Yöntem makalesi

Hipotalamik Mikroglia'nın Manyetik Olarak Aktive Edilmiş Hücre Ayıklama ile Yeni Perfüze Edilmiş Yetişkin Fare Beyninden İzolasyonu

2.1K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/66769

⸱

6 Eylül 2024

 ,  ,  , 
1University of Bordeaux, INSERM, Neurocentre Magendie

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Manyetik olarak aktive edilmiş hücre sınıflandırması (MACS) kullanarak fare hipotalamusundan (veya eşdeğer küçük beyin yapılarından) mikroglial hücreleri nispeten kısa sürede izole etmek için bir protokol açıklıyoruz. MACS ile sıralanan hipotalamik mikroglia, ex vivo analiz için kullanılabilir ve in vitro testler yapmak üzere kaplanabilir.

Özet

Beynin yerleşik makrofajları olan mikroglia, beyin homeostazını korumak için gereklidir. Gelişim sırasında nöronal devreleri şekillendirirler, çevrelerini enkaz veya ölü hücreler için incelerler ve diğer birçok işlevin yanı sıra beyindeki enfeksiyon ve yaralanmalara yanıt verirler. Bununla birlikte, nörogelişim ve sinaptik plastisite ve patofizyolojideki önemli rolleri tam olarak tanımlanmamıştır ve bu da daha fazla araştırmaya duyulan ihtiyacı vurgulamaktadır. Mikroglia'nın bu süreçlerdeki rolünü daha kapsamlı bir şekilde anlamak için, mikrogliaları izole etmemiz ve bunları genetik, metabolik ve fonksiyonel olarak karakterize etmemiz gerekir. Bununla birlikte, mikroglia'nın yetişkin farelerden, özellikle küçük beyin yapılarından izolasyonu, toplam beyin hücrelerinin küçük bir yüzdesini temsil ettikleri ve izole edilmiş mikroglia'nın verimi genellikle çok düşük olduğu için zordur. Burada, CD11b + mikro boncuklar kullanılarak mikroglia'nın manyetik izolasyonu, mikroglial hücreleri yeni perfüze edilmiş bir yetişkin fare beyninin hipotalamusundan ayırmamıza izin verir. Mevcut yöntem, hücre canlılığını korurken kısa sürede nispeten yüksek saflık ve verim elde etmemizi sağlar.

Giriş

Mikroglia, toplam nöral hücrelerin %5-20'sine karşılık gelir ve yolk kesesi içindeki eritromiyeloid progenitörlerden köken alan ve gelişmekte olan beyni embriyonik gün E9.5 1,2 civarında kolonize etmeye başlayan tek glial hücrelerdir. Kemik iliği kaynaklı hücrelerden bağımsız olarak yavaş yavaş kendini yenileme yeteneğine sahip uzun ömürlü hücrelerdir3. En yüksek dinamik hücrelerden bazıları olarak, bağlamsal ve çevresel ipuçlarına yanıt olarak çeşitli fenotipler elde edebilirler 2,4. Aktivitelerini modüle edebilen sinyaller arasında, merkezi sinir sistemi (CNS) hasarı, nöronal aktivite ve besinler en güçlü olanıdır. Artan bir araştırma grubu, mikroglia'nın yaralanma, nörodejeneratif hastalıklar ve obezitede önemli rolünü göstermiştir 2,5,6. Bununla birlikte, mikroglia'nın hem fizyolojik süreçlerde hem de patofizyolojideki kesin rolü daha fazla çalışma gerektirir. Bu nedenle, farklı koşullar altında transkripsiyonel, metabolik ve fonksiyonel karakterizasyonları büyük önem taşır ve izolasyonlarını gerektirir, çünkü in situ çalışmalar DNA, RNA ve protein lokalizasyonu ve kalitatif karşılaştırmaların yanı sıra mikroglia'nın morfolojik karakterizasyonu için uygundur.

Mikroglia izolasyonu için tanımlanmış çeşitli teknikler vardır, bunlar arasında Percoll gradyan yöntemi7, akış-sitometri hücre sıralaması (FACS)8 ve manyetik olarak aktive edilmiş hücre sıralaması (MACS) vardır. Uygun yöntemin seçimi, çalışmanın amaçlarına ve sonraki uygulamalar için gereken saflık seviyesine bağlıdır. Saf mikroglia'nın yetişkin fare beyninden, özellikle hipotalamus gibi küçük beyin yapılarından izolasyonu, sınırlı sayıda mikroglial hücre nedeniyle zordur. Miltenyi teknolojisi kullanılarak hipotalamusun otomatik olarak nazikçe ayrıştırılması, nazikMACS Octo Dissociator ile aynı anda sekiz numuneye kadar ilerleyebilme yeteneği ile kısa sürede nispeten yüksek bir mikroglia veriminin saflaştırılmasına olanak tanır.

