PyOKR: Optokinetik Refleks İzleme Yeteneğini Ölçmek İçin Yarı Otomatik Bir Yöntem

Özet

Burada, iki boyutlu görüntü hareketine verilen görsel tepkilerden kaynaklanan göz hareketlerini doğrudan ölçen yarı otomatik bir nicel analiz yöntemi olan PyOKR'yi açıklıyoruz. Python tabanlı bir kullanıcı arayüzü ve analiz algoritması, önceki yöntemlere göre daha yüksek verim ve göz izleme parametrelerinin daha doğru nicel ölçümlerine olanak tanır.

Özet

Görsel uyaranlara verilen davranışsal tepkilerin incelenmesi, görsel sistem işlevini anlamanın önemli bir bileşenidir. Dikkate değer bir yanıt, retinada görüntü stabilizasyonu için gerekli olan yüksek oranda korunmuş doğuştan gelen bir davranış olan optokinetik reflekstir (OKR). OKR, görüntü izleme yeteneğinin sağlam bir şekilde okunmasını sağlar ve farklı genetik geçmişlere sahip hayvanlarda görsel sistem devrelerini ve işlevini anlamak için kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. OKR iki aşamadan oluşur: göz, görsel düzlemin kenarına kadar bir uyaranı takip ederken yavaş bir izleme aşaması ve gözün yörüngedeki konumunu sıfırlayan telafi edici bir hızlı faz sakkad. Önceki izleme kazancı niceleme yöntemleri, güvenilir olmasına rağmen, emek yoğundur ve öznel veya keyfi olarak türetilebilir. Göz izleme yeteneğinin daha hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde ölçülmesini sağlamak için, her türlü video-okülografi ekipmanına uyarlanabilir olmanın yanı sıra, herhangi bir yönlü uyarana yanıt olarak iki boyutlu göz izleme hareketinin nicelleştirilmesine olanak tanıyan yeni bir yarı otomatik analiz programı olan PyOKR'yi geliştirdik. Bu yöntem, otomatik filtreleme, yavaş izleme aşamalarının seçimi, dikey ve yatay göz vektörlerinin modellenmesi, uyaran hızına göre göz hareketi kazanımlarının nicelleştirilmesi ve elde edilen verilerin istatistiksel ve grafiksel karşılaştırmalar için kullanılabilir bir elektronik tablo halinde düzenlenmesini sağlar. PyPI içe aktarma yoluyla kolayca erişilebilen bu nicel ve kolaylaştırılmış analiz hattı, OKR yanıtlarının hızlı ve doğrudan ölçümünü sağlayarak görsel davranışsal yanıtların incelenmesini kolaylaştırır.

Giriş

Görüntü sabitleme, kendi kendine hareket sırasında meydana gelen küresel optik akışı telafi etmek için hassas okülomotor tepkilere dayanır. Bu stabilizasyon esas olarak iki motor tepki tarafından yönlendirilir: optokinetik refleks (OKR) ve vestibülo-oküler refleks (VOR)^1,2,3. Retina boyunca yavaş küresel hareket^{, görüntüyü 1,2} stabilize etmek için karşılık gelen yönde refleksif göz dönüşünü ortaya çıkaran OKR'yi indükler. Yavaş faz olarak bilinen bu hareket, yeni bir yavaş faza izin vermek için gözün hızla ters yönde sıfırlandığı hızlı faz olarak bilinen telafi edici sakkadlar tarafından kesintiye uğrar. Burada, bu hızlı fazlı sakkadları göz izleme hareketleri (ETM'ler) olarak tanımlıyoruz. VOR, kafa hareketlerini telafi etmek için göz hareketlerini ortaya çıkarmak için vestibüler sisteme^güvenirken, OKR, ON'un ateşlenmesi ve ardından orta beyindeki Aksesuar Optik Sisteme (AOS) sinyal gönderilmesiyle^{retinada başlatılır 4,5}. Retina devrelerine doğrudan bağlı olması nedeniyle OKR, hem araştırma hem de klinik ortamlarda görsel izleme yeteneğini belirlemek için sıklıkla kullanılmaktadır ^6,7.

OKR, temel görme yeteneği ^2,6,8, DSGC gelişimi ^9,10,11,12, okülomotor yanıtlar¹³ ve genetik arka planlar arasındaki fizyolojik farklılıkları⁷ değerlendirmek için bir araç olarak kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. OKR, hareketli bir uyaranla sunulan başa sabitlenmiş hayvanlarda değerlendirilir¹⁴. Okülomotor tepkiler tipik olarak çeşitli video araçları kullanılarak yakalanır ve göz izleme hareketleri yatay ve dikey yönlerde OKR dalga biçimleri olarak yakalanır⁹. İzleme yeteneğini ölçmek için iki temel metrik tanımlanmıştır: izleme kazancı (uyaranın hızına göre gözün hızı) ve ETM frekansı (belirli bir zaman dilimi boyunca hızlı faz sakkadlarının sayısı). Kazancın hesaplanması, izleme yeteneğini tahmin etmek için gözün açısal hızını doğrudan ölçmek için tarihsel olarak kullanılmıştır; Bununla birlikte, bu hesaplamalar emek yoğundur ve video-okülografi toplama yöntemlerine ve müteakip nicelemeye dayalı olarak keyfi olarak türetilebilir. Daha hızlı OKR değerlendirmesi için, ETM frekansının sayımı, izleme keskinliğini ölçmek için alternatif bir yöntem olarak kullanılmıştır⁷. Bu, izleme yeteneğinin oldukça doğru bir tahminini sağlasa da, bu yöntem yavaş faz tepkisini ölçmek için dolaylı bir metriğe dayanır ve bir dizi önyargı ortaya çıkarır. Bunlar, sakkad belirlemede bir gözlemci yanlılığını, belirli bir dönem boyunca zamansal olarak tutarlı sakkadik tepkilere güvenmeyi ve yavaş faz tepkisinin büyüklüğünü değerlendiremeyi içerir.

