İntermüsküler yağ dokusunun (IMAT) biyolojisi, insan dokusunun sınırlı erişilebilirliği nedeniyle büyük ölçüde keşfedilmemiştir. Burada, bu benzersiz yağ deposunun hücresel bileşimini tanımlamak için tek çekirdekli RNA dizilimi için donmuş insan IMAT'ının çekirdek izolasyonu ve kütüphane hazırlığı için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İnsan İntermüsküler Yağ Dokusundan Çekirdeklerin İzolasyonu ve Aşağı Akış Tek Çekirdekli RNA Dizilemesi
Bu makalede
Özet
Özet
İntermüsküler yağ dokusu (IMAT), kas lifleri arasında yer alan nispeten az çalışılmış bir yağ deposudur. IMAT içeriği yaş ve VKİ ile artar ve metabolik ve kas dejeneratif hastalıklarla ilişkilidir; bununla birlikte, IMAT'ın biyolojik özelliklerinin ve çevredeki kas lifleri ile etkileşiminin anlaşılması ciddi şekilde eksiktir. Son yıllarda, tek hücreli ve çekirdekli RNA dizilimi bize birkaç insan dokusunun hücre tipine özgü atlaslarını sağlamıştır. Bununla birlikte, insan IMAT'ın hücresel bileşimi, insanlarda biyopsi toplanmasından erişilebilirliğinin doğasında var olan zorluklar nedeniyle büyük ölçüde keşfedilmemiş kalmaktadır. Toplanan sınırlı doku miktarına ek olarak, iskelet kası dokusuna ve fasyaya olan yakınlığı nedeniyle insan IMAT'ın işlenmesi karmaşıktır. Adipositlerin lipid yüklü doğası, onu tek hücre izolasyonu ile uyumsuz hale getirir. Bu nedenle, tek çekirdekli RNA dizilimi, tek hücre çözünürlüğünde yüksek boyutlu transkriptomikler elde etmek için idealdir ve IMAT'ın tam hücresel bileşimi de dahil olmak üzere bu deponun biyolojisini ortaya çıkarma potansiyeli sağlar. Burada, tek çekirdekli RNA dizilimi için donmuş insan IMAT'inin çekirdek izolasyonu ve kütüphane hazırlığı için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, damlacık tabanlı bir yaklaşım kullanarak binlerce çekirdeğin profilinin çıkarılmasına izin verir, böylece nadir ve az miktarda hücre tiplerini tespit etme kapasitesi sağlar.
Giriş
İntermüsküler yağ dokusu (IMAT), kas lifleri arasında ve çevresinde bulunan ektopik bir yağ deposudur1. Goodpaster ve arkadaşlarının yakın zamanda yaptıkları bir derlemede ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, IMAT yüksek çözünürlüklü bilgisayarlı tomografi (BT) ve manyetik rezonans görüntüleme (MRG) kullanılarak tespit edilebilir (Şekil 1A,B) ve tüm vücut boyunca kas liflerinin çevresinde ve içinde bulunur1. IMAT miktarı bireyler arasında büyük farklılıklar gösterir ve VKİ, yaş, cinsiyet, ırk ve yerleşiklikten etkilenir 2,3,4. Ayrıca, kas dejenerasyonu ile ilişkili patolojik durumlardaIMAT birikimi yaygın olarak görülür5 ve çok sayıda çalışma obezite, tip 2 diyabet, metabolik sendrom ve insülin direnci olan bireylerde IMAT kütlesinin arttığını belgelemiştir 6,7,8,9. Bununla birlikte, IMAT'ın hücresel ve biyolojik özellikleri henüz çözülmeye başlanmıştır. Ulaşılabilirliğin sınırlı olması ve IMAT konumlarının ve içeriğinin tüm vücuda yayılması, bu eşsiz yağ deposundan numune toplanmasını zorlaştırmıştır2. Ayrıca, numuneler toplandıktan sonra iskelet kası (SM) ile kolayca 'kontamine olur', bu da farklı dokulardan gelen biyolojik katkı arasındaki ayrımın deşifre edilmesini zorlaştırır (Şekil 1C). Bu amaçla, son on yılda büyük ilgi gören tek çekirdekli RNA dizilimi (snRNA-seq), IMAT ve SM'den türetilmiş gen ekspresyon modellerinin tek hücre çözünürlüğü ile ayrılmasına izin vermek için ideal bir metodoloji olarak hizmet eder. Ayrıca, çekirdek izolasyonu, hücrelerin bütünlüğünden ödün vermeden tek hücreli süspansiyona ayrışması imkansız olan büyük lipid yüklü adipositler nedeniyle yağ dokusu için özellikle yararlıdır. Son olarak, bu teknoloji, IMAT'a özgü adipositlerin yeni belirteçlerini keşfetme ve farklı progenitör hücre popülasyonlarının bileşimini ve varlığını ortaya çıkarmanın yanı sıra patolojik ve normal koşullarda hücre bileşiminin varyasyonunu inceleme potansiyeline sahiptir.
