Yöntem makalesi

İlaç Etkinliği Çalışmaları için Bir Chagas Hastalığı Fare Modelinin In Vivo Biyolüminesans Görüntülemesinin Gizeminin Çözülmesi

2.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/66740

⸱

31 Mayıs 2024

 ,  ,  ,  , 
1Departamento de Microbiologia, Instituto de Ciências Biomédicas (ICB), Universidade de São Paulo, 2Drugs for Neglected Diseases initiative (DNDi) Latin America, 3Programa de Pós-Graduação em Microbiologia e Imunologia, Universidade Federal de São Paulo, 4Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo

Bu makalede

Özet

Burada sağlanan protokol, veri toplama, analiz ve yorumlamaya odaklanarak, Trypanosoma cruzi enfeksiyonunun biyolüminesans modelinde ilaç etkinliği çalışmaları gerçekleştirmek için ayrıntılı adımları açıklamaktadır. Teknik sorunları en aza indirmek için sorun giderme ve kalite kontrol prosedürleri de sağlanmaktadır.

Özet

Chagas hastalığı, leishmaniasis ve insan Afrika tripanozomiyazisi gibi insan protozoan hastalıklarının halk sağlığı üzerindeki etkisini kontrol etmek ve azaltmak için yeni ilaçların ve aşıların geliştirilmesini hızlandırmak gereklidir. Bununla birlikte, bu süreç, oldukça karmaşık parazit biyolojisi ve hastalık patogenezi gibi zorluklarla doludur ve ihmal edilen tropikal hastalıklar için tipik olarak, araştırma ve geliştirme için nispeten sınırlı fonlar. Bu nedenle, in vitro ve in vivo kaynakların rasyonel kullanımını sağlarken enfeksiyon ve hastalığın temel özelliklerini yeterince yeniden üretebilen modeller, bu koşullar için araştırmaları ilerletmek için gereklidir. Bir örnek, lusiferaz eksprese eden Trypanosoma cruzi parazitleri tarafından üretilen uzun dalga boylu ışığın oldukça hassas bir şekilde tespit edilmesini sağlayan Chagas hastalığı için in vivo biyolüminesans görüntüleme (BLI) fare modelidir. Bu tekniğin in vivo çalışmalarda ilaç etkinliği için standart yaklaşım haline gelmesine rağmen, araştırma grupları, uygun BLI ekipmanı hazır olsa bile, ekipman kullanımı ve kalite kontrol prosedürlerinin uygulanması konusunda uygun pratik eğitim eksikliği nedeniyle bunu uygulamakta hala zorlanabilir. Bu senaryo göz önüne alındığında, bu protokol, Chagas hastalığı veya diğer bulaşıcı hastalık fare modelleri için BLI ile çok az deneyimi olan veya hiç deneyimi olmayan araştırma gruplarında protokollerin uygulanmasını kolaylaştıran ayrıntılarla, deneylerin planlanmasından veri toplama ve analizine kadar rehberlik etmeyi amaçlamaktadır.

Giriş

Chagas hastalığı Latin Amerika'da endemiktir ve dünya çapında yaklaşık yedi milyon insanı etkilemektedir1. Her yıl 50.000'den fazla ölüm ve yaklaşık 7 milyar dolarlık ekonomik kayıp, bu hastalığın engelleyici doğasından kaynaklanmaktadır2. Chagas hastalığına, vektörel iletimin kurulduğu Amerika'da memelileri (vahşi ve evcil) ve triatomin vektörlerini (Hemiptera, Reduviidae)3 enfekte edebilen heteroksenik bir hemoflagellat parazit olan protozoan Trypanosoma cruzi neden olur. Diğer önemli enfeksiyon yolları arasında kan transfüzyonu, organ nakli, oral (enfekte bir triatomin ile kontamine olmuş gıdaların yutulmasıyla)4 ve konjenital bulaşma yer alır. Vektörel olmayan bulaşma yolları, Chagas hastalığının endemik olmayan bölgelere yayılmasına katkıda bulunmuştur 3,5.

Chagas hastalığı iki klinik aşamada kendini gösterir. Akut faz çoğu durumda asemptomatiktir. Semptomatik enfeksiyonlar genellikle ateş, yorgunluk, kas ağrısı, lenfadenopati, splenomegali ve hepatomegali gibi spesifik olmayan belirtilerle ilişkilidir. Akut faz ayrıca sıklıkla patent parazitemisi ve parazitlerin sistemik dolaşımı ile ilişkilidir. Teşhis edilen vakaların %10 kadarında, özellikle oral enfeksiyon olanlarda ölüm meydana gelebilir6. Kronik faz genellikle herhangi bir semptomun uzun süre yokluğu ile karakterizedir. Zamanla, onlarca yıl önce enfekte olan hastaların yaklaşık üçte biri, genellikle fibroz ve miyokard iltihabının eşlik ettiği kardiyak bulgular ve/veya çoğunlukla megaözofagus ve/veya megakolon sendromlarının gelişimi ile ilişkili gastrointestinal bozukluklar sergiler 3,5,6.

Chagas hastalığının etiyolojik tedavisi sadece iki ilaçtan oluşur: benznidazol ve nifurtimox. Bu antiparaziter ajanlar 50 yılı aşkın bir süredir mevcuttur ve önemli toksisiteye ve sınırlı etkinliğesahiptir 5,7,8. Sonuç olarak, Chagas hastalığı hastaları için yeni, güvenli ve daha etkili tedaviler geliştirmeye acil bir ihtiyaç vardır.