Bu endişeleri mevcut OKR değerlendirme yaklaşımlarıyla ele almak ve OKR parametrelerinin yüksek verimli derinlemesine nicelleştirilmesini sağlamak için, OKR dalga formlarını ölçmek için yeni bir analiz yöntemi geliştirdik. Yaklaşımımız, "PyOKR" adlı erişilebilir bir Python tabanlı yazılım platformu kullanıyor. Bu yazılımı kullanarak, OKR yavaş faz tepkilerinin modellenmesi ve nicelleştirilmesi daha derinlemesine ve daha fazla parametrelendirme ile incelenebilir. Yazılım, sayısız görsel uyarana verilen yanıtların erişilebilir ve tekrarlanabilir nicel değerlendirmelerini ve ayrıca yatay ve dikey harekete yanıt olarak iki boyutlu görsel izlemeyi sağlar.

Protokol

Johns Hopkins Üniversitesi Tıp Fakültesi'nde (JHUSOM) gerçekleştirilen tüm hayvan deneyleri, JHUSOM'daki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. Kaliforniya Üniversitesi, San Francisco'da (UCSF) gerçekleştirilen tüm deneyler, UCSF Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Programı tarafından onaylanan protokollere uygun olarak gerçekleştirildi.

1. Davranışsal veri toplama

1. Dalga verileri (yani, küresel koordinatlarda gözün bakış açısının bir zaman serisi) oluşturmak için tercih edilen video-okülografi yöntemini kullanarak OKR göz hareketlerini kaydedin.
   NOT: JHUSOM'da toplanan temsili veriler, daha önce tarif edildiği gibi kafa direği implantasyon cerrahisi ve video-okülografi kullanılarak elde edilmiştir ^9,13 (Şekil 1). UCSF'den toplanan temsili veriler, daha önce^10'da tarif edildiği gibi kafa direği implantasyon cerrahisi ve video-okülografi yöntemi ile elde edildi (Şekil 7).
   1. Uyaran ve kayıt parametrelerini not edin: kayıt kare hızı, uyaran hızı ve yönü ve uyaran dönemleri arasındaki ve sonrasındaki süreler. Sinüzoidal uyaranlar için, uyaran dalgasının genliğini ve frekansını da not edin.
2. Toplanan dalga verilerini bir . Yatay ve dikey (azimut ve yükseklik) dalga verilerini içeren CSV dosyası.
   1. Dalga verilerini sekmeyle ayrılmış olarak düzenleyin. Yatay veri (epxWave) ve dikey veri (epyWave) içeren iki sütunlu CSV dosyası.

2. Analiz yazılımının kurulumu

1. Python'u indirin ve yükleyin.
   1. Grafik denetimi için Spyder'ı Anaconda aracılığıyla yükleyin.
   2. Spyder'da grafiklerin düzgün çalıştığından emin olmak için Araçlar > Tercihler > Ipython Console > Graphics > Graphics Backend'e gidin. Satır İçi'ni Otomatik olarak ayarlayın.
2. Python ile yeni bir Anaconda ortamı oluşturun.
3. PyOKR'yi pip ile PyPi aracılığıyla kurun Paket bağımlılıklarıyla birlikte en yeni sürümü yüklemek için PyOKR'yi kurun (Ek Kodlama Dosyası 1 ve Ek Kodlama Dosyası 2)
4. Bir Windows bilgisayar kullanılıyorsa, PyOKR import OKR_win dan o olarak çalıştırın ve ardından o.run().
5. Bir Mac bilgisayar kullanılıyorsa, PyOKR import OKR_osx dan o olarak çalıştırın ve ardından o.run() çalıştırın.

