Yöntem makalesi

Bir hücre fabrikası platformu kullanarak yüksek titre, yüksek kaliteli adeno-ilişkili virüs vektörleri oluşturmak için kolaylaştırılmış ve standartlaştırılmış bir prosedür

DOI:

10.3791/66741

⸱

3 Mayıs 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Pediatric Surgery, Department of Surgery, Children's Hospital of Pittsburgh, University of Pittsburgh School of Medicine, 2North Allegheny High School, 3Wright State University Boonshoft School of Medicine, 4College of Engineering, University of Michigan

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gen terapisi alanı gelişmeye devam ettikçe, bu zorlukların üstesinden gelebilecek yenilikçi yöntemlere artan bir ihtiyaç var. Burada, in vivo çalışmalar için kalite standartlarını karşılayan, bir hücre fabrikası platformu kullanarak yüksek verimli ve yüksek saflıkta AAV vektörleri üretme sürecini kolaylaştıran benzersiz bir yöntem sunulmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Özellikle kemirgen ve büyük hayvan modellerinde klinik öncesi gen tedavisi araştırmaları, yüksek verim ve saflıkta AAV vektörlerinin üretimini gerektirmektedir. Araştırma laboratuvarlarındaki geleneksel yaklaşımlar, genellikle hem zahmetli hem de sorunlu olabilen bir süreç olan HEK293T hücrelerini yetiştirmek için hücre kültürü kaplarının yaygın kullanımını içerir. Burada, bu işlemi belirli bir hücre fabrikası (veya hücre yığınları, CF10) platformuyla basitleştiren benzersiz bir şirket içi yöntem sunulmaktadır. Polietilen glikol/sulu iki fazlı bölümlemenin iyodiksanol gradyan ultrasantrifüjleme ile entegrasyonu, üretilen AAV vektörlerinin hem verimini hem de saflığını artırır. AAV vektörlerinin saflığı, SDS-PAGE ve gümüş boyama ile doğrulanırken, dolu parçacıkların boş parçacıklara oranı, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kullanılarak belirlenir. Bu yaklaşım, in vivo çalışmalar için kalite taleplerini karşılamak için geliştirilmiş bir saflaştırma yöntemi ile birlikte AAV vektörlerinin yüksek verimlerde üretilmesi için verimli bir hücre fabrikası platformu sunar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adeno-ilişkili virüs (AAV) vektörleri, gen iletimi için benzersiz bir etkinlik ve güvenlik kombinasyonu sunarak gen terapisi araştırmalarında vazgeçilmez bir araç haline gelmiştir1. Laboratuvar ortamlarında AAV'ler oluşturmak için geleneksel yöntemler, gen terapisi2 anlayışımızı ve uygulamamızı ilerletmede çok önemli olmuştur. Bununla birlikte, bu yöntemler, temel olmakla birlikte, özellikle verim, zaman verimliliği ve üretilen vektörlerin kalitesi, özellikle de dolu parçacıkların boş parçacıklara oranı açısından belirli sınırlamalar ve zorluklar sergilemektedir3.

AAV üretimi için geleneksel prosedür öncelikle HEK293 hücrelerinin4 transfeksiyonunu içerir. Tipik olarak hücre kültürü kaplarında gerçekleştirilen bu işlem, hücrelerin yardımcı plazmid ve AAV kapsid plazmidi 5,6 ile birlikte ilgilenilen geni içeren bir plazmit ile transfekte edilmesini gerektirir. Transfeksiyonu takiben, hücreler daha sonra hasat edilen ve saflaştırılan AAV parçacıkları üretir 5,6. Saflaştırma işlemi genellikle, yüksek saflıkta AAV vektörleri7 elde etmede kritik bir adım olan ultrasantrifüjlemeyi içerir. Özellikle sezyum klorür (CsCl) veya iyodiksanol gradyanı kullanılarak yapılan ultrasantrifüjleme, AAV partiküllerini hücresel kalıntılardan ve diğer safsızlıklardan ayırmak için standart bir yöntemdir8. Bu adım, AAV vektörlerinin istenen saflığını ve konsantrasyonunu elde etmek için çok önemlidir ve bu da gen iletimindeki etkinliklerini doğrudan etkiler8. Yaygın kullanımına rağmen, geleneksel ultrasantrifüjlemenin dezavantajları vardır. Örneğin, bu yöntemden elde edilen AAV vektörlerinin verimi değişken ve genellikle düşük olabilir, bu da özellikle in vivo çalışmalar veya büyük hayvan modelleri için büyük miktarlarda yüksek titreli vektörlere ihtiyaç duyulduğunda önemli zorluklar ortaya çıkarmaktadır9.

AAV vektör kalitesinin bir diğer kritik yönü, dolu parçacıkların boş parçacıklaraoranıdır 10. AAV preparatları genellikle bu parçacıkların bir karışımını içerir; Bununla birlikte, sadece tam parçacıklar terapötik genetik materyali içerir. Yüksek oranda boş parçacıkların varlığı, gen iletiminin verimliliğini önemli ölçüde azaltabilir10. Bu nedenle, dolu parçacıkların boş parçacıklara oranının değerlendirilmesi ve optimize edilmesi, AAV vektörlerinin etkinliğinin değerlendirilmesinde önemli bir parametredir. Geleneksel yöntemler, AAV vektörleri üretebilse de, genellikle bu oranı tutarlı bir şekilde kontrol etmekte zorlanır ve bu da vektör potensinde10 değişikliklere yol açar.

