Yöntem makalesi

Tek Hücreli RNA Dizilimi için İnsan ve Fare Tümör Dokusu Örneklerinin Ayrışması

DOI:

10.3791/66766

⸱

16 Ağustos 2024

 ,  ,  ,  , 
1Krantz Family Center for Cancer Research, Department of Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Broad Institute of MIT and Harvard, 3Department of Medicine, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, tek hücreli RNA dizilimi için insan ve fare tümör örneklerini hızlı bir şekilde ayırma prosedürünü ana hatlarıyla belirtir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan tümör örnekleri, mikro çevreleri ve bağışıklık repertuarları hakkında bol miktarda bilgi içerir. İnsan doku örneklerinin canlı hücre süspansiyonlarına etkili bir şekilde ayrışması, tek hücreli RNA dizileme (scRNAseq) boru hattı için gerekli bir girdidir. Toplu RNA dizileme yaklaşımlarından farklı olarak, scRNAseq, tümör örneklerinde tek hücre düzeyinde transkripsiyonel heterojenliği çıkarmamızı sağlar. Son yıllarda bu yaklaşımın dahil edilmesi, bağışıklık ve tümör hücresel durumlarının tanımlanması ve immünoterapilere ve diğer tedavi türlerine klinik yanıtlarla ilişkili programlar gibi birçok keşfe yol açmıştır. Ayrıca, ayrışmış dokulara uygulanan tek hücreli teknolojiler, DNA barkodlu antikorlar (CITEseq) kullanılarak erişilebilir kromatin bölgeleri T ve B hücre reseptör repertuarını ve proteinlerin ekspresyonunu tanımlamak için kullanılabilir.

Ayrışmış numunenin canlılığı ve kalitesi, bu teknolojileri kullanırken kritik değişkenlerdir, çünkü bunlar, tek hücrelerin ortam RNA'sı ile çapraz kontaminasyonunu, verilerin kalitesini ve yorumlamayı önemli ölçüde etkileyebilir. Ayrıca, uzun ayrışma protokolleri, hassas hücre popülasyonlarının ortadan kaldırılmasına ve bir stres tepkisi gen imzasının yukarı regülasyonuna yol açabilir. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, birden fazla insan ve fare tümörü tipinde doğrulanmış hızlı bir evrensel ayrışma protokolü tasarladık. İşlem, mekanik ve enzimatik ayrışma ile başlar, ardından filtrasyon, kırmızı kan lizisi ve düşük hücre girdisine sahip numuneler (örneğin, iğne çekirdeği biyopsileri) için uygun olan canlı ölü zenginleştirme ile devam eder. Bu protokol, Jel Boncuk Emülsiyonlarının (GEM'ler) başarılı bir şekilde üretilmesi, barkodlama ve sıralama için çok önemli olan temiz ve canlı bir tek hücreli süspansiyon sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kanser araştırmalarındaki birçok ilerleme, kontrol noktası blokaj inhibitörleri olarak bilinen, bağışıklık ve tümör hücreleri üzerinde eksprese edilen inhibitör reseptörleri hedef alan ajanların geliştirilmesine ve FDA onayına yol açmış olsa da, tedavi direnci ve hasta yanıtını yönlendiren mekanizmaların belirlenmesi zorlu olmaya devam etmektedir1. Tümör heterojenliğini moleküler çeşitliliği ve tümör hücreleri ile immün mikroçevre arasındaki karmaşık etkileşim üzerinde karakterize etmenin karmaşık zorluğu, bu karmaşık ekosistemi tek hücre çözünürlüğünde incelemek için yeni yaklaşımlar gerektirmektedir. Tümörler ve mikro çevrelerindeki moleküler karmaşıklıkları anlamak, terapötik stratejileri ilerletmek ve kanser ilerlemesinin altında yatan karmaşık biyolojiyi deşifre etmek için çok önemlidir2. Tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-dizilimi), karmaşık tümör örnekleri içindeki tek tek hücrelerin yüksek çözünürlüklü analizini sağladığı için giderek daha popüler hale gelmiştir 3,4.

Genetik, epigenetik ve fenotipik çeşitlilikleri kapsayan tümör heterojenliği, kanser biyolojisinin karmaşıklıklarını ortaya çıkarmada bir zorluk teşkil etmektedir5. Toplu RNA dizilemenin geleneksel yöntemleri, tümörlerde bulunan heterojen hücre popülasyonlarının benzersiz ekspresyon profillerini ve fenotiplerini gizleme eğilimindedir, çünkü bu yöntemler tüm hücre popülasyonları boyunca sinyallerin ortalamasını alır4. Buna karşılık, scRNA-seq, bireysel hücre tiplerinin diseksiyonuna izin vererek, aksi takdirde gözden kaçan çeşitli gen ekspresyonu, baskı modelleri ve hücresel durumları ortaya çıkarır 4,6. scRNA-seq'in öncülü, tek tek hücrelerin genetik ve moleküler imzalarını çözme kapasitesinde yatmaktadır ve yeni kanser terapötiklerini keşfetmede büyük umut vaat etmektedir7.

