Yöntem makalesi

Farelerde Yükselen Vajinal Enfeksiyon, Erken Doğum ve Yenidoğan Morbiditesinin Modellenmesi

1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66723

⸱

10 Ekim 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1EGA Institute for Women's Health, University College London, 2Department of Women and Children's Health, St Thomas' Hospital, King's College London

Bu makalede

Özet

Erken doğum (37 haftadan < doğum), optimal olmayan önleme ve tedavi seçenekleriyle acil bir küresel sağlık sorunudur. Artan vajinal bakteriyel enfeksiyon kaynaklı erken doğumun bir fare modelini sunuyoruz ve ortaya çıkan yenidoğan morbidite ve mortalitesinin nasıl analiz edileceğini özetliyoruz.

Özet

Erken doğum, sınırlı önleyici tedavilerle birlikte dünya çapında yenidoğan mortalite ve morbiditesinin birincil nedeni olmaya devam etmektedir. Klinik olarak zorunlu bir ihtiyaç vardır.
Yenilikçi müdahalelerin çevirisi için ilgili ve tekrarlanabilir hayvan modelleri
gerçeğe dönüşmek. Erken doğumun çeşitli fare modelleri mevcuttur. Bununla birlikte, nöropatolojik değişiklikler ve
Artan enfeksiyon ve erken doğumun karakteristik sekelleri olan akciğer hasarı. Bildiğimiz kadarıyla, vajinadan yükselen canlı bir bakteri tarafından erken doğumun indüklenmesinin ardından bu yenidoğan morbiditelerinin mevcut olduğu insan senaryosunu taklit eden tek model olan bir modeli karakterize ettik. Bu makale, Escherichia coli'nin biyolüminesans suşunun intravajinal uygulamasını göstermekte ve immünohistokimya ve histoloji teknikleri kullanılarak nöropatolojik sonuçların ve akciğer hasarının değerlendirilmesini detaylandırmaktadır.

Giriş

Erken doğum (PTB; 37 hafta < doğum) dünya çapında yenidoğan ölümlerine en çok katkıda bulunan faktördür 1,2. Tüm doğumların %11'ini oluşturan, tam olarak anlaşılamamış karmaşık bir etiyolojiye sahip, tahmin edilmesini ve önlenmesini zorlaştıran önemli bir küresel sağlık sorunudur 3,4,5. PTB'den kurtulan yenidoğanlar, serebral palsi, bronkopulmoner displazi (BPD) gibi solunum bozuklukları ve nekrotizan enterokolit (NEC) gibi gastrointestinal rahatsızlıklar dahil olmak üzere olumsuz nörogelişimsel sonuçlar yaşayabilir 6,7,8. Bu nedenle, PTB'ye katkıda bulunan biyolojik yolları ele almak ve yenilikçi müdahaleler geliştirmek için klinik olarak ilgili, tekrarlanabilir hayvan modellerine acil ihtiyaç vardır.

Spontan PTB'nin altında yatan desidual yaşlanma, maternal-fetal toleransın bozulması, stres, kısa servikal uzunluk veya servikal hasar gibi bir dizi olası mekanizma vardır9. Bununla birlikte, spontan PTB'lerin en az %40'ının mikrobiyal enfeksiyon ile ilişkili olduğu bildirilmektedir10,11. Vajinal kanaldan serviksten uterusa yükselen mikroplar, amniyotik sıvıdan izole edilen mikroplar ile vajinal mikrobiyotada ikamet edenler arasındaki korelasyon nedeniyle yaygın bir enfeksiyon yolu olarak varsayılmakta ve yaygın olarak kabul edilmektedir 12,13,14. Genellikle erken doğumla ilişkili mikroorganizmalar arasında Mycoplasma, Ureaplasma, Fusobacterium ve Streptococcus türleri bulunur ve çoğu vaka polimikrobiyaldir15,16.

Fareler genellikle PTB'yi modellemek için kullanılır, en yaygın yaklaşım, doğumu başlatmak için gerekli inflamasyon seviyelerini indüklemek için intrauterin, intraperitoneal veya intra-amniyotik yollarla verilebilen bakteriyel toksin lipopolisakkaritin (LPS) uygulanmasıdır17. Bununla birlikte, LPS canlı mikrobiyal enfeksiyonu modellemez ve daha da önemlisi, LPS fetal ölümü indüklediği için bu modellerde yenidoğan sonuçları ölçülemez18. Son yıllarda, artan vajinal bakteriyel enfeksiyonun hayvan modelleri geliştirilmiştir, ancak hem erken doğumu hem de ilişkili yenidoğan sonuçlarını özetlemek zor olmuştur 19,20,21,22,23,24.

Grubumuz, insan PTB25'in patofizyolojisini özetleyen, artan vajinal bakteriyel enfeksiyon, erken doğum ve neonatal morbidite için yeni bir model oluşturmuştur. Burada, insan yenidoğan menenjitiyle bağlantılı patojenik bir Escherichia coli (E. coli) suşu ile maternal çıkan vajinal enfeksiyona maruz kalan yavrularda yenidoğan nöropatolojisinin ve akciğer hasarının nasıl değerlendirileceğini gösteriyoruz. Bu model, artan enfeksiyonun patofizyolojisini araştırmak için eşsiz bir fırsat sunmanın yanı sıra, yenidoğan sonuçlarını iyileştirmede erken doğum müdahalelerinin etkinliğini değerlendirmek için araçlar sağlar.

Protokol

Prosedürler, Hayvan Bilimsel Prosedürler Yasası (1986) ve ARRIVE yönergelerine uygun olarak Birleşik Krallık İçişleri Bakanlığı Lisansı (PAD4E6357) altında yürütülmüştür. Sıcaklık (19-23 °C), nem (~%55) ve 12 saatlik aydınlık/karanlık döngüleri sıkı bir şekilde kontrol edildi. Bakire dişi C57BL/6 Tyrc-2J fareleri (6-12 haftalık) 16-18 saat boyunca gece boyunca zamanla çiftleştirildi. Çiftleşme tıkacının kanıtı embriyonik gün (E) 0.5 olarak atandı.

Patojenik E. coli O18:K1 (A192PP)26, A192'nin (DSM. No. 10719)27, nematod ortakyaşamı Photorhabdus Luminescens ATCC29999'den (Hb suşu) kaynaklanan ve bir kanamisin direnç kaseti (Km2)28 içeren lux operonunu (luxCDABE) içerecek şekilde modifiye edilmiştir. Bu suş, Birleşik Krallık Hükümeti Tehlikeli Patojenler Danışma Komitesi (ACDP) tarafından Tehlike Grubu 2 olarak kategorize edilmiştir. Biyolojik ajanları kullanırken ve atarken uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) giyin ve yerel yönergeleri izleyin.