Burada, hücre yemeklerinde emek yoğun HEK293T hücre kültürleri kullanmaktan arınmış bir hücre fabrikası platformu kullanarak yüksek verimli ve yüksek saflıkta AAV vektörleri üretme sürecini kolaylaştıran, polietilen glikol/sulu iki fazlı bölmelemeyi iyodiksanol gradyan ultrasantrifüjleme ile entegre eden benzersiz bir yöntem sunulmaktadır. AAV vektör saflığı, SDS-PAGE ve gümüş boyama ile doğrulanır ve dolu-boş parçacık oranı, in vivo çalışmalar11 için kalite standartlarını karşılayan transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kullanılarak belirlenir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çalışmada kullanılan reaktiflerin, plazmitlerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir. Kullanılan tamponların bileşimi Ek Dosya 1'de verilmiştir.

1. Plazmid hazırlığı

  1. Plazmitleri (pAAV-GOI, pHelper, pAAV-Cap) E. coli'de dönüştürün.
    NOT: Plazmit amplifikasyonu için herhangi bir E.coli suşu kullanılabilir. Bazı plazmitler için, NEB stabil gibi özel yetkin hücreler plazmit verimini artırabilir. Bu protokolde kullanılan üç plazmit pAAV-GOI'dir: pAAV-CMV-GFP, pHelper: pAdDeltaF6 ve pAAV-Cap: pAAV-RC6.
  2. Uygun seçici antibiyotikleri içeren LB ortamında optimal hacimde 37 ° C'de 16-18 saat boyunca bakteri üremelidir.
    NOT: NEB kararlı hücreleri kullanırken, 18-20 saat boyunca 30 ° C'de kültürleyin.
  3. E. coli'yi santrifüjleyerek plazmit DNA'sını hasat edin. 4000 x g, 4 °C'de 15 dakika boyunca kültür ortamı.
  4. Süpernatan sıvıyı santrifüj şişesinden dikkatlice bir atık kabına dökün ve plazmit DNA'yı peletten büyük ölçekli bir endotoksin içermeyen plazmit saflaştırma kiti ile saflaştırın.
    NOT: Yavaşça döktüğünüzden ve sıçramasını önlediğinizden emin olun.
  5. Bir spektrofotometre kullanarak DNA konsantrasyonunu ve saflığını ölçün.
    NOT: OD260 / OD280 oranını kontrol ederek DNA saflığını kontrol edin. Saf DNA oranı yaklaşık 1.8'dir. Daha sonraki ko-transfeksiyon aşaması için DNA konsantrasyonu 1 μg/μL'nin üzerinde olmalıdır. Bir kriyoviyalde 500 μL %50 gliserole 500 μL gece kültürü ekleyerek bakteriyel gliserol stokları yapın ve -80 °C'de saklayın.

2. HEK293T hücrelerinin hazırlanması

  1. % 10 FB HEK293T S içeren DMEM yüksek glikoz ortamlı hücreleri 10 katmanlı bir hücre fabrikasına (CF10) tohumlayın ve hücrelerin gece boyunca inkübatörde büyümesine izin verin.
    NOT: Sağlam AAV üretimi için en uygun koşula sahip olmak için 293T hücrelerinin geçişleri 10'dan az olmalıdır. Mümkünse, şu anda kültür ortamına antibiyotik eklemeyin. CF10, 150 mm'lik bir hücre kültürü kabının yaklaşık 42 katı büyüme yüzey alanına sahiptir. Hücre büyümesini mikroskop altında kontrol etmek için aynı hücre yoğunluğunu 150 mm'lik bir hücre kültürü kabına tohumlayın. 1075 mL hücre süspansiyonu hazırlayın, 150 mm'lik bir tabağa 25 mL hücre süspansiyonu ekleyin ve kalanını CF10'a ekleyin.
  2. Transfeksiyondan önceki ertesi gün hücre birleşmesini kontrol edin.
    NOT: Hücreler, mikroskop altında gözlemleyerek transfeksiyon anında %80-90 birleşme noktasına ulaşmalıdır.