Doku homojenizasyonunu, MACS kolon tabanlı teknoloji ve süper manyetik nano boyutlu CD11b+ boncuklar kullanılarak mikroglia saflaştırması takip eder. Bu nedenle, tüm numuneler tam olarak aynı şekilde işlenir ve bozulmamış CD11b+ hücreleri elde edilir. CD11b'nin sadece mikroglia'da bulunmadığı, aynı zamanda makrofajlar ve monositler9 dahil olmak üzere diğer miyeloid soy hücrelerinde de eksprese edildiği dikkat çekicidir. Bunu sınırlamak için, hipotalamus ekstraksiyonundan önce buz gibi soğuk tuzlu su çözeltisi ile beyin perfüzyonu (protokol adımı 2.6'ya bakınız), çoğu miyeloid hücrenin ortadan kaldırılmasını sağlar ve yerleşik makrofajların veya kan damarlarına yapışmış olanların potansiyel olarak küçük bir kısmını bırakır. Sağlıklı ve kararlı bir durum CNS'nin yerleşik makrofajları ve monositleri, toplam beyin bağışıklık hücrelerinin küçük bir yüzdesini oluşturur (sırasıyla ~%10 ve %<2)10,11. Bu nedenle, beyin hücreleri CD11b + boncukları ile sıralandığında, hem mikroglia hem de makrofajlar izole edilebilir, ancak büyük çoğunluğu mikrogliadır.

Mikroglia'nın son verimi ve canlılıklarının korunması, ilgilenilen belirli beyin bölgelerini analiz etme avantajı ile in vitro testlerin yanı sıra ex vivo olarak da gerçekleştirmemize izin verir. En son kanıtlar, mikroglia popülasyonunun oldukça heterojen olduğunu, bölgeye özgü gen ekspresyonunu ve morfolojik özellikleri ve işlevi temsil ettiğini göstermiştir 2,12,13. Bu nedenle, mevcut protokol yetişkin mikroglialarını bölgeye özgü bir şekilde izole etmeyi ve analiz etmeyi amaçlamaktadır. Gerçekten de, yetişkin hipotalamik mikroglia'nın genetik, transkripsiyonel ve translasyonel profillerini RT-qPCR ve RNA dizileme gibi yöntemler kullanarak ve ayrıca in vitro fonksiyonel analiz yaparak karakterize edebiliriz.

Protokol

Açıklanan tüm hayvan deneyleri, Avrupa Birliği tavsiyelerine (2013/63/EU) sıkı bir şekilde uygun olarak yürütülmüş ve Bordeaux Üniversitesi yerel etik komitesi (CEEA50) ve Fransa Yüksek Öğrenim, Araştırma ve Yenilik Bakanlığı tarafından onaylanmıştır (onaylanmış proje NTS-FR-619193 v.1, 23-12-2022'nin teknik olmayan özeti).

Aşağıdaki protokol, ortalama yaşı 2-4 ay olan yetişkin C57BL / 6 farelerinde gerçekleştirilir. Bununla birlikte, CNS'nin bağışıklık hücresi manzarasının değişebileceği ve yerleşik makrofajların ve monositlerin yüzdesinin artabileceği (örneğin yaşlanma ve nörodejenerasyonda) dikkate alınarak tüm farelerde, yaşlarda ve koşullarda gerçekleştirilebilir.

1. Çözeltilerin hazırlanması

NOT: Aşağıdaki hacimler ve çözeltiler kesinlikle Cd11b+ hücrelerinin izolasyonuna atıfta bulunulmuştur.

  1. Numune sayısına bağlı olarak gereken toplam D-PBS /% 0.5 Sığır Serum Albümini (BSA) hacmini belirleyin. Çözeltiyi, piyasada bulunan Kalsiyum ve Magnezyum ve BSA tozu içeren D-PBS'yi kullanarak hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakın).
  2. Etiketli ayrışma tüplerini (C-Tüpleri) hazırlayın ve her birini yetişkin beyin dokusu ayrışma kitinde sağlanan 1.900 μL tampon Z ile doldurun ( Malzeme Tablosuna bakınız). Enzimleri çözün ve aşağıdaki adımlarda gerekli olan tüm tamponlarla birlikte buz üzerinde tutun.
  3. Perfüzyon (adım 2.6) için gerekli olan uygun hacimde 1x Fosfat Tamponlu Salin (PBS) ( Malzeme Tablosuna bakınız) hazırlayın ve buz üzerine yerleştirin. Her hayvan için 10 mL artı fazla% 10 hesaplayın.
  4. RT-qPCR analizi için, numune başına qPCR tamponu hazırlayın: RNA'yı saflaştırmak için ticari olarak mevcut bir kit kullanarak 2,5 μL tiyokliserol + 250 μL lizis tamponu (Malzeme Tablosuna bakınız).
  5. Protein miktar tayini için, fosfataz inhibitör kokteylini ve proteaz inhibitör kokteylini bir memeli ekstraksiyon tamponunda 1:100 oranında seyrelterek lizis tamponu hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız).
  6. Reaktif Oksijen Türlerinin (ROS) tespiti ve fagositoz testi için, piyasada bulunan 10x HBSS'den 1x HBSS hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakınız). Ardından, 1x HBSS'ye %0,2 BSA ekleyerek FACS tamponunu hazırlayın.