3. Dalga verilerinin analizi

1. Analizin başlatılması ve dosya içe aktarma
   1. Kullanıcı arabirimini açmak için bir .py komut dosyasında o.run() komutunu çalıştırın.
   2. Dosya altında, kullanıcının istenen dalga dosyasını seçmesine izin verecek bir tarayıcı açmak için Aç işlevini veya Ctrl+O [iOS komutu] komutunu kullanın.
   3. Dosya altında, son analizlerin dışa aktarılacağı bir çıktı klasörünün seçilmesine izin verecek bir klasör tarayıcısı açmak için Klasörü Dışa Aktar düğmesini veya Ctrl+E komutunu kullanın.
   4. Çıktı dosyasının altına son analiz dosyası adını AnimalGenotype_AnimalNumber_Analysis gibi önerilen bir biçimde girin.
   5. Dosya altında Set Subject komutunu veya tek bir hayvan için veri kümesini başlatmak üzere Ctrl+S komutunu kullanarak programı tek bir hayvan için ayarlayın.
2. Dalga dosyası parametrelerinin tanımı
   1. Uyaran parametrelerini ayarlamaya başlamak için, dört ana yönden birini seçerek Uyaran yönünü seç altında yönlülüğü tanımlayın. Sinüzoidal uyaranlar için, sinüzoidal dalganın başlangıç yönünü tanımlayan ana yön ile buna göre (Yatay) veya (Dikey) içeren birini seçin.
   2. Uyaran türünü seç altında Uyaran türünü Tek Yönlü, Salınımlı veya Eğik olarak ayarlayın.
   3. Yönlülüğü ayarladıktan sonra, kendi uyaran konumu veri kümesini içe aktarın (Kendi uyaran vektör verilerini içe aktarın) veya parametrelere dayalı olarak otomatik olarak bir vektör oluşturun (Parametrelerden uyaran vektörü oluşturun). Bir uyaran vektörünü içe aktarıyorsanız, 3.2.3.1 ile devam edin ve ardından adım 3.3'e atlayın. Bir uyaran vektörü oluşturuyorsanız, sonraki adımlarla devam edin.
      1. Kişinin kendi vektör verilerini içe aktarıyorsa, uyaranın uzaklık değerlerini (yani, uyaranın her bir bitişik edinim çerçevesi arasında ne kadar hareket ettiğini açıklayan bir zaman serisi) adım 3.2.1'de açıklanan formatta içe aktarın. Ek olarak, PyOKR v1.1.2'den itibaren içe aktarılan uyaran değerini alt kümelere ayırma işlevi eklenmediğinden, tüm veri kümesini tek tek dönemlere bölmek yerine tek bir dönem olarak analiz edin.
   4. Uyaran parametreleri altında, veri toplama için kullanılan uyaranın parametrelerini ayarlayın.
      1. Baş ve Kuyruk ile belirli bir denemenin başında (baş) ve sonunda (kuyruk) uyaran olmadığı sürenin uzunluğunu ayarlayın.
      2. Bir uyaranın gösterildiği süreyi, ardından uyaransız geçen süreyi ve belirli bir denemedeki toplam dönem sayısını sırasıyla Dönem Uzunluğu, Uyaran Sonrası Uzunluk ve Dönem Sayısı ile ayarlayın.
      3. Tek yönlü ve eğik uyaranlar için, Yatay Hız ve Dikey Hız ile uyaran hızını saniyede derece olarak ayarlayın.
      4. Yakalama kare hızı ile toplama kamerasının yakalama hızını ayarlayın.
      5. Sinüzoidal uyaranlar için, salınım uyaranlarını Frekans ve Genlik ile modellemek için sinüzoidal dalgayı oluşturun.
   5. Parametrelendirmeden sonra Parametrelerden uyaran vektörü oluştur ile yukarıda girilen uyaran bilgilerinden uygun modeli yapınız.
   6. Toplam dalga dosyasını taramak için Dönem seç'i kullanarak girilen uyaran için belirli bir dönem seçin.
3. İzleme aşamalarının denetimli seçimi
   1. Yavaş izleme bölgelerini belirlemek için, maksimum hız değişikliklerine dayalı olarak potansiyel sakkadları etiketleyecek olan Filtrelenmemiş Veriler veya Filtrelenmiş Veriler'e tıklayarak Ön ayarlama ile hızlı faz sakkadlarını otomatik olarak seçin.
   2. Filtrelenmemiş Veriler altında, sakkadların mavi bir nokta ile doğru bir şekilde seçildiğini onaylayın. Otomatik seçim doğru değilse, Sol Fare Tuşu (LMB) ile noktaları manuel olarak kaldırın veya Sağ Fare Tuşu (RMB) ile nokta ekleyin. Hızlı faz sakkadları yeterince seçildiğinde, noktaları Orta Fare Tuşu (MMB) ile kaydedin ve grafiği kapatın.
   3. Otomatik filtreleme isteniyorsa, bir Z-Skoru Eşiği ayarlayın ve sakkadları otomatik olarak filtrelemek için Filtrelenmiş Veriler'e tıklayın. Gerekirse, herhangi bir gürültüyü gidermek için adım 3.3.2'de açıklananla aynı manuel gözetimi kullanın.
   4. Uygun sakkad seçiminden sonra, çıkarılacak bölgeyi seçmek için Nokta Ayarı'na basın. Daha önce adım 3.3.2'de açıklandığı gibi benzer bir kontrol şeması aracılığıyla üst ve alt noktaları değiştirin. LMB veya RMB ile üst (yeşil) noktaları düzenleyin ve Shift+LMB veya Shift+RMB ile alt (kırmızı) noktaları düzenleyin. Puanlar düzgün bir şekilde yerleştirildiğinde, puanları kaydetmek için MMB'yi kullanın.
      NOT: Mac kullanıyorsanız, alt ve üst nokta ayarı iki ayrı düğmededir ve adım 3.3.2'de açıklananla aynı kontrol şemasını izler.
4. Yavaş izleme aşamalarının analizi
   1. Tek tek yavaş fazlara takılacak polinom modelini tanımlamak için Polinom Sırasını Ayarla'yı kullanarak polinom modelinin sırasını ayarlayın.
      NOT: Tek yönlü veya eğik uyaranlar için, izleme kazancını hesaplamak için doğrusallık gerektiğinden varsayılan değer 1'dir. Sinüzoidal uyaranlar için, dalganın eğrisini modellemek için varsayılan olarak 15 olan daha yüksek bir düzen gereklidir.
   2. İzlemeyi analiz etmek için, seçilen yavaş fazlar için yavaş faz modellerini (Şekil 2) oluşturmak için Nihai Analiz'i seçin (bkz. Şekil 2A-D) ve dönem boyunca ortalama mesafeleri, hızları ve izleme kazançlarını hesaplayın (Şekil 2E).
   3. Seçili bölgelerin iki boyutlu (2B) veya üç boyutlu (3B) grafiğini görüntülemek için sırasıyla 2B grafiği görüntüle veya 3B grafiği görüntüle'yi seçin.
   4. Adım 3.4.2'de oluşturulan toplanan değerleri kaydetmek için Dönem ekle'yi seçin. Belirli bir hayvan için eklenen tüm değerlerin yanı sıra toplanan denemelerin ortalamalarını görüntülemek için Geçerli veri kümesini görüntüle'yi seçin.
   5. Bir dönem eklendikten sonra, 3.3.1 ile 3.4.4 arasındaki adımları izleyerek Dönem Seç ile dosyanın geri kalanında geçiş yapın.
   6. Bir dalga dosyası tamamen analiz edildikten sonra, yeni dosyalar açarak, uygun parametreleri ayarlayarak ve bunları buna göre analiz ederek belirli bir hayvan için diğer tüm dosyalar için bu işlemi tekrarlayın. Her dosya için 3.2.1-3.4.5 adımlarını tekrarlayarak, belirli bir hayvan için tüm dalga verilerini içeren son bir veri kümesi oluşturun.
5. Verilerin nihai olarak dışa aktarılması
   1. Belirli bir hayvan için veri analizi tamamlandıktan ve tüm yönler veya uyaranlar analiz edildikten sonra, veri kümesini Verileri dışarı aktar aracılığıyla dışa aktarın.
      NOT: Ham veri kümesi, Çıktı dosyası adına göre dışa aktarılacak ve Çıktı Klasörü tarafından ayarlanan yol boyunca, her bir uyaran parametresi için toplam ortalamayla birlikte ayrı dönem verilerini içeren bir CSV olarak kaydedilecektir.
   2. Tek bir hayvanı dışarı aktardıktan sonra, Ctrl+S ile veri kümesini yeniden başlatın ve ardından yeni bir hayvanı analiz etmek için önceki tüm adımları yineleyin.
   3. Gerekirse, Analiz sekmesi altındaki Verileri Sırala komutunu kullanarak daha kolay analiz için birden fazla hayvan için toplanan tüm çıktı verilerini yeniden düzenleyin.
      NOT: Bu işlev, grafiklerin ve istatistiksel karşılaştırmaların daha kolay oluşturulmasını sağlamak için çıktı klasöründe depolanan tüm analiz edilen hayvan dosyaları için tüm ortalama değerleri derleyecek ve sıralayacaktır. Sıralama, v1.1.2'den itibaren dosyaların adlandırılmasına bağlıdır. Her dosya için adım 3.1.4'te açıklandığı gibi önerilen adlandırma şemasını kullanın (örneğin, WT_123_Analysis).

