Bu makale, modifiye edilmiş bir ortak DNA ekstraksiyon kiti kullanılarak taze ve eski nekrofilik sinek DNA ekstraksiyonu için bir protokolü açıklamaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
DNA Ekstraksiyonu ve Eski ve Taze Nekrofilik Sinek Örnekleri Arasında Karşılaştırma
* These authors contributed equally
Bu makalede
Düzeltme bildirimi
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Özet
Özet
Chrysomya megacephala örneklerinin toplam beş örneği - üç taze örnek, 2 yıl boyunca alkolde saklanan bir örnek ve 2 yıl boyunca sadece ışıktan korunan kuru kapalı depoda saklanan bir örnek - bir kan DNA ekstraksiyon kitinin nekrofilik sineklerden DNA çıkarıp çıkaramayacağını araştırmak ve alkolün nekrofilik sineklerin DNA'sının korunmasını uzatıp uzatamayacağını belirlemek için seçildi. İlk olarak, göğüs dokularından DNA'yı çıkarmak için kan DNA ekstraksiyon kiti kullanıldı. Daha sonra, DNA saflığı ve konsantrasyonu bir mikroplaka okuyucu ve bir florometre kullanılarak incelendi. Son olarak, ekstrakte edilen DNA'nın PCR amplifikasyonu ve elektroforezi, mitokondriyal CO I gen dizisinde bulunan nekrofilik sinek spesifik primerler ile yapıldı. Sonuçlar, tüm örneklerin DNA saflığının 2.0'dan büyük olduğunu gösterdi. DNA konsantrasyonunun şu sırada olduğu gözlendi: taze numuneler > alkolle korunmuş eski numuneler > işlenmemiş, eski numuneler. PCR amplifikasyonundan sonra tüm örneklerde spesifik elektroforetik bantlar vardı. Sonuç olarak, nekrofilik sineklerden DNA'yı başarılı bir şekilde çıkarmak için bir kan DNA ekstraksiyon kiti kullanılabilir ve taze sinek örneklerinin DNA konsantrasyonu eski sinek örneklerinden daha fazladır. Sinekler uzun süre alkolde saklanabilir.
Giriş
Ölüm zamanının çıkarımı, yargı pratiğinde her zaman çözülmesi gereken kilit ve zor konulardan biri olmuştur. Adli tıp pratiğinde, bir ceza davası için, ölüm sonrası aralığın belirlenmesi, suçun zamanının çıkarılmasında, şüphelinin kilitlenmesinde ve soruşturmanın kapsamının daraltılmasında çok önemli bir rol oynar. Ölüm zamanını belirlemenin geleneksel yöntemleri, esas olarak, genellikle yalnızca 24 saat içindeki ölüm zamanını çıkarmak için kullanılabilen erken ölüm sonrası olaylara dayanır. Bununla birlikte, uzun ölüm süresi ölüm sonrası olaylarla belirlenemez. Artık adli bilim camiasında, adli entomolojinin daha uzun bir ölüm süresini çıkarmada etkili bir yöntem olma potansiyeline sahip olduğu genel olarak kabul edilmektedir.
Nekrofag böcekler, cesetlerle beslenen larvaları için adlandırılır. Bunların arasında, bir ceset mevcut olduğunda, yetişkin nekrofil sinekler cesede ilk ulaşan ve yumurtalarını veya larvalarını bırakan ilk sinekler olacaktır. Larvalar ceset dokusuyla beslenir ve olgunlaşarak yetişkinlere dönüşen pupalara dönüşür. Nekrofilik sinekler, düzenli yaşam döngüleri ve coğrafi dağılımları nedeniyle adli bilimlerin uygulanmasında büyük bir rol oynamaktadır, örneğin, ölüm zamanının düşülmesi ve ölüm yerininbelirlenmesi 1,2. Bununla birlikte, adli uygulamada nekrofil sineklerin kullanılmasının önündeki engel tür tanımlamasıdır. Morfolojik yöntemler, nekrofilik sineklerin tür tanımlaması için yetkili yöntem olarak hala kullanılmaktadır. Bununla birlikte, morfolojik türlerin tanımlanması, yüksek derecede böcek bütünlüğü gerektirir. Sinekler farklı gelişim aşamalarındaysa veya çevresel seçimlerin neden olduğu morfolojik değişiklikler nedeniyle, bunların hepsi morfolojik incelemeyi daha zor hale getirir. Özellikle, suç mahallinde en sık bulunan pupa ve pupa kabuklarının morfolojisi zar zor tanınabilir. Bu, morfolojik uzmanların azlığı ile birlikte, türlerin morfolojik olarak tanımlanmasında büyük zorluklar yaratmaktadır. Bu nedenle, sineklerin tür tanımlaması için moleküler biyoloji yöntemlerinin uygulanması ortaya çıkmıştır, bu da morfolojik tanımlamanın zorluğunu azaltır ve gelişim evresi 3,4,5,6,7'den bağımsızdır.
