyum iyodür (PI; 1 μg/mL) ile karıştırarak Canlılık tamponu hazırlayın.
  7. DMEM/F12'yi %5 FBS ve %1 (h/v) kalem/strep ile karıştırarak Temel ortamı hazırlayın.
  8. DMEM / F12'yi %10 FBS,% 1 (h / v) pen / strep ve 2.5 ng / mL bFGF ile karıştırarak Proliferasyon ortamını hazırlayın.
  9. Bazik besiyeri ile 10 ng/mL rh-TGFβ1'i karıştırarak Mribojenik besiyeri hazırlayın,
  10. DMEM/F12'yi %1 kalem/strep ve piyasada bulunan 10x fare adipojenik farklılaşma takviyesi ile karıştırarak Adipojenik ortam (1x) hazırlayın.
  11. 1x PBS'ye %4 Paraformaldehit (a/h) ekleyerek %4 PFA hazırlayın.
  12. 498,5 mL 1x PBS ve 1,5 mL TritonX-100'ü karıştırarak %0,3 PBS-Triton hazırlayın.
  13. %5 (h/h) Eşek serumu, %1 BSA (a/h) ve %0.3 PBS-Triton'u karıştırarak Eşek engelleme tamponunu hazırlayın.
  14. 2,5 mL Eşek engelleme tamponu ve 2 damla MOM bloğunu karıştırarak Eşek + MOM engelleme tamponunu hazırlayın.
  15. 600 nM 4 ", 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) 1x PBS'de karıştırarak DAPI boyama çözeltisi hazırlayın.

2. Doku toplama

  1. Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi yönergelerini izleyerek hayvana ötenazi yapın. Dikenli fareler için, izofluran ve ardından CO2 (kafes / dakika hacminin% 20'si) ve ölümü sağlamak için omurga çıkığı önerilir.
  2. Fareyi sırtüstü pozisyonda diseksiyon aşamasına yerleştirin ve fare kürkü ile kontaminasyonu önlemek için% 70 etanol ile iyice püskürtün.
  3. Ventral orta hatta 2-3 cm'lik dikey bir kesi yapın ve göğüs kafesini ve karın kasını ortaya çıkarın. Ksifoid sürecinde kasları doku makasıyla kesin ve diyaframı açığa çıkarın. Diyaframı ve göğüs kafesini her iki taraftan kesin. Kesilen kaburgaları kelepçelemek ve soymak için bir kanama durdurucu kullanın.
  4. Sağ atriyumu doku makasıyla çentikleyin, kalbin tepesine 20 mL'lik bir şırıngaya bağlı 23 G'lik bir iğne yerleştirin ve 20 mL 2 mM PBS-EDTA'yı yavaşça enjekte ederek perfüze edin.
  5. Kalbi eksize edin, buz üzerinde 60 mm'lik bir Petri kabında soğuk 1x PBS'de durulayın, kulakçıkları çıkarın ve kanı mümkün olduğunca temizleyin.
  6. Diz ekleminin üzerindeki cildi çıkarın. Fasyayı çıkarmak için ince forseps kullanın ve uyluk kemiğini kılavuz olarak kullanarak kuadrisep kasını makasla izole edin. Soğuk 1x PBS ile ayrı bir Petri kabına yerleştirin.
  7. Diğer bacak için adım 2.6'yı tekrarlayın.