2. Beynin çıkarılması

  1. Hayvanı 20 mg / kg Ksilazin dozu ile sakinleştirin; Daha sonra, fareyi aşırı dozda 400 mg / kg pentobarbital ile ötenazi yapın ve sırtüstü bir diseksiyon tepsisine yerleştirin.
    NOT: Hayvanı ötenazi yapmak için diğer anestezik kombinasyonlar da işe yarayabilir.
  2. 10 mL'lik bir şırıngayı 10 mL buz gibi soğuk 1x PBS ile doldurun ve bir kelebek 21 G iğnesine takın.
  3. Fare tamamen uyuşturulduktan sonra (yanıt eksikliğini sağlamak için pençeleri sıkıştırarak doğrulayın), solunum durdu ve kalp fibrilasyona girdi, cildi forseps ile örtün ve göğüs boşluğunu makasla açın, son kaburgalar ve sternum seviyesinde.
  4. Kalbi ortaya çıkarmak için göğüs kafesinin kenarları boyunca göğüs kafesinin üst kısmına doğru derin bir kesim yapmak için makası kullanın.
  5. 21 G iğnesini sol ventrikülün distal kısmına yerleştirin (iğnenin yaklaşık 1 / 3'ünün ventrikülün içinde olduğundan emin olun). Makası kullanarak hemen sağ atriyumdan bir kesi yapın.
  6. Beyni dolaşımdaki bağışıklık hücrelerinden temizlemek için 10 mL buz gibi soğuk 1x PBS demleyin.
    NOT: Temiz ve iyi perfüze edildiğinden emin olmak için beyni görsel olarak kontrol edin.
  7. Fare kafasını kesin, beyni dikkatlice çıkarın ve buzla doldurulmuş ve alüminyum folyo ile kaplanmış bir Petri kabına yerleştirin.
    NOT: Petri kabı ve folyo beyin parçalarının görülmesine yardımcı olur. Metabolik aktiviteleri sınırlamak için beyin parçalarının doğranması sırasında serin bir ortamın korunmasında fayda vardır.
  8. Hipotalamusu forseps kullanarak izole edin ve jiletle küçük parçalar halinde kesin.
    1. Hipotalamusu tanımlamak ve incelemek için, beyni baş aşağı yerleştirin, böylece korteks ventral olur ve hipotalamus üst yüzeyde dorsal olarak görünür hale gelir. Üçüncü ventrikülün her iki yanında beynin alt kısmında bulunan hipotalamusu kavisli forseps kullanarak ayırın. Yetişkin C57BL / 6 farelerden alınan hipotalamusun ortalama ağırlığı 15 mg'dır.
      NOT: Beyin parçaları mümkün olduğunca küçük olmalıdır (<0,5 mm). Küçük parçalara ayırmak, daha iyi bir ayrışma ve daha yüksek hücre verimi sağladığı için kritik bir adımdır.
  9. Hipotalamus parçalarını, daha önce 1.900 μL Tampon Z ile doldurulmuş ayrışma tüplerinde (C-Tüpleri) toplayın (adım 1.2).
    NOT: Tahlilleri gerçekleştirmek için yeterli olan iyi bir mikroglial hücre verimine sahip olmak için, tüp başına en az iki (protein ölçümü için) veya üç (qPCR ve RNAseq için) hipotalami havuzlayın.

3. Doku ayrışması

NOT: Tüm adımlar buz üzerinde gerçekleştirilmelidir. Hücre süspansiyonunu herhangi bir adımda girdap yapmayın; sadece 1.000 μL'lik bir pipetle dikkatlice karıştırın.

