Bu çalışma, kan-beyin bariyeri (BBB) açıklığını izlemek için juguler ven kateterizasyonu ile canlı sıçanları kullanan kombine manyetik rezonans görüntüleme (MRI) ve düşük yoğunluklu darbeli odaklanmış ultrason (FUS) protokolünü açıklamaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Klinik Öncesi Odaklanmış Ultrason Sistemi ile Sıçanlarda Kan-Beyin Bariyeri Açıklığının İzlenmesi
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Beyin, terapötik makromoleküler ajanların beyne verilmesini önleyen kan-beyin bariyeri (BBB) olarak adlandırılan oldukça seçici yarı geçirgen bir kan bariyerine sahiptir. MR kılavuzluğunda düşük yoğunluklu darbeli odaklanmış ultrasonun (FUS) mikro kabarcık ön enjeksiyonu ile entegrasyonu, non-invaziv ve toksik olmayan BBB modülasyonu için umut verici bir tekniktir. MRG, üstün yumuşak doku kontrastı ve vasküler geçirgenlik, perfüzyon ve MRG kontrast maddelerinin mekansal-zamansal dağılımı gibi çeşitli kantitatif değerlendirmeler sunabilir. Özellikle, gadolinyum bazlı MR kontrast ajanları ile kontrastlı MRG tekniklerinin BBB açıklıklarını tespit etmek için altın standart olduğu gösterilmiştir. Bu çalışma, bir sıçan modelinde BBB açılmasını izlemek için MRI protokollerini ve hayvan prosedürlerini içeren kapsamlı bir metodolojiyi özetlemektedir. Sıçan modeli, hızlı ilaç uygulamasını kolaylaştıran juguler ven kateteri kullanımının ek faydasını sağlar. Stereotaktik kılavuzlu bir preklinik FUS dönüştürücü, hayvan prosedürlerinin ve MRI protokollerinin iyileştirilmesini ve kolaylaştırılmasını kolaylaştırır. Ortaya çıkan yöntemler, tekrarlanabilirlik ve basitlik ile karakterize edilir ve özel cerrahi uzmanlık ihtiyacını ortadan kaldırır. Bu araştırma, sıçan modelleri ile klinik öncesi prosedürlerin optimizasyonuna katkıda bulunmayı ve nörolojik bozukluklarda terapötik müdahaleleri geliştirmek için BBB'nin modülasyonu hakkında daha fazla araştırmayı teşvik etmeyi amaçlamaktadır.
Giriş
BBB, kan damarları ve beyin dokuları arasındaki iyonların, moleküllerin ve hücrelerin hareketini düzenler1. Bu işlev, terapötik makromoleküler ajanların beyin dokularına verilmesini önlerken nöronal fonksiyonun ve sağlığın korunmasına izin verir. BBB'nin sınırlı geçirgenliği, beyin tümörleri ve Parkinson hastalığı, amyotrofik lateral skleroz ve Alzheimer hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıklar için tedavilerin etkinliğinin ve etkinliğinin azalmasına neden olabilir2. Bu nedenle, konveksiyonla güçlendirilmiş uygulama, doğrudan intrakraniyal enjeksiyonlar, ozmotik bozulma ve gelişmiş ilaç tasarımı gibi çeşitli yaklaşımlar, terapötik ajanların kontrollü verilmesi için BBB'yi atlamak için araştırılmıştır3,4,5.
Bununla birlikte, bu yaklaşımların invazivlik, enfeksiyon riski, kanama riski, heterojenlik ve hızlı ilaç akışı gibi içsel sınırlamaları vardır. Mikro kabarcıkların enjeksiyonu ile düşük yoğunluklu darbeli odaklanmış ultrason (FUS), lokalize ve geri dönüşümlü BBB bozulmasına izin veren umut verici bir non-invaziv tekniktir. Ultrasonun mikro kabarcıklarla birleştirilmiş mekanik etkileri, BBB'nin geçirgenliğini geçici olarak değiştirebilir (yani, BBB açıklığı)6,7. BBB açılmasını kullanan tedavi uygulamalarında daha fazla ilerleme için, in vivo küçük hayvan deneyleri gereklidir.
