Yöntem makalesi

Tam Kandan Yüksek Derecede Canlı İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinin İzolasyonu ve Dondurularak Saklanması: Yeni Başlayanlar İçin Bir Kılavuz

DOI:

10.3791/66794

⸱

25 Ekim 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, University of California San Diego, 2Department of Medical Biochemistry, Amsterdam Immunity and Infection: Inflammatory diseases; Amsterdam Cardiovascular Sciences: Atherosclerosis and Ischemic Syndrome, Amsterdam UMC location University of Amsterdam, 3Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California San Diego, 4Division of Clinical Immunology & Rheumatology, Department of Medicine, Heersink School of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 5Comprehensive Arthritis, Musculoskeletal, Bone and Autoimmunity Center, Heersink School of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 6Department of Medicine, University of California San Diego

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, aşağı akış analizleri ve akış sitometrisi ve RNA dizilimi gibi iş akışları için uygun periferik kan mononükleer hücrelerinin toplanması, saklanması ve çözülmesi için erişilebilir bir kılavuz sunar. Plazma ve buffy coat koleksiyonları da sergilenmektedir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler), bağışıklık sistemi ve hastalık ve patojenlere tepkisi üzerine biyomedikal araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu ayrıntılı protokol, akış sitometrisi ve RNA dizilimi gibi aşağı akış uygulamaları için uygun olan tam kan hücrelerinden yüksek kaliteli ve yüksek derecede canlı PBMC'leri izole etmek, kriyopreservasyon ve çözmek için ekipmanı, malzemeleri ve adımları açıklar. Tam kandan plazma ve buffy coat için PBMC'lerle paralel ve eş zamanlı olarak işleme protokolleri de tanımlanmıştır. PBMC'leri izole etmek için yoğunluk gradyan santrifüjlemeyi kullanan, takip etmesi kolay adım adım protokole, malzeme, ekipman ve hazırlık adımlarından oluşan bir kontrol listesi eşlik eder. Bu protokol, laboratuvar teknikleri konusunda daha önce herhangi bir deneyimi olan kişiler için uygundur ve klinik veya araştırma laboratuvarlarında uygulanabilir. Yüksek kaliteli hücre canlılığı ve RNA dizilimi, bu protokolü kullanarak daha önce laboratuvar deneyimi olmayan operatörler tarafından toplanan PBMC'lerden kaynaklandı.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC'ler) tam kandan izolasyonu için erişilebilir bir yöntem ve iş akışı gösterir. Bu protokol, laboratuvar teknikleri konusunda önceden eğitim almadan PBMC'lerin toplanmasını ve dondurularak saklanmasını kolaylaştırmak amacıyla özellikle acemi araştırma teknisyenlerine, öğrencilere ve klinik laboratuvar personeline yöneliktir.

Bu protokol, tam kanın bileşenlerini yoğunluğa göre ayırmak için santrifüjlemeyi kullanır. Tam kan, azalan yoğunluk sırasına göre listelenen dört ana bileşenden oluşur: kırmızı kan hücreleri/eritrositler (hacmin ~%45'i), beyaz kan hücreleri (hacmin %<1'i), trombositler (hacmin %<1'i) ve plazma (hacmin ~%55'i)1,2,3,4,5,6. Beyaz kan hücreleri, çekirdek özelliklerine göre iki kategoriye ayrılabilir: yuvarlak veya çok çekirdekli6. PBMC'ler yuvarlak çekirdekli beyaz kan hücreleri olarak tanımlanır ve aşağıdaki hücre tiplerinden oluşur: lenfositler (T hücreleri, B hücreleri, NK hücreleri), dendritik hücreler ve monositler6. Çok çekirdekli beyaz kan hücreleri, aşağıdaki hücre tiplerinden oluşan granülositleri içerir: nötrofiller, bazofiller ve eozinofiller6. Çok çekirdekli beyaz kan hücreleri PBMC'lerden daha yoğundur6. Tam kanın her bir bileşeninin yoğunlukları Tablo 1'de detaylandırılmıştır.

Bu protokolde tam kan, yoğunluk gradyanlı santrifüj tüplerinde toplanır. Bu tüpler, yoğunluğu 1.077 g/mL olan önceden paketlenmiş bir yoğunluk gradyan ortamı içerir. Santrifüjlemeyi takiben, çok çekirdekli beyaz kan hücreleri ve eritrositler dahil olmak üzere daha yoğun hücreler, yoğunluk gradyan ortamı ile PBMC'lerden ve trombositlerden ayrılır (Şekil 1A)6,7. PBMC ve trombosit fraksiyonu daha sonra toplanır, yıkanır ve trombositleri çıkarmak için santrifüjlenir. Elde edilen saflaştırılmış PBMC'ler -80 °C'de veya sıvı nitrojen içinde toplanır ve saklanır. Dondurularak saklanmış PBMC'ler canlı bir şekilde çözülebilir ve doğrudan aşağı akış analizlerinde kullanılabilir veya belirli bileşen hücre tiplerini izole etmek için ek olarak işlenebilir.