3. AAV plazmitlerinin üçlü transfeksiyonu

  1. CF10 başına 2.5-5 mg toplam DNA ile 1.2: 1: 1 molar orana sahip olmak için gereken her bir plazmitin miktarını (pAAV-GOI, pHelper, pAAV-serotip) hesaplayın.
    NOT: Üç plazmitin molar oranı, optimal transfeksiyon etkinliği için değişken olabilir. Bu CF10 ayarına geçmeden önce küçük ölçekli bir ayarda test etmek daha iyidir. pAAV-CMV-GFP, pAdDeltaF6 ve pAAV-RC6, örnek olarak AAV6-CMV-GFP virüsünü yapmak için kullanılır. PEI hesap makinesi formülü Tablo 1'de listelenmiştir.
  2. 350 mL OptiMEM'i 500 mL'lik steril bir şişeye koyun.
  3. Üç plazmit DNA'sını da Opti-MEM içeren şişeye ekleyin. İyice karıştırın.
  4. 15 mL 1 mg / mL polietilenimin (PEI) çözeltisi (1: 3 μg DNA / μg PEI oranı) ekleyin. OptiMEM/DNA/PEI karışımını 30 saniye boyunca kuvvetlice yukarı ve aşağı çalkalayın.
    NOT: Baloncuk yapmakta bir sakınca yoktur.
  5. Karışımı oda sıcaklığında 10-15 dakika inkübe edin.
    NOT: Daha uzun inkübasyon, transfeksiyon verimliliğini azaltabilir.
  6. OptiMEM/DNA/PEI solüsyonunu, 10 mM HEPES ve% 2 FBS ile 700 mL DMEM düşük glikoz içeren 1 L'lik şişeye ekleyin. İyice karıştırın.
    NOT: Bu çalışmada, DMEM'deki düşük glikoz, ko-transfeksiyondan sonra daha iyi AAV vektör üretimi göstermiştir. HEPES ilavesi, hücrelerin daha iyi bir durumda kalmasına yardımcı olur. Şişeyi yavaşça çevirerek karıştırın. Çok fazla baloncuk oluşturmaktan kaçının.
  7. CF10'u inkübatörden çıkarın ve ortamı bir atık kabına vakumlayın.
    NOT: CF10'u kaputun içindeki yüzeye koyun ve bir tarafını kademeli olarak yukarı kaldırın, hücreleri ayırmadan ortamı yavaşça vakumlayın.
  8. Transfektan karışımını dikkatlice CF10'a ekleyin. On katmanın tamamının ortamla kaplandığından emin olun.
    NOT: 150 mm'lik tabağa 25 mL transfektant karışımı ekleyin. Hücreleri hasada kadar günlük olarak izleyin. Kalan transfektant karışımını yavaşça dökerek CF10'a ekleyin. CF10'u çok dikkatli bir şekilde döndürün ve her katman için eşit hacim sağlayın.
  9. CF10'u 72-96 saat boyunca inkübatöre geri koyun.
    NOT: AAV vektörlerinin ne zaman hasat edileceğine karar vermek için 150 mm'lik monitör çanağını kontrol edin. Hücreler tam bir AAV yükü ile çok kolay bir şekilde ayrıldığında, hasat zamanı gelmiştir.

4. AAV vektörlerinin toplanması

  1. CF10'u kuvvetlice çalkalayarak transfeksiyondan 3-4 gün sonra virüsü hasat edin. Ortamı 250 mL'lik konik tüplere dökün ve virüsü 4 °C'de 20 dakika boyunca 4000 x g'da döndürün.
    NOT: Bu protokolde kullanılan AAV6 serotipi için, %80 AAV çoğunlukla peletteki hücresel materyale bağlı kalacaktır. Ve %20'lik AAV medyaya gizlendi. Bu oranlar diğer AAV serotipleri için farklılık gösterebilir.
  2. Arıtılmış süpernatanı 0,45 μm filtre ünitesi ile filtreleyin ve yağış için saklayın.
  3. CF10'u 500 mL DPBS 1x tampon ile durulayın ve 4000 x g'da 4 °C'de 20 dakika santrifüjleyin.
  4. Bir vakum sistemi ve aspirasyonlu bir pipet kullanarak süpernatanı atın. Saflaştırmaya kadar -80 ° C'de CF10 başına 20 mL AAV lizis tamponu ekleyin.
    NOT: Daha sonra AAV ekstraksiyonu için AAV lizatını 50 mL'lik bir konik tüpe aktarın.
  5. Filtrelenmiş süpernatanı çıkarın,% 8'lik bir nihai konsantrasyon için% 40 PEG-2.5 M NaCl çözeltisi ekleyin ve en az 3 saat veya gece boyunca bir orbital döndürücü üzerinde soğuk bir odada inkübe edin.
    NOT: 100 mL süpernatan için 25 mL %40 PEG-2.5 M NaCl çözeltisi ekleyin.
  6. Virüsü 4000 ° C'de 30 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyerek çökeltin.
    NOT: Karışımı santrifüjleme için 250 mL konik tüplere aktarın.
  7. Süpernatanı çıkarmak için aspirat edin ve peletleri askıya almak için 5-10 mL AAV HEPES yeniden süspansiyon tamponu ekleyin. Aşağı akış saflaştırmasına devam etmek için 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın veya -80 °C'de saklayın.