1. Artan vajinal bakteriyel enfeksiyonun fare modeli

  1. E. coli kültürlerinin hazırlanması
    1. Luria-Bertani (LB) suyunu% 20'lik bir çözelti ve otoklav yapmak için tozu damıtılmış suda (dH2O) çözerek hazırlayın. LB oda sıcaklığına soğuduktan sonra 50 μg/mL kanamisin ekleyin. 4 °C'de 1 haftaya kadar saklayın.
    2. Katıyı steril fosfat tamponlu salin (PBS) içinde çözerek %20'lik bir Pluronic jel F127 çözeltisi hazırlayın. Gece boyunca 4 °C'de karıştırmak ve çalkalamak için vorteks.
    3. Steril 30 mL'lik evrensel bir kaba 10 mL antibiyotikle işlenmiş LB suyu ekleyin. Donmuş bir gliserol E . coli stoğunu -80 °C'lik depodan çıkarın. Steril bir pipet ucu kullanarak, ucun ucunu hafifçe kaplamak için donmuş gliserol stoğu E. coli'yi kazıyın ve ucu doğrudan LB suyuna çıkarın. Üniversal kabı parafilm ile sabitleyin, biyolojik tehlike olarak etiketleyin ve gece boyunca (200 rpm) 37 °C'de bir yörünge çalkalayıcıya yerleştirin.
    4. Ertesi sabah, bakteri kültürünü 1:100 (0.1 mL kültür + 9.9 mL taze LB suyu) seyreltin ve 1.5-3 saat (37 °C'de 200 rpm) orbital çalkalayıcıya geri koyun, absorbansı 600 nm'de ölçerek kültürün büyümesini düzenli olarak kontrol edin. Kültürün 100 μL'sini iki kopya halinde berrak, düz tabanlı 96 oyuklu bir plakaya pipetleyin. Yol uzunluğu düzeltmesi etkinleştirilmiş bir spektrofotometrede absorbansı ölçün. 0,5 ile 0,7 arasındaki bir OD600 , büyümenin orta logaritmik fazını belirtir.
    5. OD600 0.5-0.7'ye ulaşıldığında (~108-9 koloni oluşturan birim [CFU]), bakteri kültüründen 100 μL'yi çıkarın ve 900 μL steril PBS içinde seyreltin. Bakteri peletini yıkamak ve LB suyunu çıkarmak için 14.000 × g'da 1 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın, bakteri peletini steril PBS'de yeniden süspanse edin ve steril PBS'de (102-3 CFU'ya kadar) 1:10.000 seyreltin.
    6. Bakterilere maruz kalan tüm uçları ve kapları atmadan önce dezenfekte edin.
  2. Anestezi
    1. E16.5'te, hamile fareleri izofluran inhalasyonu ile uyuşturun (indüksiyon için% 5, oksijende idame için% 1.5). Anestezi akışını ve ardından hayvanı burun konisine aktarın ve dişiyi yüzüstü pozisyona getirin. Ayak parmağı sıkıştırma refleksinin olmamasıyla anesteziyi doğrulayın ve izofluranı prosedür için gereken minimum yüzdede tutun.
      DİKKAT: İzofluran, göz ve cildi tahriş edici ve merkezi sinir sistemi toksik maddesidir. Uygun KKD giyin. Her zaman bir süpürme sistemi kullanın.
    2. Steril 200 μL'lik bir pipet ucu kullanarak vajinaya 20 μL midlogaritmik faz E. coli (1 × 102-3 CFU) veya steril PBS (araç kontrolü) uygulayın (Şekil 1). Yeni, steril 200 μL'lik bir pipet ucu kullanarak, bakteri sızıntısını önlemek için vajinaya 20 μL %20 Pluronic jel F127 jeli verin. Steril gazlı bez kullanarak, fareleri bakteri süspansiyonunu temizlemekten caydırmak için introitusun üzerine kinin tozu sürün. Tedavinin tarihini ve saatini kaydedin.
      NOT: Kullanılan CFU, istenen fenotipi (canlı yavrularla erken doğum) elde etmek için titrasyon deneylerine dayanmaktadır. CFU, LB agar plakaları29 üzerinde seri seyreltmeler ve kaplama yapılarak belirlenebilir.
    3. Hayvanları ayrı ayrı havalandırılan kafeslerde (IVC) tek tek kafes yapın ve kafesi bekleme odasına geri koymadan önce anesteziden kurtulmalarına izin verin; Kafesi biyolojik tehlike olarak açıkça işaretleyin. Normal davranışları devam edene kadar hayvanları izleyin.
      NOT: Bu prosedür 5 dakikadan fazla sürmemeli ve hayvanlar hızlı bir şekilde (2-5 dakika içinde) iyileşmelidir.
  3. Gebelik sonuçlarının ölçülmesi
    1. Fareleri doğum ve yavru doğum belirtileri açısından izlemek için her kafesin dışına bir kamera takarak CCTV'yi kurun. Doğuma kadar geçen süreyi, E. coli veya PBS'nin intravajinal uygulamasından (adım 1.2.2) ilk yavrunun doğumuna kadar geçen saat sayısı olarak kaydedin.
    2. Doğumdaki canlı/ölü yavruların sayısını kaydedin ve çöp başına hayatta kalma yüzdesini hesaplayın. Barajı ve yavruları günlük olarak gözlemleyin, yavruların doğum sonrası 7 güne kadar hayatta kalma sürelerini kaydedin ve barajların iyileşmesini sağlayın. Bu süre zarfında yavru ağırlığı ve uzunluğu gibi diğer ölçümleri yapın.
      NOT: Doğum sinyalleri arasında artan tımar, daireler çizerek dönme ve arka ayaklarını germe ve tekmeleme yer alır. Bu canlı bir bakteriyel enfeksiyon olduğundan, barajlar zamanla (genellikle tedaviden 24 saat sonra) semptomlar geliştirecektir. Dişi enfeksiyondan kurtulmalıdır, ancak doğumdan sonra hala enfeksiyon belirtileri gösteriyorsa, yuva yapmadıysa veya yavrularını ilk gün içinde beslemediyse, o zaman Çizelge 1 yöntemlerini kullanarak hayvanları insanca kurban edin (artan konsantrasyonda CO2'ye maruz kalma ve servikal çıkık ile ölümü doğrulama gibi).
  4. Biyolüminesans görüntüleme
    1. Bakteriyel aşılamayı takiben, aşağıda açıklandığı gibi enfeksiyonun yayılmasını izlemek için dişileri 24 saat ve 48 saatte görüntüleyin. Yavruları doğum sonrası günde (P)0'dan P14'e kadar anesteziye gerek kalmadan görüntüleyin.
    2. Görüntüleme yazılımını açtıktan sonra Başlat'a tıklayın ve kameranın çalışma sıcaklığına ulaşmasını bekleyin (sıcaklık çubuğu yeşile dönecek ve "kilitlenecektir"). Lüminesans görüntüleme kutusunu işaretleyin ve Uyarma Filtresinin Engelle ve Emisyon Filtresinin Açık olarak ayarlandığını onaylayın.
    3. Yetişkin kadınları izofluran inhalasyonu ile uyuşturun (indüksiyon için% 5, oksijende idame için% 1.5). Farelere anesteziyi sürdürürken hayvanları biyolüminesans görüntüleme makinesine (ısıtılmış bir aşama ile) sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Otomatik pozlama süresi öğesini seçin veya pozlama süresini manuel olarak ayarlayın (pozlama aralığı: 1 dakika - 5 dakika). Görüntülemeden sonra, hayvanları bekleme odasına geri döndürmeden önce anesteziden kurtulmak için kafeslerine geri koyun.
    4. Foton parlaklığını nicel olarak ölçmek için, fare görüntülerinde ilgilenilen bölgeleri (ROI'ler) seçin ve steradyan başına santimetre kare başına saniyedeki fotonları kaydedin (fotonlar∙(saniye-cm2)-1∙sr-1).