Daha sofistike ve doğru teknikler, Chagas hastalığı için yeni tedaviler arayışında ilerlemelere izin veren eski soruların cevaplarını elde etmeyi mümkün kılmaktadır. Bu anlamda, bilim camiası, enfeksiyonun seyri ve ilaç etkinliğinin değerlendirilmesi üzerine in vivo çalışmalar için genetiği değiştirilmiş parazitlerden büyük ölçüde yararlanmaktadır 9,10,11,12. Biyolüminesans görüntüleme (BLI) sistemine dayalı uzunlamasına bir test, tedavi rejimi sırasında ve sonrasında etkinlik değerlendirmesine izin vererek, tripanosidal aktiviteye sahip bileşiklerin tanımlanmasına yol açar10,13. BLI yöntemi, genetik olarak değiştirilmiş T. cruzi CL Brener Luc::Neon soyu11 tarafından üretilen ışığın nicelleştirilmesi yoluyla hem dolaşımda hem de doku ve organlarda parazit yükünün doğrudan ölçümünü sağlar ve bu da kırmızıya kaymış ateşböceği lusiferaz12'yi yapısal olarak ifade eder.

Bununla birlikte, Chagas hastalığı BLI hayvan modelinin ve ilaç etkinliği çalışmalarının kurulmasından yaklaşık 10 yıl sonra, sadece birkaç araştırma grubu bu tekniğe hakimdir. Bu gerçek, yalnızca uygun görüntüleme ekipmanına erişimin azalmasından değil, aynı zamanda eğitim eksikliğinden ve yapılandırılmış, ayrıntılı protokollerin mevcudiyetinden de kaynaklanmaktadır. Bu yöntem, parazit DNA tespiti için mikroskopi, seroloji veya qPCR ile organ/doku enfeksiyonu değerlendirmesi ile paraziteminin değerlendirilmesine dayanan diğer yaklaşımlara göre çeşitli avantajlar sunar, çünkü farelerin refahını iyileştirir ve daha sağlam ve entegre in vivo veri üretme olasılığı ile hayvan kullanımının azaltılmasına izin verir. Ayrıca, bu yöntem, ilaç tedavisinden sonra iç organlardaki parazit odaklarının hazır tespitini sağladığı için tartışmasız daha hassastır10,12. Bu nedenle, bu protokol, Parazitoloji ve diğer enfeksiyon hastalıkları ile ilgili araştırma gruplarına, teknik prosedürleri detaylandırarak laboratuvarlarında bu metodolojiyi kurmaları için rehberlik etmeyi amaçlamaktadır. Burada, İhmal Edilen Hastalıklar için İlaçlar girişimi (DNDi) tarafından koordine edilen ilaç keşif çabalarının bir parçası olarak, Latin Amerika'da türünün ilk örneği olan Chagas hastalığı BLI modelinin Brezilya'da uygulanmasıyla elde edilen deneyimi paylaşıyoruz.

Protokol

Bu protokolde açıklanan tüm prosedürler, Universidade de São Paulo'daki Instituto de Ciências Biomédicas Hayvan Etik Komitesi tarafından önceden belirlenenyönergelere 14 göre sunulmuş, onaylanmış ve yürütülmüştür: protokol CEUA ICB/USP no 5787250522.

1. Çözümler

NOT: 10 mL/kg'lık önceden uygulanan hacmi göz önünde bulundurun (20 g ağırlığında bir fare için 20 μL)15,16. Örneğin, 150 mg / kg hayvan dozuna ulaşmak için 15 mg / mL'lik bir çalışma çözeltisi hazırlayın.

  1. Hidroksipropilmetilselüloz süspansiyonlu araç (HPMC-SV)
    NOT: Gerekli reaktifler %0,5 (a/h) Hidroksipropilmetilselüloz (HPMC), %0,4 (h/h) Tween 80 ve %0,5 (h/h) Benzil alkoldür.
    1. 200 mL araç çözeltisi için 1 g HPMC'yi tartın ve 64 mL sıcak ultra saf suda çözün. 2 dakika karıştırın.
    2. 120 mL buz gibi ultra saf su ekleyin ve 1 saat karıştırın. 1 mL benzil alkol ekleyin.
    3. Ardından, ters pipetleme tekniğini kullanarak 0,8 mL Tween 80 ekleyin ve çözelti şeffaf hale gelene kadar karıştırmaya devam edin.
    4. Çözeltiyi 200 mL'lik son hacim için ayarlayın. HPMC-SV'yi buzdolabında (4 °C) en fazla 3 ay saklayın.
  2. benznidazol
    1. Gerekli bileşik çözelti miktarını aşağıdaki gibi hesaplayın:
      Bileşik çözelti hacmi = (her gündeki doz sayısı x gün sayısı x tedavi edilecek fare sayısı x her farede uygulanan hacim) +% 30 ekstra.
    2. İstenilen dozu göz önünde bulundurarak gerekli miktarda benznidazol (BZ) tartın. İyileştirici tedavi için, 10 gün boyunca günde bir kez 100 mg / kg'lık bir oral doz, CD kronik modelinde100% 100 iyileşme sağlar 17.
    3. İstenen nihai hacim göz önüne alındığında,% 5 (h / h) DMSO konsantrasyonuna ulaşmak için uygun miktarı hesaplayın ve BZ'yi saf DMSO'da tamamen çözün.





figure-protocol-1













figure-protocol-2


Sonuçlar

Yapısal olarak lusiferazı eksprese eden transgenik parazitlere dayanan yeterli bir fare modeli kullanarak, konakçıya minimum zarara neden olan anahtar insan T. cruzi enfeksiyon özelliklerini yeniden üretmek mümkündür, bu da parazitlerin konakçının tüm vücut BLI'si ile uzunlamasına (ömür boyu) bir şekilde gerçek zamanlı olarak izlenmesine olanak tanır, birkaç aya kadar12.