Şekil 1: IMAT görüntüleri. (A) orta yaşlı, zayıf bir kadın ve (B) obezitesi olan orta yaşlı bir erkekten IMAT'ın temsili manyetik rezonans (MRG) görüntüsü. Kırmızı: deri altı yağ dokusu, sarı: kas arası yağ dokusu, yeşil: iskelet kası, mavi: kemik. Resim, AdventHealth Translational Research Institute'tan Heather Cornnell'in izniyle. (C) IMAT ile taze doku örneği (kesikli siyah çizgi ile çevrelenmiş). Resim, AdventHealth Çeviri Araştırma Enstitüsü'nden Meghan Hopf ve Colorado Üniversitesi'nden Bryan Bergman'ın izniyle. Bu şekil Goodpaster ve ark.1'in izniyle değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Hayvancılık endüstrisinden, tek hücreli (sc) ve snRNA-seq10 kullanarak domuz, tavuk ve sığırlarda etin (özellikle IMAT) ebrusunu araştıran bir dizi çalışma yayınlanmıştır. Bu çalışmalar, IMAT 11,12,13'ün potansiyel progenitör hücrelerinin çeşitli adiposit alt popülasyonlarını ve belirteçlerini tanımlamıştır; ancak bu hücresel bileşimlerin insan IMAT'ına dönüşüp dönüşmediği bilinmemektedir. Bildiğimiz kadarıyla, sadece bir çalışma, snRNA-seq14 kullanılarak kalça osteoartriti olan erkek hastalardan elde edilen yağ infiltrasyonu ile insan kasının hücresel heterojenliğini incelemiştir. Araştırmacılar, büyük myonuclei14 popülasyonu içinde küçük bir adiposit popülasyonu ve birkaç fibro-adipogen progenitör (FAP) alt popülasyonu bildirdiler. Çalışmamız, snRNA-seq kullanarak hücresel kompozisyon için insan kasından manuel olarak diseke edilen IMAT'ı doğrudan sorgulamak için bir yöntem geliştiren ilk çalışmadır.
Daha da önemlisi, mevcut doku miktarı ve spesifik dokunun fiziksel özellikleri optimal işleme adımlarını belirleyeceğinden, snRNA-seq protokollerinin incelenen spesifik doku için özelleştirilmesi gerekir. IMAT için doku verimi tipik olarak küçüktür ve ultrason eşliğinde biyopsiler yapılırken bile genellikle 50 mg'ı geçmez. Bu nedenle, bu kıt dokunun uygun şekilde işlenmesi esastır. Bu protokolün, insan IMAT üzerine çalışan araştırmacılar için değerli bir kaynak olacağına inanıyoruz.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu protokol için kullanılan örnek, Batı IRB-Copernicus Grubu (WCG) Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanan ve Helsinki Bildirgesi'ne uygun olarak yürütülen Kas, Hareketlilik ve Yaşlanma Çalışması'nın (SOMMA)15 bir parçasıydı. Katılımcılar, çalışmaya katılımları için yazılı bilgilendirilmiş onam verdiler.
NOT : Bu protokol, nanowell bazlı bir platformda 100 mg insan abdominal deri altı yağ dokusu kullanılarak önceki bir protokolden uyarlanmıştır16. Mevcut protokol, damlacık tabanlı bir platform kullanılarak 50 mg insan IMAT ve kütüphane hazırlığı için optimize edilmiştir. İnsan dışı IMAT veya diğer yağ depolarından çekirdek izolasyonları için bu protokolün daha fazla optimizasyonu gerekebilir.
1. Tamponların ve reaktiflerin hazırlanması (Tablo 1 ve Tablo 2)
NOT: Deney günü tamponları taze olarak hazırlayın ve tekrar kullanmayın.
- Bir santrifüjü 4 °C'ye kadar önceden soğutun.
- Homojenizasyon tamponu ve çekirdek izolasyon ortamı hazırlayın.
- İki kova buz alın ve 2 x 15 mL konik tüpleri önceden soğutun.
- Homojenizasyon tamponu (HB) için tüm reaktifleri 15 mL'lik bir konik tüpte Tablo 1'de listelenen sırayla karıştırın. Buz üzerinde tutun. Girdap yaparak karıştırın.