2. Fetal ve neonatal doku analizleri

  1. Perinatal doku toplama
    1. E18.5'te, artan CO2 konsantrasyonuna maruz bırakarak ve servikal çıkık ile ölümü doğrulayarak barajı feda edin ve uterusu çıkarmak için mini bir laparotomi yapın; Daha sonra makas kullanarak rahimde bir kesi yapın.
    2. Amniyotik sıvı topluyorsanız, zarlarda küçük bir kesi yapın ve sıvıyı bir Pasteur pipeti veya iğnesiz bir şırınga kullanarak toplayın.
    3. Forseps kullanarak, bir elinizle plasentanın bağlı olduğu noktada uterusun dışını tutun ve diğer elinizde kavisli forseps ile dokuları birbirinden ayırarak plasentayı iç uterus duvarından nazikçe ayırın, zarlar ve plasenta takılı olarak fetüsü dikkatlice uterustan dışarı yönlendirin. Yine her iki elinizde forseps ile plasentayı nazikçe tutun ve zarları plasenta ile birleştikleri noktada kavrayın ve koparın (bunların temiz bir şekilde çıktığından emin olun).
    4. Artık dokular ayrıldığına göre, gerekli gebelik dokularını (örneğin rahim, plasenta, fetal membranlar, serviks ve vajina) toplayın ve fetal dokuları (örneğin beyin, akciğerler ve bağırsak) inceleyin.
    5. Dokuları hemen kuru buz veya sıvı nitrojen üzerinde dondurun ve/veya dokuları paraformaldehit (PFA; PBS'de %4) içinde sabitleyin.
    6. Dondurulmuş mendili -80 °C'de saklayın ve mendilleri 24-48 saat sabitleyin; daha sonra 4 °C'de %30 sükroz içinde saklayın.
      DİKKAT: PFA yanıcıdır ve göz, cilt ve solunum yolu tahrişine neden olabilir. Bir biyogüvenlik kabininde %4'lük çözelti hazırlayın ve kullanım sırasında uygun KKD giyin.
  2. Doğum sonrası doku toplama
    1. P7'de, yavruları izofluran kullanarak uyuşturun (indüksiyon için% 5, oksijende bakım için% 1.5).
    2. Sağ atriyumu keserek kan kaybı ve doku perfüzyonu yapın ve sol ventriküle 10 mL PBS enjekte edin. Karkasın başını kesin ve steril makas ve forseps kullanarak beyni ve akciğerleri çıkarın. Dokuyu yukarıda açıklandığı gibi işleyin ve saklayın.
      NOT: Maternal ve fetal snap-frozen doku, qPCR, ELISA ve western blot ile inflamatuar ve diğer mediatörler için analiz edilebilir. Bu teknikler için protokoller, reaktif üreticilerinden veya diğer yayınlarda 25,30,31 kolayca temin edilebilir.
  3. Fetal ve neonatal beyinlerin kriyoseksiyonu
    1. Bir bıçak kullanarak, düz bir yüzey oluşturmak için beyinciği çıkarın ve dokuyu kuru buz üzerinde dondurun. Dondurulmuş dokuyu optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiği kullanarak numune tutucuya monte edin ve dokuyu ince bir OCT tabakasıyla kaplayın. Donmaya bırakın (1-2 dakika).
    2. -20 °C'ye ayarlanmış bir kriyostat kullanarak kolun kilitli olduğundan emin olun ve numune tutucuyu yükleyin. Doku pozisyonunu ince bir şekilde ayarlayın ve yerine kilitleyin. Dokuyu kesin ve korpus kallozumun füzyonundan mikro slaytlar üzerinde doku kesitleri toplamaya başlayın, kesitleri hemen kuru buz üzerinde dondurun. Her dokudan 50 seri 40 μm kesit kesin.
      DİKKAT: Keskin bıçağa dikkat edin.
    3. Dondurulmuş bölümleri -80 °C'de mikro slaytlarda saklayın.
  4. İmmünohistokimya
    NOT: Aşağıdaki protokol astrositleri (glial fibriler asidik protein; GFAP), mikroglia (allogreft inflamatuar faktör 1; IBA-1) ve nötrofiller (lenfosit antijeni 6 aile üyesi G; Ly6G). Antikor bilgileri şurada bulunabilir: tablo 1.
    1. Beynin değişken derinliklerinde farklı beyin bölgelerinin değerlendirilmesine izin verecek şekilde beyin başına 400 μm aralıklarla beş bölüm seçin. Dondurulmuş bölümleri bir damla dH2O ile yeniden sulandırın ve iki ince fırça kullanarak dokuyu yayın ve açın. Mendili bir fan altında 20-30 dakika kurutun. Hidrofobik (PAP) bir kalem kullanarak, dokunun etrafını dokunmadan dikkatlice çizin.
    2. 1. günde, bir 50 mL küvet (15 slayt kapasitesi) için 50 mL 0,1 M fosfat tamponuna (PB) 5,4 mL formaldehit ekleyerek %4 formaldehit (FA) hazırlayın. Kriyoseksiyonları sabitlemek, slaytlara yapışmayı sağlamak ve antijenleri hareketsiz hale getirmek için slaytları 5 dakika FA'ya batırın.
      DİKKAT: FA yanıcıdır ve göz, cilt ve solunum yolu tahrişine neden olabilir. Bir biyogüvenlik kabininde %4'lük bir çözelti hazırlayın ve kullanım sırasında uygun KKD giyin.
    3. 400 mL 0,1 M PB'ye 0,4 g BSA ekleyerek %0,1 sığır albümin serumu (BSA) hazırlayın. Bölümleri 0,1 M PB'ye daldırarak 2 kez yıkayın, ardından BSA'da bir yıkama yapın (yıkama başına ~3 sn). Slaytları şurada saklayın:
      ihtiyaç duyulana kadar BSA içeren küvetler.
    4. Kağıt mendili dH2O ile ıslatarak nem odaları hazırlayın ve bunları fazla suyu boşaltarak hazneye yerleştirin.
    5. % 5 keçi serumu hazırlayın (1 mL 0.1 M PB içinde 50 μL keçi serumu). PAP kalem kenarlığının sağlam olduğundan emin olarak doku bölümünün etrafındaki slaytı kağıt mendille dikkatlice kurulayın, ardından doku kesiti başına 50 μL solüsyon uygulayın. Nem odasında 30 dakika inkübe edin.
    6. Temiz kağıt mendil üzerine hafifçe vurarak serumu çıkarın ve BSA içinde seyreltilmiş birincil antikoru ekleyin (antikorlar ve seyreltmeler Tablo 1'de sunulmuştur). Gece boyunca 4 oC'de inkübe edin.
    7. 2. günde, ikincil antikoru fare serumunda (bakınız Tablo 1) 37 oC'de 30 dakika inkübe edin ve BSA'ya (1:100 seyreltme) ekleyin (örneğin, 5 mL BSA + 100 μL fare serumu + 50 μL ikincil antikor).
    8. Slaytları BSA'ya daldırarak 2 kez (~3 sn) ve ardından 0,1 M PB'de bir kez yıkayın. Slaytları BSA içeren küvetlerde tutun ve her doku bölümünün etrafındaki kenarlığı kurulayın. Doku kesiti başına 50 μL ikincil antikor çözeltisi uygulayın ve nem odasında 1 saat inkübe edin.
    9. 1 mL 0.1 M PB'ye 10 μL A ve 10 μL B ekleyerek avidin biotin kompleksi (ABC) (%0.1 seyreltme) hazırlayın. Slaytları 2 kez BSA'ya ve 0,1 M PB'de bir kez daldırın (~3 sn), ardından slaytları 0,1 M PB içeren bir küvete yerleştirin. Slaytları kurutun, slayt başına 50 μL ABC çözeltisi uygulayın ve nem odasında 1 saat inkübe edin.
    10. Diaminobenzidin (DAB) çözeltisi hazırlayın. Küvet başına 25 mg DAB tartın, 50 mL 10 mM PB içinde çözün ve 4 No'lu filtre kağıdı ile filtreleyin.
      DİKKAT: DAB, olası germ hücre mutajenitesi ve kanserojenliği olan bir sağlık tehlikesidir. Uygun KKD giyin ve güvenli bir şekilde atın.
    11. Slaytları 3 x 3 s 10 mM PB ile yıkayın ve 10 mM PB içeren küvetlere yerleştirin. Çözeltiyi hemen taze küvetlere (küvet başına 16.7 μLH2O2 ) dökmeden önce DAB çözeltisine hidrojen peroksit (H2O2 ) ekleyin. Slaytları DAB küvetlerine taşıyın ve mikroskop altında boyama yoğunluğunu sürekli kontrol ederken ~3 dakika (maksimum 5 dakika) bırakın.
      DİKKAT: H2O2 gözleri , cildi ve boğazı tahriş edebilir. Uygun KKD giyin.
    12. Slaytları (3 sn) 10 mM PB'de bir ve 2x dH2O'da yıkayın ve slaytların kurumasını bekleyin. Kuru slaytları 3 kez ksilene batırın. Bir lamel üzerine bir damla DPX montaj ortamı uygulayın ve hava kabarcıklarını önlemeye dikkat ederek doku bölümünün üzerine yerleştirin.
      DİKKAT: Ksilen ve DPX yanıcıdır ve göz, cilt ve solunum yolu tahrişine neden olabilir. Bir biyogüvenlik kabininde taşıyın ve tutarken daima eldiven giyin.
  5. Nissl boyama
    1. 1. günde, dokuyu dH2O'da rehidrate edin ve yayın. 50 mL 0,1 M PB'ye 5,4 mL FA ekleyerek %4 FA hazırlayın ve hemen kullanın. Slaytları gece boyunca %4 FA'da inkübe edin.
    2. 2. günde, slaytları %4 FA'dan %70 etanole (EtOH) taşıyın ve gece boyunca inkübe edin.
    3. 4 g Cresyl Violet'i 40 mL% 100 EtOH içinde kapalı 50 mL'lik konik bir tüpte çözerek Nissl boyasını hazırlayın. 15 dakika ters çevirin, çözeltiyi 360 mL ılık dH2O'ya ekleyin ve 20 dakika boyunca bir karıştırma plakasında karıştırın. Kullanmadan önce çözeltiyi süzün.
    4. 3. günde, Tablo 2'de özetlenen boyama prosedürünü izleyin ve doku kesitlerini DPX ile kapatın.
  6. Terminal deoksinükleotidil transferaz dUTP nick end etiketleme (TUNEL)
    1. Dokuyu dH2O'da yeniden sulandırın ve yayın, ardından slaytları 5 dakika boyunca% 4 FA'da inkübe edin. Slaytları bir H2O2 ve metanol (CH3OH) (1:10) çözeltisine taşıyın ve 15 dakika inkübe edin. Slaytları 0,1 M PB'de 2 x 3 saniye yıkayın ve 0,1 M PB içeren küvetlere yerleştirin.
    2. TUNEL çözeltisini üreticinin talimatlarına göre buz üzerinde hazırlayın. Çözeltiyi slaytlara ekleyin (doku kesiti başına 50 μL) ve 2 saat boyunca 37 oC'de bir nem odasında inkübe edin.
    3. 1 saatlik inkübasyondan sonra, ABC çözeltisini adım 2.4.9'da açıklandığı gibi hazırlayın ve oda sıcaklığında inkübe edin.
    4. 2 saat sonra, slaytları 10 dakika boyunca TUNEL STOP çözeltisine (300 mM NaCl, 30 mM Sodyum Sitrat) taşıyın ve slaytları 10 mM PBS çözeltisinde 3 x 3 s yıkamak için daldırın. Slaytları ABC çözeltisinde 1 saat inkübe edin.
    5. Kobalt sülfat (100 mL dH2O içinde 1.55 g susuz CoSO4) ve nikel klorür heksahidrat (100 mL dH2O içinde 2.38 g NiCl2·6H2O ) hazırlayın. DAB Co-Ni çözeltisi hazırlayın (10 mM PB + 25 mg DAB + 1 mL/100 mL Co + 1 mL/100 mL Ni). Çözeltiyi vakum altında süzün ve karanlıkta tutun. DAB çözeltisini küvetlere dökmeden hemen önce, 50 mL küvet başına 16,7 μLH2O2ekleyin.
    6. 1 saat sonra, slaytları DAB küvetlerine taşıyın ve boyama yoğunluğunu sürekli kontrol ederek oda sıcaklığında ~3 dakika inkübe edin. Slaytları 10 mM PB içeren küvetlere taşıyarak reaksiyonu durdurun. 2 x 3 sn'yi dH2O'ya daldırarak yıkayın ve doku bölümlerini DPX ile kaplamadan önce kurumasını bekleyin.
  7. Hematoksilen ve Eozin boyama (H&E)
    1. Dokuyu dH2O'da yeniden sulandırın ve yayın ve bölümlerin kurumasını bekleyin.
    2. Slaytları 2 dakika hematoksilin içine daldırın.
      DİKKAT: Hematoksilen göz ve cilt tahrişine neden olabilir. Uygun KKD giyin.
    3. Slaytları akan musluk suyunda 5 dakika durulayın, asit alkolde 1 saniye rengini giderin ve musluk suyunda durulayın.
    4. 30 saniye boyunca %0,5 eozin (300 mL %95 EtOH içinde çözülmüş 1,5 g) içinde karşı boyama yapın.
      DİKKAT: Eozin yanıcıdır ve göz ve cilt tahrişine neden olabilir. Çözeltileri bir biyogüvenlik kabininde hazırlayın ve uygun KKD giyin.
    5. Doku bölümlerini bir EtOH gradyanında kurutun: her biri 3 dakika boyunca% 50,% 70,% 95 ve son olarak% 100 EtOH. Slaytları 2 x 5 dakika boyunca ksilen içine taşıyın. DPX ile kapel.