3. Doku sindirimi

  1. Kalp için 5 mL'lik bir taşıma şişesine 2 mL sindirim tamponu ve iki kuadripepl kas için 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne 4 mL sindirim tamponu ekleyin.
  2. Petri kabının kapağındaki doku makası ile dokuyu 1 mm'den küçük3 parçaya doğrayın.
  3. Kıyılmış dokuyu ilgili sindirim tüplerine ekleyin. Karıştırmak için düşük hızda 2 saniye boyunca girdap.
  4. Hafifçe döndürerek ve çalkalayarak 37 °C'de inkübe edin.
  5. 20 dakika sonra tüpleri döndürücüden çıkarın ve doku parçalarının yerleşmesine izin verin. Süpernatanı bir P1000 pipeti ile 50 mL santrifüj tüplerinde 20 mL buz gibi soğuk FACS tamponuna çıkarın.
  6. Sindirim tüplerini kalp ve kas sindirimi için sırasıyla 2 mL ve 4 mL sindirim tamponu ile doldurun ve hafif döndürme ve çalkalama ile 37 ° C'ye geri yerleştirin.
  7. Adım 3.5'ten adım 3.6'ya kadar 20 dakika sonra bir kez daha tekrarlayın. Süpernatanı adım 3.5'ten itibaren ilgili 50 mL santrifüj tüpüne koyun.
  8. Sindirim tamponunu buz gibi soğuk FACS tamponu ile söndürerek 60 dakika sonra sindirimi durdurun.
  9. Sindirim süspansiyonunu ve süpernatanı, 50 mL santrifüj tüplerinin üstündeki 40 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün. FACS tamponu ile 40 mL'ye kadar doldurun.
  10. Hücre süspansiyonunu 500 ° C'de 8 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltın ve hücre peletini 3 mL ACK lizis tamponunda yeniden süspanse edin. Buz üzerinde 5 dakika inkübe edin ve FACS tamponu ile 40 mL'ye kadar doldurun.
  11. 500 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltın.
  12. Hücrelerin eşit şekilde dağıldığından emin olmak için yukarı ve aşağı pipetleyerek 0,5 mL FACS tamponunda yeniden süspanse edin.
  13. Süspansiyonu, hücre süzgeç kapaklı 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüpler üzerindeki 40 μm'lik bir filtreden süzün.

4. Floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) için boyama

  1. Tek renk ve floresan eksi bir (FMO) kontroller için, önceden etiketlenmiş 1,5 mL santrifüj tüplerinde 2x çalışma konsantrasyonunda 30 μL boyama tamponu (FACS tamponunda seyreltilmiş antikorlar) hazırlayın. Antikor boyama tamponu kurulumu için Tablo 1'e bakın.
  2. Kas ve kalp için tek renkler ve FMO kontrollerini ayrı ayrı hazırlayın.
  3. 30 μL tek renk ve FMO kontrol boyama tamponunu 96 oyuklu bir plakaya aktarın. 20 μL FACS tamponu ile doldurun.
  4. Numune FACS boyaması için, 1.5 mL santrifüj tüplerinde 2x çalışma konsantrasyonunda 0.5 mL boyama tamponu (FACS tamponunda seyreltilmiş antikor) hazırlayın.
  5. Tek renk ve FMO kontrol kuyularına 10 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Hücre süspansiyonunun geri kalanına boyama tamponu ekleyin ve yeniden askıya alın.
  6. 4 °C'de inkübe edin, 30 dakika ışıktan koruyun.
  7. Kuyucukları 100 μL FACS tamponu ve numune tüpünü 2 mL FACS tamponu ile doldurun.
  8. 500 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
  9. 4.7 ve 4.8 adımlarını tekrarlayın.
  10. Hücre peletini canlılık tamponunda yeniden süspanse edin. Tek renk ve FMO kontrolleri için 100 μL, FACS sıralama numuneleri için 1 mL.
  11. 1.7 mL'lik santrifüj tüplerine 300 μL proliferasyon ortamı ekleyerek toplama tüplerini hazırlayın.

5. Floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması

  1. Geçit stratejisi: FSC'yi kullanın vs. Kalıntıları temizlemek için SSC (günlük). FSC-H ile karşılaştırın. Tekli kapılar için FSC-A. CD31 ile karşılaştırın. Canlı ve soy negatif hücrelere kapı açmak için PI. FAP'lere geçit vermek için PDGFRα kullanın (Şekil 2).
  2. Önceden hazırlanmış toplama tüplerine ayırın.

6. Doku kültürü

  1. Toplanan hücreleri 800 x g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin.
  2. Süpernatanı bir P1000 pipeti ile çıkarın. Hücre peletini rahatsız etmemeye dikkat edin.
  3. Peletleri kültür ortamında (250 μL/oyuk) yeniden süspanse edin ve 48 oyuklu bir doku kültürü plakasında 25k hücre/kuyuda tohumlayın.
  4. Bir inkübatörde kültür (37 °C,% 5 CO2). Hücreler% 80 birleşme noktasına ulaşana kadar her 3 günde bir ortamı değiştirin.