5. AAV ekstraksiyonu

  1. Virüs peletini 37 °C'lik bir su banyosunda 10-15 dakika çalkalayıcı ile çözdürün.
    NOT: AAV lizatını tamamen erimesi için girdaplayın.
  2. -80 °C %100 etanol banyosunda 20-30 dakika dondurun.
    NOT: Alternatif olarak, dondurma döngüsü kuru buzla çevrili soğuk bir %100 etanol kabı ile yapılabilir.
  3. 3-4 kez donma/çözülme yapın ve gerekirse arada girdap yapın.
    NOT: Bu döngü, dondurma adımında duraklatılabilir. AAV lizatını aşağı akış çalışmasına kadar -80 °C'de saklayın.
  4. AAV lizatını (adım 5.3'ten itibaren) ve yeniden askıya alınan AAV'yi (adım 4.7'den itibaren) 37 ° C'lik bir su banyosunda 10-15 dakika boyunca bir çalkalayıcı ve girdap ile çözün.
    NOT: Tamamen eridiğinden ve karıştırdığından emin olun.
  5. AAV lizatına Benzonaz nükleaz (250 birim / μL) ekleyin ve 50 birim / mL'lik bir nihai konsantrasyon için AAV'yi yeniden süspanse edin. Çözümü girdap.
  6. 37 °C'lik bir su banyosunda 30 dakika çalkalayarak inkübe edin.
    NOT: Çözünmesi, ısınması ve iyice karışması için zaman tanımak için bir su banyosunda% 10 sodyum deoksikolat alikotlarını çıkarın.
  7. %0,5'lik bir nihai konsantrasyon için %10 sodyum deoksikolat ekleyin ve 37 ° C'de bir çalkalayıcı ile 30 dakika inkübe edin.
    NOT: Hücrelerden AAV salınımını arttırmak için sodyum deoksikolat kullanıldı.
  8. Ham AAV çözeltisini 2 mL santrifüj tüplerine dağıtın ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüjleyin.
  9. Süpernatanı 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
    NOT: Süpernatanı aktarmak için 1 mL'lik bir pipet kullanın. Peletleri atın.
  10. Eşit miktarda kloroform ekleyin ve 1-2 dakika girdaplama yaparak AAV'yi çıkarın.
    NOT: Çözelti opak, beyaz, süt benzeri olmalıdır.
  11. Sütlü çözeltiyi 2 mL'lik santrifüj tüplerine aktarın ve eşit şekilde dağıtın. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüjleyin.
  12. Üst pembe tabakayı dikkatlice pipetleyin ve 50 mL'lik yeni bir konik tüpe aktarın.
    NOT: Kloroform/protein katmanlarını rahatsız etmeyin.
  13. Bir pipet kullanarak son hacmi ölçün. Ham AAV-PEG-Sülfat hacim tablosuna (Tablo 2) göre, uygun hacimlerde %50 (NH4)2 S04 ve %40 PEG çözeltisini karıştırın. 2 dakika boyunca girdap.
  14. Karışımı eşit şekilde dağıtmak için 2 mL santrifüj tüplerine aktarın. 4 °C'de 10 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüjleyin
  15. 22 G'lık bir iğne ve 3 mL'lik bir şırınga kullanarak alt tabakayı toplayın. AAV'yi 50 mL'lik bir konik tüpte toplayın ve daha sonra iyodiksanol gradyanları ultrasantrifüjlemesi için 4 ° C'de saklayın.

6. İodyiksanol gradyan ultrasantrifüjleme ile AAV saflaştırma

  1. Kullanılan ultrasantrifüj tüplerinin sayısına göre AAV'yi yüklemeden önce iyodiksanol gradyanlarını taze olarak hazırlayın (Tablo 3).
    NOT: Katmanları gözlemlemek için fenol kırmızısı kullanılmıştır.
  2. Her bir çözeltiyi, 16 G'lik uzun bir iğne ile tutturulmuş 10 mL'lik bir şırınga kullanarak yavaşça yuvarlak tepeli polipropilen ultrasantrifüj hızlı sızdırmaz bir tüpe yerleştirin. Baloncuklardan kaçının.
  3. 22 G'lik bir şırınga ile gradyanın üzerine dikkatlice 17 mL'ye kadar AAV çözeltisi ekleyin. Tüpü doldurmak için AAV diyaliz tamponu kullanın.
    NOT: Ultrasantrifüj tüpündeki duvara damla yükleyerek AAV çözeltisini ekleyin. Degrade katmanlarını rahatsız etmeyin.
  4. Ultrasantrifüj tüplerini elektrikli bir sızdırmazlık maddesi ile kapatın.
    NOT: Tüpleri ultrasantrifüje göndermeden önce ±0,2 g farkla dengeleyin.
  5. 4 °C'de bir Ti70 rotorunda 2 saat boyunca 350.000 x g'da santrifüjleyin.
  6. Tüpleri rotordan dikkatlice çıkarın ve ultrasantrifüj tüpleri rafına yerleştirin.
    NOT: Degradelerin bozulmadığından emin olun.
  7. Aşağıdaki adımları izleyerek AAV kesirlerini toplayın:
    1. Tüpü bir stand tutucu üzerinde sabitleyin.
    2. Ultrasantrifüj tüplerini 10 mL'lik bir şırıngaya bağlı 19 G'lık bir iğne ile %40-60'lık arayüzün biraz altına delin.
      NOT: İğnenin açıklığı yukarı bakacak şekilde %40 eğime bakacak şekilde olmalıdır.
    3. 16 G'lik bir iğne ile tüpün üstüne bir delik açın.
    4. Tüp başına 5 mL'ye kadar toplayın. Protein kontaminasyonunu %25-40 arayüzde toplamaktan kaçının.
    5. Her ultrasantrifüj tüpü için tekrarlayın.
      NOT: AAV fraksiyonlarını 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın.

7. İkinci tur iyodiksanol gradyanları ultrasantrifüjleme

NOT: Bu adım isteğe bağlıdır. Bu adım, daha yüksek kaliteli bir tam AAV kapsid için boş AAV oranını azaltmaktır.