Şekil 3 , BALB/c farelerinde enfeksiyondan sonraki 1. günden 150 dpi'ye kadar CL Brener Luc::Neon enfeksiyonu zaman seyrini gösteren bir pilot deneyi göstermektedir. İlk 20 dpi'de, parazitemi zirvesine özgü biyolüminesans ile çıkarılan parazit yükü artar, bunu farelerin bağışıklık kontrolüne bağlı olarak parazit yükünde keskin bir azalma izler. Bu nedenle, enfeksiyonun akut fazı ilk 50 dpi olarak kabul edilir. Kronik faz, enfeksiyon 100-150 dpi arasında sabit bir biyolüminesan hızına ulaştığında tanımlanır.

figure-results-1
Şekil 3: Modeli anlama. Trypanosoma cruzi CL Brener Luc'un kinetiği::BALB/c farelerinde neon enfeksiyonu (n = 11). Üst panel: intraperitoneal enjeksiyon ile 1 x 10³ kan dolaşımı tripomastigotları ile enfeksiyon sonrası 150 gün (dpi) boyunca farklı zaman noktalarından ventral ve dorsal biyolüminesan görüntüler. Parlaklıkta (p/s/cm, 2/sr) biyolüminesan sinyalin ısı haritası ölçeği (Günlük10'da). Renk kodu: Mor = 5 x 103; kırmızı = 1 x 107. Alt panel: tüm vücut farelerinin Toplam Akısı (p/s) cinsinden biyolüminesan sinyal ölçümü. Veriler ortalamalar (çizgiler) ve standart sapmalar (gölgeli bölgeler) olarak ifade edilir. Bu fare modelinde enfeksiyonun akut ve kronik fazları için tanımlanan dönemler turuncu renkle vurgulanmıştır. Enfekte olmayan farelerin (n = 3) lüminesans ortalama değerleri eşik (açık gri çizgi) olarak gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Enfeksiyonun ana fazları bir fare modelinde iyi bir şekilde yeniden üretildiği için terapötik sonuçlar da tahmin edilebilir. Bu nedenle, BLI artık bileşik etkinlik potansiyeli ve geliştirme hattındaki ilerleme hakkında karar vermeyi destekleyen kavram kanıtı çalışmaları yoluyla çeviri bilimine uygulanmaktadır10,27. Akut fare modelinde, enfeksiyon parazitemi zirvesine ulaştığında (yaklaşık 14-21 dpi) oral tedaviye başlanmalıdır, bu da kan dolaşımında yüksek sayıda tripomastigot (yaklaşık 1 x 105 tripomastigot/mL - veriler gösterilmemiştir) ve sistemik enfeksiyon ile karakterize edilir. Kronik fazda, fare tedavisi, parazit yükünün nispeten çok daha düşük olduğu 100 dpi'de başlar ve stabil alt patent parazitemisi vardır.

Antiparaziter ajanların değerlendirilmesinde yukarıda tarif edilen protokolün uygulanmasını göstermek için, Chagas hastalığının tedavisinde kullanılan standart ilaç olan benznidazol (BZ) ve Chagas hastalığı için klinik çalışmalarda başarısız olan ve ayrıca T. cruzi'ye karşı antiparaziter ajan olarak etkisiz olduğu gösterilen bir sterol 14α-demetilaz (CYP51) inhibitörü olan posakonazolün (Posa) tedavi etkinliğini karşılaştırdık , bu protokolde açıklanan BLI modeli de dahil olmak üzere 13,18,28,29,30.

Akut fare modeli için, grup başına 6 fareden oluşan kohortlar, günde bir kez 20 mg / kg'da Posa veya 100 mg / kg'da BZ ile 20 gün boyunca gavaj31 ile oral olarak tedavi edildi. Fareler ayrıca kısa tedavilerin etkisini değerlendirmek için günde bir kez 100 mg / kg'da 5 gün boyunca BZ ile tedavi edildi. Bileşik eliminasyondan sonra (tedavi sona erdikten 10 gün sonra), BLI negatif fareler immünosuprese edildi, bu da parazitolojik bir tedavi sağlanamadığında enfeksiyonun nüksetmesini teşvik eden bir durumdur (Şekil 4A

figure-results-2

figure-results-3
figure-results-4

Tartışma

Biyolüminesans görüntüleme, görünür ve kızılötesi bir elektromanyetik radyasyon spektrumu kullanarak bir rapor geninin tespit edilmesini sağlayan çığır açan bir yöntemdir. Bu nedenle, numunenizi35 izlemek için radyoaktif işaretli işaretleyicilere gerek yoktur. BLI, kemirgen modelleri ve diğer küçük türler için uygundur. Klinik öncesi çalışmalar için çok faydalıdır çünkü daha güvenlidir ve birkaç görüntü turuna izin vererek minimum hayvan rahatsızlığına neden olur. Ayrıca, biyolüminesans, floresan ve pozitron emisyon tomografisi gibi diğer tekniklerin birleştirilme olasılığı nedeniyle in vivo görüntüleme çok esnektir36.