Araştırmacılar, tümör hücrelerinin ve çevredeki stromal ve bağışıklık hücrelerinin gen ekspresyon profillerini deşifre ederek, yeni terapötik hedefleri belirleyebilir ve bireysel hastalara göre uyarlanmış hassas genetik tıp stratejileri geliştirebilirler6. Ayrıca, tümör mikroçevresi içindeki bağışıklık repertuarının incelenmesi, tümör hücreleri ve bağışıklık efektörleri arasındaki etkileşime dair önemli bilgiler sağlar ve immünoterapötik müdahalelerin önünü açar3. Klinik numunelerde scRNAseq kullanımındaki ilerlemelere rağmen, işleme adımları sırasındaki çeşitli zorluklar hücrenin RNA bütünlüğüne, canlılığına ve üretilen verilerin kalitesine zarar verebilir. Ayrıca, düşük hücre canlılığına sahip dokunun işlenmesi, tek tek hücrelerin kapsüllenmesi sırasında oluşan damlacıklardaki ortam RNA seviyelerini artırabilir, bu da çapraz kontaminasyona ve hücre tiplerinin yanlış açıklanmasına neden olurken, 37 °C'de gerçekleştirilen uzun ayrışma protokolleri, çoklu hücre tiplerinde bir stres yanıtı gen imzasının yukarı regülasyonuna yol açabilir 8,9, 10.

Bu protokolde özetlenen aşamalı prosedür (Şekil 1A), tümörlerin hızlı mekanik ve enzimatik ayrışması ile başlar, ardından her bir tümör örneğinin canlılığına bağlı olarak filtrasyon ve ölü hücrelerin uzaklaştırılması ile devam eder. Şu anda, bu prosedür melanom11, kolorektal12, baş ve boyun skuamöz hücreli karsinom13, pankreas ve akciğer (yayınlanmamış veriler) tümör örneklerinde doğrulanmıştır. Bu teknikler, aşağı akış analizleri için çok önemli olan yüksek kaliteli canlı hücre süspansiyonlarının üretilmesini sağlar14. Özellikle, sentezlenmiş RNA'dan yoksun kırmızı kan hücrelerinin çıkarılması, numuneyi saflaştırmak için zorunlu hale gelir15. Hücre sayımlarının müteakip değerlendirilmesi ve ölü hücrelerin ortadan kaldırılması, başarılı 10x Genomics Jel boncuklu Emülsiyon (GEM) üretimi, barkodlama için bir ön koşul görevi görür ve hassas popülasyonların (örneğin, nötrofiller ve epitel hücreleri) dışlanmasını tehlikeye atmadan transkriptlerin ve dizilenmiş hücrelerin geri kazanımını artırır16. Bu adımlar, tümör örneklerinde 9,10 tek hücreli çözünürlük analizinin potansiyelini ortaya çıkarmada, yenilikçi terapötik müdahaleleri yönlendirmek için gerekli yeni gen ekspresyon profillerini ve bağışıklık imzalarını ortaya çıkarmada ve yeni tümör güvenlik açıklarını belirlemede esastır.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, insan dokusu örneklemesi ile ilgili tüm kurumsal kılavuzlara uygundur. Hastalardan bilgilendirilmiş onam alındı ve tanımlanabilir örnek veriler anonim hale getirildi. Örnekler ameliyathanede toplanır, bir RPMI, salin veya PBS çözeltisine yerleştirilir ve araştırmada kullanılmadan önce patoloji bölümü tarafından kanserli olduğu doğrulanır. Belirtilen durumlar dışında tüm adımlar 4 °C'de veya buz üzerinde gerçekleştirilmelidir. İnsan dokusunu işlerken bir biyogüvenlik başlığı içinde çalışın. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler ve aletlerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

1. Numunenin alınması

  1. Bir ortam tüpünde katı bir tümör örneği alın ve buzun üzerine yerleştirin.
    1. Ameliyathane personeline, numunenin dehidrasyonunu önlemek için dokuyu tamamen batırmak için yeterli RPMI, salin veya PBS içeren bir tüpte numuneyi taşıması talimatını verin.
      NOT: Numunenin kurutulmadığından emin olmak önemlidir, çünkü bu canlılığı azaltacaktır.
  2. Tüm santrifüjleri 4 °C'ye soğutun ve termal karıştırıcıyı 37 °C'ye getirin.
  3. Hazırlanmış insan veya fare tümör ayrışma enzimlerini (Malzeme Tablosu) çıkarın, 37 ° C'lik termal karıştırıcıda çözdürün ve çözüldükten sonra buza geçin.
  4. 20 mL'lik bir rpmi alikotu alın.
  5. İlgili numune bilgilerini kaydedin (örn. Hasta Kimliği, tanımlayıcı kaldırma, numune türü).
  6. Tüpü birkaç kez ters çevirerek ve tüm numune materyalinin aktarıldığından emin olmak için içindekileri tabağa dökerek numuneyi 60 mm'lik bir doku kültürü kabına (buz üzerine yerleştirilmiş) aktarın. Numune varışta medya olarak teslim edilmediyse, tabağa taze RPMI ortamı ekleyin.
    1. Numune parçalanmışsa, numuneyi içeren tüpü 450 × g'da, 4 °C'de 5 dakika döndürün, süpernatanı atın, numuneyi 420 μL RPM'de yeniden süspanse edin ve bölüm 2'ye geçin.