7. Fibrojenik farklılaşma

  1. Hücreler tedavi edilmeye hazır olduğunda, kullanmadan önce temel ortamı ve 1x DPBS'yi ılık bir banyoya veya oda sıcaklığına koyun.
  2. Kültür medyasını aspire edin.
  3. 200 μL 1x DPBS ile iki kez durulayın.
  4. 200 μL bazik ortam ile bir kez durulayın.
  5. İlgili kuyucuklara 250 μL fibrojenik veya bazik ortam ekleyin.
  6. Hücreleri inkübatöre geri koyun (37 °C,% 5 CO2).
  7. 48 saat sonra farklılaşmayı durdurun.

8. Adipojenik farklılaşma

  1. Hücreler tedavi edilmeye hazır olduğunda, kullanmadan önce temel ortamı, adipojenik ortamı ve 1x DPBS'yi ılık bir banyoya veya oda sıcaklığına yerleştirin.
  2. Kültür medyasını aspire edin.
  3. 200 μL 1x DPBS ile iki kez durulayın.
  4. 200 μL bazik ortam ile bir kez durulayın.
  5. İlgili kuyucuklara 400 μL adipojenik veya bazik ortam ekleyin.
  6. İnkübatöre geri dönün (37 ° C,% 5 CO2).
  7. Her 2 günde bir, kuyucuklardan bir pipetle 200 μL ortamı çıkarın ve 200 μL taze adipojenik veya bazik ortam ekleyin.
  8. İskelet kası FAP'ları için 6. günde , kardiyak FAP'lar için 14. günde farklılaşmayı durdurun.

9. İmmün boyama

  1. Besiyerini aspire ederek ve 250 μL 1x PBS ile iki kez durulayarak farklılaşma testini durdurun. Hücre ayrılmasını önlemek için tüm yıkamaları 3 mL şırıngaya bağlı 18 G iğne ile yapın.
  2. Kuyucuk başına 250 μL% 4 PFA ekleyin ve oda sıcaklığında 7 dakika inkübe edin.
  3. PFA'yı çıkarın ve her seferinde 250 μL 1x PBS ile 3 kez 5 dakika durulayın.
  4. Son yıkamada 1x PBS'yi aspire edin ve 250 μL Eşek + MOM engelleme tamponu ekleyin.
  5. Oda sıcaklığında 60 dakika inkübe edin.
  6. Kuyucuk başına 100 μL'lik bir nihai hacim için Eşek bloke edici tamponda (anti-SMA ve anti-perilipin) birincil antikor boyama solüsyonu hazırlayın.
  7. Boyama kuyularını aspire edin. Varsa, Eşek + MOM engelleme tamponunu kontrol kuyusunda bırakın.
  8. İlgili kuyucuklara birincil antikor boyama solüsyonu ekleyin.
  9. Gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
  10. Ertesi gün, her seferinde 1x PBS ile 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
  11. Kuyucuk başına 100 μL'lik bir nihai hacme sahip Eşek bloke etme tamponunda ikincil antikor boyama çözeltisi hazırlayın.
  12. Son yıkamayı aspire edin ve tüm kuyucuklara ikincil antikor boyama solüsyonu ekleyin.
  13. Oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin (numuneler bu noktadan itibaren ışıktan korunmalıdır).
  14. Her seferinde 1x PBS ile 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
  15. Son yıkamayı aspire edin ve 250 μL DAPI boyama solüsyonu ekleyin.
  16. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
  17. DAPI boyama solüsyonunu çıkarın ve 1x PBS ile 5 dakika boyunca bir kez yıkayın.
  18. Her kuyucuğa 100 μL Fluoromount-G ekleyin.
  19. Buharlaşmayı en aza indirmek için plakayı kapak ve parafin filmi ile kapatın. 4 °C'de, görüntülemeye kadar ışıktan koruyarak saklayın.
  20. Mikroskop ile görüntü (Şekil 3 ve Şekil 4).
    NOT: Eşek serumu, bu protokolde kullanılan eşek tarafından yetiştirilen ikincil antikorlara karşı türe özgü bir blok olarak tamponu bloke etmek için kullanılır. Fare üzerinde fare engelleme reaktifi, farede yükselen anti-SMA birincil antikoruna karşı kullanılır.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İskelet kası ve kardiyak FAP'ları izole etmek ve kültürlemek için bu protokolün şeması Şekil 1'de özetlenmiştir. Doku toplanması için, karaciğerin renginin koyu kırmızıdan soluk sarıya değişmesi genellikle başarılı bir perfüzyonun göstergesidir. Dikenli farenin belirtilen yaş aralıklarında, kalp ağırlıkları tipik olarak 200 mg civarındayken, kuadrisep kası yaklaşık 350 mg'dır.