Bu çalışmada, bir sıçan modelinde BBB açılmasını izlemek için MRI protokollerini ve hayvan prosedürlerini tanıttık. Protokol, ticari bir kuruluş tarafından kanüle edilen Juguler ven kateterine sahip bir sıçan modelini içeriyordu (bkz. Juguler ven kateterizasyonunun bir sıçan modeli, hızlı ilaç uygulaması, hemodinamik izleme testleri ve stabil kateterizasyonun potansiyel faydalarına sahiptir. BBB açılması preklinik FUS sistemi kullanılarak gerçekleştirildi. Sıçanlar ve fareler gibi küçük hayvan modellerinde BBB açılması için özel olarak tasarlanan bu sistem, tezgah üstü sistem, kontrol bilgisayarı, dönüştürücü, su gazı giderici ve beraberindeki aksesuarlar gibi temel bileşenleri içerir. Bu stereotaktik kılavuzlu klinik öncesi FUS sisteminin kullanımı sadece hassasiyeti artırmakla kalmaz, aynı zamanda hayvan prosedürlerini ve MRI protokollerini düzene sokarak genel deneysel protokolün tekrarlanabilirliğine ve basitliğine katkıda bulunur.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu çalışmadaki tüm hayvan deneyleri, Kaliforniya Üniversitesi, San Francisco (UCSF) Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmada erkek Sprague-Dawley cinsi sıçanlar (200-250 g) kullanıldı. Sıçanlar, farelerde ve sıçanlarda Ulusal Sağlık Enstitüleri Hayvan Bakımı ve Kullanım Kılavuzları Ofisi'ne göre barındırıldı ve bakıldı. Reaktiflerin ve kullanılan ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Hayvan hazırlama
NOT: Ev içi işlemler için hayvanlar hazırlık odasına nakledildi ve işlemler şu şekilde yapıldı:
- Sıçanları ayrı ayrı bir Lucite odasına yerleştirin ve bilinçsiz olana kadar (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek) tıbbi bir oksijen tankından ekstrakte edilen oksijenle karıştırılmış izofluranı (% 2 -% 3) maruz bırakın.
NOT: İzofluran kullanılarak yapılan anestezi, uzun süreli bir MRG protokolünün uygulanmasını sağlar. - Fareleri hazneden çıkarın ve bir epilasyon (tüy dökücü) kremi kullanarak boynun ön ve arka bölgelerindeki tüyleri tıraş edin.
- Gözlere kayganlaştırıcı merhem sürün.
- Spontan solunumla anesteziyi sürdürmek için burnu burun konisine yerleştirin (izofluran buharlaştırıcı %2-2,5 arasında, oksijen akış ölçer 1-1,5 L/dk'ya kadar).
- Anestezi uygulanmış fareyi ısıtılmış bir ameliyat masasına yerleştirin ve bir ayak parmağı tutamıyla onaylayın.
NOT: MRG protokolü, T1 ağırlıklı gradyan eko görüntüleme ve T2 ağırlıklı spin eko görüntüleme gibi kontrastlı dizileri içeriyordu. Bu sekanslar, kan-beyin bariyeri (BBB) geçirgenliğini değerlendirmek için gadolinyum (GAD) bazlı kontrast maddelerin enjeksiyonundan önce ve sonra gerçekleştirildi. Bu, sıçan bir MRI tarayıcısındayken GAD kontrast maddelerinin uygulanmasını içerir7. Bu işlemi kolaylaştırmak için, sıçanda kanüle edilen kateterden uzanan kateter tüpleri kullanıldı. Uzatma, bir kateter konektörü ve 30 cm uzunluğunda polietilen boru içeriyordu. Açıklığı sağlamak ve sızıntıyı önlemek için, uzatma borusu heparinize gliserol (250 IU heparin / 1 mL gliserol) ile yıkandı.
2. Stereotaktik kılavuzlu odaklanmış ultrason sistemi
NOT: Hayvanlar transfer edildi ve stereotaktik bir FUS sisteminde bir masaya yerleştirildi. Sıçanın burnu, anesteziyi sürdürmek için burun konisine yerleştirildi. FUS sistemi bir fonksiyon üreteci, bir RF amplifikatörü ve bir osiloskop içerir. Dönüştürücüyü kurmadan önce, tüm cihazların sisteme doğru şekilde bağlanmasını sağladık. Dönüştürücü kurulumu aşağıdaki adımlar kullanılarak tamamlandı:
- Bregma'nın kafatasındaki konumuna keskin bir işaretçi yerleştirin ve konumu kaydedin. Bregma'nın konumu, orta hat8'de Lambda'nın 9.0 mm önündeki konumu işaret edilerek tanımlanabilir. Lambda, iki taraflı kulak zarları arasındaki çizginin merkezinde bulunabilir9.