2. Mekanik ve enzimatik sindirim

  1. 60 mm'lik numune kabından 420 μL ortamı 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin. Medyada asılı kalan tüm örnek parçalarını dahil etmeye çalışın.
  2. Numune dokusunu 60 mm'lik tabaktan cımbız kullanarak ortam içeren 1,5 mL'lik tüpe aktarın. Numuneyi tüpün içinde temiz bir makasla kesin, böylece parçalar maksimum 2-3 mm çapında olur.
  3. Üretici spesifikasyonlarına (Malzeme Tablosu) göre hazırlanan sindirim enzimlerini numuneye aşağıdaki hacimlerde ekleyin: insan numuneleri için 42 μL Enzim H (spesifik olmayan proteazlar), murin numuneleri için Enzim D (spesifik olmayan proteazlar), 21 μL enzim R (spesifik olmayan proteazlar) ve 5 μL enzim A (nükleaz).
  4. Çanaktan 420 μL daha veya tüp üzerindeki 1 mL işaretine kadar başka bir ortam ekleyin. 420 μL ortamı aşmayın.
  5. Tüpü 5 saniye boyunca vorteksleyin ve yan tarafına dikey olarak yerleştirilmiş bir termal karıştırıcıya yerleştirin (Şekil 1B). 37 °C'de, 450 rpm'de 15 dakika inkübe edin.
    NOT: Kuluçka sırasında, GEM üretimi için gerekli olan tüm 10x Genomik materyallerini çıkarın, çünkü bunların oda sıcaklığına dengelenmesi 30 dakika sürer

3. Örnek filtreleme

  1. Yeni bir 15 mL konik tüpün üzerine 50 μm'lik bir hücre filtresi yerleştirin ve 1 mL taze RPMI ortamını tüpe geçirerek filtreyi hazırlayın.
  2. Sindirimden sonra, 1.000 μL'lik düşük tutma özelliğine sahip geniş pipet ucu kullanarak numuneyi 15 mL'lik tüpe aktarın. 1,5 mL'lik tüpü 1 mL taze besiyeri ile yıkayın ve tüm numune materyalinin filtreden geçtiğinden emin olmak için besiyerini filtreye aktarın.
  3. 1 mL'lik bir plastik şırınga alın ve sadece pistonu çıkarın (şırınganın geri kalanını atın). Şırınga pistonunun arkasını kullanarak, numuneyi bir bükülme hareketiyle filtre üzerinde öğütün ve itin.
  4. Dokudan ayrılmış olabilecek hücreleri toplamak için filtreyi 5 mL ortam ve numuneyi içeren tabaktan kalan ortamla (bölüm 1) yıkayın.
  5. Yeni bir 15 mL konik tüpün üzerine 30 μm'lik bir hücre filtresi yerleştirin, filtreyi 1 mL ortamla doldurun ve ayrışmış numuneyi içeren tüpün içeriğini filtreden aktarın.
    NOT: Bu adım, numuneyi 10x Genomics mikroakışkan çipleri kullanarak çalıştırırken tıkanabilecek veya ıslatma hatasına neden olabilecek büyük kalıntıları temizleyecektir.

4. Kırmızı kan hücresi lizisi

  1. Numuneyi 450 × g'da, 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Peleti rahatsız etmemeye dikkat ederek medyayı aspire edin.
  2. Kırmızı kan hücrelerini (RBC'ler) çıkarmak ve kullanılan hacmi kaydetmek için ACK Lizis tamponunda yeniden süspansiyon yapın. Hacim, pelet boyutuna ve peletteki RBC'lerin kapsamına bağlı olacaktır.
    NOT: Yeterli ACK Lizis tamponu eklendiğinde yeniden askıya alınan ACK numune çözeltisi renksiz olmalıdır, çünkü bu, kırmızı kan hücrelerini numuneden temizleyecektir.
  3. Numune tüpünü 450 × g'da, 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin.
  4. Santrifüjlemeden sonra numune peletinde görünür kırmızı renk kalmayana kadar 4.2-4.3 adımlarını gerektiği kadar tekrarlayın (Şekil 2). Bu adımda kullanılan ekstra hacimlerde ACK Lysis tamponunu kaydedin.
  5. Sayıma hazırlanırken numune peletini taze ortamda yeniden süspanse edin.

5. Hücre sayımı

  1. 1,5 mL'lik bir tüpe 10 μL tripan mavisi yerleştirin. Ayrışmış hücreleri nazikçe karıştırın, 10 μL numune alın ve (1:1) tripan mavisi ile karıştırın. Bir hemositometrenin her iki tarafına 10 μL yükleyin ve hücreleri sayın.
  2. Sayımdan sonra hücre konsantrasyonunu, toplam canlı hücre sayısını, canlılık yüzdesini ve son ortam hacmini kaydedin.
  3. Optimum 10x Genomik çalışması için hücre sayısının 700 ila 1.200 hücre/μL (7 ×10 5- 1.2 × 106/mL) arasında olduğundan emin olun.
    1. Numune çok konsantreyse, ortamla seyreltin ve yeniden sayın.
    2. Numune çok seyreltilmişse, numuneyi 450 × g'da, 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin ve daha az hacimli bir ortamda yeniden süspanse edin.
    3. Hücre canlılığı% 80'in altındaysa, ölü hücreleri çıkarmak için canlı ölü bir prosedür uygulayın.
    4. Bir milyondan az hücre varsa, bölüm 6'ya bakın.
    5. Bir milyondan fazla hücre varsa ve canlılık %10>sa, bölüm 6'ya bakın.
    6. Bir milyondan fazla hücre varsa ve canlılık %10
    7. Hücre canlılığı %80'in üzerindeyse, işlenmiş hücreleri buz üzerinde tutun ve üreticinin talimatlarına göre hemen GEM üretimine geçin.