Sonuçlar

Yukarıda açıklanan analiz yöntemini doğrulamak için, vahşi tip farelerden ve bilinen bir izleme açığına sahip koşullu nakavt mutantından toplanan dalga izleri üzerindeki OKR izleme kazancını ölçtük. Ek olarak, analiz yöntemimizin daha geniş uygulanabilirliğini test etmek için, farklı bir video-okülografi toplama yöntemi kullanılarak elde edilen ayrı bir vahşi tip fare kohortundan elde edilen izleri analiz ettik. Sakkadların otomatik olarak filtrelenmesi, OKR veri işlemeyi ve analizini kolaylaştırır (Şekil 3). Tek yönlü ve sinüzoidal uyaranlardan elde edilen kayıtları kullanarak (Şekil 1D), vahşi tip hayvanlar (n = 2F) için dört ana yönde (Şekil 13F) tek yönlü uyaranlara ve ayrıca yatay ve dikey sinüzoidal uyaranlara yanıt olarak izleme kazanımlarını hesapladık (Şekil 4). Hem tek yönlü hem de sinüzoidal uyaranlar için uyaran yönüne göre izleme yeteneğindeki eşitsizlik, tüm vahşi tip farelerde tutarlı bir şekilde gözlenir ve açıklandığı gibi, dikey yanıtlardan önemli ölçüde daha yüksek izleme kazanımları gösteren eşit derecede sağlam yatay yanıtlarla². Ayrıca, daha önce bildirildiği gibi, her iki video-okülografi toplama yöntemini kullanan vahşi tip farelerde yukarı ve aşağı tepkiler arasında asimetrik izleme kazanımları da gözlenmiştir ^2,10. OKR yanıtlarının yayınlanmış karakterizasyonuna kıyasla izleme kazanımlarının göreceli büyüklükleri ve tutarlılığı, yazılım kullanılarak hesaplanan izleme kazanımlarının izleme yeteneğini doğru bir şekilde yansıttığını göstermektedir. Tek yönlü kazanç hesaplamalarına ek olarak, yatay ve dikey göz hareketi aynı anda modellenebilir (Şekil 5), bu da belirli bir uyarana yanıt olarak göz hareketinin üç boyutlu bir yeniden yapılandırılmasına izin verir. Bu, çapraz bağlı yatay ve dikey yanıtları^araştıran gelecekteki çalışmalar için yararlı olan ek bir niceleme yeteneği sağlar 9.

Yazılımın farklı deneysel koşullardaki önemli davranış değişikliklerini belirlemeye yönelik faydasını doğrulamak için, bu çalışmada hızlı faz sakkadlarının manuel olarak sayılmasıyla değerlendirilen dikey izlemedeki eksikliklerin, burada sunulan metodolojiyi kullanarak izleme kazanımlarına yansıtıldığını doğrulamak için yayınlanmış verilerimizi⁹ yeniden analiz ettik. Önceki çalışmalar, transkripsiyon faktörü T-box Transkripsiyon Faktörü 5'in (Tbx5) retinasında Protocadherin 9-Cre (Pcdh9-Cre) kullanılarak koşullu nakavt yoluyla genetik inaktivasyonun, yukarı doğru ayarlanmış ON Yön Seçici Ganglion Hücrelerinin spesifik kaybına neden olduğunu göstermektedir (up-oDSGC'ler) ve Tbx5 Flox / Flox (Tbx5f / f); Pcdh9-Cre mutantları, dikey OKR takibinde spesifik bir kayıp sergiler⁹. Burada açıklanan yöntem kullanılarak yapılan kantitatif analiz, Tbx5f/f; Pcdh9-Cre hayvanları, daha önce tarif edilenlere benzer ve hızlı faz sakkadlarının (ETM'ler) manuel sayımıyla elde edilenlere benzer şekilde normal yatay izleme kazanımlarını (Şekil 6A) korur (Şekil 2F); bununla birlikte, bu fareler, hem yukarı hem de aşağı doğru uyaranlara yanıt olarak sıfıra yakın kazançlarla önemli ölçüde dikey izleme kaybı gösterir (Şekil 6B, C). Ek olarak, sinüzoidal tepkilerin analizi, Tbx5 cKO hayvanlarının önemli ölçüde azalmış dikey izleme gösterirken daha fazla yatay izleme kazancı sergilediğini doğrulamaktadır (Şekil 6D-F). Daha önce açıklanan bu fenotipin PyOKR kullanılarak yeniden analizi, farklı genetik suşlara sahip farelerde OKR yanıtlarının nicel karşılaştırmalarına izin veren bu yeni metodolojinin hassasiyetini ve hassasiyetini göstermektedir.