- Çekirdek izolasyon ortamı (NIM) için tüm reaktifleri Tablo 2'deki sıralı listede 15 mL'lik bir konik tüpte karıştırın. Buz üzerinde tutun. Girdap yaparak karıştırın.
- 900 μL Nukalaz içermeyen suya 100 μL Triton X-100 ekleyerek Triton-X hazırlayın. Uygun karışımı sağlamak için girdap. Oda sıcaklığında (RT) saklayın.
| Reaktif | Hacim (μL) | Nihai konsantrasyon (mM) | |
| 1 katı | 2 katı | ||
| 1 M MgCl2 | 10 | 20 | 5 |
| 1 m Tris tamponu, pH 8.0 | 20 | 40 | 10 |
| 2 milyon KCl | 25 | 50 | 25 |
| 1,5 m sükroz (-4oC) | 334 | 668 | 250 |
| 1 milyon DTT | 2 | 4 | 0,001 (~1 μM) |
| 100x proteaz inhibitörü | 20 | 40 | 1 katı |
| Süperasin 20 U/μL | 40 | 80 | 0,4 U/μL |
| Nükleaz içermeyen su | 1549 | 3098 | - |
| Toplam Hacim | 2000 | 4000 | - |
Tablo 1: Homojenizasyon tamponu (HB). Buz üzerinde tutun. Girdap yaparak karıştırın.
| Reaktif | Hacim (μL) | Nihai konsantrasyon (mM) | |
| 1 katı | 2 katı | ||
| EDTA | 0.4 | 0.8 | 0.1 |
| Ribolock RNAse inhibitörü (40U/μL) | 40 | 80 | 0,8 U/μL |
| %1 BSA-PBS (-/-) | 1959.6 | 3919.2 | - |
| Toplam Hacim | 2000 | 4000 | - |
Tablo 2: Çekirdek izolasyon ortamı (NIM). Buz üzerinde tutun. Girdap yaparak karıştırın.
2. Donmuş dokunun pulverizasyonu ( Şekil 2A)
- Homojenizasyon için iş istasyonunu kurun.
- Kutuyu sıvı nitrojen (LN2) ile doldurun.
DİKKAT: LN2 ile çalışırken daima gözlük ve kriyo eldiven kullanın. - Otomatik douncer için 2 adet havan, 1 adet havan tokmağı, 1 adet mikro kepçe spatula, 1 adet cam don ve 1 adet paslanmaz çelik havan tokmağı edinin.
- Otomatik douncer'ı ayarlayın.
- Bir kabı buzla doldurun ve cam dounce'u önceden soğutun.
- Kutuyu sıvı nitrojen (LN2) ile doldurun.
- Aletleri soğutmak için 2 havan topunu (havan tokmağı ve spatula içeren) LN2 ile doldurun. LN2'nin buharlaşmasına izin verin ve tekrarlayın.
- Aletler soğurken cam doza 1 mL HB ekleyin.
- Her iki harcı da son bir kez LN2 ile doldurun ve 50 mg IMAT numunesini havanlardan birine dökün.
- Havaneli kullanarak IMAT'ı küçük parçalara ayırmak için doku parçasına hafifçe bastırarak toz haline getirin. Tüm parçaların toz haline getirildiğinden emin olun.
- LN2 , dokuyu toz haline getirirken yavaşça buharlaşacaktır. Doku düzgün bir şekilde toz haline getirildiğinde ve hala LN2'lik bir harcın 1/4 - 1/2'si kaldığında, toz haline getirilmiş dokuyu dudaktan toplamak için harcı harcın dudağına doğru eğin. LN2'nin tamamen buharlaşmasına izin verin.
- Son LN2 buharlaştıktan hemen sonra, toz haline getirilmiş dokuyu 1 mL HB içeren cam dounce içine alın.
3. Toz haline getirilmiş dokunun homojenizasyonu
- Otomatik douuncer kullanarak toz haline getirilmiş dokuyu homojenize edin. Cam dounce'ı paslanmaz çelik havaneli üzerinde ileri yönde 10 vuruş, ardından ters yönde 10 vuruş boyunca yukarı ve aşağı getirin.
- Homojenizasyondan sonra çözeltinin bulanık olduğundan ve görünür doku parçası içermediğinden emin olun. Kas dokusu ile kontaminasyon nedeniyle genellikle açık pembe bir renk beklenir.
- Homojenatı buz üzerinde önceden soğutulmuş 1,7 mL düşük bağlayıcı bir tüpe aktarın.