- Ultrason jelini farenin kafasına, su bağlantı torbasına ve dönüştürücüye (1 MHz frekansı) yerleştirin. Farenin derisi, su bağlantı torbası ve dönüştürücü arasında hava kabarcığı olmadığından emin olun.
- Dönüştürücünün bir koaksiyel BNC kablosunu FUS sistem modülünün girişine bağlayın.
- Bir kontrol bilgisayarında) Önceden kaydedilmiş fare görüntüleri için yükle'ye tıklayın; Bir dizi odak noktası ve akustik basınç seçilir.
- Bir kontrol bilgisayarında) Dönüştürücünün bir patlama periyodu içinde noktalar arasında geçiş yapabilmesini sağlamak için tedavi modülündeki hareket testine tıklayın.
- 3. adımda açıklanan sonikasyon parametrelerini ayarlayın.
3. Mikro kabarcık infüzyonu ve sonikasyon
- Mikro kabarcığı etkinleştirin.
NOT: Bu çalışmada kullanılan mikro kabarcık, 1,7 μm çap ve mililitre başına 0,2 × 109 partikül konsantrasyonu ile karakterize edilmiştir10. Mikro kabarcık şişesi, satıcı tarafından sağlanan reçete talimatlarına ve daha önce yayınlanmış bir report11'e dayalı olarak etkinleştirildi.- Luer kilit uçlu 5 mL'lik bir şırınga hazırlayın ve 5 mL katkısız% 0.9 sodyum klorür enjeksiyonu ile doldurun.
- Yeşil kapağı çıkarın ve şırıngayı saat yönünde çevirerek havalandırmalı dağıtım pimine (Malzeme Tablosuna bakın) bağlayın.
- Pim korumasını çıkarın ve şişenin lastik tıpasının ortasına yerleştirin. Sivri uç durdurucuya tam olarak girene kadar sıkıca bastırın.
- Piston çubuğunu iterek 5 mL'lik şırınganın tamamını şişeye boşaltın.
- Tüm içeriği karıştırmak için şişeyi 20 saniye kuvvetlice çalkalayın. Tutarlı beyaz, sütlü bir sıvı, kükürt heksaflorür lipid mikro kürelerinin oluştuğunu gösterecektir.
- Gerekli dozu elde etmek için, şırıngayı ters çevirin ve istenen süspansiyon hacmini 5 mL'lik bir şırıngaya yavaşça çekin.
- Bir infüzyon pompası kullanın.
NOT: İnfüzyon yaklaşımı12, bir şırınga pompası kullanılarak sıçanlara mikro kabarcıklar vermek için kullanıldı. Mikro kabarcıklar içeren bir şırınga, sıçanın içine yerleştirilen bir kateter konektörüne bağlandı. Mikro kabarcıklar polietilen borulardan aktarıldı ve infüzyon pompası akış hızı 0.66 mL/dk'ya ayarlandı. Bu infüzyon hızı, 3 mL'lik bir şırıngadan 3 dakika boyunca 2 mL mikro kabarcıkların enjeksiyonuna izin verir. İnfüzyon 1 dakika boyunca sonikasyondan önce başladı ve 2 dakikalık sonikasyon süresi boyunca devam etti. - Sonikasyon gerçekleştirin.
NOT: Bu çalışmada, FUS darbeleri aşağıdaki parametrelerle seçilmiştir: (1) Hedef bölge: sol hipokampus; (2) Nokta sayısı: Beyindeki hipokampusu örtmek için 6; (3) Seri çekim uzunluğu: 10 ms; (4) Patlama süresi: 1200 ms; (5) Akustik basınç: 0,65 MPa; (6) FUS sistemindeki sonikasyon modu menüsünde 'Patlama modu'; (7) Sonikasyon süresi: 120 s.
4. 3T preklinik tarayıcı kullanarak MRG prosedürü
- Sonikasyondan sonra, hayvanları klinik öncesi 3T kriyojen içermeyen bir tarayıcıda bir masaya aktarın.
- Fareleri yüzüstü pozisyonda konumlandırın. Tarayıcıdaki ısıtma yastığının sıcaklığını koruyun ve pnömatik bir yastık sensörü kullanarak solunum hızını izleyin. Çeşitli MR görüntüleme türlerini test etmek için MRI protokolünü uygulayın (Tablo 1).