6. Ölü hücre temizleme - Kit 1

NOT: Ölü hücre temizleme reaktiflerini kullanırken bir biyogüvenlik başlığı içinde çalışın, çünkü bunlar kolayca kontamine olabilir.

  1. Numuneyi 450 × g'da, 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
  2. İzolasyon ortamını 15 mL'lik konik bir tüpte hazırlayın ve oda sıcaklığında tutun: 9,8 mL PBS, 10 μL CaCl2 ve 200 μL ısıyla inaktive edilmiş FCS (bir Biyogüvenlik başlığına eklenir).
  3. Santrifüjlemeden sonra, ortamı peletten aspire edin ve izolasyon ortamının 1 mL'sinde yeniden süspanse edin.
  4. Tüpü tekrar 450 × g'da, 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve peleti 100 μL izolasyon ortamında yeniden süspanse edin.
  5. İzolasyon ortamındaki 100 μL numuneyi 0.2 mL PCR şerit tüpünün bir kuyucuğuna aktarın.
  6. Bir biyogüvenlik başlığında, izolasyon ortamında 100 μL numune içeren kuyucuğa 10 μL Annexin V Kokteyli ve 10 μL Biotin Selection Kokteyli ekleyin. Pipetle karıştırın, solüsyonu karıştırın ve oda sıcaklığında 4 dakika bekletin.
  7. 4 dakika sonra, dekstran kaplı manyetik parçacıkları 30 saniye boyunca vorteksleyin. Numuneye 20 μL boncuk ve 60 μL izolasyon ortamı ekleyin (toplam hacim 200 μL). Canlılık %40'tan düşükse, toplam hacmi 200 μL'de tutarak izolasyon ortamının hacmini (40 μL'ye kadar) ayarlarken boncuk miktarını 40 μL'ye kadar ölçeklendirin. Pipet karıştırın ve çözeltiyi oda sıcaklığında 3 dakika bekletin.
  8. Şerit tüpünü oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 10x Genomics Manyetik Ayırıcıya (yüksek ayarda) yerleştirin.
  9. Boncukları bozmadan sıvıyı şerit tüpünden yeni bir 1.5 mL lo-bind mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Şerit boruyu mıknatıstan çıkarmayın.
  10. Numuneyi içeren 1,5 mL'lik tüpü 450 × g'da, 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve peleti, bölüm 5'te açıklandığı gibi pelet boyutuna ve hücre sayısına bağlı olarak uygun bir hacimde RPMI ortamında yeniden süspanse edin. Canlılık %80'in altında kalırsa ölü hücre çıkarma prosedürünü tekrarlayın (Şekil 3 ve Şekil 4).
    NOT: Kalsiyum klorür, kapsülleme işlemine ve ters transkripsiyon (RT) adımına müdahale edeceğinden, aşağı akış GEM üretimi için izolasyon ortamındaki hücreleri yeniden askıya almayın.
  11. Hücre canlılığı %80'in üzerindeyse işlenmiş hücreleri buz üzerinde tutun ve üreticinin talimatlarına göre hemen GEM üretimine geçin.

7. Ölü hücre temizleme - Kit 2

NOT: Kit reaktiflerini kullanırken bir biyogüvenlik başlığı içinde çalışın.