Optik görüntüleme, absorpsiyon ve saçılma gibi optik fiziksel özellikler tarafından yönetilir. Tüm dokular, farklı dalga boylarındaki ışığı farklı şekilde emer ve saçar37. Kritik bir adım, kimyasal reaksiyon tarafından üretilen ışığın yayılan dalga boyunu hesaba katmadan bir raportör gen seçmektir. Raportör gen ekspresyon seviyesi biyolüminesan deneylerde in vitro olarak yüksek olabilirken, in vivo ortama ilerlerken aynı ekspresyon seviyeleri elde edilemeyebilir. Bu protokolde, in vivo çalışmalar için en uygun olanlardan biri olan 617 nm'de ışık yayan tripanosomatidler9 için kırmızıya kaymış Photinus pyralis luciferase (PpyRE9H)38 kodonu optimize edilmiş versiyon kullandık39. 600 nm'den daha uzun dalga boyları, özellikle hemoglobin ve melanin olmak üzere vücut endojen kromoforları tarafından daha az emilir ve saçılır. Böylece, kırmızı ışıklar birkaç santimetre dokudan iletilebilir ve fotonların iç organların içinden bile CCD kameraya ulaşmasını sağlar39,40.

Görüntüleme ayarlarındaki endişe alanlarından biri, işlevlerinin ve etkilerinin kapsamlı bir şekilde anlaşılmamasıdır. Bir ön işleme tekniği olan gruplama, bitişik dedektörler tarafından elde edilen bilgileri daha büyük bir pikselde birleştirir. Bu işlem, sinyal-gürültü oranını artırarak arka plan gürültüsünü azaltır ve hassasiyeti artırır. Bununla birlikte, uzamsal çözünürlük doğruluğunu azaltarak pikselli bir görüntüyeneden olur 41,42. Bu değiş tokuş, görüntüleme stratejinizde önemli bir husustur.

Chagas hastalığı34 için Hedef Ürün Profili ve Hedef Aday Profiline dayanarak, kavram kanıtlama çalışması, T. cruzi'yi tespit etme ve yeni bir ilaç adayının steril bir tedavi sağlayıp sağlayamayacağını belirlemeye yardımcı olma duyarlılığına odaklanmıştır (birkaç immünosupresyon turundan sonra nüks eksikliği ile temsil edilir). Bu nedenle, görüntüyü aşırı doygunlaştırmadan en yüksek gruplama faktörünü kullanarak BLI'yi yürütürüz. Görüntü aşırı doygunluğa ulaştığında, daha düşük bir gruplama faktörü kullanılarak yeni bir alım gerçekleştirilir. Analiz sırasında, farklı gruplama gerektiren görüntülere matematiksel bir düzeltme uygulanır. Bu şekilde, nihai veriler aynı gruplama kullanılarak sunulmalıdır. Tablo 1 , aynı görüntüde ve ROI'lerde farklı gruplama faktörleri uygulandığında elde edilen farklı değerleri göstermektedir.

Tablo 1: Gruplama ayarlarının BLI niceliği üzerindeki etkisi. Akut model (d13) ve kronik model (d118) görüntüsünde üç ROI'nin ölçülmesi, farklı gruplama faktörlerinde analiz edildi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Klinikte Chagas hastalığının mevcut senaryosu nedeniyle, ilaç keşif çabaları parazitleri tamamen ortadan kaldırmayı amaçlamaktadır (parazitolojik tedavi)27,34. Bu nedenle, in vivo preklinik protokol, BLI teknik duyarlılığının sınırlamalarının üstesinden gelen yaklaşımları içerir. Yaklaşımlardan biri, parazit yükünü kontrol eden bağışıklık tepkisini azaltmak için fareleri siklofosfamid ile tedavi etmektir. Başka bir strateji, doku derinliğini azaltmak ve kameraya giden ışık yolunu engelleyen kas, deri ve kürk katmanlarını çıkarmaktır. Ex vivo prosedür sayesinde, Posa ile tedavi edilen farenin ex vivo sonucu Şekil 5C'de gösterildiği gibi, in vivo BLI eşiğinin altında parazit odaklarını ortaya çıkaran küçük biyolüminesan noktalar tespit edilebilir.

Modelin kendisini ve enfeksiyon dinamiklerini değerlendirmek için bir pilot deney tasarlamak, antiparaziter ilaç etkinliği değerlendirmesi için doğru bir deney oluşturmak için çok önemlidir. Bu nedenle, araştırmacı uygun BLI ayarlarını ve enfeksiyon zaman seyrini önceden tanımlayabilecektir. Keşif amaçlı bir deneyde, edinim ayarlarını tanımlamaya yardımcı olabilecek bir araç 'Otomatik Pozlama'dır. Bu araçla araştırmacı, mümkün olan en iyi görüntüyü elde etmek için üç ayarın (Pozlama süresi, Gruplama ve F/Stop) önceliğini belirler. Özellikle, araştırmacı, görüntülerin CCD kameranın dinamik aralığı içinde, aşırı doygunluk veya düşük pozlama olmadan, ölçeğin ve otomatik pozlama özelliğinin minimum ve maksimum sınırları aracılığıyla kontrol edilebilen, elde edilmesini sağlamalıdır (Menü Düzenleme > Tercihler > Sekme Alma > Sekme Otomatik Pozlama). Bu protokolde, kamera açıklığı maksimum değere (F/Stop: 1) ayarlandı ve akut ve kronik modeller için farklı pozlama süreleri ve gruplama faktörleri tanımlandı. Bu ayarlar, aynı anda farklı görüntü turları gerçekleştirmek için zaman öngörülebilirliği sağlar. Raportör yönteminin bir enzimatik reaksiyona dayandığı göz önüne alındığında, hem substratın fareye biyolojik dağılımı hem de lusiferaz kinetiği, biyolüminesan sinyalini ve dolayısıyla enfeksiyon miktarını etkiler (Şekil 1B). Sonuç olarak, enzimatik kinetik momentlerinde görüntü elde etmek, açıklanamayan veya düzeltilemeyen veri değişkenliğini ortaya çıkarır ve toplam akı (fotonlar/saniye) veya parlaklık (fotonlar/saniye/cm2/steradyan) hesaplamasını etkiler. Ayrıca, T. cruzi enfeksiyonu farelerde dinamik uzamsal konumlandırma gösterir (farklı alanlar ve dokular, derinlik ve parazit yükü). Bu nedenle, elde edilecek sayımların bir değerini belirlemek, başka bir daha güçlü sinyalin kaynağı tanımlanan otomatik maruz kalma kriterlerini karşılıyorsa, daha zayıf sinyal kaynaklarını (dokunun daha derin bir noktasında düşük sayıda parazit) gözden kaçırabilir.