Bu protokol, son derece uygulanabilir PBMC'lerden yüksek kaliteli RNA dizilimi için optimize edilmiştir. Bu makalede, PBMC'ler bir poliklinikte hastalardan izole edildi ve dondurularak saklandı. Daha sonra, monositler FACS ile PBMC'lerden izole edildi ve RNA dizileme yoluyla analiz edildi. Bununla birlikte, protokol, hücre kültürü, gen düzenleme, ex-vivo fonksiyonel çalışmalar, tek hücre analizleri, uçuş zamanına göre akış sitometrisi veya sitometri ile fenotipleme, DNA / RNA veya proteinlerin izolasyonu, immünohistokimya için slaytlar gibi diğer deneysel ihtiyaçlara geniş çapta uyarlanabilir 8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18.

Yoğunluk gradyanlı santrifüj tüplerinden PBMC toplamaya ek olarak, bu protokol, bir EDTA tüpü kullanılarak santrifüjleme yoluyla plazma ve buffy coat nasıl toplanacağını gözden geçirir. Santrifüj işleminden sonra tam kan plazma, eritrositler ve lökosit içeren buffy coat adı verilen ince bir arayüz tabakasına ayrılır (Şekil 1B)6. Buffy ceket, DNA ekstraksiyonu ve sonraki genomik analizler için yaygın olarak kullanılır19,20. Plazma tabakası, tam kanın hücresiz bileşenlerini içerir ve biyobelirteç testleri için kullanılabilir21,22.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çalışma protokolü UCSD ve KUMC İnsan Koruma Programı tarafından onaylanmıştır ve Helsinki Bildirgesi'ne uygundur. Tüm bireyler katılım ve kan alımı için bilgilendirilmiş onam verdi.