  1. AAV'yi >1: 1'i AAV diyaliz tamponu ile seyreltin.
    NOT: Ultrasantrifüjlemenin ilk turundan toplanan AAV, %40 iyodiksanol tabakasındaydı. %30'luk iyodiksanol tabakasının üzerine yüklenebilmesi için en az %50 oranında seyreltilmesi gerekir.
  2. Her bir çözeltiyi (Tablo 4) 16 G'lik bir iğne kullanarak bir ultrasantrifüj tüpüne yerleştirin ve yavaşça 10 mL'lik bir şırınga takın. Baloncuklardan kaçının.
  3. 22 G'lik bir şırınga ile gradyanın üzerine dikkatlice 20 mL seyreltilmiş AAV çözeltisi ekleyin. Tüpü doldurmak için AAV diyaliz tamponu kullanın.
  4. 6.4 ile 6.7 arasındaki adımları tekrarlayın.

8. AAV diyalizi ve konsantrasyonu

  1. Yeni bir 18 G iğne ve 10 mL şırınga kullanarak AAV virüsünü diyaliz kasetine aktarın. Virüsü yavaşça kasete enjekte edin ve içindeki havayı çıkarın.
  2. AAV diyaliz tamponu içeren behere bir karıştırma çubuğu ekleyin ve bir karıştırma plakasına yerleştirin.
  3. Diyaliz kasetini bir şamandıra şamandırası ile diyaliz tamponuna koyun. 4 °C'de karıştırın. AAV diyaliz tamponunun 2-3 katını değiştirin.
    NOT: Kasetin yüzmesine ve arabellek değişimini gerçekleştirmesine izin vermek için yeterli arabellek kullanın. Beheri alüminyum folyo ile örtün.
  4. 18 G'lik bir iğne ile tutturulmuş 10 mL'lik bir şırınga kullanarak, virüsü kasetten bir santrifüj filtre ünitesine toplayın.
  5. 4,000 x g'da 4 ° C'de 15-30 dakika santrifüjleyin.
    NOT: AAV'yi AAV diyaliz tamponu ile 2-3 kez çalın. AAV'yi filtrenin üstünde kalan ~200 μL olana kadar konsantre edin.
  6. Konsantre AAV'yi filtre ünitesinden toplayın. Filtreyi başka bir 300 μL AAV diyaliz tamponu ile durulayın ve konsantre AAV'ye aktarın.
  7. 1 mL tüberkülin luer kayma şırıngası kullanarak virüsü 0.22 μm'lik bir şırınga filtresinden süzün. En az hacim kaybını sağlamak için, havayı filtreden 2-3 kez itmek için 10 mL şırıngayı kullanın.
  8. Saflaştırılmış AAV virüsünü titrasyon için geçici olarak 4 °C'de saklayın.
    NOT: Virüsü titre edin, alikotlayın ve 1 hafta içinde -80 °C'de saklayın.

9. AAV virüsü titrasyonu

NOT: Saflaştırılmış AAV'yi titre etmek için TaqMan kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) kullanıldı.

  1. AAV vektörlerini DNaz I ile muamele edin ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin, ardından 95 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
    NOT: 10 μL reaksiyona örnek olarak 2 μL AAV virüs örneği, 1 μL DNaz, 1 μL DNaz tamponu ve 6 μL H2Okullanılır. PCR tüplü bir termodöngüleyicide gerçekleştirilebilir.
  2. AAV ekleme bölgesini hedefleyen astar setlerini hazırlayın.
    NOT: Hedefler, AAV yapısındaki destekleyici, transgen ve raportör olabilir. Primerler Tablo 5'te listelenmiştir.
  3. DNA plazmid standartlarını (10, 1, 0.1, 0.01, 0.001 ve 0.0001 pg/μL) ve negatif bir kontrol (H2O) hazırlayın.
  4. Primerler de dahil olmak üzere qPCR ana karışımını üreticinin talimatlarına göre hazırlayın.
  5. Standartları ve numuneleri üç nüsha halinde bir PCR plakasına yerleştirin. qPCR karışımını standartlara ve numunelere ekleyin. Plakayı kapatın ve üreticinin talimatlarına göre qPCR reaksiyonunu gerçekleştirin.
    NOT: Reaksiyon koşulları malzemelere/reaktiflere ve alete bağlıdır. Hızlı ve konvansiyonel PCR döngüleri uygulanabilir.
  6. AAV virüs titresini hesaplayın.
    NOT: Bu protokoldeki numune konsantrasyonu, orijinal numunelerden 1/10 seyreltmedir.
  7. AAV virüsünü 1.5 mL'lik tüplerde alın ve bir aya kadar 4 ° C'de saklayın ve uzun süre -80 ° C'de saklayın.
    NOT: Depolama için donma/çözülme döngülerinden kaçının. İn vivo deneyler için kullanıldığında, iki kez alikottan fazla çözülme kullanmayın.

10. AAV'nin kalite kontrolü

NOT: AAV virüsleri, bir SDS-PAGE jeli kullanılarak SDS-PAGE gümüş lekesi ile saflık açısından karakterize edildi ve ticari olarak temin edilebilen bir boyama kiti kullanılarak boyandı.