  1. Mikro boncukları ve 20x Bağlayıcı Tampon stok çözeltisini bir biyogüvenlik başlığının içine yerleştirin.
  2. Numune süspansiyonunu 450 × g, 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
  3. 19 mL DNAse-, RNAse içermeyen damıtılmış suya pipetlenmiş 20x Bağlayıcı Tampon stok çözeltisinin 1 mL'sini kullanarak steril koşullar altında 1x tampon çözeltisi hazırlayın.
  4. Santrifüjleme tamamlandıktan sonra, süpernatanı aspire edin, mikro boncukları ekleyin, numuneyi nazikçe karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
    1. Hücre sayısı 107 veya daha az olduğunda, 100 μL mikro boncuk ekleyin.
    2. Toplam 107 hücreden daha yüksek sayımlar için, mikro boncukları 107 canlı hücre başına 100 μL'lik bir nihai konsantrasyon için ayarlayın.
  5. İnkübasyon sırasında, bir MACS pozitif seçim sütunu, MACS çoklu stand ve ilgili manyetik ayırıcıyı edinin. Manyetik kuvvet güçlü olduğundan ve ölü hücre giderme verimliliğini etkileyebileceğinden, ayırıcının çoklu stand üzerinde hizalandığından ve standın yakınında başka bir metal veya manyetik nesne bulunmadığından emin olun. Sütunu, kanatları dışarı bakacak şekilde bir ayırıcı tutucuya sıkıca yerleştirin.
  6. Numune inkübasyonundan sonra, toplam yeniden süspansiyon hacmi 500 μL'den azsa, toplam hacim 500 μL olana kadar 1x Bağlayıcı Tampon ekleyin.
  7. Kolonun altına 15 mL'lik konik bir tüp yerleştirin ve kolonu 3 mL 1x Bağlama Tamponu ile astarlayın.
  8. Hücre numunesi toplama için konik tüpü yeni bir 15 mL konik ile değiştirin ve numuneyi kolona ekleyerek kolondan tamamen akmasına izin verin.
  9. Sütunu 4 x 3 mL 1x Bağlayıcı Tampon yıkayın, önceki yıkama tamamen kolondan aktıktan sonra her seferinde yalnızca bir yıkama ekleyin.
  10. Dördüncü yıkamadan sonra, izole edilmiş hücreleri içeren konik tüpü 450 × g, 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin. Sütunu ve kalan 1x Bağlama Arabelleğini atın.
  11. Numune çözeltisini pelet boyutuna bağlı olarak uygun miktarda RPMI ortamında yeniden süspanse edin ve bölüm 5'te açıklanan yöntemi kullanarak izole edilen hücreleri sayın (Şekil 3 ve Şekil 5).
    1. Canlılık %80'in altında kalırsa ve toplam hücre sayısı 106 veya daha azsa, bölüm 6'yı tekrarlayın.
    2. Hücre canlılığı %80'in üzerindeyse, işlenmiş hücreleri buz üzerinde tutun ve üreticinin talimatlarına göre hemen GEM üretimine geçin.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RPMI'de askıya alınmış bir melanom biyopsisi alındı ve hemen buz üzerine yerleştirildi. Numune, 420 μL RPMI ve sindirim enzimleri içeren 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarıldı, makas kullanılarak küçük parçalar halinde kıyıldı ve 37 °C'lik dikey olarak yerleştirilmiş bir termal karıştırıcıda 15 dakika boyunca müteakip enzimatik sindirime tabi tutuldu (Şekil 1). Sindirimi takiben, numune 50 μm steril tek kullanımlık bir filtreden süzüldü ve filtre, hücre verimini artırmak için taze RPMI ile yıkandı (Şekil 1). Yıkamalardan sonra kalan doku parçaları, istenmeyen biyolojik materyaller (örneğin yağ dokusu) olduğu için atıldı.

Elde edilen hücre peletinin rengine bağlı olarak, kırmızı kan hücrelerini çıkarmak için 15 mL ACK lizis tamponu gerekliydi (Şekil 2). 3 mL RPMI ortamında yeniden süspansiyonun ardından, toplam hücre sayısı 1 × 106 / mL idi ve canlılık% <80 idi (Şekil 3A). Bu, 10x Genomik yüklemeye geçmeden önce Kit 1 (protokol bölüm 6) kullanılarak bir canlı hücre zenginleştirme döngüsünün gerekli olduğunu gösterdi (Şekil 4). Bu numunenin 1 milyondan fazla hücresi varsa ve canlılığı 'dan az olsaydı, bunun yerine Ölü Hücre Çıkarma - Kit 2 kullanılırdı (Şekil 5). Numune izolasyon ortamı ile yıkandı ve 10 μL Annexin V ve biyotin seçim kokteyli eklendi, ardından protokol bölüm 6'da açıklandığı gibi 20 μL manyetik boncuk ve 60 μL izolasyon ortamı eklendi (Şekil 4). Bu işlemden sonra, numune 500 μL besiyerinde yeniden süspanse edildi ve yeniden sayıldı. Canlı hücre sayısı 4.9 × 105

figure-results-1

figure-results-2

figure-results-3

figure-results-4

figure-results-5

figure-results-6

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, 10x Genomik mikroakışkan sistemi kullanılarak scRNA dizilimi için insan veya fare tümör örneklerinin tek hücreli bir süspansiyona ayrışmasını tanımlar. Genellikle nadir kanserlerden gelen veya murin tümörleri için devam eden klinik deneylerin veya uzun deneylerin bir parçası olan dokuların işlenmesinde, numunenin tüm adımlar arasında en iyi ve dikkatli bir şekilde korunması gerekir. Doğal hücresel RNA profillerini korumak ve bozulmayı önlemek için tüm adımlar buz üzerinde veya 4 °C'de hızlı bir şekilde gerçekleştirilmelidir, çünkü oda sıcaklığında uzun süre çalışmak transkriptomik kaliteyietkileyecektir 17,18.

Özellikle küçük iğne çekirdeği biyopsileri işlenirken, prosedür boyunca hücre kaybının minimum düzeyde olmasını sağlamak için birkaç adım atılmalıdır17. Tümör örneğinin tüm parçalarının sindirime dahil edildiğinden emin olmak, numuneden çıkarılan daha fazla hücrenin gelecekteki 10x Genomik kapsülleme ve dizilemeyi ve analiz için geri kazanılan toplam hücre ve transkript sayısını iyileştireceği için en başarılı sonuca yol açacaktır. Numune geldiği tüpe sıkışırsa, ortam eklenebilir, tüp ters çevrilebilir ve işlenmek üzere tabağa aktarılabilir. İlk numune parçalanmışsa veya çözelti bulanıksa, bu da süspansiyon halindeki hücrelerin varlığını gösterirse, numuneyi geldiği çözelti ile santrifüjleyerek ve sindirim için ortam hacminde yeniden süspanse ederek tüm numunenin enzimatik sindirim için toplandığından emin olun (protokol bölüm 1).