Moleküler biyoloji yöntemlerine dayalı olarak nekrofil sineklerin tür tanımlamasındaki ilk adım, DNA'nın verimli bir şekilde ekstraksiyonudur, ancak böcek DNA ekstraksiyonu için özel kitler şu anda yaygın olarak mevcut değildir. Ve nekrofilik sineklerin DNA ekstraksiyonu için ortak kan kitlerinin nasıl kullanılacağı adli olarak daha alakalı hale gelir. Suç mahallerinde bulunan nekrofilik sinekler genellikle sakatlanır veya çürüme ve DNA bozulmasına uğrar. Sinek örnekleri, alındıktan sonra DNA ekstraksiyonu için hemen mevcut değildir veya mümkünse, kanıt koruma gereklilikleri nedeniyle tam örneklerin saklanması gerekir. Yukarıdaki gereksinimlere dayanarak, bu çalışmada, proteinaz K sindirimine dayalı kan DNA kitini uyguladık ve üç taze Chrysomya megacephala (Diptera, Lepidoptera) örneği seçtik (Şekil 1), iki yıl boyunca alkole yerleştirilmiş bir eski C. megacephala örneği ve iki yıl boyunca ışık korumalı depoya yerleştirilen bir C. megacephala örneği, beş örneğin her birini tarttık, DNA ekstraksiyonu için böcek toraks dokusunu seçti. Eski ve yeni örneklerden ekstrakte edilen DNA'nın kalitesi ve saflığı karşılaştırılarak, ekstrakte edilen DNA'nın PCR amplifikasyonu ve elektroforezi, mitokondriyal CO 
gen dizisinde bulunan nekrofilik sinek spesifik primerler ile gerçekleştirildi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
NOT: Bu protokolde toplam beş C . megacephala numunesi kullanıldı - üç taze numune (Taze 1, Taze 2 ve Taze 3), 2 yıl boyunca alkolde saklanan bir numune (Eski 1) ve 2 yıl boyunca kuru kapalı depoda saklanan bir numune sadece ışıktan korunarak (Eski 2). Numuneler deney gereksinimlerine göre etiketlenmelidir.
1. Genel numune saklama ve hazırlıklar
- Numune seçimi ve hazırlanması
NOT: Nekrofag sineklerini yürütmek için etil asetat uygularken çeker ocakta çalıştığınızdan emin olun. Tartmadan önce sıvıyı sineğin yüzeyinden çıkarın.- Taze numuneler: Toplanan üç sinek numunesini etil asetat ile öldürdükten sonra gaz şişelerine koyun. Numuneleri tartın ve Taze 1, Taze 2 ve Taze 3 olarak adlandırın ve deneylerde hemen kullanın.
NOT: Bu protokoldeki taze sinek örneklerinin kütleleri 56.8 mg, 49.3 mg ve 52.1 mg'dır. - Eski numune 1: Etil asetat tarafından öldürülen ve alkol dolu santrifüj tüplerinde 2 yıl boyunca hava geçirmez bir muhafaza içinde, oda sıcaklığında ışıktan korunan sinek numunelerini çıkarın. Yüzey sıvısını filtre kağıdı ile adsorbe ettikten sonra numuneyi tartın; Eski 1 deyin.
NOT: Bu protokolde Eski 1'in kütlesi 42.3 mg idi. - Eski numune 2: Etil asetat tarafından öldürülen ve oda sıcaklığında ışıktan korunarak hava geçirmez bir muhafaza altında 2 yıl boyunca bir santrifüj tüpünde saklanan sinek örneğini çıkarın. Tartın ve ona Eski 2 deyin.
- Taze numuneler: Toplanan üç sinek numunesini etil asetat ile öldürdükten sonra gaz şişelerine koyun. Numuneleri tartın ve Taze 1, Taze 2 ve Taze 3 olarak adlandırın ve deneylerde hemen kullanın.
- Ekstraksiyon öncesi hazırlık
- Paslanmaz çelik bir kabı soğutmak için az miktarda sıvı nitrojen ekleyin; Tüm sıvı nitrojen buharlaşana kadar bekleyin.
- Kabın içine bir sinek örneği koyun; Sıvı nitrojenin sıçramasını ve böcek örneğine çarpmasını önlemek için sıvı nitrojeni yavaşça dökün.