1. PBMC'lerin işlenmesi ve dondurularak saklanması

  1. Kan alımından bir gün önce, Tablo 2'de listelenen malzeme ve reaktiflerin kontrol listesini yazdırın ve buna göre hazırlayın ve etiketleyin.
    NOT: Bu protokol, 6 yoğunluk gradyanlı santrifüj tüpünün toplanması için tasarlanmıştır. Her tüp yaklaşık 12 milyon PBMC verir ve bunların yaklaşık %50'si ve %20'si sırasıyla canlı lenfositler ve monositler olacaktır. Deneysel ihtiyaçlar için uygun şekilde ölçeklendirin. Mutlak hücre sayısının hastalar veya tedavi koşulları arasında önemli ölçüde farklılık gösterebileceğini unutmayın.
  2. Standart flebotomi tekniğini kullanarak, tam kanı 6 yoğunluk gradyanlı santrifüj tüpünde ve 1 EDTA tüpünde yaklaşık 6 mL hacim dolana kadar toplayın.
    NOT: Birden fazla hastadan veya tedavi koşullarından alınan numuneler gerekiyorsa, toplanan tüpler 4 saate kadar saklanabilir ve daha sonra aynı anda işlenebilir.
  3. Toplandıktan sonra, tüm tüpleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 1.800 x g'da santrifüjleyin.
    NOT: Bir santrifüjün nasıl çalıştırılacağına dair bir gösteri için Ek Video 1'e bakın.
  4. Santrifüjlemeden sonra, yoğunluk gradyanlı santrifüj tüpünü dikkatlice açın. Plazma içeren yarı saydam sarı tabakayı çıkarmak ve atmak için bir transfer pipeti kullanın. Puslu hücre tabakasını doğrudan yoğunluk gradyan ortamının üzerinde rahatsız etmeyin. Dikkatli olun, PBMC'leri atmak yerine fazla plazma bırakın. Tüm tüpler için tekrarlayın.
    NOT: Yoğunluk gradyan ortamını içeren tüpün santrifüjlenmesinden sonra, plazma ve PBMC'ler yoğunluk gradyan ortamının üzerinde olacaktır; Eritrositler ve granülositler dibe çökecektir. Görselleştirme için Şekil 1A'ya bakın.
  5. Yeni bir transfer pipeti ile, her tüpte kalan hacmi içeren hücreleri ve artık plazmayı, yoğunluk gradyan ortamının üzerinde birkaç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.
  6. Yeniden süspansiyondan sonra, tüpün yeniden askıya alınmış içeriğini etiketli 50 mL'lik konik bir tüpe pipetleyin. Tüm tüpler için tekrarlayın.
  7. Çözelti 1'i (RPMI Medium) 50 mL çizgisine ulaşana kadar 50 mL'lik tüpe dökün.
  8. Gerektiğinde her hasta veya tedavi durumu için 1.4 ila 1.7 arasındaki adımları tekrarlayın.
    NOT: Farklı numunelerin karıştırılmadığından emin olun ve kontaminasyonu önlemek için yeni bir transfer pipeti kullanın.
  9. 50 mL'lik tüpü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
    NOT: Bölüm 2'de detaylandırılan plazma ve buffy toplama protokolü bu süre zarfında tamamlanabilir.
  10. Mümkün olduğu kadar çok süpernatanı atın. Kalan damlaları çıkarmak için gerektiği kadar dokunun.
    NOT: Santrifüjlemeden sonra, pelet PBMC'ler içerir ve süpernatant trombositler ve artık plazma içerir.
  11. PBMC peletini içeren 50 mL konik tüpe 15 mL'lik bir Çözelti 2 tüpü (RPMI Orta +% 12.5 İnsan Serum Albümini + 1 μM Flavopiridol) dökün. Hücre peletini yeniden süspanse etmek için tüpü yavaşça ters çevirin.
  12. Bir transfer pipeti kullanarak 15 mL Çözelti 3'ü (RPMI Orta +% 11.25 İnsan Serum Albümini + 1 μM Flavopiridol +% 10 DMSO) aspire edin. 50 mL'lik tüpe damla damla ekleyin.
    NOT: Çözelti 3, oda sıcaklığında hücreler için toksik olan DMSO içerir. Hemen işlenmeye hazır olana kadar Çözüm 3'ü eklemeyin.
  13. Karıştırmak için tüpü 3 kez hafifçe ters çevirin.
  14. Önceden etiketlenmiş ve önceden soğutulmuş her bir kriyoviali, çok dağıtımlı bir pipet kullanarak 1 mL PBMC ile doldurun.
    NOT: Çok dağıtımlı bir pipetin nasıl çalıştırılacağına ilişkin bir gösteri için Ek Video 2'ye bakın.
  15. Kriyovialleri önceden soğutulmuş bir dondurma kabına yerleştirin. Ardından kabı -80 °C'lik bir dondurucuya taşıyın.
  16. Gerektiğinde her hasta veya tedavi durumu için 1.9 ila 1.13 arasındaki adımları tekrarlayın.
  17. Kriyoviyalleri dondurma kabının içinde en az 12 saat tutun, ardından -80 °C'de etiketli bir saklama kutusuna aktarın.
    NOT: Alternatif olarak, donmuş kriyoviyalleri uzun süreli depolama için sıvı nitrojene (<-135 °C) aktarın.

2. EDTA tüplerinden plazma ve buffy coat işlenmesi

  1. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1.800 x g'da santrifüjleyin.
    NOT: Santrifüjlemeden sonra, üst tabaka plazmadan oluşur, alt tabaka eritrositler içerir ve arayüz buffy coat olacaktır. Görselleştirme için Şekil 1B'ye bakın.
  2. Yeni bir transfer pipeti kullanarak, buffy coat tabakasını bozmadan mümkün olduğunca çok plazma hazırlayın. Ardından, 0.5 mL alikotları önceden etiketlenmiş kriyoviyallere dağıtın. Buffy coat tabakasını aspire edin ve uygun şekilde etiketlenmiş kriyoviyal katmana aktarın.
    NOT: Bazı plazma ve eritrositler buffy coat koleksiyonunu kontamine edebilir.
  3. Gerektiğinde her hasta veya tedavi durumu için adım 2.2'yi tekrarlayın.
  4. Toplandıktan sonra kriyovialleri -80 °C'lik bir dondurucuda saklayın.
    NOT: Alternatif olarak, uzun süreli depolama için sıvı nitrojen (<-135 °C) içinde saklayın.