  1. 3 x 109 vg AAV virüs örneğini Laemmli tamponu ile denatüre edin.
    NOT: Kontrol olarak bir referans AAV virüsü kullanın. AAV6-CMV-GFP referanslı tam kapsid kullanılır.
  2. Denatüre AAV'yi %4-20 gradyanlı bir SDS-PAGE jel üzerine yükleyin ve 50 dakika boyunca 180 V'ta çalıştırın.
  3. Jeli elektroforez plakasından çıkarın. Jeli, üreticinin talimatlarına göre gümüş bir boyama kiti ile boyayın.
  4. AAV kapsid proteinleri VP1, VP2 ve VP3'ü kontrol edin.
    NOT: Saf AAV virüsü yalnızca VP1, VP2 ve VP3 kapsid proteini içerir. Saf değilse, jel üzerinde diğer protein bantları görülebilir.
    NOT: Morfolojik bütünlüğü ve dolu/boş oranını değerlendirmek için negatif boyanmış rekombinant AAV viryonlarının transmisyon elektron mikroskobu (TEM) yapıldı.
  5. Bir cımbızla bir EM ızgarası alın ve ızgaranın parlak tarafı yukarı bakacak şekilde bankın üzerine koyun.
  6. 5 μL AAV örneğini ızgaraya pipetleyin ve buharlaşarak kurumasını bekleyin.
    NOT: Gerekirse AAV'yi seyreltin. 1012 vg/mL ortalama bir titredir. Izgaranın kuruması 30-60 dakika sürebilir.
  7. Izgarayı, ızgara üzerine yaklaşık 200 μL H2O ile damla damla pipetleyerek yıkayın.
  8. Izgaranın yanına dikey olarak bir kromatografi kağıdını yavaşça yerleştirerek fazla suyu alın.
  9. Izgaraya 5 μL% 2 Uranil Asetat çözeltisi pipetleyin. 5 dakika inkübe edin ve yukarıda belirtildiği gibi fitilleyin. Izgaranın kurumasını bekleyin.
  10. AAV parçacıklarını bir transmisyon elektron mikroskobu altında (50.000 kat büyütmede) görselleştirin. Viral genoma sahip viral kapsidler homojen beyaz altıgenler olarak görünürken, boş kapsidler beyaz kenarlı ancak koyu renkli bir merkeze sahip altıgenler olarak görünecektir.
  11. Tam vs'nin yaklaşık yüzdesini belirlemek için en az 100 parçacığı rastgele sayın. boş AAV parçacıkları.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu ayrıntılı adım adım protokolde, büyük ölçekli bir araştırma laboratuvarı ortamında CF10 ile yüksek titre ve yüksek kaliteli AAV virüsü yapmak için standartlaştırılmış bir platform gösterilmiştir. Geleneksel hücre kültürü kapları ile karşılaştırıldığında, CF10 büyük miktarlarda hücreyi kültürlemek ve AAV virüsü üretmek için uygun bir yol sağlar (Şekil 1). Optimal bir ortamdaki hücrelerin viral üretimi teşvik edip edemeyeceğini belirlemek için çeşitli kültür koşulları test edildi. 10 mM HEPES ve% 2 FBS ile desteklenmiş düşük glikoz DMEM, en iyi AAV üretimini gösterdi.

AAV'leri saflaştırmak için çeşitli protokoller test edildi. Çoğu prosedür düşük virüs verimine ve AAV kapsidlerinin safsızlığına sahiptir. Burada, hem hücre peletlerinden hem de kültür ortamından AAV'yi birleştiren revize edilmiş bir saflaştırma protokolü geliştirilmiştir (Şekil 2

figure-results-1

figure-results-2

figure-results-3

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, bir hücre fabrikası platformu (CF10) kullanılarak yüksek titreli ve yüksek kaliteli AAV vektörlerinin büyük ölçekli üretimi için teknik olarak gelişmiş bir protokol tanıtılmaktadır ve bu, geleneksel hücre kültürü çanağı yöntemlerine göre önemli bir gelişmeyi temsil etmektedir. Hücre fabrikalarının kullanılması, AAV virüslerinin üretimini daha verimli bir şekilde kolaylaştırarak, büyük hacimli hücrelerin yetiştirilme sürecini basitleştirir1. Ayrıca, özellikle 10 mM HEPES ve% 2 FBS ile desteklenmiş düşük glikoz DMEM ile kültür koşullarını optimize ederek, hücresel ortamın virüs verimindeki kritik rolünü gösteren önemli ölçüde artmış bir viral üretim doğrulandı.