- Tüm malzemenin aktarıldığından emin olmak için dounce'u durulamak için 400 μL HB kullanın ve tüpe ekleyin.
NOT: Aynı anda iki numune işlenebilir. Bunu yapmak için, HB ve NIM miktarını iki katına çıkarın. Bir doku örneğini toz haline getirin ve homojenize edin ve hemen ardından izolasyon ve temizleme adımlarını paralel olarak gerçekleştirebilmek için ikinci doku örneğini toz haline getirin ve homojenize edin.
4. Çekirdek izolasyonu ve temizlenmesi (Şekil 2B)
- %0,1'lik bir konsantrasyon için homojenata 14 μL Triton-X () ekleyin.
- Tüpü buz üzerinde ve karanlıkta 10-15 dakika tutun ve her 3 dakikada bir girdap yapın.
- 50 mL'lik bir konik tüpte her biri için 100 μL RT DPBS ile bir adet 100 μm ve bir adet 40 μm hücre süzgecini (numune başına) önceden ıslatın.
- Homojenatı 100 μm hücre süzgecinden süzün.
- 1.7 mL'lik tüpü 400 μL HB ile durulayın ve 100 μm'lik hücre süzgecinden süzün.
- Ardından, çözeltiyi 40 μm hücre süzgecinden süzün.
- Her tüpte ~900 μL'ye karşılık gelen iki önceden soğutulmuş 1.7 mL düşük bağlı tüpe eşit miktarda çözelti aktarın.
- Tüpleri 4 ° C'de 2700 x g'de 10 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra görülebilen küçük bir pelet olmalıdır.
- Üst lipit tabakasını ve kalan süpernatanı çıkarın ve atın, ilk tüpten ~ 50 μL çözelti bırakın.
- İkinci tüp için tekrarlayın.
- 20 kat yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyerek ilk tüpteki peleti iyice yeniden süspanse edin ve yeni bir 1,7 mL düşük bağlamalı tüpe aktarın. Baloncuk oluşturmaktan kaçının.
- İkinci tüp için bu prosedürü tekrarlayın ve yeniden süspanse edilmiş çözeltiyi aynı tüpe aktarın.
- 500 μL NIM ekleyin ve pipetleme ile karıştırın.
- Tüpü 1000 x g'da bir terazi ile 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.
- ~50 μL bırakarak süpernatanı çıkarın ve pelet yeniden askıya alınana kadar hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. İsteğe bağlı olarak, tüpün yan tarafında bir miktar lipit kalıntısı kalırsa, yeniden askıya alınan peleti yeni bir temiz tüpe aktarın.
- 200 μL NIM ekleyin ve pipetleme ile karıştırın.
5. Çekirdek boyama ve sayım (Şekil 2C ve Şekil 3)
NOT : Sayımı kolaylaştırmak için, parlak alanı ve DAPI kanallarını ayarlamak sayımı büyük ölçüde etkileyebileceğinden, otomatik bir hücre sayacında bir 'çekirdek sayma' protokolü ayarlayın. Kanalları, enkaz değil yalnızca çekirdekler yakalanacak şekilde ayarlayın. Parlak alan kanalının yalnızca DAPI lekesi olan 'nesneleri' işaretlediğinden emin olun.
- 1 damla canlı hücre boyama solüsyonu ekleyin ve karanlıkta, buz üzerinde 15 dakika bekletin.
- Çözeltiyi 30 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün.
- Çekirdek çözeltisini pipetleme ile karıştırın ve 10 μL çözeltiyi bir hücre sayma odası slaytına ekleyin.
- Otomatik bir hücre sayacı kullanarak çekirdekleri sayın.
NOT: Optimal konsantrasyon, 1.0 x 106/mL'ye karşılık gelen 1000 çekirdek/μL'dir.- Çekirdek yığınlarının bulunmadığından emin olun, çünkü bu, tek çekirdek damlacıkları oluşturmak için çipi tıkayabilir (Şekil 3).
- Çekirdek konsantrasyonu yeterince yüksek değilse, bir pelet elde etmek için çözeltiyi 1000 ° C'de 10 dakika boyunca 4 x g'da döndürün, süpernatantı çıkarın ve daha küçük bir hacimde yeniden süspanse edin.
- Çözeltideki kalıntı derecesi yüksekse, çekirdek çözeltisini daha büyük bir NIM hacminde (yani 1 mL) yeniden süspanse edin ve tekrar 30 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün. Daha sonra 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1000 x g'da döndürün ve çekirdek konsantrasyonuna göre uygun hacimde yeniden süspanse edin.