Son olarak, yazılım uygulamasının faydasını farklı video-okülografi yöntemleri ve uyaran parametreleri ile doğrulamak için UCSF'de toplanan vahşi tip dikey OKR izlerini analiz ettik. UCSF'den elde edilen veriler, 405 nm dalga boyunda bir projektörün kafasına sabitlenmiş hayvanı çevreleyen bir yarım küre üzerine yansıması yoluyla fareye hareketli ızgaraların sunulduğu yarım küre bir projeksiyon sistemi kullanılarak toplanmıştır¹⁰ (Şekil 7A). Tek yönlü dikey ızgaralar farelere saniyede 10 derece hızla sunuldu ve OKR yanıtları 60 sn aralıklarla kaydedildi (Şekil 7B,C). Dikey izler PyOKR aracılığıyla kantitatif olarak analiz edildi ve yukarı doğru tepkiler aşağı doğru tepkilerle karşılaştırıldı (Şekil 7D). Yukarı yönlü tepkiler, beklendiği gibi aşağı yönlü tepkilerden önemli ölçüde daha güçlüydü¹⁰; bununla birlikte, izleme kazanımları, JHUSOM'da kaydedilen izlere kıyasla biraz azalmıştır (Şekil 2F). Ek olarak, sinüzoidal yanıtların nicelleştirilmesi PyOKR ile analiz edildi (Şekil 7E) ve sinüzoidal olarak hareket eden uyaranlara verilen dikey tepkilerde önemli bir asimetri hesaplanan kazanımlara yansıtıldı (Şekil 7F). JHUSOM ve UCSF'de toplanan kazanç değerleri arasındaki farklar, farklı uyaran hızları, türleri ve dalga boyları dahil olmak üzere uyaran parametreleri arasındaki farklılıklara bağlanabilir; bununla birlikte, her bir toplama yöntemi kullanılarak elde edilen verilerin analizinde gözlemlediğimiz genel tutarlılık, PyOKR'ımızın video-okülografi yöntemlerinden bağımsız olarak JHUSOM OKR veri toplama sistemimizin ötesine kolayca uyarlanabileceğini ve diğer OKR kayıtlarına uygulanabileceğini göstermektedir. Bu sonuçlar, burada açıklanan yazılım platformunun doğru olduğunu ve genel olarak okülomotor tepkilerin çalışmasına uygulanabileceğini ve görsel görüntü sabitleme devresinin çalışmasını ilerletmek için farklı gruplara ait hayvanlar arasında kesin nicel karşılaştırmalara izin verdiğini göstermektedir.