  1. Enzim karışımı 2'yi Tablo 1'e göre hazırlayın (tüm tüpler için toplam hacim + fazla% 10 hesaplanarak). Her bir C-tüpüne, karışım 1'de bulunan 50 μL enzim (bakınız Tablo 1) ve 30 μL enzim karışımı 2 ekleyin. Tüm enzimler yetişkin beyin dokusu ayrışma kitinde bulunur ( Materyal Tablosuna bakınız).
  2. C-tüplerini kapatın ve üreticinin talimatlarına göre ısıtma braketleri ile ayırıcıya baş aşağı yerleştirin. Programı 37C_ABDK_02 çalıştırın.
  3. Üzerlerinde 70 μm süzgeçler bulunan 15 mL'lik geçmeli tüpler hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakın). Süzgeci 2 mL D-PBS ile ıslatın.
  4. Ayrışma/sindirim programı bittiğinde, C-Tüpünü süzgecin üzerine boşaltın ve hücre filtrasyonunu artırarak ve doku homojenatının filtreye yapışmasını azaltarak hücre kaybını azaltmak için 200 μL'lik bir uçla çizin.
  5. Tüpü 2 x 5 mL D-PBS ile yıkayın, yıkamaları süzgecin üzerine boşaltın ve yıkamalar arasında 200 μL'lik bir uçla çizin.
  6. 300 × g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı tamamen aspire edin. Hücre peletini Tablo 1'e göre uygun hacimde soğuk D-PBS ile dikkatlice yeniden süspanse edin.
  7. Hemen 450 μL yoğunluk gradyan reaktifi (Kalıntı Giderme Solüsyonu, Malzeme Tablosuna bakınız) ile dikkatlice karıştırın ve 2 mL soğuk D-PBS ile çok nazikçe kaplayın (bkz. Tablo 1).
    NOT: Farklı yoğunluk gradyan katmanlarını elde etmek için, D-PBS, 1 mL'lik bir pipetle bir seferde 1 mL olmak üzere, mümkün olan en az "rahatsızlık" ile yavaşça damla damla üst üste bindirilmelidir.
  8. Yavaş hızlanma ve yavaş frenleme ile 4 ° C'de 10 dakika boyunca 3.000 × g'da santrifüjleyin (9 doluya eşdeğerse, 5 kullanın).
  9. Üç faz oluşur. En üstteki iki fazı tamamen aspire edin ve atın. Üçüncü alt fazı aspire etmediğinizden emin olun.
  10. 1800 μL soğuk D-PBS ile doldurun ve tüpü 3 kez nazikçe ters çevirin.
  11. 1.000 × g'da 4 ° C'de 10 dakika boyunca tam hızlanma ve tam fren ile santrifüjleyin ve süpernatanı tamamen aspire edin. 2 mL D-PBS/BSA ile yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek hücre peletini dikkatlice yeniden süspanse edin.

4. CD11b + hücrelerinin manyetik izolasyonu

  1. 300 × g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı tamamen aspire edin. Hücre peletini 90 μL tampon D-PBS/BSA'da dikkatlice yeniden süspanse edin.
  2. 10 μL CD11b-mikroboncuk karışımı ekleyin ve pipetle iyice karıştırın.
  3. Buz üzerinde değil, buzdolabında 2-8 °C'de 15 dakika inkübe edin; hücreleri 1 mL D-PBS/BSA ekleyerek yıkayın ve 300 × g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin; Süpernatanı tamamen aspire edin. 500 μL D-PBS/BSA içinde dikkatlice yeniden süspanse edin.
  4. Ekrandaki talimatları izleyerek ayırıcı üzerindeki POSSEL2 programını başlatın. Küçük sütunları ( Malzeme Tablosuna bakın) manyetik alana yerleştirin.
    NOT: Beklenen ortalama hücre sayısına göre manyetik hücre sıralama için küçük veya büyük sütunlar seçilebilir. Küçük sütunlar 1 × 107 etiketli hücrelere ve büyük sütunlar 1 × 108'e kadar kapasiteye sahiptir. Hücreleri hipotalamus gibi küçük yapılardan izole ederken, küçük sütunlar tavsiye edilir. Büyük sütunlar kullanıldığında reaktiflerin hacimleri farklıdır (üreticinin talimatlarına bakın).
  5. Sütunları ( Malzeme Tablosuna bakın) 500 μL D-PBS/BSA ile ıslatın. Daha fazla analiz için hücrelerin negatif fraksiyonu (CD11b-) gerekiyorsa, sütunların altına bir toplama plakası yerleştirin ve ardından sütunlara hücre süspansiyonu uygulayın.
  6. Kolona bir seferde 500 μL D-PBS/BSA ekleyerek üç yıkama adımı gerçekleştirin ve her seferinde tamponun kolondan geçmesini bekleyin.
    NOT: Kolonun üst kısmının kurumasını önlemek önemlidir, bu nedenle tüm tamponun geçmesini beklememeniz önerilir.
  7. CD11b-fraksiyonunun toplam atık suyunu toplama plakasının kuyularından 15 mililitrelik tüplere aktarın.
  8. Kolonu separatörden çıkarın, 5 mL'lik bir tüpe yerleştirin ve kolona 1 mL D-PBS/BSA pipetleyin.
  9. Kolonla birlikte verilen pistonu sıkıca uygulayarak manyetik olarak etiketlenmiş hücre fraksiyonunu hemen yıkayın.
  10. Sonunda, CD11b + hücrelerini bir hematitometre veya başka bir yöntemle sayın; Hipotalamus başına ~ 15.000 hücre bekleyin.
  11. Hücre süspansiyonunu 300 × g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.