3. Nöropatoloji ve akciğer hasarı için histoloji ve immünohistokimya değerlendirmeleri

NOT: Değerlendirmeler şu bölgelerde yapılabilir: korteks, piriform korteks, dış kapsül, striatum, hipokampus ve talamus (Şekil 2). E18.5 beyinleri için, hücrelerin farklılaşması henüz tamamlanmadığından ve glial hücreler tüm beyin bölgelerine göç etmediğinden korpus kallozum da dahil edilebilir. Değerlendirici tedavi gruplarına karşı kör olmalıdır.

  1. TUNEL+ hücre ölümü
    1. Geleneksel bir mikroskop kullanarak, tüm beyin bölgelerinde 20x büyütmede iki taraflı TUNEL boyama için pozitif hücreleri sayın (Şekil 2).
    2. Beyin bölgesi başına rastgele seçilen üç optik alanı değerlendirin ve beyin bölgesi başına ortalama hücre sayısını hesaplayın.
  2. Nissl morfoloji değerlendirmesi
    1. 1x büyütmede renkli bir kamera kullanarak tüm doku görüntülerini yakalayın ve bir TIFF dosyası veya istediğiniz başka bir format olarak kaydedin. Daha fazla analiz için görüntüleri ImageJ'ye aktarın.
    2. Beynin ilgilenilen bölgelerini (örneğin, korteks ve hipokampus) ana hatlarıyla belirtin ve serbest el aracını kullanarak ölçün (Şekil 2).
    3. Doku ölçümünü elde etmek için şu formülü uygulayın: (mm2 × 400 μm) = hacim × 100 (revize32).
  3. Mikroglial dallanma indeksi
    1. 0,049 mm x 0,049 mm kare ızgara özelliğine sahip bir mikroskop kullanarak, 40x büyütmede ızgara içindeki IBA-1+ hücre gövdelerinin sayısını (C) ve ızgara çizgilerini geçen ortalama dal sayısını (B) sayın. Bunu, Şekil 2'de gösterilen her beyin bölgesi için rastgele seçilen üç alanda (bkz. Şekil 3) gerçekleştirin.
    2. Mikroglial dallanma indeksini hesaplamak için (B2/ C) formülünü kullanın.
  4. GFAP boyama yoğunluğu için optik parlaklık
    1. Başvurulan yazılımı (Malzeme Tablosu) ve 40x büyütmede renkli bir kamera kullanarak, beyin bölgesi başına rastgele seçilen üç alanı yakalayın (Şekil 2). Ortalama ve standart sapmayı (SD) gösteren bir histogram elde etmek için Ctrl+H tuşlarına basın. Ortalama ve SD değerlerini bir elektronik tabloya kaydedin. Yalnızca çevreleyen camın (yani doku yok) bir kontrol görüntüsünü yakalayın ve ortalama ve SD değerlerini daha önce olduğu gibi kaydedin
    2. Bir elektronik tablodaki optik parlaklık değerlerini (OLV) hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın:
      OLV = (camın ortalaması − camın standart sapması) − ([görüntü başına ortalama − görüntü başına standart sapma] ortalaması)
      NOT: Örneğin:
      Çevreleyen cam
      Ortalama ± SD = 143.5 ± 8.56
      Beyin bölgesi (örneğin korteks)
      1. 136.7 ± 10.6
      2. 140.6 ± 10.4
      3. 137.4 ± 11.3
      OLV = (143,5 - 8,56) - ([136,7 - 10,6], [140,6 - 10,4], [137,4 - 11,3] ortalaması)
      OLV = 134.94 - 127.47
      ÖLÜ = 7.47
    3. Bölge, hayvan ve ardından deney grubu başına her değerin ortalamasını alın.
  5. Akciğer morfolojisi değerlendirmeleri
    1. H&E bölümlerini 40x büyütmede yakalayın (slayt başına üç optik alan, alan başına hava boşluklarını ölçün), TIFF (veya eşdeğeri) olarak kaydedin ve görüntüleri ImageJ'ye aktarın. Tüm akciğer bölümünü temsil eden alanları rastgele seçin.
    2. Serbest el aletini kullanarak hava sahalarının ana hatlarını çizin ve ölçümü kaydedin (Şekil 4A). Alan başına üç hava sahasının ortalamasını, ardından bölüm başına üç alan arasında ve nihayetinde numune başına üç bölüm arasında bulun.
  6. Akciğerlerde nötrofil akışı
    1. Akciğer dokusu kesiti başına üç kez olmak üzere 40x büyütmede renkli bir kamera kullanarak örnek görüntüler yakalayın ve orijinal dosyayı bir TIFF dosyası veya istenen başka bir format olarak kaydedin. Görüntüleri ImageJ'ye aktarın ve aynı akciğerin üç alanındaki tek tek nötrofilleri manuel olarak sayın. Akciğer başına ortalama nötrofil sayısını hesaplayın.

Sonuçlar

Bu protokol, artan vajinal enfeksiyonun bir fare modelini sunar ve yenidoğan nöropatolojisini ve solunum sonuçlarını değerlendirme yöntemlerini açıklar. Artan vajinal enfeksiyonu indükleme prosedürü hızlı olmalıdır (5 dakika içinde) ve fareler birkaç dakika içinde iyileşmelidir. Barajlarda yaklaşık 24 saat25 saat sonra enfeksiyon belirtileri gelişti. Buna yavaş hareket, piloereksiyon ve kambur bir duruş dahildir. Enfekte farelerde yaklaşık ortalama teslim süresi, E. coli uygulamasından sonra 40.3 saatti (PBS kontrol grubu ortalama 52.7 saat), PBS kontrol grubunun E19.531'de termik doğumuna kıyasla E18.5'te meydana geldi. Çöp başına canlı doğan yavruların yüzdesi enfeksiyonla azaldı (%100'den %71,4'e) ve doğum sonrası 7 gün boyunca hayatta kalmaları azaldı (Şekil 5)25. Biyolüminesans bakteriler kullanıldığında, görüntüleme barajlarda ve yavrularda enfeksiyonun yayılmasını izleyebilir. Bakteriler rahimde, fetal membranlarda, plasentada ve bazı fetüslerde uygulamadan sonraki 18 saat içinde gözlendi (Şekil 6) ve qPCR ve ELISA ile ölçülen inflamatuar mediatörler bu dokularda ve ayrıca beyin, akciğerler ve bağırsak gibi perinatal yavru dokularında yukarı regüle edildi 25,29,31.