Living Image yazılımının zor bir özelliği, elde edilen görüntüyü otomatik bir renk ölçeğinde görüntülemektir. Seçilen ölçek değerlerine göre otomatik olarak yepyeni bir edinilmiş görüntüyü gösterecek şekilde ölçeği önceden ayarlama seçeneği yoktur (bkz. protokol adımı 6.2). Bu durum, araştırmacıyı görüntüleri tek tek manuel olarak seçilen maksimum ve minimum değerlere değiştirmeye zorlar. Sonuç olarak, deneyimsiz ve iyi eğitimli olmayan kullanıcılar, edinme oturumu sırasında uygun okumaya sahip olamazlar ve o noktada verileri yanıltabilir veya önemli bilgileri kaybedebilirler. Bunun için pilot deney faydalıdır.

Kavram kanıtı deney tasarımı ile ilgili en yaygın sorulardan biri, tedavi süresinin ve dozunun nasıl seçileceğidir. Yeni kimyasal varlıklar için, bu parametreler genellikle, ilaç metabolizması ve farmakokinetiği (DMPK) tarafından oluşturulan veriler ve etkinlik için in vivo testlerden önce yürütülen tolere edilebilirlik çalışmaları ile kombinasyon halinde, in vitro bileşik potens ve seçicilik ile tanımlanır. Özetle, hücrelerin içindeki paraziti seçici olarak öldürebilen bileşikleri belirledikten sonra, ilk ADME deneyleri (absorpsiyon, dağılım, metabolizma ve atılım), diğer parametrelerin yanı sıra bileşiklerin suda çözünürlüğünü, hücre geçirgenliğini ve metabolik stabilitesini tahmin etmek için in vitro olarak gerçekleştirilir. Bileşikler in vitro özelliklerin iyi bir dengesini gösteriyorsa (genellikle hedef aday profillerinde tanımlanır), bu adaylar sağlıklı farelerde in vivo farmakokinetik (PK) çalışmalara ilerletilir, bu da kandaki (ve muhtemelen dokularda) bileşik maruziyetini ana hatlarıyla belirtir ve farklı doz seviyelerinde tolere edilebilirlik hakkında genel bir fikir verir17, 34,43. İdeal olarak, çoğu bulaşıcı hastalıkta PK değerlendirmesinin amacı, EC50/EC90 konsantrasyonlarının44 üzerindeki serbest plazma konsantrasyonlarına (plazma protein bağlanması için düzeltilmiş) ulaşmanın fizibilitesini belirlemektir - parazitlerin sırasıyla %50 veya %90'ını öldüren veya en azından büyümesini engelleyen etkili konsantrasyon - yeterince uzun bir süre boyunca. Belirli bir doz seviyesinde yeterli maruziyet elde edilirse, bu rejim Chagas BLI modeli kullanılarak yapılan etkinlik çalışmaları sırasında kullanılabilir. İlaç yeniden konumlandırma çalışmaları için in vitro ve in vivo PK verileri mevcut olmalıdır. İlacın yeniden profillenmesi için iyi bir başlangıç, test edilecek güvenli ve toksik olmayan tedavi rejimlerini tahmin etmek için allometrik ölçeklendirme46 kullanılarak farelere dönüştürülebilen tanınmış veriler sağlayan PubChem45 gibi kimyasal veri tabanlarıdır. Ancak, bu her zaman böyle değildir. PK çalışmaları, akademik bilimde hala göz ardı edilen bir alandır ve çok az ilaç şirketi PK sonuçlarını yayınlamaktadır. İlaç keşfi bilim topluluğu, in vivo PK değerlendirmesinin yanı sıra ilaç etkinliği deneyleri (farmakodinamik) dahil edilmesini önermektedir47. Bu nedenle, klinik öncesi görüntüleme, eş zamanlı olarak bileşik ölçümlerle uyumludur ve bu ilişkili yaklaşım, veri sağlamlığını artırır.

Ek olarak, farelerin kullanımı, ağırlığı ve sağlık koşulları tüm deney boyunca izlenir. Kamburlaşma, titreme, denge kaybı, hareket etme isteksizliği, beslenmeye veya içmeye isteksizlik, secde veya grupta veya bireysel fare koşullarında mevcut olan diğer anormallikler gibi toksisite belirtileri ve yan etkiler klinik öncesi çalışmalarda kaydedilmeli ve rapor edilmelidir. Optik görüntülemenin amaçlarından biri de hayvanların refahını sağlamaktır. Bu nedenle, 'Yüz buruşturma ölçeği48'de açıklanan ağrı belirtileri olan farelerde insancıl uç noktalar uygulanmalıdır. Ayrıca, fareler BLI alımı sırasında ve daha sık olarak ilaç dozu ve CTX tedavisi sırasında haftalık olarak tartıldı. Hayvan refahı düzenlemelerine göre, vücut ağırlığının %20'sinden fazlasını kaybeden fareler derhal insancıl bir şekilde ötenazi yapılmalıdır.