Şekil 1: OKR yanıt verilerinin toplanması. (A) Daha önce açıklandığı gibi davranışsal stimülasyon için OKR sanal arena cihazı ^9,13. Dört monitör, kafasına sabitlenmiş bir hayvanı (1) çevreler ve sürekli hareket eden bir dama tahtası uyarıcısı (2) gösterir. Sanal tambur, salınımlı sinüzoidal uyaranların yanı sıra dört ana yönün tümünde tek yönlü hareket sunabilir. Farenin sol gözü bir kızılötesi (IR) ışıkla aydınlatılır ve göz takibine yansıyan görsel sistem yanıtlarını kaydetmek için bir kamera (3) ile kaydedilir. (B) Göz izlemenin analizi, göz bebeğinin ve IR ışığı tarafından üretilen bir kornea yansımasının yakalanmasıyla gerçekleşir. Sanal tambura yanıt olarak göz hareketlerinin veri toplanması ve hesaplanması daha önce açıklandığı gibi gerçekleştirildi ^9,13. (C) Dikey (Y dalgası) ve yatay (X dalgası) hareket eden göz vektörlerinin şeması. (D) Bir gözün tek yönlü yukarı ve geri harekete ve ayrıca dikey ve yatay sinüzoidal harekete verdiği izleme tepkisinin örnek izleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Tek yönlü görsel tepkilerin izleme analizi. (A-D) Kazanç analizi için yavaş izleme aşamalarının tanımlanması ve seçimi. Örnek tek yönlü izler, farenin gözüne göre ileri (A), geri (B), yukarı (C) ve aşağı (D) hareketlere görsel tepkilerle gösterilir. Yavaş fazlar, sakkadları çıkarmak için Adım 3'te açıklanan kırmızı ve yeşil noktaların eklenmesiyle tanımlanır ve seçilen yavaş fazlar sarı renkle vurgulanır. Polinom regresyonları, izlerin üzerine çizgiler halinde bindirilir. (E) PyOKR okumasında düzenlendiği gibi numune izlerinin (AD) nicelleştirilmesi. Her iz için, yönlülükten bağımsız olarak toplam XY hızları ve ilgili kazançlar hesaplanır. Tek yönlü tepkilerde, bu toplam hızlar genellikle belirli bir yöndeki bireysel hızı yansıtacaktır; Bununla birlikte, sinüzoidal yanıtlar için bu değer, gözün ortalama genel hızını yansıtacaktır. Yatay ve dikey hız bileşenleri, her bir yöndeki hızı göstermek için parçalanır. Kazanç daha sonra sunulan uyaran hızlarına göre hesaplanır. (F) Yabani tip hayvanların (n = 13) dört ana yönde, ilişkili ETM niceliklerine kıyasla hesaplanan izleme kazançları. Veriler ortalama ± SD olarak sunulmuştur. Veriler tek yönlü varyans analizi ile çoklu karşılaştırmalar yapılmıştır. *P<0.05, **P<0.01,***P<0.005, ****P<0.0001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Sakkadların otomatik olarak filtrelenmesi, OKR veri işlemeyi ve analizini kolaylaştırır. (A-D) Şekil 2A-D'den izlerin otomatik olarak filtrelenmesi, sakkadları kaldırır ve hızlı hız değişikliklerini ortadan kaldırarak ve yavaş fazları bir araya getirerek yalnızca yavaş faz hareketini modeller. Son eğim, belirli bir dönem boyunca toplam göz hareketini temsil eder. (E) PyOKR okumasında düzenlendiği gibi, filtrelenmiş örnek verilerinden elde edilen kazançların nicelleştirilmesi. (F) Filtrelenmemiş ve filtrelenmiş numune göz izleri arasındaki kazanç değerlerinin karşılaştırılması, önemli bir fark yansıtmaz. Veriler ortalama ± SD olarak sunulmuştur. Veriler, filtrelenmemiş ve filtrelenmiş sonuçlar arasında Mann-Whitney U testi ile analiz edilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Salınımlı görsel uyaranlara yanıt olarak izleme kazanımlarının türetilmesi. (A,B) Sinüzoidal olarak hareket eden uyaranlara dikey (A) ve yatay (B) göz hareketi yanıtları, tanımlanmış salınım uyaran parametrelerine göre modellenebilir. Seçilen bölgeler, izin üzerine yerleştirilmiş polinom yaklaşımı ile sarı renkle etiketlenir. Uyaranın bir modeli, her noktada uyaranın ne olduğuna atıfta bulunmak için izin arkasında turuncu bir sinüzoid dalga olarak sunulur. (C) Vahşi tip sinüzoidal yanıtların kazanç hesaplamaları (n = 7), yatay ve dikey izleme yeteneği arasındaki asimetrik yanıtları yansıtır. Veriler ortalama ± SD olarak sunulmuştur. Veriler tek yönlü varyans analizi ile çoklu karşılaştırmalar yapılmıştır. **p<0.01,***p<0.005. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Yönlü izleme, yatay ve dikey bileşenlerinde modellenebilir. (A) Yukarı yönlü bir uyarana yanıt olarak bir göz izleme dalgasının dikey bileşeni. (B) Yukarı doğru bir uyarana yanıt olarak bir göz izleme dalgasının yatay bileşeni. (C) Hem dikey hem de yatay yönlerde genel göz yörüngesi. (D) Aşağı doğru harekete tepki olarak gözün zaman içindeki hareket vektörünün üç boyutlu modeli. Ham izleme verileri kırmızı renkle görüntülenir ve yörüngenin regresyon modeli mavi renkle görüntülenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: OKR'nin Tbx5f/f'de analizi; Pcdh9-Cre fareleri, tek yönlü dikey izleme kazançlarında önemli eksiklikler göstermektedir. (A) Tbx5f/f; Pcdh9-Cre hayvanları, yatay izleme kazancında önemli bir değişiklik göstermez. (B,C) Tbx5f/f; Pcdh9-Cre hayvanları, dikey tepkilerinde önemli bir kazanç azalması gösterir: yukarı (B) ve aşağı (C). (D,E) Tbx5f/f'nin sinüzoidal yanıtları; Yatay (D) ve dikey (E) salınımlı uyaranlara yanıt olarak Pcdh9-Cre hayvanları. (f) Tbx5f/f'nin miktar tayini; Pcdh9-Cre salınım yanıtları, yatay izleme kazançlarında önemli artışlar gösterir, ancak dikey yanıtlarda azalmalar gösterir. Veriler ortalama ± SD olarak sunulmuştur. Veriler Mann-Whitney U testleri ile analiz edilmiştir. *p<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: PyOKR'nin alternatif video-okülografi yöntemlerinden elde edilen verilere uygulanması. (A) Tarif edildiği gibi OKR sanal tambur stimülasyonu için aparat¹⁰. 405 nm dalga boyuna sahip bir DLP projektörü, hayvanın görüş alanını çevreleyen sanal bir tambur oluşturmak için dışbükey bir ayna aracılığıyla bir yarım küreye yansıtılır. Göz hareketleri, hemisferin dışına yerleştirilmiş bir NIR kamera kullanılarak ölçülür. Tek yönlü ve sinüzoidal çubuk ızgaralar, kafasına sabitlenmiş bir hayvana dikey yönlerde gösterilir. (B,C) Yukarı (B) ve aşağı (C) izleme aşamaları belirlenir ve kantitatif analiz için seçilir. Yavaş fazlar sarı renkle vurgulanır. (D) Burada açıklanan yöntemler kullanılarak yabani tip hayvanların (n=5) dikey takibinden hesaplanan izleme kazançları. Aşağı doğru izlemede önemli bir azalma ile asimetrik izleme yeteneği gözlenir. (E) Yabani tip hayvanlarda izleme kazanımlarını ölçmek için modellenen sinüzoidal uyaranlara salınım yanıtı (n = 8). Yavaş fazlar sarı renkle vurgulanır. (F) Sinüzoidal kazançların nicelleştirilmesi, yukarı yönlü kazançlara kıyasla aşağı yönlü izleme kazançlarının azaldığını ortaya koymaktadır. Veriler ortalama ± SD olarak sunulmuştur. Veriler Mann-Whitney U testleri ile analiz edilmiştir. *sayfa <0.05. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Kodlama Dosyası 1: PyOKR Windows Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Kodlama Dosyası 2: PyOKR Mac Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

PyOKR, göz hareketlerine yansıyan görsel tepkileri incelemek için çeşitli avantajlar sağlar. Bunlar, parametrelendirme ve değişken uyaran hızlarını dahil etme yeteneğine ek olarak doğruluk, erişilebilirlik ve veri toplama seçeneklerini içerir.