5. Analizler

  1. RT-qPCR analizi için, hücre peletlerini qPCR tamponu ile yeniden süspanse edin (hazırlık için bkz. adım 1.3) ve tüpleri mRNA ekstraksiyonuna kadar - 80 °C'de saklayın. Toplam RNA'yı izole edin, ardından MIQE yönergelerini izleyerek işleyin ve analiz edin14. Son olarak, cDNA'yı sentezleyin ve bir RT-PCR cihazı kullanarak qPCR gerçekleştirin. Kullanılan ticari olarak mevcut tüm kitler için Malzeme Tablosuna bakın.
  2. Protein miktar tayini için, BSA'yı ortadan kaldırmak için hücre peletlerini D-PBS (BSA olmadan) ile en az 2 kez yıkayın. Daha sonra, hücre peletlerini 20 μL lizis tamponu ile iki hipotalamiden yeniden süspanse edin. Bir protein tahlil kiti ile protein miktar tayinine devam edin (Malzeme Tablosuna bakınız).
    NOT: Serin/treonin kinaz aktivite testini gerçekleştirmek için proteinleri ölçmek için üreticinin talimatlarını15 takip ettik.
  3. Mikroglial hücrelerde Reaktif Oksijen Türlerinin (ROS) tespiti için peleti 1x HBSS'de yeniden süspanse edin. Hücreleri, Akış Sitometrisi Testi için kitin üreticisinin protokolünü izleyerek tedavi edin ( Malzeme Tablosuna bakın). Daha sonra, tedavi edilen hücreleri 200 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin (hazırlık için bkz. adım 1.5) ve oksidatif olarak stresli hücreleri tespit etmek için FACS gerçekleştirin.
  4. Fagositoz tahlili için, D-PBS / BSA'da sıralanan hücreleri floresan lateks boncuklarla ( Malzeme Tablosuna bakınız) 30 dakika inkübe edin. Boncuk sayısını hücre başına ortalama 4 boncuk olacak şekilde ayarlayın. Daha sonra 4 ° C'de 7 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin, 200 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin ve FACS ile floresan emisyonunu okuyun (λex 575 nm; λem 610 nm).

Sonuçlar

Nihai verimin değerlendirilmesi, saflık seviyesine ve izole edilen hücrelerin miktarına dayanır ve RT-qPCR, hücre sayımı ve protein miktar tayini ile belirlenebilir. Hipotalamustan izole edilen manyetik hücrelerin saflığı, RT-qPCR ile CD11b, C1qa, Gad1 ve GFAP'nin gen ekspresyon analizi ile doğrulandı (Şekil 1). CD11b ve C1qa ağırlıklı olarak kararlı bir durumda mikroglia tarafından eksprese edilir, CNS16 ve Gad1 ve GFAP sırasıyla nöronal ve astrositik bir belirteç olarak hizmet eder. Bir hipotalamustan alınan toplam cDNA 55 ila 98 ng arasında değişmektedir. Sadece pozitif fraksiyonun CD11b ve C1qa ekspresyonu sergilemesi dikkat çekicidir, bu da negatif fraksiyonda herhangi bir potansiyel mikroglial hücre kaybının olmadığını gösterir. Primerler Tablo 2'de verilmiştir.

Ayrıca, nöronal ve astrositik belirteçlerin küçük seviyeleri, izole edilen hücrelerin büyük çoğunluğunun mikroglia olmasını sağlar, çünkü yerleşik makrofajlar ve monositler, sağlıklı bir beynin toplam bağışıklık hücresi manzarasının yalnızca %10'unu oluşturur 10,11. Bu sonuçlar, manyetik seçilimin etkinliğini kanıtlar ve yeni sıralanmış hipotalamik mikroglial hücrelerde ilgilenilen tüm genlerin ekspresyon seviyelerini değerlendirmek için RT-qPCR uygulamasının yolunu açar. Benzer şekilde, transkriptomlarının kapsamlı bir görünümüne sahip olmak için hipotalamik olarak sıralanmış mikroglia üzerinde bir RNAseq analizi yapılabilir.

İzole edilen hücrelerin miktarı hücre sayımı ile belirlendi ve hipotalamus başına ~ 15.000 hücre olduğu bulundu (protokol adımı 4.10'da belirtilmiştir). Ek olarak, sıralanmış mikrogliadaki protein konsantrasyonu ölçüldü ve iki havuzlanmış hipotalamiden izole edilen CD11b + hücrelerinde ortalama 0.5 μg / μL konsantrasyon ortaya çıktı (Şekil 2). Bu bilgi, minimum protein eşiğine bağlı olarak farklı tahlillerin yapılmasına izin verir. Ayrıca, daha fazla hipotalami bir araya getirilerek, potansiyel analizlerin kapsamını genişleterek daha yüksek bir konsantrasyon elde edilebilir. Hipotalamik mikrogliadan ekstrakte edilen proteinler, AlphaLISA immünolojik testleri ve kinaz aktivite deneyleri dahil olmak üzere çeşitli teknikleri kolaylaştırır.