- Çekirdek konsantrasyonunu elde ettikten sonra, doğrudan kütüphane hazırlığındaki ilk adıma geçin.
Şekil 3: İzole edilmiş çekirdeklerin boyanması. NucBlue/DAPI ile boyanmış çekirdeklerin hücre sayacından alınan görüntü (soldaki resim) ve karşılık gelen parlak alan görüntüsü (sağdaki resim). Parlak alan görüntüsünde az miktarda döküntü varlığı belirgindir. Burada kullanılan otomatik hücre sayacının ölçek çubukları ekleme seçeneği yoktur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
6. Kütüphane hazırlama ve sıralama parametreleri
- Sağlayıcının web sayfasında17 bulunan damlacık tabanlı tek çekirdek yaklaşımını kullanarak kitaplık hazırlığı için kapsamlı bir protokole bakın.
- 10.000'lik hedeflenen bir çekirdek geri kazanımını hedefleyin. Bununla birlikte, yüksek düzeyde döküntü veya kırılgan çekirdeğe sahip numuneler için, daha az sayıda çekirdeğin geri kazanılması beklenecektir.
- Numuneleri 4°C'de 2.3. adımdan sonra 72 saate kadar saklayın. Kütüphane hazırlama protokolünde paralel olarak daha fazla örneğin işlenmesini birleştirmek için. Bunu, art arda iki günde 2.3 adımına kadar iki örneği işleyerek yapın ve üçüncü günde, 4 örneği 3. adımdan itibaren kütüphane hazırlama protokolünde birlikte işleyin.
- Sıralama parametreleri: Çekirdek başına 50.000 çift uçlu okumayı hedefleyen bir sıralama platformundaki dizi.
NOT: Bu protokolde sunulan veriler, çekirdek başına 50.000 çift uçlu okuma hedeflenerek NovaSeq 6000 platformunda sıralanmıştır.
Şekil 2: Protokol iş akışı. Protokolün (A) 2. ve 3. adımlarında, (B) 4. adımında ve (C) 5. adımında iş akışının şematik gösterimi. Figür BioRender.com ile oluşturulmuştur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
7. Veri işleme ve analizi
NOT : Bu protokolde, elde edilen sıralama verilerini işlemek için kullanılan önerilen yazılımlardan ve R paketlerinden bazıları, ilk ön işlemeden sonraki adımlara odaklanılarak kısaca tanıtılmaktadır (Tablo 3). Bu çalışma, Şekil 4'te genel kalite kontrol (QC) metrikleri ve örnek bir tekdüze manifold yaklaşımı ve projeksiyonu (UMAP) sağlar. Bununla birlikte, biyoinformatik analizin derinlemesine bir açıklaması bu protokolün kapsamı dışındadır. Bu nedenle okuyucular, Heumos ve ark.18 tarafından tek hücre analizi için en iyi uygulamalar hakkındaki son incelemeye başvurabilirler.
- Sıralama verilerinin ön işlenmesi
- Tek çekirdek okumalarını insan referans genomu GRCh38 ile eşleştirin.
- Sayıma intron okumalarını dahil edin.
- Seurat R paketi19'u kullanarak verilerin QC'sini ve filtrelemesini gerçekleştirin.
- Algılanan log(10) gen sayısını, algılanan log(10) okuma sayısına bölerek bir hücre karmaşıklık puanı hesaplayın.
- Çekirdek başına tespit edilen gen sayısı, mitokondriyal okuma yüzdesi ve hücre karmaşıklığı puanı dahil olmak üzere bir histogram veya keman grafiği kullanarak en önemli QC ölçümlerini çizin.
- Çekirdek başına 200'den az veya 10.000'den fazla gen, 'dan fazla mitokondriyal okuma ve 0.8'in altında bir karmaşıklık puanı olan çekirdekleri filtreleyin.
- Verileri normalleştirin ve boyutsallığı azaltın.
- 2000 değişken özelliği kullanarak verileri normalleştirmek için Seurat'ın SCTransform işlevini kullanın.
- Seurat R paketinden aşağıdaki işlevleri kullanarak verileri kümeleyin: RunPCA, FindNeighbors, FindClusters ve RunUMAP.
- Verilerin kümelenmesini görselleştirmek için bir UMAP çizin.
- DoubletFinder R paketi20'yi kullanarak tahmin edilen çiftleri filtreleyin ve verileri yeniden kümeleyin.
- Dokuda bulunması beklenen hücre tiplerinin bilinen gen belirteçlerini kullanarak (denetimli yaklaşım) veya kümeler arasında diferansiyel olarak ifade edilen ilk 5 gene dayalı olarak (denetimsiz yaklaşım) kümeleri açıklayın.