Doğrudan göz izleme kazancı değerlendirmesi, hızlı fazlı sakkadların (ETM'ler) geleneksel manuel sayımından daha doğrudan bir nicel ölçüm olan göz hareketinin doğru bir karakterizasyonunu sağlar. Yararlı olmasına rağmen, sakkad sayımı, gerçek izleme hareketinin dolaylı bir değerlendirmesini sağlar. PyOKR yazılım platformu, sakkad genlikleri ve yavaş fazların uzunluğu dahil olmak üzere ek parametreleri dikkate alarak izleme hızlarının doğrudan ölçülmesini sağlar. Ek olarak, hızlı fazlı sakkad sayımı, belirli bir süre boyunca sakkad frekansının değerlendirilmesine dayanır ve hayvan stresinden kaynaklanan rastgele sakkadlar da dahil olmak üzere her bir izin çok az gürültü içermesini veya hiç gürültü olmamasını gerektirir. Bu faktörler, toplanan birçok izin kullanılamaz hale gelmesine neden olur ve bu nedenle, göz izlemeyi doğru bir şekilde değerlendirmek için veri toplama için önemli ölçüde zaman ekler. Bununla birlikte, burada açıklanan yazılım, belirli bir iz içindeki bireysel yavaş fazları doğrudan ölçerek ve iz boyunca anlık noktalardaki kazançları hesaplayarak bu sorunu ele alır. Bunu, göz hareketinin hızını belirli bir noktadaki uyaranın hızıyla karşılaştırarak gerçekleştirir. Sakkadik frekans artık analiz için tanımlayıcı parametre olmadığından, gürültü kullanıcı gözetiminde kolayca giderilebilir ve bu da gürültünün analizin kalitesi üzerindeki etkisini azaltır. Bu, daha kullanılabilir toplanan verilere ve bu verileri analiz ederken daha yüksek istatistiksel güce olanak tanır, göz izlemeyi nicelleştirirken ve bireysel fareler ve farklı fare grupları için OKR parametrelerini karakterize ederken doğruluğu ve tekrarlanabilirliği artırır. Bir Z-skoru yöntemiyle bulunan göz hızındaki hızlı değişikliklere dayalı olarak sakkadların otomatik olarak filtrelenmesi, izleme kazancını karakterize etmek için^{de kullanılmıştır 10}. Bu filtreleme yöntemini yazılıma dahil etmek için, bu tür hız filtrelemesini dahil ettik, ancak bu yaklaşımdan kaynaklanan olası hataları azaltmak için eşik parametrelendirmesi ve manuel sakkadik denetim gibi ek araçlar kullandık. Analiz için otomatik filtreleme kullanmak yerine ham izler kullanılırsa, sakkadlar, göz kırpmaları veya fare sıkıntısının neden olduğu göz hareketindeki hızlı değişiklikler, iz hızının Gauss çekirdek yoğunluğu tahmini yoluyla maksimum hız değişiklikleri yoluyla tanımlanır. Bu, segmentlere ayırma bölgelerinin otomatik olarak seçilmesine ve nihayetinde manuel kullanıcı denetimine dayalı olarak kaldırılmasına olanak tanır. Manuel gözetim, gürültülü izlere karşı daha yüksek tolerans sağlayarak kullanıcıların hızlı göz değişiklikleri için yanlış pozitif veya yanlış negatif işaretleri hızlı bir şekilde düzeltmesine olanak tanır. Ek olarak, PyOKR belirli bir yöndeki genel göz hareketini modellemek için polinom yaklaşımları kullandığından, tek tek noktalardaki gürültü yumuşatılır ve yörünge hızlarının izdeki gürültüye karşı bir miktar toleransla değerlendirilmesine olanak tanır. Yalnızca tüm izleme boyunca son derece düşük veri kalitesi olması veya veri toplama sırasında yanlış kalibrasyon yapılması durumunda, yazılım doğru veri analizi oluşturamayacaktır. Birlikte ele alındığında, kullanıcı denetimi, filtreleme ve anlık kazanç hesaplama araçlarını bir araya getirerek, burada açıklanan PyOKR yazılım uygulaması, önceki yöntemlere göre yüksek doğruluk ve daha doğrudan metriklerle izleme kazançları oluşturur.

PyOKR ayrıca OKR analizlerinin kullanıcı ihtiyaçlarını karşılayacak şekilde özelleştirilmesine olanak tanıyan birçok özelliğe sahiptir. Uyaran parametrelerinin yanı sıra ham uyaran vektörlerinin girişi, kullanıcının istenen herhangi bir uyaranı kesin olarak tanımlamasına olanak tanır. Bunlar, yazılımın ilgili görsel yanıtlar için doğru izleme kazançları oluşturmak için kullanabileceği tek yönlü, sinüzoidal veya eğik uyaranları içerebilir. Bu metodolojinin uyaran parametrelendirmesi ile, girilen uyarandan bağımsız olarak her karede hesaplanan anlık kazançlar yüksek doğrulukla güvenilir bir şekilde oluşturulabilir. Eğik uyaran verileri burada analiz edilmemiş olsa da, eğik bir açıyı yeniden oluşturmak için ayrıştırılmış XY hız vektörleri aracılığıyla doğru kazançlar hesaplanabilir ve bu da eğik uyaranların doğru kazanç hesaplamalarına olanak tanır. Uyaran ayarlarının erişilebilir parametrelendirilmesi sayesinde, aracımız herhangi bir görsel uyarana yanıt olarak dalga izleme için yaygın olarak uygulanabilir. Ek olarak, yazılım, önceki yöntemlere kıyasla daha yüksek verim ve tekrarlanabilir niceleme sağlar. OKR izleri arasında sıralama yapmak zaman alıcı ve emek yoğundur; bununla birlikte, PyOKR kolaylaştırılmış kullanıcı arayüzü, birçok izi daha önce mümkün olandan daha yüksek bir hızda kolayca tarayabilir. Bu, yalnızca daha hızlı iz nicelemeye izin vermekle kalmaz, aynı zamanda göz hızlarının doğrudan nicelleştirilmesi, göz hareketinin yönlü vektör bileşenleri ve hareket vektörünün hem yatay hem de dikey bileşenlerinde uyarana göre anlık kazançlar dahil olmak üzere ek OKR parametrelerini de ortaya çıkarır. Ayrıca, sakkadların otomatik olarak tanımlanması ve yöntemimiz tarafından sağlanan izleme hızlarının hesaplanması göz önüne alındığında, veri analizindeki potansiyel deneyci yanlılığı, yanlış negatifler üretebilen manuel ETM sayımı veya otomatik izleme filtreleme gibi diğer niceleme yöntemlerine kıyasla büyük ölçüde azaltılır. Ayrıca, basitleştirilmiş aşağı akış analizi için büyük miktarda davranışsal veri oluşturulabilir ve otomatik olarak derlenebilir. PyOKR'de bulunan veri dışa aktarma ve sıralama işlevleri sayesinde, birden fazla hayvan ve koşuldaki izleme verileri, organize veri depolamanın yanı sıra hızlı istatistiksel analize izin vermek için otomatik olarak işlenebilir. Aynı kayıt oturumu sırasında devre manipülasyonu veya görsel yanıtlar gibi birden fazla koşul kullanan deneyler yapmak için, bu tek kayıt oturumundan türetilen bağımsız değişkenlere dayalı olarak ayrı veri kümelerinin depolanmasına izin veren ayrı dalga dosyalarında veya alt kümelenmiş dönemlerde veri toplamanızı öneririz. Bir örnek, deneysel bir paradigma içinde farklı sinüzoidal dalga frekanslarına verilen yanıtlardaki farklılıkları test ediyorsa, WT_1_Freq0.1Analysis, WT_1_Freq0.2Analysis ve WT_1_Freq0.3Analysis gibi ayrı analizler için farklı parametreleri farklı dalga dosyalarına kaydetmenizi öneririz. Mevcut sürümde, dönemler analiz edildikten sonra, veri kümesi içinde tek tek dönem değerlerini seçmek için bir işlevsellik yoktur, ancak gerekirse bu gelecekte eklenebilir.