Aspirasyon yaparken, peletin prosedür boyunca rahatsız edilmediğinden emin olun. Aspirasyon sırasında ekstra hacim bırakın, bu da bir P200 pipeti ile çıkarılabilir. Pelet bozulursa, hacim tüpe geri dağıtılabilir ve yeniden santrifüjlenebilir. ACK Lizisi sonrası veya canlı ölü çıkarma sonrası, numune 25 μL kadar düşük hacimlerde olabilir. Bu nedenle, hücreleri içeren herhangi bir süpernatantı kaybetmemek çok önemlidir. İlgili hücrelerin enzimatik sindirime maruz kalmasını sağlamak için uygun mekanik sindirim şarttır. Daha büyük numune boyutları 9,19,20 için uygun enzimler ve termal karıştırıcı kullanılarak daha uzun enzimatik sindirim gerekebilir. Spesifik enzim isimleri tescilli olsa da, üretici enzim A'yı bir nükleaz ve enzimler H, D ve R'yi spesifik olmayan proteazlar olarak not eder. Tümör örneğinin mümkün olduğunca çok filtreden geçirilmesi, mümkün olan en yüksek hücre verimini sağlamak için hayati önem taşır. Başarılı filtreleme, filtrenin içinde hiç görünür örnek bulunmamasına veya yalnızca küçük bir görünür numuneye sahip olmamasına neden olur. Numunenin bazı parçaları, yüksek miktarda yağ veya bağ dokusu içeriyorsa filtrelenemeyebilir. Filtrenin üst kısmında numunenin görünür parçaları varsa, filtrenin üst kısmını daha fazla ortamla yıkarken, büküm hareketini kullanarak tüm numuneyi öğütmek ve itmek için şırınga pistonunun arkasını kullanmaya devam edin.

Kırmızı kan hücresi lizis basamağının başarısı, numune sayım ve canlılık için hemositometreye yüklendikten sonra numunenin mikroskop altında görüntülenmesiyle belirlenir15,21. Kırmızı kan hücrelerini temizlemek için numuneye yeterli ACK eklenirse, pelette kırmızı kan hücresi veya görünür kızarıklık olmaz. Numunede kırmızı kan hücreleri görünüyorsa, ek ACK eklenmeli ve numune 450 × g'da, 4 ° C'de 5 dakika boyunca yeniden santrifüjlenmelidir. Bir kez yapıldıktan sonra, süpernatan aspire edilmelidir ve hücre peleti, görselleştirme ve sayma için RPMI ortamında yeniden süspanse edilebilir.

Optimal bir 10x Genomik çalışmasını sağlamak için, hücre sayısı 700 ila 1.200 hücre / μL arasında olmalıdır (7 × 105- 1.2 × 106 / mL). Yüksek bir konsantrasyon, damlacık oluşumu sırasında çift oranı (bir damlacıkta iki hücre) artıracaktır. Sayım çok yüksekse, numuneye uygun miktarda besiyeri eklenebilir ve yeniden sayım için bir hemositometreye yeniden yüklenebilir. Konsantrasyon çok düşükse, numune 450 × g'da, 4 ° C'de 5 dakika boyunca yeniden santrifüjlenebilir, süpernatant aspire edilir ve yeniden sayılmadan önce daha düşük bir hacimde yeniden süspanse edilebilir. Canlı hücre canlılığı %80'in üzerindeyse numune 10x Genomik için yüklenmeye hazırdır (Şekil 3).

Numunenin canlılığı %80'in altındaysa, 10x Genomik yükleme16'dan önce canlı ölü bir prosedür gereklidir. Bir canlı ölü çıkarma turu canlılık yüzdesini %80'in üzerine çıkarmadıysa, toplamda 1 × 105'ten fazla hücre varsa başka bir tur yapılmalıdır. Daha yüksek canlılık, sonraki 10x Genomik protokolünde tıkanmaları önleyecek, hücre iyileşmesini artıracak ve ortam RNA'sının varlığını azaltacaktır. Kit 1'in protokolü, daha düşük hücre sayımına sahip daha küçük doku örneklerini hızlı bir şekilde ayırmak için optimize edilmiş ve minyatürleştirilmiştir. Reaktif hacminin azalması ve inkübasyon sürelerinin kısalması, hücre verimini artırır ve çeşitli hücreler üzerinde stres yanıtı gen imzasını (FOS, JUN ve JUNB) önler 9,22. Canlı hücreleri zenginleştirmek için alternatif yöntemler arasında boyama ve sıralama bulunur. Bununla birlikte, bu, hücre veriminin azalmasına, hücresel durumları etkileyebilecek uzun süreli boyama inkübasyonuna (örneğin, aCD3e antikorları T hücrelerini aktive eder) ve sıralama sırasında makinenin hücreler üzerindeki basıncının neden olduğu streseneden olur 9,22. Şekil 6'da gösterilen örnek, 10X Genomik Gen Ekspresyonu (GEX) diziliminden sonra oluşturulan bir UMAP'yi ve oluşturulan hücre barkodlarının daha sonra CellRanger aracılığıyla birleştirilen ve hizalanan FASTQ dosyalarına dönüştürülmesini göstermektedir. Müteakip dizileme sonuçları ve canlı-ölü çıkarma karşılaştırmaları çizildi, bu da canlı ölü çıkarmadan önce ve sonra bir numunedeki hücre popülasyonlarını ve gelişmiş dizileme kalitesini gösterdi. Şekil 6'da gösterilen akciğer örneği, %70'in altında olduğu için okuma oranıyla ilgili bir sorun olduğunu gösterdi. Bu uyarı, parçalanmış veya ölü hücrelerden oluşan bir popülasyondaki yüksek ortam RNA'sı nedeniyle üretildi. Bununla birlikte, ölü hücrelerin uzaklaştırılmasından sonra, bu hata artık mevcut değildi vehücrelerde daha yüksek bir fraksiyon okuma yüzdesi ile sonuçlandı 23.