Ayrıca, açıklanan protokol, araştırmacıların hem fizyolojik hem de patolojik bağlamlarda mikroglial aktivitenin ve hipotalamustaki rollerinin araştırılmasını sağlayan birkaç ex vivo analiz yapmalarına izin verir. ROS üretiminin nicelleştirilmesi, mikroglial immün yanıtın çok önemli bir yönünü temsil eder17. Bu nedenle, ayırma işleminden sonra mikroglia, oksidasyon üzerine artan bir floresan sinyali sergileyerek canlı hücrelerde ROS'un saptanmasına izin veren ticari olarak temin edilebilen reaktiflerle tedavi edilebilir. Üç havuzlanmış hipotalamiden manyetik olarak izole edilen mikroglia, Şekil 3A'da gösterildiği gibi ROCS ile ROS'u tespit etmek için yeterlidir, ancak sonuçlarımız, analiz ettiğimiz koşullar arasında hücre ROS üretiminin oldukça yüksek bir değişkenliğini göstermektedir. Yukarıda bahsedilen ticari kit ile (Malzeme Tablosuna

figure-results-1

figure-results-2

figure-results-3

figure-results-4

Tartışma

Mevcut protokol, Manyetik Aktive Hücre Sıralama ile yeni perfüze edilmiş yetişkin fare beyninden hipotalamik mikroglia izolasyonunu sunmaktadır. Yukarıda sunulan sonuçlar, izole edilmiş hücrelerin saflığını ve canlılığını ve ayrıca bu yöntemin, örneğin fagositik aktivite ve ROS üretim ölçümü yoluyla mikroglia'yı ex vivo işlevsel olarak karakterize etmek için etkinliğini doğrulamaktadır. Belirli bir hücre popülasyonunun izolasyonu için klasik yöntemler mikroglial hücreler için de kullanılabilir. Yoğunluk gradyan fraksiyonlama, farklı hücrelerin ve parçacıklarının boyutlarına ve/veya yoğunluklarına göre ayrılması için iyi bilinen bir yöntemdir. Bu teknik, primer mikroglia izolasyonu ve kültürü için uygulanabilir. Bununla birlikte, yetişkin mikroglia'nın saflaştırılması, floresanla aktive edilen veya immünomanyetik hücre sınıflandırması kullanılarak izole edilen beyin hücrelerinin daha fazla sınıflandırılmasını gerektirir.

Spesifik olarak, FACS, hücreleri etiketlemek ve onları büyüklükleri ve metabolik durumları gibi yüzey belirteçlerinin ötesine geçen çok sayıda değişkene göre ayırt etmek için floresan etiketli biyokimyasal antikorlara dayanır. Bununla birlikte, hücre saflaştırma işlemi daha yavaş olabilir ve o kadar yumuşak olmayabilir, bu da ölü hücrelerin sayısını arttırır ve aynı zamanda önemli bir başlangıç verimi gerektirir. Bu nedenle, az sayıda hipotalamik mikroglia zaten sınırlayıcı bir faktördür. MACS, belirli hücre epitoplarına karşı belirli antikorlara konjuge edilmiş manyetik boncuklar kullanır ve mikroglial dinamikler üzerine bölgeye özgü çalışmaları kolaylaştıran mütevazı bir başlangıç verimi ile çalışabilir. Mikro boncukların güçlü manyetik alanı nedeniyle, minimum etiketleme gereklidir; bu nedenle, FACS'tan daha naziktir ve hücre bütünlüğünün korunmasını sağlar. Ek olarak, çok sayıda numunenin aynı anda işlenmesi gerektiğinde MACS, FACS'tan daha hızlıdır. Bu, küçük bir başlangıç veriminden de gelebilecek yüksek hücre canlılığını korumanın belirgin bir avantajını sağlar (Tablo 3).

MACS teknolojisi ile etkili bir şekilde ele alınabilen hipotalamustan mikroglia izolasyonundaki birincil zorluklar, yeterli bir son verim elde etmeyi ve hücre bütünlüğünün korunmasını sağlamayı içerir. Gerekli hücre miktarı, izolasyon sonrası seçilen analizin doğasına bağlıdır. Örneğin, mikroglia'nın in vitro fonksiyonel rolünün incelenmesi, önemli sayıda hücre gerektirir. Bu, izolasyon sürecine geçmeden önce aynı koşullara sahip farklı farelerden aynı beyin bölgesinin başlangıç havuzunun önemini vurgulamaktadır. Tersine, yüksek hassasiyetli tek hücreli dizileme gibi teknikler, büyük bir hücre popülasyonu gerektirmez ve buna karşılık, birkaç farenin bir araya getirilmesi gerekli değildir.