Adım 3.5-3.7'deki her sindirim tamponu değişikliği sırasında, sindirim tüplerindeki sindirim tamponu, hücreler dokudan salınırken opak görünür. Sindirimin sonunda, çözelti, bazı doku parçaları ile birlikte nispeten homojen bir bulamaç olmalıdır. Hücrelerin canlılığını ve kültür sonuçlarını olumsuz yönde etkileyecek aşırı sindirimi önlemek için tüm dokular tamamen sindirilmeden önce sindirimi sonlandırdığınızdan emin olun.

FACS için beklenen akış grafikleri Şekil 2'de gösterilmektedir. FAP'ların canlı ve LIN hücrelerinin yaklaşık% 2'sini temsil etmesi beklenmektedir. PI+ olaylarının yüzdesi, numune hazırlama kalitesinin bir göstergesidir ve 'dan az olmalıdır. Bu çalışmada, kalp başına 150 bin FAP (sadece ventriküller) ve iki kuadrisep kastan 100 bin FAP tipik olarak elde edilir.

Plakaya girdikten sonra, hücreler tipik olarak 72 saat içinde bağlanır, 5 gün içinde% 80 birleşmeye ulaşır ve projeksiyonlarla tipik fibroblast morfolojisi gösterir (Şekil 5).

figure-results-1
Şekil 1: Protokolün şematik gösterimi ve her adım için gereken yaklaşık süre. Doku toplama: Fare başına 10 dakika. Doku sindirimi: 1.5-2 saat. Hücre boyama: 45 dk-75 dk. Floresanla aktive edilen hücre sıralaması: 2 saat. Fibro-adipojenik progenitörler (FAP) genişlemesi: 4 gün. FAP farklılaşması: fibrojenik farklılaşma için 48 saat, iskelet kası FAP'leri için adipojenik farklılaşma için 6 gün ve kardiyak FAP'lar için 14 gün. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: İskelet kası (üstte) ve kardiyak (altta) FAP izolasyonu için temsili FACS çizimleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Dikenli fare iskelet kası FAP farklılaşması. (A) Fibrojenik farklılaşma kontrolü. (B) Fibrojenik farklılaşma. (C) Adipojenik farklılaşma kontrolü. (D) Adipojenik farklılaşma. Perilipin (yeşil), SMA (macenta), DAPI (mavi), ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Dikenli fare kardiyak FAP farklılaşması. (A) Fibrojenik farklılaşma kontrolü. (B) Fibrojenik farklılaşma. (C) Adipojenik farklılaşma kontrolü. (D) Adipojenik farklılaşma. Perilipin (yeşil), SMA (macenta), DAPI (mavi), ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Dikenli fare iskelet kası (A) ve kalp (B) FAP'lerinin 5 günlük kültürden sonra, farklılaşmadan önce parlak alan görüntüleri. Ölçek çubuğu = 360 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

DenetimCD31 SCPDGFRα SCCD31 FMOPDGFRα FMOÖrnek
CD31 antikoru+--++
PDGFRα antikoru-++-+