- Ortam RNA kontaminasyonunun derecesini belirlemek ve ortam RNA'sı için gen ekspresyon matrisini ayarlamak için decontX21'ikullanın.
- Ham gen matrisini arka plan olarak ekleyin.
- Verilerin gelecekteki keşfi için Seurat nesnesini kaydedin.
NOT: Kalite kontrol ve kümeleme analizi için kod Ek Dosya 1'de mevcuttur.
| Veri iş akışında kullanılan yazılım/R paketleri | Alternatif yazılımlar/paketler | İşleme adımı |
| Hücre Korucusu | STARsolo, kallisto | Kırpma, hizalama, eşleme |
| Seurat | SingleCellExperiment, Cellranger | Kalite kontrol, analiz ve veri keşfi |
| Çift Bulucu | scds, scdblFinder, Scrublet | Çift algılama |
| DecontX | ÇorbaX, Hücre Bükücü | Ortam RNA ayarı |
Tablo 3: Veri iş akışı için yazılım/araçlar.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu iş akışı, tek çekirdek çözünürlüğünde gen ekspresyon profilleri elde etmek için donmuş insan IMAT örneklerinin işlenmesine rehberlik etmek ve hücre tipi tanımlamasını mümkün kılmak üzere tasarlanmıştır. Burada, SOMMA çalışmasına katılan bir katılımcıdan alınan temsili bir IMAT örneği sunulmaktadır.
snRNA-seq verilerinin herhangi bir analizinin ilk adımı, potansiyel olarak veri setinden çıkarılması gereken düşük kaliteli çekirdekleri belirlemek için verilerin kalitesini değerlendirmektir. Da...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
IMAT ile çalışmanın doğasında var olan birçok zorluk vardır. Sınırlı erişilebilirliğine ek olarak, numune materyalinin verimi genellikle çok azdır ve iskelet kasının "kontaminasyonundan" kaçınmak neredeyse imkansızdır. En kaliteli numuneyi elde etmek için, biyopsi iğnesi yerleştirilirken (deri altı yağ dokusunun toplanmadığından emin olmak için) kas fasyasına nüfuz edilmeli ve numuneyi alındıktan hemen sonra mikroskop altında diseksiyon yaparak mümkün olduğunca fazla kas dokusu çıkarılmalı, ardından histoloji, hızlı dond...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.
Teşekkürler
Yazarlar, Colorado Üniversitesi'nden Dr. Bryan Bergman'a, MoTrIMAT çalışmasından (R01AG077956) Şekil 1C'deki IMAT biyopsisinin görüntüsünü sağladığı için teşekkür eder. Kas, Mobilite ve Yaşlanma Çalışması'na, temsili sonuçlar bölümünde verilerin gösterildiği IMAT örneğini sağladığı için minnettarız. Ulusal Yaşlanma Enstitüsü (NIA), Kas, Hareketlilik ve Yaşlanma Çalışmasını (SOMMA; R01AG059416) ve yardımcı çalışmaları SOMMA AT (R01AG066474) ve SOMMA Knee OA (R01AG070647). Çalışma altyapısı desteği kısmen Pittsburgh Üniversitesi (P30AG024827) ve Wake Forest Üniversitesi'ndeki (P30AG021332) NIA Claude D. Pepper Eski Amerikan Bağımsızlık Merkezleri ve Wake Forest Üniversitesi'ndeki Ulusal Translasyonel Bilimi Geliştirme Merkezi tarafından finanse edilen Klinik ve Translasyonel Bilim Enstitüleri tarafından finanse edildi (UL1 0TR001420).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 0.2 ve mikro; M Corning Şırınga Filtreleri | Millipore Sigma | CLS431229 | |
| 1.7 mL DNA LoBind tüpleri | Eppendorf | 22431021 | düşük bağlamalı tüpler |
| %10 Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| 100X proteaz inhibitörü | Thermo Fisher Scientific | 78437 | |
| 10X Manyetik Ayırıcı | 10X Genomik | 230003 | |
| 10X Vorteks Adaptörü | 10X Genomik | ||
| 15 mL kanonik tüpler | Sarstedt | 6,25,54,502 | |
| 2100 Biyoanalizör | Agilent | G2939BA | |
| 50 mL konik tüpler | Sarstedt | 6,25,47,254 | |
| CellRanger | Genomics | N/A | |
| Chromium iX aksesuar kiti | 10X Genomics | PN1000323 | |
| Chromium iX Denetleyici | 10X Genomics | PN1000326 | |
| Chromium Next GEM Chip G Tek Hücre Kiti | 10X Genomik | PN1000127 | |
| Krom Sonraki GEM Tek Hücreli 3 'Jel Boncuk Kiti v3.1 | 10X Genomik | PN1000129 | |