Son olarak, yöntemimiz birden fazla video-okülografi toplama yöntemine uyarlanabilir ve bir laboratuvarın özel ihtiyaçlarına göre kolayca uyarlanabilen sağlam bir analiz platformu sağlar. Vahşi tip ve mevcut mutant OKR verilerinin ve ayrıca farklı yöntemler ve uyaranlar kullanılarak toplanan vahşi tip OKR verilerinin analizi yoluyla, burada analiz aracımızın a) herhangi bir yönlü uyarandan OKR takibini yüksek doğruluk ve verimle nicelleştirme; b) genetik bozulmadan kaynaklanan görsel sistem davranış farklılıklarını belirlemek; ve c) farklı video-okülografi yöntemlerinden elde edilen görsel izleme verilerinin değerlendirilmesi. Analiz platformumuzun erişilebilirliği ve genel uyarlanabilirliği, OKR yanıtlarının daha fazla çalışılmasını kolaylaştırır ve okülomotor yanıtlar bağlamında nöral devre montajını ve dinamiklerini karakterize eden davranışsal çalışmaları geliştirir.

Doğru ölçümler ve müteakip faydalı veri analizleri elde etmek için, veri toplama için birkaç adım gereklidir. Hayvanın davranışsal test cihazına alışmasını sağlamak ve hayvan stresinin davranışsal tepkiler üzerindeki etkisini azaltmak için OKR verilerinin birden fazla oturumda toplanmasını öneririz; bununla birlikte, aşırı kayıt, OKR yanıtının¹³ güçlenmesine yol açabilir, bu nedenle test rejimlerinin tasarlanmasında dikkatli olunması önerilir. OKR veri toplama sırasında, analiz edilen verilerin kalitesi işlenen izin doğrudan bir fonksiyonu olduğundan, video-okülografi ekipmanının uygun kalibrasyonu doğru miktar tayini için kritik öneme sahiptir. Daha da önemlisi, Spyder IDE'nin kullanılması, Matplotlib aracılığıyla grafik denetimi için gereklidir. Platformumuzun erişilebilirliği ve çerçeve tasarımı göz önüne alındığında, başkalarının yazılımın yeteneklerini genişletmesi ve bu platformu farklı davranışsal deneysel paradigmalar için uyarlaması için gerekli tüm araçlar mevcuttur.

Sonuç olarak, burada OKR davranışsal tepkilerinin mevcut metodolojiler kullanılarak şu anda mevcut olandan daha derinlemesine ve daha fazla nicel güçle analizi için yeni, erişilebilir ve çok yönlü bir araç açıklıyoruz. PyOKR, acemi Python kullanıcıları tarafından kolayca kullanılabilir ve OKR dalgalarının artırılmış titizlik ve tekrarlanabilirlik ile hızlı ve doğru analizi için yerleşik bir analiz hattı ve arayüzü içerir. Bu yazılımın uyarlanabilirliği, kullanıcıların kendi özel ihtiyaçlarına ve veri toplama prosedürlerine uyacak şekilde kolayca uyarlayabilecekleri esnek bir çerçeve sağlar. Bu kantitatif yöntemin, okülomotor tepkilerin çalışmasını ilerleteceğini ve görsel sistem davranışlarını yönlendiren nöral devrenin gelişimi ve işlevi hakkındaki anlayışımızı ilerleteceğini tahmin ediyoruz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
C57BL/6J  fareler	Jackson Labs	664
Igor Pro	WaveMetrics	RRID: SCR_000325
MATLAB		MathWorks RRID: SCR_001622
Optokinetik refleks kayıt odası - JHUSOM	Özel yapım	N/A	Al-Khindi ve ark.(2022)9 ve Kodama ve ark. (2016)13
Optokinetik refleks kayıt odası - UCSF	Özel yapım	N/A	Harris ve Dunn, 201510
Python	Python Software Foundation'da	RRID: SCR_008394
Tbx5 flox/+ mice	B. Bruneau	N/	A'dan Hediye Al-Khindi ve ark.(2022)9
Tg (Pcdh9-cre) NP276Gsat / Mmucd	MMRRC	MMRRC Stok # 036084-UCD; RRID: MMRRC_036084-UCD