Tablo 1: Kontroller ve numune için antikor boyama kokteyllerinin ayarlanması için şematik kılavuz. SC = tek renk kontrolü, FMO = floresan eksi bir kontrol, + = karşılık gelen antikor ile, - = karşılık gelen antikor olmadan.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dikenli fare dokuları, doku ayrışmasındaki streslere karşı daha hassastır ve bu protokolün, hücre canlılığını artırmak için stresi en aza indirmeyi amaçlayan çeşitli yönleri vardır. Gerekli enzimin konsantrasyonunu düşürmek için numune hazırlama için seri enzimatik ayrışma tekniği kullanılır. Enzimatik sindirim ilerledikçe enzimatik aktivite azalır. Taze enzimlerle değiştirilerek, tüm sindirim boyunca tutarlı enzimatik aktivite daha iyi elde edilebilir ve enzimin yüksek konsantrasyonlarından kaçınılır. Ayrıca, çözelti içinde zaten salınan hücreleri aşırı sindirmek için sindirim tamponunun değiştirilmesinden kaçınılır. İkinci olarak, kırmızı kan hücrelerini uzaklaştırmak için ACK lizis tamponu kullanılır. Kalp kan durumuna düşmüş ve perfüze edilmiş olmasına rağmen, yüksek derecede vaskülarize bir organ olduğu için hala kırmızı kan hücreleri içerir. Kirletici kırmızı kan hücrelerini uzaklaştırarak, hücre bozulmasını önlemek için FACS için gereken süre en aza indirilir. Son olarak, adım 2.1'den adım 6.4'e kadar hızlı ve özenli bir şekilde çalışmak ve hücrelerle çalışmak için nazik pipetleme ve mümkün olduğunca buz üzerinde tutma gibi en iyi uygulamaları takip etmek önemlidir. Bazı ayrıntıların görsel-işitsel formatta bile gösterilmesi zordur ve belirli bir düzeyde deneyim gerektirebilir.

Hücre kültüründe, ilk tohumlama yoğunluğu optimal hücre genişlemesi için kritik öneme sahiptir. Çanaktaki FAP'lar parakrin bir şekilde iletişim kurar ve salgılanan büyüme faktörleri aracılığıyla büyümeyi uyarır. Düşük tohumlama yoğunluğu koşullarında, hücreler büyüme için yeterli sinyalleri almaz ve ya genişleyemez ya da aşağı akış uygulamaları için uygun birleşme seviyelerine ulaşmak için ek kültür süresi gerektirir. Bu aynı zamanda, adipojenik farklılaşmadaki her medya değişikliği sırasında medyanın sadece yarısını değiştirmenin mantığıdır. Farklılaşmaları için kritik olan pre-adipositlerden büyüme faktörlerini içeren bazı şartlandırılmış ortamların bırakılması önemlidir.

İmmün boyama sırasında, hücre ayrılmasını en aza indirmek için tampon eklerken veya çıkarırken nazik olmak önemlidir. Özellikle, adım 9.1'de, hücreler fiksasyondan önce ayrılmaya en yatkın olanlardır. Pipet veya iğne ve şırınga gibi manuel aspirasyon önerilir, ancak güçlü vakum aspiratörlerinin kullanılması önerilmez.

Bu protokolün bir sınırlaması, PDGFRα'nın FAP'ların genel bir belirteci olması ve FAP'lerin17'nin benzersiz alt tiplerini ayırt etmek için daha fazla belirteç gerekmesidir. FAP'lar ve CD10+ adipojenik FAP'lar gibi DPP4+ progenitörleri gibi alt tipler hem hastalık hem de homeostatik bağlamda rol oynamaktadır 18,19,20. FAP alt kümeleri muhtemelen dikenli farede de mevcuttur. Farklı oranlarda bulunabilirler, farklı hücresel davranışlar sergileyebilirler veya karşılık gelen mus musculus FAP alt kümelerine kıyasla farklı fizyolojik işlevlere sahip olabilirler. Dikenli fare FAP'lerinin ayrıntılarını incelemek için dikenli farede FAP alt tipine özgü belirteçlerin daha fazla optimizasyonuna ihtiyaç duyulacaktır.