| Chromium Next GEM Tek Hücreli GEM Kiti v3.1 | 10X Genomik | PN1000130 | |
| Kontes 3 Otomatik Hücre Sayacı | Thermo Fisher Scientific | AMQAX2000 | Otomatik hücre sayacı |
| Kontes hücre sayma odası slaytları | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| DoubletFinder | R | N/A | |
| DPBS (kalsiyum yok, magnezyum yok) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| Çift İndeks Kiti TT Set A, 96 rxns | 10X Genomik | PN1000215 | |
| Dynabeads MyOne SILANE | 10X Genomik | PN2000048 | |
| Falcon 100 ve mikro; m Hücre süzgeci | Corning Life Science | 352360 | |
| Falcon 40 & m Hücre süzgeci | Corning Life Science | 352340 | |
| Gliserin (gliserol),% 50 (h / h) Sulu Çözelti | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
| KCL | Thermo Fisher Bilimsel | AM9640G | |
| Kütüphanesi Yapı Kiti v3.1 | 10X Genomik | PN1000196 | |
| MACS SmartStrainers (30 ve mikro; m) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Mastercycler Nexus Gradient Termal döngüleyici | Eppendorf | 6331000017 | |
| MgCl2 | Ambion | AM9530G | |
| Harç ve pestel | Sağlık lojistiği | 14075 | |
| NucBlue Canlı Hazır Problar Reaktif | Thermo Fisher Scientific | R37605 | |
| Nükleaz İçermeyen Su (DEPC ile tedavi edilmemiştir) | Thermo Fisher Scientific | AM9930 | |
| Probumin Sığır Serumu Albümin Yağ Asidi İçermeyen, Toz | Sigma-Aldrich | 820024 | |
| Qiagen Tamponu EB | Qiagen | 19086 | |
| Ribolock RNAse inhibitörü | Thermo Fisher Scientific | EO0382 | |
| Seurat | R | Yok | |
| Sükroz | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| SUPERasin 20 U/&mikro; L | Thermo Fisher Scientific | AM2695 | |
| ThermoMixer C | Eppendorf | ||
| Doku homojenizatörü | Glass-Col | 099C K54 | |
| Tris tampon pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | AC327372500 | |
| UltraPure 0.5M EDTA pH 8.0 | Gibco | 15575020 |
Kaynaklar
- Goodpaster, B. H., Bergman, B. C., Brennan, A. M., Sparks, L. M. Intermuscular adipose tissue in metabolic disease. Nat Rev Endocrinol. 19 (5), 285-298 (2023).
- Sparks, L. M., Goodpaster, B. H., Bergman, B. C. The metabolic significance of intermuscular adipose tissue: Is IMAT a friend or a foe to metabolic health. Diabetes. 70 (11), 2457-2467 (2021).
- Gallagher, D., et al. Adipose tissue in muscle: A novel depot similar in size to visceral adipose tissue. Am J Clin Nutr. 81 (4), 903-910 (2005).
- Manini, T. M., et al. Reduced physical activity increases intermuscular adipose tissue in healthy young adults. Am J Clin Nutr. 85 (2), 377-384 (2007).
- Addison, O., Marcus, R. L., LaStayo, P. C., Ryan, A. S. Intermuscular fat: A review of the consequences and causes. Int J Endocrinol. 2014, 309570(2014).
- Goodpaster, B. H., et al. Obesity, regional body fat distribution, and the metabolic syndrome in older men and women. Arch Intern Med. 165 (7), 777-783 (2005).
- Goodpaster, B. H., Thaete, F. L., Kelley, D. E. Thigh adipose tissue distribution is associated with insulin resistance in obesity and in type 2 diabetes mellitus. Am J Clin Nutr. 71 (4), 885-892 (2000).
- Goodpaster, B. H., et al. Association between regional adipose tissue distribution and both type 2 diabetes and impaired glucose tolerance in elderly men. Diabetes Care. 26 (2), 372-379 (2003).
- Sachs, S., et al. Intermuscular adipose tissue directly modulates skeletal muscle insulin sensitivity in humans. Am J Physiol Endocrinol Metab. 316 (5), E866-E879 (2019).
- Ford, H., Liu, Q., Fu, X., Strieder-Barboza, C. White adipose tissue heterogeneity in the single-cell era: From mice and humans to cattle. Biology (Basel). 12 (10), 1289(2023).