- Numuneleri sıvı nitrojen içinde dondurun. Sıvı nitrojen buharlaştıktan sonra numuneleri çıkarın.
- Göğüs kafesini ayrı ayrı ayırın, 2 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin ve mümkün olan en küçük dilimler halinde kesin.
NOT: Numuneyi tamamen parçalanabilmesi için küçük parçalara ayırın ve DNA büyük miktarlarda salınabilir. - Her sinek için yukarıdaki adımları tekrarlayın, ayrı ayrı dondurun ve ardından DNA çapraz kontaminasyonunu önlemek için yeni bir santrifüj tüpüne çıkarın.
2. DNA ekstraksiyonu
NOT: Tüm santrifüj adımları, oda sıcaklığında (15-25 °C) bir mikrosantrifüjde gerçekleştirilmelidir. Tüm adımlar, asepsi ilkelerine sıkı sıkıya bağlı kalarak ve çapraz kontaminasyonu önlemek için gerçekleştirilmelidir.
- Doku lizisi
- Kırpılmış bir numune içeren 2 mL'lik bir santrifüj tüpüne 180 μL doku lizis tamponu ekleyin.
- 20 μL proteinaz K ekleyin. 3 000 rpm'de 10 saniye girdaplayarak iyice karıştırın ve böcek dokuları tamamen parçalanana kadar 56 ° C'de inkübe edin.
NOT: Doku tam olarak sindirilmemişse daha fazla Proteinaz K eklenmelidir. Lizis genellikle 1-3 saat içinde tamamlanır, ayrıca gece boyunca lizis süresini uzatabilir.
- DNA çökelmesi
- 15 saniye boyunca 3.000 rpm'de girdap. Numuneye 200 μL lizis tamponu ekleyin ve 15 saniye boyunca 3.000 rpm'de girdaplayarak iyice karıştırın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Ekstrakte edilen DNA çözeltisinin OD260 ve OD280 değerlerini ölçmek için bir mikroplaka okuyucu kullandık ve ardından DNA'nın saflığını değerlendirmek için OD260 / OD280 değerlerini elde ettik. Tüm taze numunelerin OD260/OD280'i ve eski numune 1'in 2'den büyüktü. Eski numune 2'nin OD260/OD280'i, ortalama 2.187 olmasına rağmen maksimum 1.753 değerine sahipti ve hem OD280 hem de OD280'in küçük (≤0.01) değerleri nedeniyle üç ölçümü büyük ölçüde dalgalandı (Tablo 1). Elde edilen OD260 değerine dayanarak, DNA...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
DNA ekstraksiyonu, nekrofilik sineklerin moleküler tanımlanmasında en kritik bağlantıdır ve ekstraksiyon yöntemi ve ekstrakte edilen DNA'nın kalitesi, sonraki tespiti doğrudan etkiler. Bu deneyde, özel bir böcek DNA ekstraksiyon kiti satın almaya gerek kalmadan, ortak bir kan kiti kullanarak nekrofil sineklerden DNA'yı başarıyla çıkardık, bu da böcek DNA'sı ekstraksiyonunun gerçekleştirilmesini kolaylaştırıyor.
Sineklerin yüzeyi, özellikle epidermal kitinin% 60-70'e ulaşabildiği larva ve pupa ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rekabet eden herhangi bir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82060341,81560304) ve Hainan Eyaleti Akademisyen İnovasyon Platformu Bilimsel Araştırma Projesi (YSPTZX202134) tarafından desteklenmektedir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Tampon AE | Qiagen | 172026832 | DNA elüsyon tamponu |
| Tampon AL | Qiagen | 172028374 | lizis tamponu |
| Tampon ATL | Qiagen | 172028162 | doku lizis tamponu |
| Tampon AW1 | Qiagen | 172028760 | protein uzaklaştırma tamponu |
| Tampon AW2 | Qiagen | 57203108 | tuzdan arındırma tamponu |
| C1-J-2495 | Taihe Biyoteknoloji | TW21109216 | forword astar |
| C1-N-2800 | Taihe Biyoteknoloji | TW21109217 | ters astar |
| D2000 DNA merdiveni | Gerçek Zamanlar(Pekin) Biyoteknoloji | RTM415 | Elektroforetik bantların konumunu ölçün |
| DNeasy Mini döndürme sütunu | Qiagen | 166050343 | DNA adsorpsiyon sütunu |
| Kuru Banyo İnkübatörü | ısıtmak için kullanılan | Miulab | DKT200-2D |
| Miulab | MUC881206 | etkisi | |
| Proteinaz K | Qiagen | 172026218 | Hücre içi nükleazların ve diğer proteinlerin inaktivasyonu |
| Qubit 3.0 Florometre | Thermo Fisher Scientific | 2321611188 | |
| Hızlı Mikro Santrifüj | Scilogex | 9013001121 | santrifüj |
| Standardı # 1 | Thermo Fisher Scientific | 2342797 | |
| Standardı # 2 | Thermo Fisher Scientific | 2342797 | |
| Tanon 3500R Jel Görüntüleyici | Tanon | 16T5553R-455 | jel görüntüleme |
| Taq Mix Pro | Monad | 00007808-140534 | PCR Karışımı |
| Taq Mix Pro | Monad | 00007808-140534 | PCR Karışımı |
| Thermo Cycler | Zhuhai Hema | VRB020A | sıradan PCR |
| Çalışma Çözümü | Thermo Fisher Scientific | 2342797 |
Kaynaklar
- Amendt, J., Richards, C. S., Campobasso, C. P., Zehner, R., Hall, M. J. Forensic entomology: applications and limitations. Forensic Sci Med Pathol. 7 (4), 379-392 (2011).