Özetle, bu protokol, iskelet kası ve kardiyak FAP'leri dikenli fareden izole etmek, kültürlemek ve ayırt etmek için sağlam ve tekrarlanabilir bir yöntemi detaylandırır. Dikenli fare, yeni bir hiper-rejeneratif hayvan modeli olarak ivme kazanıyor. FAP'lar ve stroma, kas ve kardiyak homeostazın sürdürülmesinde yüksek oranda rol oynar ve çoklu kronik hastalık modellerinde organ disfonksiyonuna katkıda bulunur 5,7. Dikenli fare FAP'larını karakterize etmek, olağanüstü rejeneratif kapasitelerinin arkasındaki mekanizmayı aydınlatabilir ve rejeneratif tıpta yeni stratejilere giden yolu açabilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UBC akış çekirdeğinden Andy Johnson ve Justin Wong'a uzmanlıkları ve FACS protokolünü optimize etmedeki yardımları için ve ayrıca dikenli fare bakımı için UBC Biyomedikal Araştırma Merkezi hayvan tesisi personeline teşekkür ederiz. Şekil 1 Biorender kullanılarak yapılmıştır. Şekil 2 , FlowJo yazılımı kullanılarak yapılmıştır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.5M EDTAInvitrogen15575 – 038
1.7 mL Mikrosantrifüj tüpleriVWR87003-294
15  mL santrifüj tüpüFalcon352096
1x Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Salin (DPBS)Gibco14190-144
20 mL şırıngaBD309661
4 asal ;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)İnvitrojenD3571
40   μ m hücreli süzgeçFalcon352340
48 kuyulu düz tabanlı doku kültürü plakasıFalcon53078
5 mL polipropilenFalcon352063
5 mL polistiren hücre süzgeç kapaklı yuvarlak tabanlı tüpFalcon352235
5 mL şırıngaBD309646
50  mL santrifüj tüpüFalcon352070
60 mm Petri kabıFalcon353002
96 kuyulu V-alt doku kültürü plakasıCorning3894
Acomys dimidiatus fareler (dikenli fareler)Dr. Ashley W. Seifert (Kentucky Üniversitesi)
Amonyum-klorür-potasyum (ACK) parçalama tamponuGibcoA10492-01
Anti-perilipin (1:100)SigmaP1873
Anti-SMA (1:100)Invitrogen14-9760-82
APC PDGFRa (1:800)Abcamab270085
BD PrecisionGlide İğnesi 18 GBD305195
BD PrecisionGlide İğnesi 23 GBD305145
Sığır serum albüminiSigmaA7906-100g
BV605 CD31 (1:500)BD biyolojik bilimler744359
CaCl2Sigma-AldrichC4901
SantrifüjEppendorf5810R
DMEM/F12Gibco11320033
Eşek anti-fare Alexa 555 (1:1000)InvitrogenA31570
Eşek anti-tavşan Alexa 647 (1:1000)InvitrogenA31573
Eşek serumuSigmaS30-100ML
FACS sıralayıcı - MoFlo Astrios 5 lazerlerBeckman sürgüB52102
Fetal sığır serumuİkizler100-500
İnce makasFST14058-11
Fluoromount-GSouthernBiotech0100-01
ForsepsFST11051-10
HemostatFST91308-12
insan FGF-bazik rekombinant protein (bFGF)Gibco13256029
İnsan TGF beta 1 rekombinant protein (TGFb1)eBiosciences14-8348-62
İnkübatör - Heracell 160i CO2ThermoFisher51033557
Ters mikroskop - RevolveECHOn/a
LiberaseRoche5401127001
Fare MesenCult Adipojenik Farklılaşma 10x EkKÖK HÜCRE teknolojileri5507
Fare üzerinde fare (MOM) bloke edici reaktifVektör LaboratuvarlarıMKB-2213
ParaformaldehitSigmaP1648-500g
Penisilin-StreptomisinGibco15140– 122
PicoLab Fare Diyeti 20LabDiet3005750-220
Propidium iyodür (PI)İnvitrojenP3566
Taşıma şişesi 5 mL tüpCaplugs Evergreen222-3005-080
Triton X-100Sigma9036-19-5
tarafından nazikçe hediye edilmiştir.