- Çeşitli görüntüleme çalışmaları için potansiyel pratikliğini göstermek için kontrastlı MRG'ye ek olarak difüzyon ağırlıklı görüntüleme (DWI), T2* haritalama, T1 haritalama ve dinamik kontrastlı (DCE) MRI gibi diğer kantitatif görüntüleme tekniklerini dahil edin. Bu çalışmada kullanılan MRG protokolleri için Tablo 1'e bakınız.
- T1 ağırlıklı MR gradyan eko sekansından sonra GAD bazlı MRG kontrast ajanları (Gadavist, 1 mmol / kg) enjekte edin ve GAD sonrası görüntüler elde edin.
NOT: 200 g'lık bir sıçan için 200 μL MRI kontrast maddesi enjekte ettik ve ardından hortumu yıkamak için 200 μL'lik bir salin solüsyonu ile takip ettik.
5. Sıçan beyninin makroskopik incelemesi
NOT: MRI taramasından sonra, 2 mL Evans mavisi çözeltisi (% 2'si fosfat tamponlu salin ile seyreltilmiş) enjekte edildi ve çözeltinin yayılmasına ve vücuda yayılmasına izin vermek için sıçanın en az 30 dakika dinlenmesine izin verildi. Daha sonra, sıçanlar, beynin makroskopik muayenesi için (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri takiben) aşırı dozda izofluran (% 5) kullanılarak ötenazi yapıldı. Ötenaziyi doğrulamak için ayak parmağına delme işlemi yapıldı ve hayvanın en az 1 dakika boyunca solunumunun durduğu gözlemlendi. Perfüzyon prosedürü uygulandı, ardından sıçan beyninin muayenesi yapıldı. Perfüzyon işlemi şu şekilde özetlenebilir:
- Göğüsteki organları ortaya çıkarmak ve kardiyak bölgeyi görselleştirmek için bir cerrahi makas kullanarak torakotomi yapın.
- Sağ atriyumu kesin (~ 5 mm).
- Perfüzyon amacıyla sol ventriküle salin solüsyonu verin.
- Beyni ortaya çıkarmak ve sunmak için kafatası kemiğini cerrahi bir makasla açın.
NOT: Yeterli perfüzyon, beynin eşit derecede parlak bir görünümüne neden olurken, kalıcı mavi alanlar, Evans mavisi tarafından tespit edildiği gibi BBB ile ilişkili albümin sızıntısını gösterir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu çalışma, ticari bir hayvan FUS sistemi kullanılarak sıçır modelinde KKB açılımının izlenmesi için preklinik bir protokol sunmaktadır. FUS sistemi bir tezgah veya büyük bir taşıma arabası üzerine kurulmuştur (Şekil 1). Sıçanlar, transdüser tutucuya sahip çerçevedeki burun konisi aracılığıyla oksijenle karıştırılmış isofluran ile anestezi altına alınmıştır. Akustik kavitasyonu tespit etmek için 500 kHz'de rezonansa giren bir hidrofon, 1.0 MHz rezonans frekanslı FUS transdüserine yerleştiril...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
BBB açma çalışmaları için sıçan juguler ven kateterizasyonu modelini kullanan bir protokol ve hayvan prosedürü geliştirilmiştir. Çok sayıda klinik öncesi protokol mevcut olsa da, bu protokol ticari olarak temin edilebilen bir FUS sistemi ve bir sıçan modeli içerir, hayvan hazırlama prosedürlerini en aza indirir ve böylece deneysel tekrarlanabilirliği sağlar.