- Wang, L., et al. Single-nucleus and bulk RNA sequencing reveal cellular and transcriptional mechanisms underlying lipid dynamics in high marbled pork. NPJ Sci Food. 7 (1), 23(2023).
- Li, J., et al. Identification of diverse cell populations in skeletal muscles and biomarkers for intramuscular fat of chicken by single-cell RNA sequencing. BMC Genomics. 21 (1), 752(2020).
- Lyu, P., Qi, Y., Tu, Z. J., Jiang, H. Single-cell RNA sequencing reveals heterogeneity of cultured bovine satellite cells. Front Genet. 12, 742077(2021).
- Fitzgerald, G., et al. MME+ fibro-adipogenic progenitors are the dominant adipogenic population during fatty infiltration in human skeletal muscle. Commun Biol. 6 (1), 111(2023).
- Cummings, S. R., et al. The study of muscle, mobility and aging (SOMMA): A unique cohort study about the cellular biology of aging and age-related loss of mobility. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 78 (11), 2083-2093 (2023).
- Whytock, K. L., et al. Isolation of nuclei from frozen human subcutaneous adipose tissue for full-length single-nuclei transcriptional profiling. STAR Protoc. 4 (1), 102054(2023).
- 10x Genomics. Chromium Single Cell 3' Reagent Kits User Guide (v3.1 Chemistry Dual Index), Document Number CG000315 RevE. , Available from: https://cdn.10xgenomics.com/image/upload/v1668017706/support-documents/CG000315_ChromiumNextGEMSingleCell3-_GeneExpression_v3.1_DualIndex__RevE.pdf (2022).
- Heumos, L., et al. Best practices for single-cell analysis across modalities. Nat Rev Genet. 24 (1), 550-572 (2023).
- Hao, Y., et al. Dictionary learning for integrative, multimodal and scalable single-cell analysis. Nat Biotechnol. 42 (2), 293-304 (2023).
- McGinnis, C. S., Murrow, L. M., Gartner, Z. J. DoubletFinder: Doublet detection in single-cell RNA sequencing data using artificial nearest neighbors. Cell Syst. 8 (4), 329-337 (2019).
- Yang, S., et al. Decontamination of ambient RNA in single-cell RNA-seq with DecontX. Genome Biol. 21 (2), 57(2020).
- Common considerations for quality control filters for single cell RNA-seq data. 10X Genomics. , Available from: https://www.10xgenomics.com/analysis-guides/common-considerations-for-quality-control-filters-for-single-cell-rna-seq-data (2022).
- Luecken, M. D., Theis, F. J. Current best practices in single-cell RNA-seq analysis: a tutorial. Mol Syst Biol. 15 (6), e8746(2019).
- Emont, M. P., et al. A single-cell atlas of human and mouse white adipose tissue. Nature. 603 (7903), 926-933 (2022).
- Hildreth, A. D., et al. Single-cell sequencing of human white adipose tissue identifies new cell states in health and obesity. Nat Immunol. 22 (5), 639-653 (2021).
- Whytock, K. L., et al. Single cell full-length transcriptome of human subcutaneous adipose tissue reveals unique and heterogeneous cell populations. iScience. 25 (8), 104772(2022).
- Probst, V., et al. Benchmarking full-length transcript single cell mRNA sequencing protocols. BMC Genomics. 23 (1), 860(2022).
- CG000148 Rev A Technical Note - Resolving cell types as a function of read depth and cell number. Technical note. 10X Genomics. , Available from: https://assets.ctfassets.net/an68im79xiti/6gDArDPBTOg4IIkYEO2Sis/803be2286bb a5ca67f353e6baf68d276/CG000148_10x_Technical _Note_Resolving_Cell_Types_as_Function_of_ Read_Depth_Cell_Number_RevA.pdf (2018).
- Gupta, A., et al. Characterization of transcript enrichment and detection bias in single-nucleus RNA-seq for mapping of distinct human adipocyte lineages. Genome Res. 32 (2), 242-257 (2022).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PLoS One. 13 (12), e0209648(2018).
- Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: Rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. J Am Soc Nephrol. 30 (1), 23-32 (2019).
- Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. -A., Lee, H. -O. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues. J Pathol Transl Med. 57 (1), 52-59 (2023).
- Avila Cobos, F., Alquicira-Hernandez, J., Powell, J. E., Mestdagh, P., De Preter, K. Benchmarking of cell type deconvolution pipelines for transcriptomics data. Nat Commun. 11 (1), 5650(2020).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