Hücre verimini en üst düzeye çıkarmak için protokoldeki belirli adımlara uymak çok önemlidir. Etkili ayrışma, hipotalamusun küçük parçalara ayrılması ve daha sonra işlem sırasında tüpün dibindeki tamponda tutulmasının sağlanmasıyla başlatılır. Daha sonra, hücre dışı matrisin enzimatik bozunması ile mekanik ayrışmanın bir kombinasyonu, önemli ölçüde yüksek bir hücre verimi sağlar. Bununla birlikte, 37 ° C'de gerçekleştirilen enzimatik ayrışma, transkripsiyonel ve translasyonel değişikliklere neden olabileceğinden, sonuçların yorumlanmasında son derece dikkatli olmalıyız19. Teknik aracılı değişiklikleri önlemek için, transkripsiyonel ve translasyonel inhibitörlerle uygun kontroller kullanılabilir19. Enzimatik ayrışmaya soğuk bir oda gibi daha düşük bir sıcaklıkta devam etmek de mümkündür (etkinlik azaltılabilir), ancak ayrışma enzimatikten çok mekanik etkiye dayanabilir. Ayrışmayı takiben, hücre süspansiyonu önceden yıkanır ve süzgeçlere aktarılır ve hücre kaybını önlemek için tüplerin iki kez daha kapsamlı bir şekilde yıkanması gerçekleştirilir. Bir diğer kritik adım, yoğunluk gradyan santrifüjlemesi ve farklı katmanların oluşumu ile elde edilen döküntü ve miyelinin uzaklaştırılmasıdır. Bu nedenle, kayda değer bir son verim elde etmek, hem hipotalamik dokunun hem de hücre süspansiyonunun titiz bir şekilde ele alınmasını, metabolizmayı yavaşlatmak ve in vivo fenotiplerini korumak için onları her zaman buz üzerinde tutmayı gerektirir.

Ayrıca, mikroglianın en yüksek saflığını elde etmek ve mikroglia hücre fenotipini korumak için son derece dikkatli olmamız gereken bazı noktalar vardır. Başlangıçta, 4 ° C'de gerçekleştirilen perfüzyon, en yüksek potansiyel mikroglia saflığını sağlayan tüm dolaşımdaki CD11b + hücrelerinin ortadan kaldırılması için çok önemlidir. Bununla birlikte, kan-beyin bariyerinin bozulması durumunda, dolaşımdaki bağışıklık hücrelerinin daha yüksek bir yüzdesi, mikroglia'nın kendilerinin çalışmasına müdahale ederek beyni kolonize edebilir. Bu sorunu hafifletmek için alternatif bir yaklaşım, CD45 antikoruna konjuge edilmiş mikro boncukları kullanan ikincil bir manyetik izolasyon turunun uygulanmasını içerir. CD45, makrofajlarda20 yüksek ekspresyon sergileyen bir hücre yüzeyi belirtecidir ve bu turun sonraki akışı sadece mikroglial hücreleri içerir. İki tur manyetik izolasyon kullanma stratejisi, işlemin özgüllüğünü arttırır; Bununla birlikte, hücresel bütünlüğü ve/veya mikroglia fenotipini kesintiye uğratma riski oluşturan ek zaman alır. Bu nedenle, hücrelerin işlevsel özelliklerini ve bütünlüğünü korumak için çok önemli bir faktör, beyin dokusunu hızlı bir şekilde izole etmeyi ve ayrışma süreci başlayana kadar buz üzerinde tutmayı içerir. Özetle, bu analitik yaklaşım, mikroglial fonksiyon ve davranışın anlaşılmasını geliştirir ve hipotalamustaki dinamik tepkileri hakkında değerli bilgiler sağlar.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

AN, Institut Universitaire de France (IUF), Bordeaux Üniversitesi, Fransız Beyin Araştırmaları Vakfı (FRC), GLN (Lipid-Beslenme Grubu) ve Ulusal Araştırma Ajansı (ANR, PRC 2023-MicroNRJ) tarafından desteklenmektedir. CA, Fondation pour la Recherche Médicale (FRM-ARF201809006962) tarafından desteklendi. Bu proje, MSCA Doktora Ağları 2021, No. 101072759 (FuElThEbRaiNIn healtThYaging and age-related diseases, ETERNITY) kapsamında Avrupa Birliği'nin Ufuk Avrupa Araştırma ve İnovasyon Programından fon almıştır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Yetişkin Beyin Ayrışma KitiMiltenyi130-107-677Kit, tampon Z, tampon Y, enzim A ve P, Kalıntı Giderme Çözeltisi, tampon A (enzim A'yı çözmek için) içerir.
Albumin Sığır FrV BSAEuroMedex04-100-812-C
CD11b (Mikroglia) Mikro Boncuklar, insan ve fare - küçük boyMiltenyi130-093-636
CellROX Yeşil Akış Sitometri Test KitiInvitrogenC10492
Santrifüj Tüpü, Snap-Pop Kapak 15 mLCellTreat978449
DPBS, kalsiyum, magnezyum, glikoz, piruvatGibco14287-072
gentleMACS C TüpleriMiltenyi130-093-237
gentleMACS Isıtıcılı Okto AyrıştırıcıMiltenyi130-096-427
Halt Fosfataz İnhibitör Kokteyli (100x)Thermofisher78420
Halt Proteaz İnhibitörü Kokteyli, EDTA içermez (100x)Thermofisher78437
HBSS (10x), kalsiyum, magnezyum, fenol yokkırmızı Thermofisher14065056
Lateks boncuklar, karboksilat modifiyeli polistiren, floresan kırmızıSigma-AldrichL3280
LightCycler  480 SYBR Yeşil I MasterRoche 4707516001Bu reaktif PCR gerçekleştirmek için kullanıldı.
MACS Akıllı Süzgeçler (70 & mikro; m)Miltenyi130-110-916
Mikro BCA Protein Test KitiThermofisher23235
M-PER Memeli Ekstraksiyon TamponuThermofisher78503
MS SütunlarıMiltenyi130-042-201Protokolde küçük sütunlar olarak anılır.
MultiMACS Cell24 Separatör PlusMiltenyi130-098-637
PBSS, pH 7.4 Thermofisher10010023
qScript XLT cDNA SuperMixQuanta biosciences733-1177Kit, cDNA'yı sentezlemek için kullanıldı.
ReliaPrep RNA Miniprep SistemleriPromegaZ6011Kit, 1-Tiogliserol ve BL tamponu (protokolde lizis tamponu olarak adlandırılır) içerir ve toplam RNA'yı izole etmek için kullanılmıştır.
Vacutainer safety-lok 21 GBecton Dickinson367282