Histoloji ve immünohistokimya 25,31,33 kullanılarak fetüsler ve yenidoğanlar üzerinde morfoloji, hücre ölümü, mikroglial aktivasyon ve astrosit aktivasyonunun değerlendirilmesi gibi bir dizi nöropatoloji değerlendirmesi yapıldı. Akciğer dokusu da değerlendirilebilir (Şekil 4 ve Şekil 7). TUNEL için pozitif boyama, hücre ölümünün daha sonraki bir aşaması olan DNA bozulmasını önerir34. Hamilelik sırasında E. coli enfeksiyonuna maruz kalan yavruların beyinlerinde korteks, piriform korteks, dış kapsül, hipokampus ve talamusta TUNEL boyanmasında önemli bir artış görüyoruz (Şekil 8A,B)31. Beynin yerleşik bağışıklık hücreleri olan IBA-1 etiketli mikroglia, morfolojik durumlarına göre kategorize edilebilir, bu sayede dallanma dinlenme fenotipini önerirken, aktive edilmiş ve fagositik hücreler amip veya yuvarlak şekil35 haline gelir. Bu nedenle, mikroglial hücreleri ölçmek yerine, durumlarının bir göstergesi olarak fenotiplerini değerlendirmek için bir strateji sunuyoruz. PBS grubuna kıyasla E. coli yavrularının dış korteksinde ve striatumunda IBA1 + dallanmasında bir artış görüyoruz (Şekil 8C, D)31. Enflamasyon ve nörolojik hasar ile ilişkili olabilen GFAP etiketli reaktif astrositler, E. coli yavrularında piriform kortekste ve dış kapsülde artmıştır (Şekil 8E, F)31,36,37. Nissl boyama, beynin yapısındaki büyük morfolojik değişikliklerin değerlendirilmesine izin verir; Cresyl menekşe, nöronlar için standart bir histolojik boyadır ve hem ekstra nükleer RNA granüllerini hem de hücre çekirdeklerini etiketler. E. coli grubunda, korteksin kalınlığının azaldığını görüyoruz (Şekil 9)31. Benzer şekilde, sırasıyla hücrelerin çekirdeğini ve sitoplazmasını boyayan H&E, akciğer morfolojisinin değerlendirilmesine izin verir (Şekil 4)31. E. coli'ye maruz kalan farelerde hava sahalarının arttığını ve ayrıca inflamasyonun bir göstergesi olan Ly6G+ nötrofillerin sayısında bir artış görüyoruz (Şekil 7)31.

Veri analizleri için, veriler normal dağılmışsa, teslimata kadar geçen süre eşleştirilmemiş bir t-testi ile analiz edildi. Canlı doğan yavrular için yüzde verileri için, bir orantı dağılımını (0 ila 1 aralığı ile sınırlanmış) normal bir dağılıma dönüştürmek için önce bir arksinüs karekök dönüşümü gerekliydi, bu da bir t-testi yapabilmek için gereksinimlerden biridir. Yavruların hayatta kalması bir Log-rank (Mantel-Cox) testi ile analiz edildi. Histoloji ve immünohistokimya için, verilerin türüne ve normal dağılıp dağılmadıklarına bağlı olarak Mann-Whitney U testi veya Welsh düzeltmeli çoklu t testleri kullanıldı. Yeterli istatistiksel güç için, tedavi grubu başına en az beş baraj kullanılmasını öneririz.

figure-results-1
Şekil 1: Escherichia coli'nin intravajinal uygulaması ve farelerde erken doğum ve neonatal morbiditeyi indüklemek için tedavi zaman çizelgesi. (A) E. coli [1], ardından %20 Pluronic jel F127 [2], steril 200 μL'lik bir pipet ucu kullanılarak fare vajinasına uygulanır. Introitusa kinin tozu eklenir [3]. (B) E. coli , embriyonik gün 16.5'te vajinaya verilir. Akciğerler ve beyin gibi dokular fetal veya yenidoğan döneminde toplanabilir. Kısaltma: EN = embriyonik gün N; PN = doğum sonrası gün N; PBS = fosfat tamponlu salin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Nöropatoloji için değerlendirilen beyin bölgeleri. Yenidoğan yavru beyninin ve nöropatoloji açısından değerlendirilebilecek bölgelerin Nissl boyamasına bir örnek. Tüm beyin bölgeleri TUNEL, IBA-1 ve GFAP için değerlendirilebilir. Nissl kullanarak korteks ve hipokampus morfolojisini değerlendirmeyi seçtik. Büyütme: 1x. Ölçek çubuğu = 1,5 mm. Kısaltmalar: TUNEL = terminal deoksinükleotidil transferaz dUTP nick end etiketleme; IBA-1 = allogreft inflamatuar faktör 1; GFAP = glial fibriler asidik protein. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Pozitif IBA-1 boyama ve dallanma indeksi değerlendirmesi. IBA-1+ hücrelerinin dallanma indeksini ölçmek için, ızgara içindeki hücre gövdelerinin sayısını ve yatay ve dikey kılavuz çizgilerini geçen ortalama dal sayısını sayın. Kısaltma: IBA-1 = allogreft inflamatuar faktör 1. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Yavru akciğerlerinde hava sahası ölçümleri (H&E boyama). (A) Hava sahalarının ana hatlarını çizin ve ImageJ'deki serbest el aracını kullanarak ölçün. (B) E. coli'ye maruz kalan yavrularda ortalama hava sahası alanı, PBS'ye kıyasla artar. (C) PBS ve E. coli'ye maruz kalan yavru akciğerlerin temsili H&E görüntüleri. Büyütme: 40x. Ölçek çubuğu = 59,5 μm. Kısaltmalar: H = hematoksilen; E = eozin. n = 2 4 yavrudan. *p < 0.05. Bu rakam Boyle ve ark.'dan31 uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: İntravajinal E. coli'nin doğum süresi ve yavruların hayatta kalması üzerindeki etkileri. (A) E. coli varlığında doğum süresi kısalır. (B) E. coli'ye maruz kalan yavrularda canlı doğan yavruların yüzdesi önemli ölçüde azalır ve (C) yavruların hayatta kalması azalır. Teslimat süresi: n = grup başına 8-10 litre; canlı doğan yavrular: n = grup başına 10-17 yavru; Yavru hayatta kalma: n = grup başına 10-12 yavru. *p < 0.05, ***p < 0.001. Bu rakam Boyle ve ark.'dan31 uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: E. coli yayılımını izlemek için biyolüminesans görüntüleme. (A) Biyolüminesans E. coli 48 saat içinde vajinadan uterus boynuzlarına yükselir. (B) Disseke uterus boynuzları, plasenta ve fetal membranlarda olduğu gibi 18 saat içinde E. coli ile enfeksiyon gösterir. Bu rakam Suff ve ark.25 ve Boyle ve ark.31'den uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-7
Şekil 7: Fetal akciğerlerdeki nötrofiller için Ly6G boyama. (A) PBS ve E. coli'ye maruz kalan fetüslerde nötrofil akışını değerlendirmek için Ly6G (pozitif: ok uçları) için boyama. (B) E. coli fetüslerinde ortalama Ly6G+ hücre sayısı önemli ölçüde artar. Büyütme: 40x. Ölçek çubuğu = 59.5 μm. n = grup başına 5 litreden 10. *p < 0.05. Kısaltmalar: Ly6G = Lenfosit antijeni 6 kompleks lokusu G6D. Bu rakam Boyle ve ark.'dan31 uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-8
Şekil 8: TUNEL, IBA1 ve GFAP boyama örnekleri. (A) PBS veya E. coli'ye maruz kalan doğum sonrası yavru beyninde hücre ölümü için TUNEL boyama. (B) Korteks, piriform korteks, dış kapsül, hipokampus ve talamusta ortalama TUNEL+ hücre sayısı artar. (C) PBS ve E. coli gruplarında mikroglia için IBA1 immünohistokimyası. (D) Mikroglia aktivasyonunun bir ölçüsü olarak dallanma indeksi, E. coli yavrularında dış kapsül ve striatumda artar. (E) Astrositler için GFAP boyaması, (F) piriform kortekste ve dış kapsülde artar. Ölçek çubuğu = 59,5 μm. Kısaltmalar: GFAP = glial fibriler asidik protein; TUNEL = terminal deoksinükleotidil transferaz dUTP nick end etiketlemesi; Pyr = Piriform korteks; EC = harici kapsül; Str = striatum; Kalça = hipokampus; thal = talamus; toplam = tüm bölgeler; CA = cornu ammonis; OLV = optik parlaklık değerleri. İmmünohistokimya analizleri: n = grup başına 5 litreden 5-7. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, n.s. - anlamlı değil. Bu rakam Boyle ve ark.'dan31 uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-9
Şekil 9: Pozitif ve negatif Nissl boyama ve morfoloji değerlendirmelerine örnek. (A) Doku yapısını ve morfolojisini değerlendirmek için doğum sonrası yavru beyninin Nissl boyaması. (B) Beyin genişliği üzerinde bir etkisi yoktur, ancak (C) E. coli'ye maruz kalan yavrularda kortikal kalınlık azalır. (D) Hipokampal hacimde bir fark yoktur. Büyütme: 1x. Ölçek çubuğu = 1,5 mm. n = grup başına 5 litreden 5-7. **p < 0.01. Bu rakam Boyle ve ark.'dan31 uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Birincil AntikorSeyreltmeİkincil Antikor/SeyreltmeSeyreltme
Tavşan anti-GFAP1:6000Keçi anti-tavşan1:100
Tavşan anti-IBA11:1000Keçi anti-sıçan1:100
Fare anti-Ly6G1:1000Keçi anti-tavşan1:100

Tablo 1: İmmünohistokimya için antikorlar.