3. PBMC'lerin çözülmesi

  1. Çözdürmeden bir gün önce, Tablo 3'te listelenen malzeme ve reaktiflerin bir kontrol listesini yazdırın ve buna göre hazırlayın ve etiketleyin.
    NOT: Bu protokol, 1 mL PBMC içeren 1 1.5 mL tüpün çözülmesi için tasarlanmıştır. Her tüp yaklaşık 2 milyon PBMC verir ve bunların yaklaşık %50'si ve %20'si sırasıyla canlı lenfositler ve monositler olacaktır. Deneysel ihtiyaçlar için uygun şekilde ölçeklendirin. Mutlak hücre sayısının hastalar veya tedavi koşulları arasında önemli ölçüde farklılık gösterebileceğini unutmayın.
  2. Dondurulmuş PBMC'leri kuru buz kullanarak depodan aktarın ve 37 °C'lik bir inkübatörde 4 dakika veya son buz kristalinin çözülmesinden hemen önce çözdürün.
    NOT: İstenirse, Bölüm 4'te detaylandırıldığı gibi hücre sayımı ve canlılık ölçümleri için bir alikot alınabilir.
  3. Çözüldükten sonra, her kriyovial'e 1 mL Çözelti 4 (PBS + 2 mM EDTA) ekleyin. Ardından, içeriği, çözülen her PBMC tüpü için 10 mL Çözelti 4 içeren önceden etiketlenmiş 50 mL'lik bir tüpe dökün. Kalan damlaları çıkarmak için dokunun.
  4. Hücre süzgecini boş 50 mL'lik tüpe yerleştirin ve ardından hücre süspansiyonunu hücre süzgecinden dökün.
    NOT: Gerekirse, yüzey gerilimini kırmak için hafifçe vurun.
  5. Süzülmüş hücreleri içeren her bir tüpü oda sıcaklığında 7 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin.
  6. Santrifüjlemeden sonra, DMSO içeren süpernatanı dökün. Kalan damlaları çıkarmak için gerektiği kadar dokunun.
  7. Hücre peletini, aşağı akış deneysel ihtiyaçları için uygun olan istenen ortamda (örneğin, hücre kültürü ortamı, akış sitometrisi, antikor kokteyli, vb.) yeniden süspanse edin.

4. Hücre sayımı ve canlılığı

  1. Adım 3.2'de donmuş PBMC'ler çözüldükten hemen sonra, 20 μL hücreyi 1.5 mL'lik bir tüpe pipetleyin. Eşit hacimde %0,4 Tripan Mavisi çözeltisi ekleyin ve karıştırmak için 3-4 kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.
  2. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak, hücreleri saymak ve canlılığı değerlendirmek için üreticinin protokolünü izleyin. 2 seyreltme faktörünün hesaba katıldığından emin olun.
    NOT: Başka bir yerde açıklandığı gibi, hücre sayısını ve canlılığını değerlendirmek için alternatif bir yöntem olarak bir hemositometrekullanılabilir 23.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PBMC toplama ve kriyoprezervasyonun ardından, 56 benzersiz numuneden çözülmüş PBMC'lerin, monositlerin ve lenfositlerin canlılığı, üreticilerin talimatlarına göre Tablo 4'te listelenen reaktifler kullanılarak akış sitometrisi ile değerlendirildi (Şekil 2A-F

<>
<
<
>






Yoğunluk gradyan santrifüj diyagramında kan bileşeni ayrımı; plazma, PBMC'ler, buffy kaplama katmanları.

Akış sitometrisi dağılım grafikleri; PBMC'ler, monositler, lenfositler; canlılık analizi, hücre tipi grafiği.

FastQC veri analizi grafikleri; Milyon Dizi ve Hizalanabilir, GC İçerik Dağıtımı.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PBMC toplama ve kriyoprezervasyon için bu protokol, önceden araştırma laboratuvarı eğitimi almış ve almamış kişiler tarafından başarıyla uygulanmıştır. Uygulamamızda, depolanmış PBMC'lerden saflaştırılan yüksek derecede canlı monositlerin FACS ve RNA dizilemesi, yüksek kaliteli dizilerle sonuçlandı.

Bu protokolün önemli bir gücü erişilebilirliğidir. Protokolde sunulan teknik, katı yoğunluklu gradyan bir ortamla önceden paketlenmiş tüpleri kullanır. Sonuç olarak, tam kan doğrudan tüpe toplanabilir ve daha sonra PBMC'leri izole etmek için hemen işlenebilir. Reaktiflerin hazırlanabileceği araştırma laboratuvarı ile numunelerin toplandığı ve işlendiği klinik laboratuvar arasındaki işbirliğini kolaylaştıran nispeten az sayıda hazır çözelti ve özel ekipmana ihtiyaç vardır. Yazılı ve video protokolleri, herhangi bir eğitim seviyesindeki operatörlere yöneliktir.

Bu protokol, PBMC'leri izole etmek için taze tam kan kullanır ve bu nedenle, %>90 gibi nispeten yüksek bir beklenen verim ve saflığa sahip olsa da, %>98 gibi olağanüstü yüksek saflıklar gerektiren uygulamalar için uygun olmayabilir26,27. Ayrıca, yoğunluk gradyanlı santrifüjleme tüplerinin elde edilmesi, özellikle çok sayıda numunenin toplanması gerekiyorsa, maliyetli olabilir.