T. cruzi biyolüminesan modeli, Chagas hastalığı için yeni tedavilerin keşfedilmesi ve geliştirilmesi için son teknoloji deneysel modeldir. T. cruzi enfeksiyonu ve Chagas hastalığı49'un temel özelliklerini çoğaltan, paraziteminin gerçek zamanlı izlenmesine ve bilinen etki modlarıyla ilişkili çeşitli etkinlik profillerine sahip bileşiklerin farklılaşmasına izin veren bir model. BLI, enfekte olmuş dokuları tanımlamada atılganlığı artıran bir tekniktir. Enfekte dokuların hassas seçiminin, T. cruzi araştırmasında50,51 halihazırda uygulanmış olan tüm klasik yöntemler de dahil olmak üzere çok çeşitli yaklaşımlarda kullanılmasını sağlar. Ek olarak, araştırmacıların en son teknolojileri keşfetmelerine ve yenilerini geliştirmelerine olanak tanır33. Ek olarak, BLI, aynı anda 3R ilkelerine10,35 göre hayvan refahının iyileştirilmesini ve daha rasyonel kullanımını sağlar.

İhmal edilen tropikal hastalıklara odaklanan birçok araştırma grubu, in vivo görüntüleme cihazlarının bulunmadığı ülkelerde yer almaktadır. Mevcut senaryonun üstesinden gelmek için, Global BioImaging ve ilgili konsorsiyumları gibi yeni uluslararası ağlar, görüntüleme çekirdek tesislerine açık erişim sağlamak ve personel ile görüntüleme bilimcilerinin eğitimini iyileştirmek için eylemleri teşvik etmektedir 52,53. Bu girişimler, bunun gibi kullanıcı dostu protokollerle birlikte, tüm araştırmacılar için üst düzey teknolojileri demokratikleştiren koşulları karşılayabilir. Bu yöntemin klinik öncesi ilaç keşfinde uygulanması, Chagas hastalığı için ilaç keşfini kolaylaştıran sağlam bir etkinlik okuması ve klinik sonucun prediktif değerini sunmuştur.

Açıklamalar

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, ilaç etkinliği deneyleri konusunda BLI eğitimi ve desteği sağladıkları için Amanda Franscisco, John Kelly ve Fanny Escudié'ye, parazitler sağladıkları için John Kelly ve Simone Calderano'ya ve hayvan çalışmalarına destek için Gabriel Padilla'ya teşekkür eder. A.C.S, London School of Hygiene and Tropical Medicine'de (Birleşik Krallık) eğitim almak için CAPES PSDE Bursu aldı. Yazarlar ayrıca, IVIS Spektrum ekipman analiziyle ilgili teknik destek için Sao Paulo Üniversitesi (CEFAP-USP) Bilimsel Araştırma Çekirdek Tesisi'ndeki Akış Sitometrisi ve Görüntüleme Araştırmaları (FLUIR) Platformuna ve Genetik ve Sıhhi Kontrol Laboratuvarı'na teşekkür etmek isterler. Bu proje DNDi tarafından finanse edilmiştir. DNDi, 2003 yılındaki kuruluşundan bu yana tüm DNDi faaliyetleri için finansman sağlayan kamu ve özel bağışçılarına minnettardır. DNDi'nin bağışçılarının tam listesi https://dndi.org/about/donors/ adresinde bulunabilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
BD LSRFortessa ve ticaret; X-20 Hücre Analiz CihazıBD Biosciences Tartı Terazisi
(hayvan tesisi)Çeşitli tedarikçilerden
IVIS Spectrum In Vivo Görüntüleme SistemiRevvity (eski PerkinElmer)
FlowJ Yazılımı v10.7.1BD Biosciences
Spectrum v4.7.1Revvity (eski PerkinElmer)için Canlı Görüntü Yazılımı'Aura Imaging' adlı Lisanssız Analiz Yazılımı, Spectral Instruments Imaging (Bruker şirketi) (https://spectralinvivo.com/software/)
Microsoft Office yazılımıMicrosoft
GraphPad Prism v8.4.0GraphPad Software Inc.
DMEM Düşük GlikozVitrocellD0025
Sodyum bikarbonatSigma-AldrichS5761-500G
Fetal Sığır Serumu (FBS)Gibco16000-044
Penisilin-StreptomisinGibco15140-122
Tripsin% 0.5 EDTAGibco25300-062
LIT ortaIn ev
Higromisin B (50 mg / mL)Gibco10687010
Grace & prime; s Böcek OrtaSigma-Aldrich G9771
HEPESSigma-Aldrich 54457
IVISBrite d-lusiferin potasyum tuzuRevvity (eski PerkinElmer)122799Ayrıca kullanılabilir: VivoGlo Luciferin, in vivo sınıf (Promega / P1043); D-Luciferin, Monopotasyum Tuzu (Thermo Scientific/88293) veya PierceD-Luciferin, Monosodyum* Tuzu (Thermo Scientific/88291); D-Luciferin, Potasyum Tuzu (GoldBio / LUCK veya eLUCK); D-Luciferin, Sodyum* Tuzu (GoldBio / LUCNA veya eLUCNA) * Sodyum veya potasyum tuzu farklılıkları, çözünürlüğe minimum şans verir, ancak in vivo performansı etkilemez.
DPBSGibco21600-044
Siklofosfamid (CTX)Sigma-AldrichC0768-5g
Dimetil sülfoksit (DMSO)Sigma-AldrichD5879
(Hidroksipropil) metil selüloz (HPMC)Sigma-Aldrich09963-25G
Benzil alkolSigma-Aldrich402834
Tween 80Sigma-Aldrich P1754-1L
BenznidazolELEA
Posakonazol (Noxafil ticari formülasyonu)Schering-Phough
GiemsaBirkaç tedarikçiden
gavaj iğnesi (paslanmaz çelik düz) - 22GAAton  CA2003
1 mL Şırınga ve 31G iğneBirkaç tedarikçiden
1 mL Şırınga ve çıkarılabilir 26G iğneBirkaç tedarikçiden
1 mL Şırınga ve çıkarılabilir 24G X & frac34; iğneBirkaç tedarikçiden
Steril Şırınga Filtresi 0.2 ve mikro; mBirkaç tedarikçiden
A4 Mat Siyah kağıt 120gr veya daha kalınKağıt Rengi/ Canson (Birkaç tedarikçiden temin edilebilir)
alüminyum folyoBirkaç tedarikçiden
Neubauer odasıBirkaç tedarikçiden
temin edilebilir tarafından sağlanan en temel özellikler için kullanılabilir.temin edilebilirtemin edilebilirtemin edilebilirtemin edilebilirtemin edilebilirtemin edilebilir temin edilebilir