AdımReaktifSüre (dk)
1NISSL boyası10
2Taze Damıtılmış Su2
3Taze Damıtılmış Su2
4%70 EtOH2
5%90 EtOH2
6%96 EtOH2
73-5 damla buzlu asetik asit ile %96 EtOH2-5 (SÜREKLI KONTROL EDİN)
8%100 EtOH2
9İzopropanol2
10Ksilen2
11Ksilen2
12Ksilen2

Tablo 2: Nissl prosedürü.

Tartışma

Burada, bakteriyel vajinal yükseliş yoluyla erken doğum ve yenidoğan morbiditesinin yeni bir fare modelinin indüksiyonunu açıklıyoruz. Yenidoğan sepsisi ve menenjitin yaygın bir nedeni olması ve anneden fetüse dikey olarak bulaşması nedeniyle E. coli K1'i seçtik 38,39,40. Bu modelin başarısının anahtarı, bakteri süspansiyonunun vajinadan sızmasını önleyen, enfeksiyonun yerleşmesine ve rahme yükselmesine izin veren Pluronic ısıya duyarlı jelin kullanılmasıdır. Bu model, bir septisemi izolatından elde edilen canlı bakterileri kullandığından, barajları yakından izlemek çok önemlidir27. Hayvanlar hareket etmeyi veya yemek yemeyi reddederlerse veya yavrularına bakmazlarsa (örneğin, yuva yapmayı ve beslenmeyi ihmal ederlerse), derhal insanca kurban edilmelidirler.

Çoğunlukla enfeksiyonla ilişkili semptomlar doğumdan sonraki 24 saat içinde kaybolur. E. coli'nin farklı serotiplerinin ve diğer bakteri türlerinin gebelik süresi, enfeksiyon/inflamasyonun derecesi ve yenidoğan sonuçları üzerinde farklı etkileri olacağının farkında olmak da önemlidir. İstenen fenotip için gereken minimum konsantrasyonu belirlemek için yeni bakteriyel serotipler/suşlar kullanırken ve acıyı önlemek için katı insancıl son noktalar belirlerken farklı CFU'larla ön doz deneyleri yapmanızı öneririz. Canlı bir patojen verirken çok dikkatli olunmalıdır; Literatürün, artan enfeksiyonu modellerken bu organizmaların uygun kullanımına rehberlik etmesine izin verin.

Bağışıklık sistemleri farklı olduğu için fare suşu da önemlidir. Örneğin, bu modelde kullanılan zamanlama ve CFU'lar, C57BL/6 farelerinde gerçekleştirildiğinde aynı sonuçlara sahip değildir. C57BL/6 Tyrc-2J farelerini kullanmayı seçtik çünkü zaman süreci deneyleri bu suşta CD-1, BALB/c ve C57BL/6'ya kıyasla önemli ölçüde daha fazla enfeksiyon gösterdi. Ek olarak, bu model29'da yararlı bir ölçülebilir sonuç olan siyah kürk söndürme biyolüminesans sinyallerine dair kanıtlar vardır. Bakteri uygulaması için en uygun gebelik günü, patojen ve fare suşu ile de farklılık gösterebilir. Klinik öncesi PTB modellerinde büyük bir heterojenlik vardır; bu nedenle, tekrarlanabilir sonuçlar geliştirmek için bu değişkenleri dikkate almak önemlidir17.

Bir diğer husus da hayvanların anesteziye maruz kaldığı sürenin uzunluğudur. Hamilelik sırasında aşırı maruz kalma, yavrularda nörotoksisite ile ilişkili olduğundan, anestezi altında geçirilen süreyi minimumda tutmak (örneğin, maksimum 5 dakika) ve her zaman aynı ortama maruz bırakılan ve bir araç maddesi 41,42,43 ile tedavi edilen kontrolleri dahil etmek önemlidir. Bu model için yararlı olan ek kontrol grupları, yalnızca Pluronic jelin tedavi edilmemiş, intravajinal verilmesini ve yalnızca anesteziyi içerir.

İmmünohistokimya, farklı proteinleri ve hücreleri tanımlamak için deneysel bir araç olarak yaygın olarak kullanılmaktadır ve beyindeki yapıyı ve bağlantıyı karakterize etmek için kullanılabilir. Burada, nöroinflamasyon ve nörolojik yaralanma ile ilişkili merkezi sinir sisteminin anahtar hücrelerinin nasıl analiz edileceğini açıklıyoruz. Ayrıca beyin ve akciğer morfolojisini ölçmek için yararlı olan hücresel apoptozu ve histolojik lekeleri değerlendirmek için yöntemler sunuyoruz. Bu protokollerin başarısını sağlamak için önemli hususlar PAP kaleminin dikkatli kullanımıyla başlar; PAP kalemi dokuya temas ederse boyama başarısız olur ancak parametre çok genişse bölümler gece boyunca kuruyabilir. Benzer şekilde, bölümlerin kurumasını önlemek için nem odası nemli tutulmalıdır.

Nissl boyamasını gerçekleştirirken, buzlu asetik asit adımı en kritik olanıdır; Bölümlerin sürekli kontrol edilmesi gerekir. Beynin ana yapıları görünür hale geldiğinde, reaksiyonu durdurmak için bölümlerin hemen EtOH'ye taşınması gerekir. İnsan prematüre yenidoğanlarda ve diğer hayvan modellerinde kortikal kalınlıkta azalma ve hipokampal hacimde azalma bildirildiğinden, korteks ve hipokampusu değerlendirmeyi seçtik, ancak diğer bölgeler morfoloji değişiklikleri için değerlendirilebilir 44,45,46,47. DAB boyamanın gelişimine de çok dikkat edilmelidir. Bu, deneyler arasında zamanlanmalı ve tutarlı tutulmalıdır.

Veri analizi, genellikle subjektif olarak kabul edilen sonuçların ölçülmesindeki zorluk nedeniyle immünohistokimyanın en yaygın sınırlamasıdır. GFAP analizi bilgisayar destekli optik parlaklık ölçümleri kullanılarak yapılırken, tutarsız boyama bu ölçümleri etkileyebilir. Ek olarak, beyin ve akciğer morfolojisi değerlendirmeleri, gözlemcinin kararına dayanan manuel, serbest ölçümleri içerir. Tutarsızlığı önlemek için bu değerlendirmeleri iki kez ve kısa sürede tekrarlıyoruz. Herhangi bir önyargıyı daha da azaltmak için, değerlendiricinin tedavi gruplarına karşı kör olması önemlidir. Düşük immünoreaktivite de sınırlayıcı bir faktör olabilir. Sinyal eksikliği, ilgilenilen antijenin bulunmadığını veya bunun bir protokol hatasından kaynaklanabileceğini gösterebilir. Bunu ele almak için, mümkün olduğunda pozitif kontrol görevi görebilecek bir doku örneği ekliyoruz ve bunun deneysel bir hatanın sonucu olmadığından emin olmak için düşük veya eksik bir sinyal gözlemlediğimizde boyama prosedürünü tekrarlıyoruz.

Tarif edilen protokollere ek olarak, maternal, fetal ve neonatal dokuların immünolojik analizleri qPCR ve ELISA ile yapılabilir. Enfeksiyona maruz kalan hayvanlarda inflamatuar mRNA ve protein düzeylerinde artış gözlemledik 25,31,48. Histolojik olarak gösterdiğimiz yenidoğan nöropatolojisinin fetal beyin, akciğer ve bağırsak iltihabınınsonucu olabileceğini varsayıyoruz 25,31. Yaptığımız diğer nöropatoloji değerlendirmeleri arasında miyelinleşmeyi araştırmak için miyelin bazik proteini (MBP) ve nöronal çekirdekleri boyamak için NeuN25,31 yer alır. Buna ek olarak, utero 49,50'de enfeksiyona maruz kaldıktan sonra bu hücrelerin fenotipini ve davranışını daha iyi anlamak için nötrofiller ve mikroglia için başka belirteçler de değerlendirilebilir. Ek olarak, yavrular üzerindeki uzun vadeli etkiyi belirlemek için davranış testleri yapılabilir.