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gaire, J., et al. Spiny mouse (Acomys): An emerging research organism for regenerative medicine with applications beyond the skin. NPJ Regen Med. 6, 1(2021).
  2. Sandoval, A. G. W., Maden, M. Regeneration in the spiny mouse, Acomys, a new mammalian model. Curr. Opin. Genet. Dev. 64, 31-36 (2020).
  3. Judson, R. N., Zhang, R. H., Rossi, F. M. A. Tissue-resident mesenchymal stem/progenitor cells in skeletal muscle: Collaborators or saboteurs. FEBS J. 280 (17), 4100-4108 (2013).
  4. Uezumi, A., et al. Fibrosis and adipogenesis originate from a common mesenchymal progenitor in skeletal muscle. J Cell Sci. 124, 3654-3664 (2011).
  5. Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nat Cell Biol. 12, 153-163 (2010).
  6. Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nat Cell Biol. 122 (12), 143-152 (2010).
  7. Soliman, H., et al. Pathogenic Potential of Hic1-Expressing Cardiac Stromal Progenitors. Cell Stem Cell. 26 (2), 205-220 (2020).
  8. Hall, C., Gehmlich, K., Denning, C., Pavlovic, D. Complex relationship between cardiac fibroblasts and cardiomyocytes in health and disease. J Am Heart Assoc. 10, 1-15 (2021).
  9. Gawriluk, T. R., et al. Comparative analysis of ear-hole closure identifies epimorphic regeneration as a discrete trait in mammals. Nat Commun. 71 (7), 1-16 (2016).
  10. Seifert, A. W. Skin shedding and tissue regeneration in African spiny mice (Acomys). Nature. 489, 561(2012).
  11. Koopmans, T., et al. Ischemic tolerance and cardiac repair in the spiny mouse (Acomys). NPJ Regen Med. 6, 78(2021).
  12. Peng, H., et al. Adult spiny mice (Acomys) exhibit endogenous cardiac recovery in response to myocardial infarction. NPJ Regen Med. 6, 74(2021).
  13. Maden, M., et al. Perfect chronic skeletal muscle regeneration in adult spiny mice, Acomys cahirinus. Sci Rep. 8, 8920(2018).
  14. Riparini, G., Simone, J. M., Sartorelli, V. FACS-isolation and culture of fibro-adipogenic progenitors and muscle stem cells from unperturbed and injured mouse skeletal muscle. J Vis Exp. (184), e63983(2022).
  15. Low, M., Eisner, C., Rossi, F. Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture. Methods Mol Biol. 1556, 179-189 (2017).
  16. Molina, T., Fabre, P., Dumont, N. A. Fibro-adipogenic progenitors in skeletal muscle homeostasis, regeneration and diseases. Open Biol. 11 (12), 210110(2021).
  17. Contreras, O., Rossi, F. M. V., Theret, M. Origins, potency, and heterogeneity of skeletal muscle fibro-adipogenic progenitors-time for new definitions. Skelet Muscle. 111 (11), 1-25 (2021).
  18. Fitzgerald, G., et al. MME+ fibro-adipogenic progenitors are the dominant adipogenic population during fatty infiltration in human skeletal muscle. Commun Biol. 61 (6), 1-21 (2023).
  19. Babaeijandaghi, F., et al. DPPIV+ fibro-adipogenic progenitors form the niche of adult skeletal muscle self-renewing resident macrophages. Nat Commun. 141 (14), 1-10 (2023).
  20. Schutz, P. W., Cheung, S., Yi, L., Rossi, F. M. V. Cellular activation patterns of CD10+ fibro-adipogenic progenitors across acquired disease states in human skeletal muscle biopsies. Free Neuropathol. 5, 3-3 (2024).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Fibro Adipojenik Progenit rlerAk SitometrisiEnzimatik SindirimKalp Kas Rejenerasyonuskelet Kas RejenerasyonuH cre Ay klamaDoku DisosiyasyonuProgenit r H cre EkspanasyonuH cre D Matriks Yeniden Yap lanmas

İlgili makaleler