Kaynaklar

  1. WHO fact sheet. Chagas disease (also known as American trypanosomiasis). WHO, World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/chagas-disease-(american-trypanosomiasis) (2023).
  2. Lee, B. Y., Bacon, K. M., Bottazzi, M. E., Hotez, P. J. Global economic burden of Chagas disease: a computational simulation model. Lancet Infect Dis. 13 (4), 342-348 (2013).
  3. Bern, C. Chagas' disease. N Engl J Med. 373 (5), 456-466 (2015).
  4. Shikanai-Yasuda, M. A., Carvalho, N. B. Oral transmission of Chagas disease. Clin Infect Dis. 54 (6), 845-852 (2012).
  5. Lidani, K. C. F., et al. Chagas disease: From discovery to a worldwide health problem. Front Public Health. 7, 166(2019).
  6. Perez-Molina, J. A., Molina, I. Chagas disease. Lancet. 391 (10115), 82-94 (2018).
  7. Field, M. C., et al. Anti-trypanosomatid drug discovery: An ongoing challenge and a continuing need. Nat Rev Microbiol. 15 (7), 447(2017).
  8. Kratz, J. M. Drug discovery for chagas disease: A viewpoint. Acta Trop. 198, 105107(2019).
  9. McLatchie, A. P., et al. Highly sensitive in vivo imaging of Trypanosoma brucei expressing 'red-shifted' luciferase. PLoS Negl Trop Dis. 7 (11), e2571(2013).
  10. Lewis, M. D., Francisco, A. F., Taylor, M. C., Kelly, J. M. A new experimental model for assessing drug efficacy against Trypanosoma cruzi infection based on highly sensitive in vivo imaging. J Biomol Screen. 20 (1), 36-43 (2015).
  11. Costa, F. C., et al. Expanding the toolbox for Trypanosoma cruzi: A parasite line incorporating a bioluminescence-fluorescence dual reporter and streamlined CRISPR/Cas9 functionality for rapid in vivo localisation and phenotyping. PLoS Negl Trop Dis. 12 (4), e0006388(2018).
  12. Lewis, M. D., et al. Bioluminescence imaging of chronic Trypanosoma cruzi infections reveals tissue-specific parasite dynamics and heart disease in the absence of locally persistent infection. Cell Microbiol. 16 (9), 1285-1300 (2014).
  13. Francisco, A. F., et al. Limited ability of posaconazole to cure both acute and chronic Trypanosoma cruzi infections revealed by highly sensitive in vivo imaging. Antimicrob Agents Chemother. 59 (8), 4653-4661 (2015).
  14. du Sert, N. P., et al. The arrive guidelines 2.0: Updated guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 18 (7), e3000410(2020).
  15. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 600-613 (2011).
  16. Turner, P. V., Pekow, C., Vasbinder, M. A., Brabb, T. Administration of substances to laboratory animals: equipment considerations, vehicle selection, and solute preparation. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 614-627 (2011).
  17. Francisco, A. F., et al. Nitroheterocyclic drugs cure experimental Trypanosoma cruzi infections more effectively in the chronic stage than in the acute stage. Sci Rep. 6, 35351(2016).
  18. Moraes, C. B., et al. Nitroheterocyclic compounds are more efficacious than CYP51 inhibitors against Trypanosoma cruzi: implications for Chagas disease drug discovery and development. Sci Rep. 4, 4703(2014).
  19. Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nat Methods. 10 (5), 407-409 (2013).
  20. de Araújo-Jorge, T. C., de Castro, S. L. Chagas Disease: Manual for Animal Experimentation. , FIOCRUZ Publisher. Rio de Janeiro. (2000).
  21. JoVE. JoVE Science Education Database. Anesthesia Induction and Maintenance. JoVE. , (2023).
  22. Taylor, M. C., et al. Exploiting genetically modified dual-reporter strains to monitor experimental Trypanosoma cruzi infections and host-parasite interactions. Methods Mol Biol. 1955, 147-163 (2019).
  23. Keyaerts, M., et al. Inhibition of firefly luciferase by general anesthetics: effect on in vitro and in vivo bioluminescence imaging. PLoS One. 7 (1), e30061(2012).
  24. Jiron, J. M., et al. Comparison of isoflurane, ketamine-dexmedetomidine, and ketamine-xylazine for general anesthesia during oral Procedures in rice rats (Oryzomys palustris). J Am Assoc Lab Anim Sci. 58 (1), 40-49 (2019).
  25. GoldBio. GoldBio Luciferin In Vivo Handbook - a detailed method for Luciferin preparation and administration for model animals. GoldBio Protocol. , Available from: https://goldbio.com/documents/1068/Luciferin%20in%20vivo%20handbook.pdf (2013).
  26. Revity. Preparation of IVISbriteTM D-Luciferin for in vitro and in vivo bioluminescent assays. Revvity Standard Operate Procedure (Tech Notes). , Available from: https://resources.perkinelmer.com/lab-solutions/resources/docs/SOP_LuciferinPrep_InVitroInVivo_BLI-Assays.pdf (2023).