Tek hücreli RNA dizilimi, kanser immünolojisi ve kanser araştırmaları alanını önemli ölçüde ilerleten maliyetli ve güvencesiz bir süreçtir. Belirli hücre tiplerinde ifade edilen ve bastırılan genlerin, hücresel durumların ve programların daha fazla sorgulanmasına izin vererek, kanserlerin davranışı ve heterojenliği hakkında daha fazla bilgi verir. Optimal olmayan veya düşük canlılığa sahip dokunun, tümör biyolojisinin gerçekliğinden uzaklaşan eserler yaratabilecek düşük kaliteli veriler üretme olasılığı daha yüksektir ve bu da uygun tümör ayrışmasının ve numune hazırlamanın kritik önemini vurgular.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yüksek Lisans Bristol Myers-Squibb, Istari Oncology'den fon aldı ve Galvazine Therapeutics için danışmanlık yaptı.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Adelson Tıbbi Araştırma Vakfı (AMRF), Melanom Araştırma Birliği (MRA) ve U54CA224068 tarafından desteklenmiştir. Şekil 1, Şekil 4 ve Şekil 5 BioRender.com ile oluşturulmuştur.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1x PBSCorning21-040-CV
10 mL serolojik pipetCorning357551
1000 & mu; L düşük tutma noktalı pipet uçlarıRainin30389213
1000 μ L düşük tutma özelliğine sahip geniş pipet uçlarıRainin30389218
1000 & mu; L pipet uçlarıRainin30389212
10x Manyetik Ayırıcı10x Genomics120250
15 mL konik tüplerCorning430052
2 mL aspirasyonlu pipetCorning357558
20 &; mu; L düşük tutma özelliğine sahip pipet uçlarıRainin30389226
20 & mu; L pipet uçlarıRainin30389225
200 μ L düşük tutma noktalı pipet uçlarıRainin30389240
200 μ L pipet uçlarıRainin30389239
50 mL Polipropilen Konik BoruFalcon352098
60 x 15 mm Doku Kültürü KabıFalcon353004
ACK Lysing TamponuGibcoA10492-1
BD 1 mL şırıngaBecton, Dickinson and Company3090659
Parlak Çizgili HemositometreHausser Scientific551660
Kalsiyum Klorür ÇözeltisiSigma Aldrich2115-100ML
Hücre Korucu 10x GenomicsN/Ahttps://www.10xgenomics.com/support/software/cell-ranger/latest
TC20 hücre sayacıBio-Rad1450015
CellTrics 30&mu için hücre sayma slaytları; m steril tek kullanımlık filtrelerSysmex04-004-2326
CellTrics 50μ m steril tek kullanımlık filtrelerSysmex04-004-2327
Ölü Hücre Temizleme Kiti Miltenyi Biotec130-090-101-20 > C; kit 2
Diseksiyon Forseps, İnce UçluVWR82027-386
DNA LoBind Mikrosantrifüj tüpleri, 1.5 mLEppendorf22431021
EasySepTM Ölü Hücre Kaldırma
(Ek V) Kit		STEMCELL Teknolojileri178994 &°C'de saklayın; C; Kit 1
Eppendorf santrifüj 5425REppendorf5406000640
Eppendorf santrifüj 5910REppendorf2231000657
Eppendorf Easypet 3 Elektronik Pipet kontrol cihazıEppendorfEP4430000018
Eppendorf Thermomixer F1.5 Model 5384EppendorfEP5384000012
FBSGibco26140-0794 & derecede saklayın; C, Biyolojik başlıkta kullanın
Alman Paslanmaz MakasGüzel Bilim Araçları14568-12
Leica Dmi1 MikroskopLeica Microsystems454793
LS SütunuMiltenyi Biotec130-042-401
MACS MultistandMiltenyi Biotec130-042-303
Pipet-Lite LTS Pipet L-1000XLS+Rainin17014382
Pipet-Lite LTS Pipet L-200XLS+Rainin17014391
Pipet-Lite LTS Pipet L-20XLS+Rainin17014392
Quadro MACS MıknatısMiltenyi Biotec130-091-051
RPMI Orta 1640 (1x)Gibco21870-0764 > C
TempAssure 0.2 mL PCR 8 Tüp şeritleriUSA Scientific1402-4700
Tripan mavisi leke %0.4Thermo Fisher ScientificT10282
Tümör Ayrışma Kiti, İnsanMiltenyi Biotec130-095-929-20 &°C'de saklayın; C, enzimleri kit talimatlarına göre hazırlayın:
Liyofilize Enzim H şişesini 3 mL RPMI 1640
içinde sulandırın Liyofilize Enzim R şişesini 2.7 mL RPMI 1640
içinde sulandırın Liyofilize Enzim A şişesini kit ile birlikte verilen 1 mL Tampon A'da sulandırın.
Tümör Ayrışma Kiti, FareMiltenyi Biotec130-096-730-20 &°C'de saklayın; C, enzimleri kit talimatlarına göre hazırlayın:
Liyofilize Enzim D şişesini 3 mL RPMI 1640
içinde sulandırın Liyofilize Enzim R şişesini 2.7 mL RPMI 1640 < br / > liyofilize Enzim A şişesini kit ile birlikte verilen 1 mL Tampon A'da yeniden oluşturun.
UltraPure Damıtılmış SuInvitrogen10977-0154 &°C'de saklayın; Ç