PBMC toplamanın alternatif yöntemleri arasında bir sıvı yoğunluğu gradyan ortamının kullanılması veya immünomanyetik tükenme28,29 bulunur. Kısaca, birincisi, heparinize tam kan altında önceden hazırlanmış bir yoğunluk gradyan ortamının katmanlanmasını ve ardından santrifüjlemeyi içerir. İkincisi, PBMC olmayanları etiketlemek için manyetik olarak etiketlenmiş antikorları kullanır ve bunlar daha sonra etiketlenmemiş PBMC'ler etkilenmeden geçerken manyetik bir sütunda tutulur.

Sunulan protokole göre, bir sıvı yoğunluk gradyan ortamının kullanılması hem daha az maliyetlidir hem de yoğunluk gradyan santrifüjleme tüplerinin olmaması nedeniyle çok daha az malzeme gerektirir; PBMC izolasyonu standart 50 mL'lik bir tüpte8 gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte, bu teknik daha ayrıntılıdır, daha uzun bir işlem süresine sahiptir ve daha yüksek bir kullanıcı hatası riskine tabi olabilir. Aşırı seyreltmeyi önlemek için heparin hassas bir şekilde eklenmelidir ve iyi bir PBMC ayrımı sağlamak için yoğunluk gradyan ortamı doğru miktarlarda dikkatli bir şekilde katmanlanmalıdır26.

Sunulan protokole göre, immünomanyetik tükenme kullanımı daha yüksek verim ve saflık, santrifüjleme eksikliği nedeniyle daha az kullanım, daha hızlı işlem süresi sunar ve çok daha az malzeme gerektirir 30,31,32. Bununla birlikte, ana dezavantajı, bu yöntemin, özellikle ölçekte, açıklanan üç yöntemden en maliyetli olanı olmasıdır.

Bu protokol sağlam olsa da, bazı kritik adımlar ek dikkat gerektirebilir. Protokol boyunca, özellikle aynı anda birden fazla hasta veya durumla çalışırken, numunelerin karıştırılmadığından ve uygun şekilde etiketlenmiş tüplere yerleştirildiğinden emin olun. Adım 1.4 için hiçbir PBMC'nin atılmadığından emin olun; fazla plazma yalnızca PBMC'lerin konsantrasyonunu azaltacaktır, bu da numune canlılığını ve kalitesini korumada daha az kritiktir. Ayrı olarak, toplanan PBMC'lerde çökeltilerin varlığı, yoğunluk gradyan ortamının parçalarının yerinden çıktığını göstermektedir. Bu sorunu önlemek için adım 1.5'te daha nazikçe pipetleyin. Adım 1.10 ve 3.6'da, santrifüjlenmiş hücre peletinin atılmadığından emin olun. Çözelti 3, oda sıcaklığında33 hücreler için toksik olan DMSO içerdiğinden, adım 1.12 ve 3.3 için hızlı bir şekilde çalışmak kritik öneme sahiptir. PBMC'lerin sıvı nitrojen içinde depolanmasının -80°C'de depolama yerine tavsiye edildiğine dikkat etmek de önemlidir. -80 ° C'de uzun süreli depolama, hücre canlılığının azalması ve gen ekspresyonunun değişmesi ile ilişkilendirilmiştir34,35.

Bu protokol deneysel ihtiyaçlara göre uyarlanabilir. RNA polimeraz ve mRNA sentezinin bir inhibitörü olan flavopiridolün Çözelti 2 ve 3'e eklenmesi, RNA dizileme36 ile herhangi bir işleme ve strese bağlı artefaktı önlemeyi amaçlamaktadır. Bununla birlikte, PBMC'leri kullanan fonksiyonel veya ex vivo çalışmalar isteniyorsa, flavopiridol ihmal edilebilir.

EDTA tüplerinden toplanan plazma, bir kenetleme maddesi olan EDTA ile kontamine olacaktır. Sonuç olarak, EDTA plazması pıhtılaşma veya kalsiyum iyonları içeren testler için uygun değildir 37,38. İstenirse, santrifüjleme sonrası yoğunluk gradyanlı orta tüplerdeki plazma tabakası bunun yerine adım 1.4'te toplanabilir. Bu tüpler, antikoagülan olarak sodyum heparin içerir ve heparinaz39 ilavesiyle çıkarılabilir. Özellikle, heparin, ters transkriptaz ve PCR amplifikasyonunu inhibe eder, bu da toplanan plazmayı bir heparin bloke edici ajan40 eklenmeden PCR deneyleri için uygun hale getirmez.

EDTA tüplerinden toplanan buffy kaplama, DMSO veya flavopiridol içeren bir çözelti içinde saklanmaz. DMSO, buz kristali oluşumunu ve hücre ölümünü azaltmada önemlidir41. Flavopiridol, RNA sentezinin inhibisyonu için önemlidir36. Bu nedenle, buffy coat ex vivo ve transkriptomik analizler için uygun değildir. İstenirse, hücre canlılığını en üst düzeye çıkarmak ve RNA sentezini inhibe etmek için toplanan buffy coat kullanılarak 1.6 ila 1.15 arasındaki adımlar gerçekleştirilebilir.