Kaynaklar

  1. Ginhoux, F., Lim, S., Hoeffel, G., Low, D., Huber, T. Origin and differentiation of microglia. Front Cell Neurosci. 7, 45(2013).
  2. Paolicelli, R. C., et al. Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads. Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).
  3. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. M. V. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nat Neurosci. 10 (12), 1538-1543 (2007).
  4. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  5. Alexaki, V. I. The impact of obesity on microglial function: immune, metabolic and endocrine perspectives. Cells. 10 (7), 1584(2021).
  6. Gao, C., Jiang, J., Tan, Y., Chen, S. Microglia in neurodegenerative diseases: mechanism and potential therapeutic targets. Sig Transduct Target Ther. 8 (1), 359(2023).
  7. Lee, J. -K., Tansey, M. G. Microglia isolation from adult mouse brain. Microglia: Methods Mol Biol. 1041, 17-23 (2013).
  8. Schwarz, J. Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. J Vis Exp. (2015), (2015).
  9. Lee, E., Eo, J. -C., Lee, C., Yu, J. -W. Distinct features of brain-resident macrophages: microglia and non-parenchymal brain macrophages. Mol Cells. 44 (5), 281-291 (2021).
  10. Korin, B., et al. single-cell characterization of the brain's immune compartment. Nat Neurosci. 20 (9), 1300-1309 (2017).
  11. Mrdjen, D., et al. High-dimensional single-cell mapping of central nervous system immune cells reveals distinct myeloid subsets in health, aging, and disease. Immunity. 48 (2), 380-395 (2018).
  12. Grabert, K., et al. Microglial brain region−dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nat Neurosci. 19 (3), 504-516 (2016).
  13. Tan, Y. -L., Yuan, Y., Tian, L. Microglial regional heterogeneity and its role in the brain. Mol Psychiatry. 25 (2), 351-367 (2020).
  14. Bustin, S. A., et al. The MIQE Guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
  15. PamGene International B. V. 1160-Preparation-Lysates-of-Cell-Lines-or-Purified-Cells.pdf. PamGene International B. V. , (2022).
  16. Fonseca, M. I., et al. Cell-specific deletion of C1qa identifies microglia as the dominant source of C1q in mouse brain. J Neuroinflamm. 14 (1), 48(2017).
  17. Simpson, D. S. A., Oliver, P. L. ROS generation in microglia: understanding oxidative stress and inflammation in neurodegenerative disease. Antioxidants. 9 (8), 743(2020).
  18. Galloway, D. A., Phillips, A. E. M., Owen, D. R. J., Moore, C. S. Phagocytosis in the brain: homeostasis and disease. Front Immunol. 10, 790(2019).
  19. Marsh, S. E., et al. Dissection of artifactual and confounding glial signatures by single-cell sequencing of mouse and human brain. Nat Neurosci. 25 (3), 306-316 (2022).
  20. DePaula-Silva, A. B., et al. Differential transcriptional profiles identify microglial- and macrophage-specific gene markers expressed during virus-induced neuroinflammation. J Neuroinflammation. 16 (1), 152(2019).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Mikroglia zolasyonuManyetik H cre Ay klamaCD11b MikroboncuklarBeyin HomeostazMikroglia N ron leti imiBeslenme DavranMetabolik DurumlarH cre Canl l
Hipotalamik Mikroglia'nın Manyetik Olarak Aktive Edilmiş Hücre Ayıklama ile Yeni Perfüze Edilmiş Yetişkin Fare Beyninden İzolasyonu
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.