Bu protokolde, mikro kabarcık seçimi, stabilitesine ve oda sıcaklığında depolanmasına dayanıyordu. Diğer ticari mikro kabarcıklar alterna...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların beyan edecekleri ilgili herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, Ulusal Diş ve Kraniyofasiyal Araştırma Enstitüsü (NIDCR) Hibe K99DE032397, UCSF Bölüm Tohum Hibesi (No. 7504831), UCSF RAP hibesi (PI: Kazım Narsinh, MD) ve Alman Araştırma Vakfı (DFG, GA 3535/1-1) tarafından kısmen desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1 mL şırınga | BD plastipak | ||
| 20 mL, Sodyum Klorür %0.9 | Hospira, Inc | 00409-7101-67 | |
| 3 mL şırınga | BD plastipak | ||
| 5 mL şırınga | BD plastipak | ||
| Künt İğne, 21 G | SAI infüzyon teknolojileri | B21-50 | |
| Kateter konektörü, 21 G | SAI infüzyonu teknolojiler | CC-25-25 | |
| Kateter kilit çözümü | SAI infüzyon teknolojileri | Sku # HGS-10 | (500 &mikro; / mL) Gliserol |
| Evans Mavi | Sigma aldrich | E2129-10g | |
| ExAblate Neuro | Insightec Inc., İsrail | ||
| Gadavist | Bayer | 2068062 | |
| GE izofluran Buharlaştırıcı | GE Healthcare | ||
| IPS-12RS Şırınga Pompası | Inovenso | IPS-12 | |
| izofluran USP | Vet one | 501017 | |
| Lumason microbbuble | Bracco Diagnostics Inc | SKJ709700 | |
| Erkek Sprague-Dawley sıçanları (200 – 250 g) | Charles River Laboratories | ||
| İğne, 18 G | BD Precisionglide | ||
| Fosfat tamponlu tuzlu su | Mediatech | 21-030-CVR | |
| Polietilen Boru | BD Intramedic | ||
| preklinik 3T kriyojen içermeyen Bruker Biospin tarayıcı | Bruker | Biospec3T | |
| Juguler ven kateterizasyonu ile sıçan | Charles River Laboratories | ||
| RK-50 odaklanmış ultrason dönüştürücü | FUS Instruments | Tx-50-1000-0 | |
| RK-50 tezgah üstü odaklı ultrason sistemi | FUS Instruments | ||
| Sonic Concepts | Sonic Concepts Inc., WA, ABD | ||
| Havalandırmalı Dağıtım Pimi ve nbsp; | B Braun | 4550560 |
Kaynaklar
- Daneman, R., Prat, A. The Blood-Brain Barrier. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (1), a020412(2015).
- Meng, Y., et al. Applications of focused ultrasound in the brain: from thermoablation to drug delivery. Nat Rev Neurol. 17 (1), 7-22 (2021).
- Mungur, R., et al. Low-intensity focused ultrasound technique in glioblastoma multiforme treatment. Frontiers in Oncology. 12, 903059(2022).
- Boado, R. J., et al. Pharmacokinetics and brain uptake of a genetically engineered bifunctional fusion antibody targeting the mouse transferrin receptor. Mol Pharm. 7 (1), 237-244 (2010).
- Hendricks, B. K., et al. Novel delivery methods bypassing the blood-brain and blood-tumor barriers. Neurosurgical Focus. 38 (3), E10(2015).
- Hynynen, K., et al. Non-invasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220 (3), 640-646 (2001).
- Hynynen, K., et al. Local and reversible blood-brain barrier disruption by non-invasive focused ultrasound at frequencies suitable for trans-skull sonications. NeuroImage. 24 (1), 12-20 (2005).
- Yao, X., et al. Non-invasive, targeted creation of neuromyelitis optica pathology in AQP4-IgG seropositive rats by pulsed focused ultrasound. J Neuropathol Exp Neurol. 78 (1), 47-56 (2019).
- Cecyn, M. N., Abrahao, K. P. Where do you measure the Bregma for rodent stereotaxic surgery. IBRO Neurosci Rep. 15, 143-148 (2023).
- Kotopoulis, S., et al. SonoVue vs. Sonazoid vs. Optison: Which bubble is best for low-intensity sonoporation of pancreatic ductal adenocarcinoma. Pharmaceutics. 14 (1), 98(2022).
- Bracco Diagnostics Inc. LUMASON (sulfur hexafluoride lipid-type A microspheres) for injectable suspension, for intravenous use or intravesical use. , Lumason - accessdata.fda.gov. (2016).
- Lapin, N. A., et al. Consistent opening of the blood brain barrier using focused ultrasound with constant intravenous infusion of microbubble agent. Sci Rep. 10, 16546(2020).
- Vlachos, F., et al. Permeability dependence study of the focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening at distinct pressures and microbubble diameters using DCE-MRI. Magn Reson Med. 66 (3), 821-830 (2011).
- Singh, A., et al. An all-ultrasound cranial imaging method to establish the relationship between cranial FUS incidence angle and transcranial attenuation in non-human primates in 3D. Sci Rep. 14 (1), 1488(2024).
- Plaksin, M., et al. Magnetic resonance imaging analysis predicts nanoparticle concentration delivered to the brain parenchyma. Commun Biol. 5 (1), 1-11 (2022).
- Singh, A., et al. Guiding and monitoring focused ultrasound mediated blood-brain barrier opening in rats using power Doppler imaging and passive acoustic mapping. Sci Rep. 12 (1), 14758(2022).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