Bu protokol RNA dizilemesi için tasarlanmış olsa da, bu protokol kullanılarak toplanan ve dondurularak saklanan PBMC'lerin ek potansiyel uygulamaları arasında hücre kültürü, gen düzenleme, ex-vivo fonksiyonel çalışmalar, tek hücre analizleri, akış sitometrisi veya uçuş zamanına göre sitometri ile fenotipleme, DNA/RNA veya proteinlerin izolasyonu, immünohistokimya için slaytlar ve diğerleri yer alır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek ilgili finansal veya finansal olmayan çıkarları yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rızalarını, zamanlarını ve kan örneklerini bağışlamalarını gönüllü olarak veren hastalara teşekkür ederiz. Ayrıca Kansas Üniversitesi Tıp Merkezi'nden Dr. Patrick Moriarty, Julie-Ann Dutton ve Mark McClellen'a işbirlikleri ve bu protokolü uzak bir yerde uyguladıkları için teşekkür ederiz. CY, NIH hibesi 1K08HL150271'den araştırma desteği aldı.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1000 ve mikro; L İpuçlarıGilsonF174501PBMC/Plazma/Buffy Coat Koleksiyonu için hasta/tedavi koşulu başına yaklaşık 3 uç
gerekir 15 mL tüpBiopioneeerCNT-15PBMC/Plazma/Buffy Coat Koleksiyonu için hasta/tedavi koşulu başına 2/3
2
gerekir 2 mL CryovialsGlobe Scientific3012PBMC/Plazma/Buffy Coat Collection 20 µ için hasta/tedavi koşulu başına yaklaşık 40 kriyovial gerekir
; L İpuçlarıGilsonF174201Hücre sayımında kullanım için; İhtiyaç duyulan hacim, kullanılan hücre sayımı yöntemine bağlıdır. Çözülecek 1 mL havuzlanmamış donmuş PBMC için 1 uç gereklidir
50 mL Konik TüpCEM Corporation50-187-7683PBMC/Plazma/Buffy Coat Koleksiyonu için hasta/tedavi koşulu başına 2 adet gereklidir
Çözülecek 1 mL havuzlanmamış donmuş PBMC başına 3 adet gerekir
CD14 AntikorBiyoefsanesi325621
CD16 AntikorBiyoefsanesi360723
CD19 AntikorBiyoefsanesi363007
CD3 AntikorBiyoefsanesi300405
CD56 AntikorBiyoefsanesi318303
CD66b AntikorBiyoefsanesi305103
Hücre SüzgeciBiopioneeerDGN258367Buzunun çözülmesi için 1 mL havuzlanmamış donmuş PBMC başına 1 adet gerekir
CPT Mononükleer Hücre Hazırlama TüpüBD Biosciences362753PBMC/Plazma/Buffy Coat Koleksiyonu için hasta/tedavi koşulu başına 6 tüp gerekir
Cryo Dondurucu Kutusu SouthernLabwareSB2CC-8181 tüp
tutar PBMC/Plazma/Buffy Coat Collection Cryotube
05-669-4550 kriyoviyal'e kadar
tutar DMSOInvitrogen15575020PBMC/Plazma/Buffy Coat Collection için hasta/tedavi koşulu başına yaklaşık 2,5 mL gerekir
DNase/RNaz İçermeyen Damıtılmış Suİnvitrojen10977015PBMC/Plazma/Buffy Coat Collection için hasta/tedavi durumu başına yaklaşık 2 mL gerekir
Çözülecek
1 mL donmuş PBMC başına yaklaşık 9 mL gerekirEDTA TüpleriBD Biosciences366643PBMC/Plazma/Buffy Coat Koleksiyonu için hasta/tedavi koşulu başına 1 tüp gerekir
FlavopiridolSigma-AldrichF3055-5MG
HLA-DR AntikorBiyoefsanesi307609
İnsan Serumu AlbüminiGeminiBio800-120PBMC/Plazma/Buffy Coat Koleksiyonu için hasta veya tedavi durumu başına yaklaşık 25 mL gerekir
İnsan Güveni FcXBiolegend422301
İzopropanolSigma-AldrichW292912-1KG-KMr. Frosty Etiket Yazıcısında kullanım için
PhomemoM110-WH
Canlı Ölü LekeBiyoefsanesi423105
Bay FrostyThermo Scientific5100-000118 tüpe kadar tutar.
PBMC/Plazma/Buffy Coat Collection Multidispense Pipet için hasta/tedavi durumu başına 2 Mr. Frostys gerekir
Brandtech705110
Çok Dağıtımlı Pipet UçlarıBrandtech705744PBMC/Plazma/Buffy Coat Koleksiyonu
için hasta/tedavi durumu başına yaklaşık 3 uç gerekirP20 PipetGilsonF144056MHücre sayımında kullanım için; ihtiyaç duyulan hacim, kullanılan hücre sayımı yöntemine bağlıdır.
Yazıcı EtiketleriPhomemoPM-M110-3020PBMC/Plazma/Buffy Coat Koleksiyonu için hasta/tedavi koşulu başına yaklaşık 45 etiket gerekir
Çözülecek 1 mL havuzlanmamış donmuş PBMC başına yaklaşık 5 etiket gerekir
RNaz İçermeyen EDTA (0,5 M)İnvitrojenAM9260GYaklaşık 40 &mikro; Çözülecek 1 mL donmuş PBMC başına L gerekir
RNaz İçermeyen PBS (10X)InvitrogenAM9625Çözülecek 1 mL donmuş PBMC başına yaklaşık 1 mL gerekir
RNasinPromegaN2111
RPMICorning10-040-CVPBMC/Plazma/Buffy Coat Toplama Transfer Pipetleri için hasta veya tedavi koşulu başına yaklaşık 80 mL gerekir
Fisherbrand13-711-7MPBMC/Plazma/Buffy Coat Toplama Tüpü Tutucu Endicott-Seymour için hasta/tedavi koşulu başına yaklaşık 5 gereklidir
14-781-1580 CPT/EDTA Tüpüne kadar
Rack Fisherbrand için hasta/tedavi koşulu başına 1 tüp gereklidir P1000 Pipet Gilson F144059M tutar