Hem hücre peletlerinden hem de kültür ortamından AAV'yi birleştiren revize edilmiş saflaştırma protokolü, mevcut birçok protokolde görülen düşük virüs verimi ve safsızlık gibi yaygın bir sorunu ele almaktadır. Kloroform ekstraksiyonu ve sulu iki fazlı bölme adımları, çoğu protein kirleticisini etkili bir şekilde uzaklaştırır ve AAV, amonyum sülfat fazında çözünür kalır. Geleneksel gradyan ultrasantrifüjleme yöntemlerinin aksine, iyodiksanol gradyan ultrasantrifüjleme ile birleştirilmiş PEG / sulu iki fazlı bölmeleme kullanılarak AAV vektörlerinin hem verimindeki hem de saflığındaki iyileşme, PEG / sulu iki fazlı bölme ile gelişmiş başlangıç ayırma, iyodiksanol gradyan ultrasantrifüjleme ile rafine saflık ve kirletici birlikte saflaştırmada azalmaya bağlanabilir12. İlk olarak, ultrasantrifüjlemeden önce PEG/sulu iki fazlı bölmenin tanıtılması, AAV partiküllerinin hücresel kalıntılardan ve diğer kirleticilerden ilk ayrılmasını önemli ölçüde iyileştirir. Yüksek moleküler ağırlıklı bir polimer olan PEG, sulu bir çözelti ile karıştırıldığında iki farklı fazoluşturur 13. AAV vektörleri, tercihen bu fazlardan birine (genellikle PEG açısından zengin faz) bölünme eğilimine sahipken, birçok kirletici ve safsızlık diğer13'e bölünür. Bu seçici bölme, AAV partiküllerini etkili bir şekilde konsantre eder ve ultrasantrifüjlemeden önce bile safsızlıkların önemli bir bölümünü giderir, böylece verimi artırır ve ultrasantrifüjleme adımı13'e giren kirletici yükünü azaltır. İkincisi, iyodiksanol gradyan ultrasantrifüjleme, AAV vektörlerinin saflığını daha da rafine eder. İyonik olmayan, izo-ozmolar gradyan bir ortam olan İodiksanol, geleneksel CsCl gradyanlarına kıyasla daha yumuşak ve kontrollü bir ayırma sağlar14. Bu gradyanda, AAV parçacıkları, kaldırma kuvveti yoğunluğuna14 karşılık gelen gradyanda bir konuma göç eder. Daha da önemlisi, bu işlem, vektör kalitesinin çok önemli bir belirleyicisi olan dolu AAV kapsidlerini (genetik yükü içeren) boş kapsidlerden (genetik materyal eksikliği) ayırmada etkilidir. İodiksanolün izo-ozmolar doğası ayrıca AAV kapsidlerinin bütünlüğünü CsCl gibi hiperosmolar ajanlardan daha iyi korur ve potansiyel olarak daha yüksek bozulmamış, fonksiyonel vektörverimine yol açar 14. Son olarak, geleneksel ultrasantrifüjleme yöntemleri, özellikle CsCl gradyanlarını kullananlar, bazen AAV vektörlerine15 benzer yüzdürme yoğunluklarına sahip kirleticileri birlikte saflaştırabilir. Ön adım olarak PEG bölümlemeyi kullanarak, bu tür kirleticilerin yükü ultrasantrifüjlemeden önce büyük ölçüde azaltılır13. Kirletici yükündeki bu azalma, iyodiksanol gradyanının AAV vektörlerinin saflaştırılmasında daha etkili ve seçici bir şekilde çalışabileceği ve daha yüksek saflığa yol açabileceğianlamına gelir 15.

AAV vektörlerinin saflığı ve kalitesi, gümüş boyama ve TEM11 ile titizlikle değerlendirilir. AAV kapsid proteinleri VP1, VP2 ve VP3'e karşılık gelen ve %90'ı aşan saflıkta üç ana bandın gözlemlenmesi, bu AAV vektörlerinin in vivo kullanım için uygunluğunu gösterir. Dolu-boş kapsid oranını belirlemek için TEM analizi özellikle önemlidir, çünkü boş kapsidlerin yüksek bir oranı gen iletim verimliliğinin azalmasına ve potansiyel bağışıklık tepkilerine yol açabilir11. Bu kalite kontrolü, gerekli olmasına rağmen, prosedürel karmaşıklığı artırır ve ek teknik uzmanlık gerektirebilir.

Sonuç olarak, protokol, AAV vektörlerinin üretiminde, özellikle ölçeklenebilirlik ve saflık açısından önemli teknik ilerlemeler sunmaktadır. Bununla birlikte, saflaştırma prosesi ile ilişkili karmaşıklıklar ve özel ekipman ve uzmanlık ihtiyacı, belirli araştırma ortamlarında uygulanması için hala küçük bir sınırlama olabilir. Bu tekniklerin daha da iyileştirilmesi ve basitleştirilmesi, bu yaklaşımı gen terapisi araştırmaları alanında daha erişilebilir ve yaygın olarak uygulanabilir hale getirebilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda yapıldığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TZ deneyleri tasarladı. Deneyleri TZ, VD, SB ve JP gerçekleştirdi. TZ ve VD ile veri üretilmiş ve veriler analiz edilmiştir. TZ ve YX el yazmasını yazdı. TZ ve GG el yazmasını revize etti. Bu çalışma Pittsburgh UPMC Çocuk Hastanesi tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
293T/17 hücreATTCCRL-11268
0.5 M EDTAMilliporeSigma324506-100ml
1 mL Henke-Ject şırıngaFisher Scientific14-817-211
%10 çoğul F68 çözeltisiFisher Scientific24-040-032
10x Tris/Glisin/SDS TamponuBiorad1610732
1M HEPESFisher Scientific15-630-080
%2 Uranil Asetat ÇözeltisiElektron Mikroskobu Bilimleri22400-2
%4 – %20 Prekast Protein Jelleribiorad4561094
%40 PEG çözeltisiSigmaP1458-50ML
AAV6 referans tam kapsidlerCharles River LaboratoriesRS-AAV6-FL
Accutase Hücre Ayırma ÇözeltisiFisher ScientificA6964-100ML
BenzonazSigmaE1014-25KU
BioLite Hücre Kültürü İşlem Görmüş Tabaklar 150 mmFisher Scientific12-556-003
Santrifüj Filtre ÜnitesiMilliporeSigmaUFC905024
Corning  PES Şırınga FiltreleriFisher Scientific09-754-29
Diyaliz Kasetleri, 10 K MWCOFisher ScientificPI66810
Tek Kullanımlık PES Filtre Üniteleri 1 L 0.2 & mikro; mFisher ScientificFB12566506
Tek Kullanımlık PES Filtre Üniteleri 1 L 0.45 & mikro; mFisher ScientificFB12566507
Tek Kullanımlık PES Filtre Üniteleri 500 mL 0.2 & mikro; mFisher ScientificFB12566504
DMEM yüksek glikozFisher Scientific10-569-044
DMEM düşük glikozFisher Scientific10567022
DNaseNEBM0303S
DPBS 1xFisher Scientific14-190-250
Fetal Bovin Serumu (FBS)BiowestS1620
Formvar / Karbon 300 Mesh, CuElektron Mikroskobu BilimleriFCF300-Cu-50
gliserolSigmaG5516-1L
KClSigmaP9541-500G
LB agarSigmaL2897-250G
LB suyuFisher ScientificBP9732-500
MgCL2· 6H2OSigmaM9272-100G
NEB kararlı yetkin hücrelerNEBC3040H
Nest Biofactory 10 odacıklıMidSci771302
NucleoBond Xtra Maxi EFMacherey-Nagel740424
Opti-MEMFisher Scientific31-985-088
OptiPrep Yoğunluk Gradyan OrtamıMillipore SigmaD1556-250ml
pAAV-CMV-GFPAddgene105530
pAAV-DJHücre BioLabVPK-420-DJ
pAAV-RC6Hücre BioLabVPK-426
pAdDeltaF6Addgene112867
PEG 8000PromegaV3011
PEI MaxPolysciences, Inc49553-93-7
Pen-StrepFisher Scientific15-140-163
Fenol kırmızıMillipore Sigma1.07242.0100
Pierce Gümüş Leke KitiThermo Fisher Scientific24612
QuickSeal tüpFisher ScientificNC9144589
Sodyum KlorürSigma1162245000
sodyum deoksikolat Millipore SigmaD6750-100G
Taqman Hızlı Gelişmiş Master MixThermo Fisher Scientific4444557
Tipi 70 Ti Sabit Açılı Titanyum RotorBeckman Coulter337922
Western Blotting SubstratThermoFisher 32209