Bu model sınırsız değildir. Örneğin, hem yavrular arasında hem de yavrular içinde patolojide farklılıklar görüyoruz. Bu, enfeksiyonun yayılmasının kontrol edilemediği canlı bir bakteri kullanmanın sonucu olabilir. Sonuç olarak, uterus boynuzlarına yükselen enfeksiyonun paterni ve erişimi değişir ve genellikle asimetriktir. Diğer bir sınırlama, bazen barajların yavrularına bakamayacak kadar hasta olmasına neden olabilen E. coli'nin patojenitesidir. Fareler ayrıca, insanlarda olduğu gibi doğum öncesi değil, doğum sonrası gerçekleşen alveologenez nedeniyle akciğer hasarının en iyi modeli değildir51. Numuneler toplanırken akciğer dokularımızı şişirmeyi başaramadık, bu da sonuçlarımızı etkileyebilirdi. Bununla birlikte, sonuçlarımız yenidoğan BPD hayvan modellerindegözlenen değişikliklerle tutarlıdır 52,53.

Bu model, bakteriyel enfeksiyonun vajinadan uterusa yükselerek erken doğumu teşvik ettiği varsayılan insan durumunu özetlemektedir. Bu modelin ilk yayınını takiben, diğerleri benzer modelleri kopyaladı veya üretti, bu da bu metodolojinin tekrarlanabilirliğini ve uygunluğunu daha da vurguladı19,54. En önemlisi, bu model, diğer modellerin başarısız olduğu prematüre yenidoğanların yaşadığı yaygın morbiditeleri sergilemektedir. Bu, özellikle yenidoğan sepsisi ile ilişkili bir bakteri suşunun kullanılmasından kaynaklanıyor olabilir. Hayvan modellerinde erken doğumu tetiklemek için en yaygın olarak kullanılan LPS, yavrular için öldürücüdür, bu nedenle yenidoğan sonuçları ölçülemez18. Artan enfeksiyonun diğer modelleri de hayatta kalan yavrular üretmekte veya yenidoğan morbiditesini göstermekte zorlanmıştır 19,20,21,22,23,24,55,56. Tanımladığımız gibi klinik olarak ilgili hayvan modelleri, erken doğumun patofizyolojisini anlamak ve yenidoğan sonuçlarını iyileştirecek yenilikçi müdahaleler geliştirmek için temeldir.

Açıklamalar

Yazarların konuyla ilgili herhangi bir açıklaması yoktur.

Teşekkürler

Escherichia coli K1 A192PP-luxABCDE, University College London'dan Profesör Peter Taylor tarafından nazikçe hediye edildi. Şekil 1 ve Şekil 3 BioRender.com'de oluşturulmuştur. Bu araştırma, Wellcome Klinik Araştırma Kariyer Geliştirme Bursu 222970/Z/21/Z (N.S.), Action Medical Research ve Borne hibesi GN2647 (N.S., S.N.W. ve D.P.) tarafından desteklenmiştir; ve Kadınların Refahı RG2365 hibesi (A.K.B., N.S., M.H., S.N.W. ve D.P.).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Anti-GFAP, tavşanAgilent TeknolojileriZ033429-2
Anti-IBA1, tavşan Wako019-19741
Anti-Ly6G, fareBioLegend127601
AVT-Horn 184 3CCD kameraSony
Biotin-16-DUTPMerck11093070910
Borosilikat Cam Dikdörtgen Kapak KapaklarıFisherScientific12363128
Kresil Mor asetatThermoFisher Scientific405760100
Cryostat CM1900Leica
Cam küvet ve nbsp;MerckBR472700
Diaminobenzidin (DAB)Generon40480004-3
Diseksiyon Pensapları, Paslanmaz Çelik, 10 cm, Dişli, KavisliDünya Hassas Aletleri Ltd15915
Diseksiyon Pensetleri, Paslanmaz Çelik, 10 cm, Dişli, DüzDünya Hassas Aletleri Ltd15914
Diseksiya Makasları, 10 cm uzunluğunda, düzDünya Hassas Aletleri Ltd14393
DPX Merck100579
EosinSigma-AldrichHT110116
Formaldehit çözeltisi %4 tamponluMerck100496
Keçi Anti-Tavşan IgG Antikoru (H+L), BiotinileVektör LaboratuvarlarıBP-9100-50
Keçi Anti-Fare IgG Antikoru (H+L), BiotinileVektör LaboratuvarlarıBA-9400-1.5
GraphPad Prism v.8 GraphPad Yazılımı
H2O2Sigma-Aldrich7722-84-1
HematoksilinSigma-AldrichMHS16
ImageJUlusal Sağlık Enstitüleri
İzofluran (IsoFlo)Zoetis50019100
IVIS Lumina II Canlı Görüntüleme Sistemi/Yaşayan Görüntü YazılımıPerkin Elmer/Revvity
MikroslaytlarVWRISO8037/I
Optimas 6.51 Media Cybernetics Inc.
ParaformaldehitSigma-Aldrich158127
Fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS) & nbsp;Thermo Fisher Scientific (Yaşam Teknolojileri)14190094
Plüronik F-127 Sigma-AldrichP2443
KininBilimsel Laboratuvar MalzemeleriQ0132
ReadyProbes hidrofobik bariyer pap penThermo Fisher Scientific R3777
Sodyum hidroksitHoneywellS8045
Sodyum Fosfat Monobazik AnhidrozFisherScientificBP329-1
SucroseMerckS9378
Terminal transferase Merck3333574001
VECTASTAIN ABC-HRP Kiti, PeroksidazVektör LaboratuvarlarıPK-4000
Ksilen (histolojik derece) & nbsp;Sigma-Aldrich534056