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mathew, J., Sankar, P., Varacallo, M. Physiology, Blood Plasma. , StatPearls Pubs. Treasure Island, Florida. (2018).
  2. Van Oost, B., Van Hien-Hagg, I. H., Timmermans, A. P., Sixma, J. J. The effect of thrombin on the density distribution of blood platelets: Detection of activated platelets in the circulation. Blood. 62 (2), 433-438 (1983).
  3. Hassani, M., et al. On the origin of low-density neutrophils. Journal of Leukocyte Biology. 107 (5), 809-818 (2020).
  4. Norouzi, N., Bhakta, H. C., Grover, W. H. Sorting cells by their density. PLOS ONE. 12 (7), e0180520(2017).
  5. Manzone, T. A., Dam, H. Q., Soltis, D., Sagar, V. V. Blood volume analysis: A new technique and new clinical interest reinvigorate a classic study. JNMT. 35 (2), 55-63 (2007).
  6. Kleiveland, C. R. The impact of food bioactives on health: In vitro and ex vivo models. , Springer. Cham. 161-167 (2015).
  7. Rosado, M., et al. Advances in biomarker detection: Alternative approaches for blood-based biomarker detection. Adv Clin Chem. 92, 141-199 (2019).
  8. Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. Multiple sclerosis: Methods and Protocols. 1304, Humana Press. New York, NY. 53-61 (2016).
  9. Panda, S. K., Ravindran, B. In vitro Culture of Human PBMCs. Bio Protoc. 3 (3), e322(2013).
  10. He, D., et al. Whole blood vs PBMC: Compartmental differences in gene expression profiling exemplified in asthma. Allergy Asthma Clinic Immol. 15, 67(2019).
  11. Pelák, O., et al. Lymphocyte enrichment using CD81-targeted immunoaffinity matrix. Cytometry Part A. 91 (1), 62-72 (2017).
  12. Higdon, L. E., et al. Impact on in-depth immunophenotyping of delay to peripheral blood processing. Clin Exp Immunol. 217 (2), 119-132 (2024).
  13. Liu, Z., et al. Photoactivatable aptamer-CRISPR nanodevice enables precise profiling of interferon-gamma release in humanized mice. ACS Nano. 18 (4), 3826-3838 (2024).
  14. Ren, Z., Li, C., Wang, J., Sui, J., Ma, Y. Single-cell transcriptome revealed dysregulated RNA-binding protein expression patterns and functions in human ankylosing spondylitis. Front Med. 11, 1369341(2024).
  15. Honardoost, M. A., et al. Systematic immune cell dysregulation and molecular subtypes revealed by single-cell-RNA-seq of subjects with type 1 diabetes. Genome Med. 16, 45(2024).
  16. Amini, A., Esmaeili, F., Golpich, M. Possible role of lncRNAs in amelioration of Parkinson's disease symptoms by transplantation of dopaminergic cells. NPJ Parkinsons Dis. 10, 56(2024).
  17. Luo, Y., et al. Sars-Cov-2 spike induces intestinal barrier dysfunction through the interaction between CEACAM5 and Galectin-9. Front Immunol. 15, e1303356(2024).
  18. Zhang, X., Wu, G., Ma, X., Cheng, L. Immune cell alterations and PI3k-PKB pathway suppression in patients with allergic rhinitis undergoing sublingual immunotherapy. Adv Ther. 41 (2), 777-791 (2024).
  19. Rucci, C., et al. Exploring mitochondrial DNA copy number in circulating cell-free DNA and extracellular vesicles across cardiovascular health status: A prospective case-control pilot study. FASEB J. 38 (10), e23672(2024).
  20. Ghamrawi, R., et al. Buffy coat DNA Methylation Profile is Representative of Methylation Patterns in White Blood Cell Types in Normal Pregnancy. Front Bioeng Biotechnol. 9, e782843(2022).
  21. Johansson, C., et al. Plasma biomarker profiles in autosomal dominant Alzheimer's disease. Brain. 146 (3), 1132-1140 (2023).