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liu, C., Yang, M., Zhang, D., Chen, M., Zhu, D. Clinical cancer immunotherapy: Current progress and prospects. Front Immunol. 13, 961805(2022).
  2. Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Commun Signal. 18 (1), 59(2020).
  3. Sun, G., et al. Single-cell RNA sequencing in cancer: Applications, advances, and emerging challenges. Mol Ther Oncolytics. 21, 183-206 (2021).
  4. Huang, D., et al. Advances in single-cell RNA sequencing and its applications in cancer research. J Hematol Oncol. 16 (1), 98(2023).
  5. Ottaiano, A., et al. From chaos to opportunity: decoding cancer heterogeneity for enhanced treatment strategies. Biology. 12 (9), 1183(2023).
  6. Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Exp Mol Med. 50 (8), 1-14 (2018).
  7. Erfanian, N., et al. Deep learning applications in single-cell genomics and transcriptomics data analysis. Biomed Pharmacother. 165, 115077(2023).
  8. Jovic, D., et al. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview. Clin Transl Med. 12 (3), e694(2022).
  9. Burja, B., et al. An optimized tissue dissociation protocol for single-cell RNA sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies. Front Cell Dev Biol. 10, 872688(2022).
  10. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130(2020).
  11. Sade-Feldman, M., et al. Defining T cell states associated with response to checkpoint immunotherapy in melanoma. Cell. 176 (1-2), 404(2019).
  12. Pelka, K., et al. Spatially organized multicellular immune hubs in human colorectal cancer. Cell. 184 (18), 4734-4752 (2021).
  13. Bill, R., et al. CXCL9:SPP1 macrophage polarity identifies a network of cellular programs that control human cancers. Science. 381 (6657), 515-524 (2023).
  14. Al'Khafaji, A. M., et al. High-throughput RNA isoform sequencing using programmed cDNA concatenation. Nat Biotechnol. 42 (4), 582-586 (2024).
  15. Xing, Y., et al. The effect of cell isolation methods on the human transcriptome profiling and microbial transcripts of peripheral blood. Mol Biol Rep. 48 (4), 3059-3068 (2021).
  16. Ma, F., Hernandez, G. E., Romay, M., Iruela-Arispe, M. L. Single-cell RNA sequencing to study vascular diversity and function. Curr Opin Hematol. 28 (3), 221-229 (2021).
  17. Fan, X. -J., et al. Impact of cold ischemic time and freeze-thaw cycles on RNA, DNA and protein quality in colorectal cancer tissues biobanking. J Cancer. 10 (20), 4978-4988 (2019).
  18. LoCoco, P. M., et al. Reliable approaches to extract high-integrity RNA from skin and other pertinent tissues used in pain research. Pain Rep. 5 (2), e818(2020).
  19. Montanari, M., et al. Automated-mechanical procedure compared to gentle enzymatic tissue dissociation in cell function studies. Biomolecules. 12 (5), 701(2022).
  20. Yosefov-Levi, O., Tornovsky, S., Parnas, O. Pancreatic tissue dissection to isolate viable single cells. J Vis Exp. (195), (2023).
  21. Janssen, P., et al. The effect of background noise and its removal on the analysis of single-cell expression data. Genome Biol. 24 (1), 140(2023).
  22. Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single cell RNA-seq artifacts: A molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
  23. Sutermaster, B. A., Darling, E. M. Considerations for high-yield, high-throughput cell enrichment: fluorescence versus magnetic sorting. Sci Rep. 9 (1), 227(2019).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

T m r Dokusunun DissosiyasyonuH cre S spansiyonu Haz rlamansan T m r rnekleriFare T m r rnekleriMekanik DissosiyasyonEnzimatik DissosiyasyonEritrosit LizisiCanl l H cre Zenginle tirmeHemositometre H cre Say m

İlgili makaleler