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Arjomandnejad, M., Dasgupta, I., Flotte, T. R., Keeler, A. M. Immunogenicity of recombinant adeno-associated virus (AAV) vectors for gene transfer. BioDrugs. 37 (3), 311-329 (2023).
  2. Liu, Y., Siriwon, N., A Rohrs, J., Wang, P. Generation of targeted adeno-associated virus (AAV) vectors for human gene therapy. Curr Pharm Des. 21 (22), 3248-3256 (2015).
  3. Bilal, A. S., et al. Optimization of large-scale Adeno-Associated Virus (AAV) production. Curr Protoc. 3 (5), e757(2023).
  4. Rashnonejad, A., Chermahini, G. A., Li, S., Ozkinay, F., Gao, G. Large-scale production of adeno-associated viral vector serotype-9 carrying the human survival motor neuron gene. Mol Biotechnol. 58, 30-36 (2016).
  5. Challis, R. C., et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nat Protoc. 14 (2), 379-414 (2019).
  6. Challis, R. C., et al. Publisher Correction: Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nat Protoc. 14 (8), 2597-2597 (2019).
  7. Mueller, C., Ratner, D., Zhong, L., Esteves-Sena, M., Gao, G. Production and discovery of novel recombinant adeno-associated viral vectors. Curr Protoc Microbiol. 26 (1), 14(2012).
  8. Guo, P., Wiersch, J., Xiao, X., Gittes, G. Simplified purification of AAV and delivery to the pancreas by intraductal administration. Methods Mol Biol. 1950, 373-387 (2019).
  9. Berns, K. I., Srivastava, A. Next generation of adeno-associated virus vectors for gene therapy for human liver diseases. Gastroenterol Clin North Am. 48 (2), 319-330 (2019).
  10. Khasa, H., Kilby, G., Chen, X., Wang, C. Analytical band centrifugation for the separation and quantification of empty and full AAV particles. Mol Ther Methods Clin Dev. 21, 585-591 (2021).
  11. Chen, H. Comparative observation of the recombinant adeno-associated virus 2 using transmission electron microscopy and atomic force microscopy. Microsc Microanal. 13 (5), 384-389 (2007).
  12. Burnham, B., et al. Analytical ultracentrifugation as an approach to characterize recombinant adeno-associated viral vectors. Hum Gene Ther Methods. 26 (6), 228-242 (2015).
  13. Kato, M., et al. In situ-formable, dynamic crosslinked poly (ethylene glycol) carrier for localized adeno-associated virus infection and reduced off-target effects. Commun Biol. 6 (1), 508(2023).
  14. Sena-Esteves, M., Gao, G. Enrichment of fully packaged virions in column-purified recombinant adeno-associated virus (rAAV) preparations by iodixanol gradient centrifugation followed by anion-exchange column chromatography. Cold Spring Harb Protoc. 2020 (2), 095638(2020).
  15. Matsumoto, M., Wangelin, J. R., Murphy, M. L. Purification of avian encephalomyelitis virus by ultracentrifugation in a nonlinear cesium chloride gradient. Avian Dis. 22 (3), 496-502 (1978).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

AAV VectorsCell Factory PlatformHigh Titer ProductionHEK293T CellsIodixanol GradientPolyethylene Glycol PurificationSDS PAGE AnalysisTransmission Electron MicroscopyViral PurityGene Therapy

İlgili makaleler