  22. Bonaterra-Pastra, A., et al. Comparison of plasma lipoprotein composition and function in cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease. Biomedicines. 9 (1), 72(2021).
  23. Green, M. R., Sambrook, J. Estimation of cell number by hemocytometry counting. Cold Spring Harb Protoc. (11), prot097980(2019).
  24. Cobo, I., et al. Monosodium urate crystals regulate a unique JNK-dependent macrophage metabolic and inflammatory response. Cell Rep. 38 (10), e110489(2022).
  25. Andrews, S. Fastqc: A quality control tool for high throughput sequence data. , http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2015).
  26. Corkum, C. P., et al. Immune cell subsets and their gene expression profiles from human PBMC isolated by Vacutainer Cell Preparation Tube (CPT™) and standard density gradient. BMC Immunology. 16, 48(2015).
  27. Golke, T., et al. Delays during PBMC isolation have a moderate effect on yield but severely compromise cell viability. Clin Chem Lab Med. 60 (5), 701-706 (2022).
  28. Fuss, I. J., Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Curr Protoc Immunol. 85 (1), 7.1.1-7.1.8 (2009).
  29. Faass, L., et al. Contribution of heptose metabolites and the cag pathogenicity island to the activation of monocytes/macrophages by Helicobacter Pylori. Front Immunol. 12, e632154(2021).
  30. Preobrazhensky, S. N., Bahler, D. W. Immunomagnetic bead separation of mononuclear cells from contaminating granulocytes in cryopreserved blood samples. Cryobiology. 59 (3), 366-368 (2009).
  31. Schenz, J., Obermaier, M., Uhle, S., Weigand, M. A., Uhle, F. Low-density granulocyte contamination from peripheral blood mononuclear cells of patients with sepsis and how to remove it - A technical report. Front Immunol. 12, e684119(2021).
  32. Tessema, B., Riemer, J., Sack, U., König, B. Cellular stress assay in peripheral blood mononuclear cells: factors influencing its results. Int J Mol Sci. 23 (21), 13118(2022).
  33. abc. Chen, X., Thibeault, S. 2013 35th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society (EMBC), , IEEE. 6228-6231 (2013).
  34. Yang, J., et al. The effects of storage temperature on PBMC gene expression. BMC Immunol. 17, 6(2016).
  35. Ticha, O., Moos, L., Bekeredjian-Ding, I. Effects of long-term cryopreservation of PBMC on recovery of B cell subpopulations. J Immunol Methods. 495, e113081(2021).
  36. Chao, S. -H., Price, D. H. Flavopiridol inactivates P-TEFb and blocks most RNA polymerase II transcription in vivo. J of Biol Chem. 276 (34), 31793-31799 (2001).
  37. Banfi, G., Salvagno, G. L., Lippi, G. The role of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) as in vitro anticoagulant for diagnostic purposes. Clin Chem Lab Med. 45 (5), 565-576 (2007).
  38. Mohri, M., Rezapoor, H. Effects of heparin, citrate, and EDTA on plasma biochemistry of sheep: Comparison with serum. Res Vet Sci. 86 (1), 111-114 (2009).
  39. Edwards, K., et al. Heparin-mediated PCR interference in SARS-CoV-2 assays and subsequent reversal with heparinase I. J Virol Methods. 327, 114944(2024).
  40. Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells. J Clin Lab Anal. 13 (3), 133-140 (1999).
  41. Yuan, Y., et al. Efficient long-term cryopreservation of pluripotent stem cells at -80  °C. Sci Rep. 6 (1), 34476(2016).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

PBMC zolasyonuYo unluk Gradyan Santrif jasyonuH cre KriyoprezervasyonuBuffy CoatEDTA PlazmaAk SitometrisiRNA DizilemeH cre Canl lMonosit Ay klama

İlgili makaleler