  27. Chatelain, E., Scandale, I. Animal models of Chagas disease and their translational value to drug development). Expert Opin Drug Discov. 15 (12), 1381-1402 (2020).
  28. Khare, S., et al. Antitrypanosomal treatment with benznidazole is superior to posaconazole regimens in mouse models of Chagas disease. Antimicrob Agents Chemother. 59 (10), 6385-6394 (2015).
  29. Bustamante, J. M., Craft, J. M., Crowe, B. D., Ketchie, S. A., Tarleton, R. L. New, combined, and reduced dosing treatment protocols cure Trypanosoma cruzi infection in mice. J Infect Dis. 209 (1), 150-162 (2014).
  30. Molina, I., et al. Randomized trial of posaconazole and benznidazole for chronic Chagas' disease. N Engl J Med. 370 (20), 1899-1908 (2014).
  31. JoVE. Science Education Database. Compound Administration II. JoVE. , (2023).
  32. Pukhalsky, A. L., Toptygina, A. P., Viktorov, V. V. Immunosuppressive action of cyclophosphamide in mice: Contribution of some factors to determination of strain differences. Int J Immunopharmacol. 15 (4), 509-514 (1993).
  33. Francisco, A. F., et al. Comparing in vivo bioluminescence imaging and the Multi-Cruzi immunoassay platform to develop improved Chagas disease diagnostic procedures and biomarkers for monitoring parasitological cure. PLoS Negl Trop Dis. 16 (10), e0010827(2022).
  34. Kratz, J. M., et al. The translational challenge in Chagas disease drug development. Mem Inst Oswaldo Cruz. 117, e200501(2022).
  35. Youn, H., Hong, K. -J. In vivo noninvasive small animal molecular imaging. Osong Public Health Res Perspect. 3 (1), 48-59 (2012).
  36. Refaat, A., et al. In vivo fluorescence imaging: success in preclinical imaging paves the way for clinical applications. J Nanobiotechnology. 20 (1), 450(2022).
  37. Pirovano, G., Roberts, S., Kossatz, S., Reiner, T. Optical imaging modalities: Principles and applications in preclinical research and clinical settings. J Nucl Med. 61 (10), 1419-1427 (2020).
  38. Branchini, B. R., Southworth, T. L., Khattak, N. F., Michelini, E., Roda, A. Red- and green-emitting firefly luciferase mutants for bioluminescent reporter applications. Anal Biochem. 345 (1), 140-148 (2005).
  39. Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. J Biomed Opt. 10 (4), 041210(2005).
  40. O'Neill, K., Lyons, S. K., Gallagher, W. M., Curran, K. M., Byrne, A. T. Bioluminescent imaging: a critical tool in pre-clinical oncology research. J Pathol. 220 (3), 317-327 (2010).
  41. Mennel, L., et al. A photosensor employing data-driven binning for ultrafast image recognition. Sci Rep. 12 (1), 14441(2022).
  42. Yoo, Y., Im, J., Paik, J. Low-light image enhancement using adaptive digital pixel binning. Sensors. 15 (7), 14917-14931 (2015).
  43. Moraes, C. B., et al. Accelerating drug discovery efforts for trypanosomatidic infections using an integrated transnational academic drug discovery platform. SLAS Discov. 24 (3), 346-361 (2019).
  44. Sebaugh, J. L. Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation. Pharm Stat. 10 (2), 128-134 (2011).
  45. Kim, S., et al. PubChem 2023 update. Nucleic Acids Res. 51, D1 D1373-D1380 (2023).
  46. Sharma, V., McNeill, J. H. To scale or not to scale: the principles of dose extrapolation. Br J Pharmacol. 157 (6), 907-921 (2009).
  47. Barrow, J. C., Lindsley, C. W. The importance of PK-PD. J Med Chem. 66 (7), 4273-4274 (2023).
  48. Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nat Methods. 7 (6), 447-449 (2010).
  49. Lewis, M. D., Kelly, J. M. Putting infection dynamics at the heart of Chagas disease. Trends Parasitol. 32 (11), 899-911 (2016).
  50. Brener, Z. Therapeutic activity and criterion of cure on mice experimentally infected with Trypanosoma cruzi. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 4, 389-396 (1962).
  51. Cummings, K. L., Tarleton, R. L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Mol Biochem Parasitol. 129 (1), 53-59 (2003).
  52. Keppler, A., Grebnev, G., Reis, Y. Global BioImaging. , . (2024).
  53. Pfander, C., et al. Euro-BioImaging - Interdisciplinary research infrastructure bringing together communities and imaging facilities to support excellent research. iScience. 25 (2), 103800(2022).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Trypanosoma cruziIn Vivo G r nt lemeParazit Y kLusiferaz ReporterBoylamsal zlemeAntiparasitik Ajanlar
İlaç Etkinliği Çalışmaları için Bir Chagas Hastalığı Fare Modelinin In Vivo Biyolüminesans Görüntülemesinin Gizeminin Çözülmesi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.