- Wydra, J., Matuszewski, S. The optimal post-eclosion interval while estimating the post-mortem interval based on an empty puparium. Forensic Sci Med Pathol. 17 (2), 192-198 (2021).
- Mazzanti, M., Alessandrini, F., Tagliabracci, A., Wells, J. D., Campobasso, C. P. DNA degradation and genetic analysis of empty puparia: genetic identification limits in forensic entomology. Forensic Sci Int. 195 (1-3), 99-102 (2010).
- Odeniran, P. O., et al. molecular identification and distribution of Trypanosome-transmitting Dipterans from cattle settlements in Southwest Nigeria. Acta Parasitol. 66 (1), 116-128 (2021).
- Wells, J. D., Stevens, J. R. Application of DNA-based methods in forensic entomology. Annu Rev Entomol. 53, 103-120 (2008).
- Kotrba, M., et al. DNA barcoding in forensic entomology-establishing a DNA reference library of potentially forensic relevant arthropod species. J Forensic Sci. 64 (2), 593-601 (2019).
- Weedon, M. N., et al. Use of SNP chips to detect rare pathogenic variants: Retrospective, population based diagnostic evaluation. BMJ. 372, 214(2021).
- Cai, J. -F., et al. The availability of mitochondrial DNA cytochrome oxidasegene for the distinction of forensically important flies in China. Acta Entomologica Sinica. 48 (3), 380-385 (2005).
- Khayrova, A., Lopatin, S., Varlamov, V. Obtaining chitin, chitosan and their melanin complexes from insects. Int J Biol Macromol. 167, 1319-1328 (2021).
- Guo, Y. Q., et al. Comparison of three DNA extracting methods from different parts of common necrophagous flies. J Henan Univ Sci Tech (Med Sci). 36 (02), 130-133 (2018).
- Du, H., Xie, H., Ma, M., Igarashi, Y., Luo, F. Modified methods obtain high-quality DNA and RNA from anaerobic activated sludge at a wide range of temperatures. J Microbiol Methods. 199, 106532(2022).
- Sukumaran, S. Concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume BioSpec-nano-spectrophotometer. J Vis Exp. (48), e2699(2011).
- Masago, K., et al. Comparison between fluorimetry (Qubit) and spectrophotometry (NanoDrop) in the quantification of DNA and RNA extracted from frozen and FFPE tissues from lung cancer patients: A real-world use of genomic tests. Medicina (Kaunas). 57 (12), 1375(2021).
- Ponti, G., et al. The value of fluorimetry (Qubit) and spectrophotometry (NanoDrop) in the quantification of cell-free DNA (cfDNA) in malignant melanoma and prostate cancer patients. Clin Chim Acta. 479, 14-19 (2018).
- Adams, Z. J., Hall, M. J. Methods used for the killing and preservation of blowfly larvae, and their effect on post-mortem larval length. Forensic Sci Int. 138 (1-3), 50-61 (2003).
- Fliegerova, K., et al. Effect of DNA extraction and sample preservation method on rumen bacterial population. Anaerobe. 29, 80-84 (2014).
- Rodrigues, B. L., Galati, E. A. B. Molecular taxonomy of phlebotomine sand flies (Diptera, Psychodidae) with emphasis on DNA barcoding: A review. Acta Trop. 238, 106778(2023).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
Düzeltme
Formal Correction: Erratum: DNA Extraction and Comparison Between Old and Fresh Necrophilic Fly Samples
Posted by JoVE Editors on 8/12/2024. Citeable Link.
This corrects the article 10.3791/66737