Kaynaklar

  1. WHO. WHO: recommended definitions, terminology and format for statistical tables related to the perinatal period and use of a new certificate for cause of perinatal deaths. Modifications recommended by FIGO as amended October 14, 1976. Acta Obstet Gynecol Scand. 56 (3), 247-253 (1977).
  2. Liu, L., et al. Global, regional, and national causes of under-5 mortality in 2000–15: an updated systematic analysis with implications for the sustainable development goals. Lancet. 388 (10063), 3027-3035 (2016).
  3. Chawanpaiboon, S., et al. regional, and national estimates of levels of preterm birth in 2014: a systematic review and modelling analysis. Lancet Glob Health. 7 (1), e37-e46 (2019).
  4. Unicef. Levels and trends in child mortality report 2017. , Unicef. (2017).
  5. Blencowe, H., et al. National, regional, and worldwide estimates of preterm birth rates in the year 2010 with time trends since 1990 for selected countries: a systematic analysis and implications. Lancet. 379 (9832), 2162-2172 (2012).
  6. Jung, E., et al. The fetal inflammatory response syndrome: the origins of a concept, pathophysiology, diagnosis, and obstetrical implications. Semin Fetal Neonatal Med. 25 (4), 101146(2020).
  7. Humberg, A., et al. Preterm birth and sustained inflammation: consequences for the neonate. Semin Immunopathol. 42 (4), 451-468 (2020).
  8. Boyle, A. K., Rinaldi, S. F., Norman, J. E., Stock, S. J. Preterm birth: inflammation, fetal injury and treatment strategies. J Reprod Immunol. 119, 62-66 (2017).
  9. Romero, R., Dey, S. K., Fisher, S. J. Preterm labor: one syndrome, many causes. Science. 345 (6198), 760-765 (2014).
  10. Goldenberg, R. L., Culhane, J. F., Iams, J. D., Romero, R. Epidemiology and causes of preterm birth. Lancet. 371 (9606), 75-84 (2008).
  11. Jones, H. E., et al. Differing prevalence and diversity of bacterial species in fetal membranes from very preterm and term labor. PLoS One. 4 (12), e8205(2009).
  12. Cobo, T., et al. Characterization of vaginal microbiota in women with preterm labor with intra-amniotic inflammation. Sci Rep. 9 (1), 18963(2019).
  13. Romero, R., et al. Microbial invasion of the amniotic cavity in patients with suspected cervical incompetence: prevalence and clinical significance. Am J Obstet Gynecol. 167 (4 Pt 1), 1086-1091 (1992).
  14. Mendz, G. L., Kaakoush, N. O., Quinlivan, J. A. Bacterial aetiological agents of intra-amniotic infections and preterm birth in pregnant women. Front Cell Infect Microbiol. 3, 58(2013).
  15. DiGiulio, D. B., et al. Prevalence and diversity of microbes in the amniotic fluid, the fetal inflammatory response, and pregnancy outcome in women with preterm pre-labor rupture of membranes. Am J Reprod Immunol. 64 (1), 38-57 (2010).
  16. DiGiulio, D. B. Diversity of microbes in amniotic fluid. Semin Fetal Neonatal Med. 17 (1), 2-11 (2012).
  17. Miller, F. A., Sacco, A., David, A. L., Boyle, A. K. Interventions for infection and inflammation-induced preterm birth: a preclinical systematic review. Reprod Sci. , (2022).
  18. Migale, R., et al. Specific lipopolysaccharide serotypes induce differential maternal and neonatal inflammatory responses in a murine model of preterm labor. Am J Pathol. 185 (9), 2390-2401 (2015).
  19. Spencer, N. R., et al. Development of a mouse model of ascending infection and preterm birth. PLoS One. 16 (12), e0260370(2021).
  20. Pavlidis, I., et al. Cervical epithelial damage promotes Ureaplasma parvum ascending infection, intrauterine inflammation and preterm birth induction in mice. Nat Commun. 11 (1), 199(2020).
  21. Vornhagen, J., et al. Group B streptococcus exploits vaginal epithelial exfoliation for ascending infection. J Clin Invest. 128 (5), 1985-1999 (2018).
  22. Bernardini, R., et al. Neonatal protection and preterm birth reduction following maternal group B streptococcus vaccination in a mouse model. J Matern Fetal Neonatal Med. 30 (23), 2844-2850 (2017).
  23. Tantengco, O. A. G., et al. Modeling ascending Ureaplasma parvum infection through the female reproductive tract using vagina-cervix-decidua-organ-on-a-chip and feto-maternal interface-organ-on-a-chip. Faseb J. 36 (10), e22551(2022).
  24. Randis, T. M., et al. Group B streptococcus β-hemolysin/cytolysin breaches maternal-fetal barriers to cause preterm birth and intrauterine fetal demise in vivo. J Infect Dis. 210 (2), 265-273 (2014).
  25. Suff, N., et al. Ascending vaginal infection using bioluminescent bacteria evokes intrauterine inflammation, preterm birth, and neonatal brain injury in pregnant mice. Am J Pathol. 188 (10), 2164-2176 (2018).
  26. Mushtaq, N., Redpath, M. B., Luzio, J. P., Taylor, P. W. Treatment of experimental Escherichia coli infection with recombinant bacteriophage-derived capsule depolymerase. J Antimicrob Chemother. 56 (1), 160-165 (2005).
  27. Achtman, M., et al. Six widespread bacterial clones among Escherichia coli K1 isolates. Infect Immun. 39 (1), 315-335 (1983).
  28. Winson, M. K., et al. Engineering the luxCDABE genes from Photorhabdus luminescens to provide a bioluminescent reporter for constitutive and promoter probe plasmids and mini-Tn5 constructs. FEMS Microbiol Lett. 163 (2), 193-202 (1998).
  29. Suff, N. The use of cervical gene therapy for the prevention of infection-related preterm birth [Ph. D. Thesis]. , University College London. (2017).
  30. Boyle, A. K., Rinaldi, S. F., Rossi, A. G., Saunders, P. T. K., Norman, J. E. Repurposing simvastatin as a therapy for preterm labor: evidence from preclinical models. Faseb J. 33 (2), 2743-2758 (2019).
  31. Boyle, A. K., et al. Ascending vaginal infection in mice induces preterm birth and neonatal morbidity. Am J Pathol. 195 (5), 891-906 (2025).
  32. Kendall, G. S., Robertson, N. J., Iwata, O., Peebles, D., Raivich, G. N-methyl-isobutyl-amiloride ameliorates brain injury when commenced before hypoxia ischemia in neonatal mice. Pediatr Res. 59 (2), 227-231 (2006).
  33. Rocha-Ferreira, E., et al. Curcumin: novel treatment in neonatal hypoxic-ischemic brain injury. Front Physiol. 10, 1351(2019).
  34. Kyrylkova, K., Kyryachenko, S., Leid, M., Kioussi, C. Detection of apoptosis by TUNEL assay. Methods Mol Biol. 887, 41-47 (2012).
  35. Lier, J., Streit, W. J., Bechmann, I. Beyond activation: characterizing microglial functional phenotypes. Cells. 10 (9), (2021).
  36. Schmidt-Kastner, R., Wietasch, K., Weigel, H., Eysel, U. T. Immunohistochemical staining for glial fibrillary acidic protein (GFAP) after deafferentation or ischemic infarction in rat visual system: features of reactive and damaged astrocytes. Int J Dev Neurosci. 11 (2), 157-174 (1993).
  37. Pekny, M., Pekna, M. Astrocyte reactivity and reactive astrogliosis: costs and benefits. Physiol Rev. 94 (4), 1077-1098 (2014).
  38. Witcomb, L. A., Collins, J. W., McCarthy, A. J., Frankel, G., Taylor, P. W. Bioluminescent imaging reveals novel patterns of colonization and invasion in systemic Escherichia coli K1 experimental infection in the neonatal rat. Infect Immun. 83 (12), 4528-4540 (2015).
  39. Obata-Yasuoka, M., Ba-Thein, W., Tsukamoto, T., Yoshikawa, H., Hayashi, H. Vaginal Escherichia coli share common virulence factor profiles, serotypes and phylogeny with other extraintestinal E. coli. Microbiology (Reading). 148 (Pt 9), 2745-2752 (2002).
  40. Bonacorsi, S., Bingen, E. Molecular epidemiology of Escherichia coli causing neonatal meningitis. Int J Med Microbiol. 295 (6-7), 373-381 (2005).
  41. Hartling, L., Liang, Y., Lacaze-Masmonteil, T. Chorioamnionitis as a risk factor for bronchopulmonary dysplasia: a systematic review and meta-analysis. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed. 97 (1), F8-F17 (2012).
  42. Liang, G., et al. Isoflurane causes greater neurodegeneration than an equivalent exposure of sevoflurane in the developing brain of neonatal mice. Anesthesiology. 112 (6), 1325-1334 (2010).
  43. Yang, B., et al. Comparison of neurodegeneration and cognitive impairment in neonatal mice exposed to propofol or isoflurane. PLoS One. 9 (6), e99171(2014).
  44. Schmitz-Koep, B., et al. Decreased cortical thickness mediates the relationship between premature birth and cognitive performance in adulthood. Hum Brain Mapp. 41 (17), 4952-4963 (2020).
  45. Nagy, Z., Lagercrantz, H., Hutton, C. Effects of preterm birth on cortical thickness measured in adolescence. Cereb Cortex. 21 (2), 300-306 (2011).
  46. Dimitrova, R., et al. Preterm birth alters the development of cortical microstructure and morphology at term-equivalent age. Neuroimage. 243, 118488(2021).
  47. Dada, T., et al. Mouse model of intrauterine inflammation: sex-specific differences in long-term neurologic and immune sequelae. Brain Behav Immun. 38, 142-150 (2014).
  48. Suff, N., et al. Cervical gene delivery of the antimicrobial peptide, human beta-defensin (HBD)-3, in a mouse model of ascending infection-related preterm birth. Front Immunol. 11, 106(2020).
  49. McKenna, E., et al. Neutrophils: need for standardized nomenclature. Front Immunol. 12, 602963(2021).
  50. Jurga, A. M., Paleczna, M., Kuter, K. Z. Overview of general and discriminating markers of differential microglia phenotypes. Front Cell Neurosci. 14, 198(2020).
  51. Jackson, C. M., et al. Pulmonary consequences of prenatal inflammatory exposures: clinical perspective and review of basic immunological mechanisms. Front Immunol. 11, 1285(2020).
  52. Durrani-Kolarik, S., et al. miR-29b supplementation decreases expression of matrix proteins and improves alveolarization in mice exposed to maternal inflammation and neonatal hyperoxia. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 313 (2), L339-L349 (2017).
  53. Nguyen, L., et al. Sex-differences in LPS-induced neonatal lung injury. Sci Rep. 9 (1), 8514(2019).
  54. Zhang, Y., Edwards, S. A., House, M. Cerclage prevents ascending intrauterine infection in pregnant mice. Am J Obstet Gynecol. , (2023).
  55. Kammala, A. K., et al. Extracellular vesicles-mediated recombinant IL-10 protects against ascending infection-associated preterm birth by reducing fetal inflammatory response. Front Immunol. 14, 1196453(2023).
  56. Tantengco, O. A. G., et al. Inflammatory response elicited by Ureaplasma parvum colonization in human cervical epithelial, stromal, and immune cells. Reproduction. 163 (1), 1-10 (2021).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Vajinal Enfeksiyon ModeliFare ModeliEscherichia Coli EnfeksiyonuBiyol minesans G r nt lementravajinal UygulamaN ropatolojik De erlendirmeAkci er Hasarmm nohistokimya
Farelerde Yükselen Vajinal Enfeksiyon, Erken Doğum ve Yenidoğan Morbiditesinin Modellenmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.