Bu protokol, aşağı akış analizleri ve akış sitometrisi ve RNA dizilimi gibi iş akışları için uygun periferik kan mononükleer hücrelerinin toplanması, saklanması ve çözülmesi için erişilebilir bir kılavuz sunar. Plazma ve buffy coat koleksiyonları da sergilenmektedir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Tam Kandan Yüksek Derecede Canlı İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinin İzolasyonu ve Dondurularak Saklanması: Yeni Başlayanlar İçin Bir Kılavuz
Bu makalede
Özet
Özet
Periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler), bağışıklık sistemi ve hastalık ve patojenlere tepkisi üzerine biyomedikal araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu ayrıntılı protokol, akış sitometrisi ve RNA dizilimi gibi aşağı akış uygulamaları için uygun olan tam kan hücrelerinden yüksek kaliteli ve yüksek derecede canlı PBMC'leri izole etmek, kriyopreservasyon ve çözmek için ekipmanı, malzemeleri ve adımları açıklar. Tam kandan plazma ve buffy coat için PBMC'lerle paralel ve eş zamanlı olarak işleme protokolleri de tanımlanmıştır. PBMC'leri izole etmek için yoğunluk gradyan santrifüjlemeyi kullanan, takip etmesi kolay adım adım protokole, malzeme, ekipman ve hazırlık adımlarından oluşan bir kontrol listesi eşlik eder. Bu protokol, laboratuvar teknikleri konusunda daha önce herhangi bir deneyimi olan kişiler için uygundur ve klinik veya araştırma laboratuvarlarında uygulanabilir. Yüksek kaliteli hücre canlılığı ve RNA dizilimi, bu protokolü kullanarak daha önce laboratuvar deneyimi olmayan operatörler tarafından toplanan PBMC'lerden kaynaklandı.
Giriş
Bu protokol, periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC'ler) tam kandan izolasyonu için erişilebilir bir yöntem ve iş akışı gösterir. Bu protokol, laboratuvar teknikleri konusunda önceden eğitim almadan PBMC'lerin toplanmasını ve dondurularak saklanmasını kolaylaştırmak amacıyla özellikle acemi araştırma teknisyenlerine, öğrencilere ve klinik laboratuvar personeline yöneliktir.
Bu protokol, tam kanın bileşenlerini yoğunluğa göre ayırmak için santrifüjlemeyi kullanır. Tam kan, azalan yoğunluk sırasına göre listelenen dört ana bileşenden oluşur: kırmızı kan hücreleri/eritrositler (hacm....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Çalışma protokolü UCSD ve KUMC İnsan Koruma Programı tarafından onaylanmıştır ve Helsinki Bildirgesi'ne uygundur. Tüm bireyler katılım ve kan alımı için bilgilendirilmiş onam verdi.
1. PBMC'lerin işlenmesi ve dondurularak saklanması
- Kan alımından bir gün önce, Tablo 2'de listelenen malzeme ve reaktiflerin kontrol listesini yazdırın ve buna göre hazırlayın ve etiketleyin.
NOT: Bu protokol, 6 yoğunluk gradyanlı santrifüj tüpünün toplanması için tasarlanmıştır. Her tüp yaklaşık 12 milyon PBMC verir ve bunların yaklaşık %50'si ve %20'si sırasıyla canlı lenfositler ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
PBMC toplama ve kriyoprezervasyonun ardından, 56 benzersiz numuneden çözülmüş PBMC'lerin, monositlerin ve lenfositlerin canlılığı, üreticilerin talimatlarına göre Tablo 4'te listelenen reaktifler kullanılarak akış sitometrisi ile değerlendirildi (Şekil 2A-F
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
PBMC toplama ve kriyoprezervasyon için bu protokol, önceden araştırma laboratuvarı eğitimi almış ve almamış kişiler tarafından başarıyla uygulanmıştır. Uygulamamızda, depolanmış PBMC'lerden saflaştırılan yüksek derecede canlı monositlerin FACS ve RNA dizilemesi, yüksek kaliteli dizilerle sonuçlandı.
Bu protokolün önemli bir gücü erişilebilirliğidir. Protokolde sunulan teknik, katı yoğunluklu gradyan bir ortamla önceden paketlenmiş tüpleri kullanır. Sonuç olara.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların ifşa edecek ilgili finansal veya finansal olmayan çıkarları yoktur.
Teşekkürler
Rızalarını, zamanlarını ve kan örneklerini bağışlamalarını gönüllü olarak veren hastalara teşekkür ederiz. Ayrıca Kansas Üniversitesi Tıp Merkezi'nden Dr. Patrick Moriarty, Julie-Ann Dutton ve Mark McClellen'a işbirlikleri ve bu protokolü uzak bir yerde uyguladıkları için teşekkür ederiz. CY, NIH hibesi 1K08HL150271'den araştırma desteği aldı.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1000 ve mikro; L İpuçları | Gilson | F174501 | PBMC/Plazma/Buffy Coat Koleksiyonu için hasta/tedavi koşulu başına yaklaşık 3 uç |
| gerekir 15 mL tüp | Biopioneeer | CNT-15 | PBMC/Plazma/Buffy Coat Koleksiyonu için hasta/tedavi koşulu başına 2/3 2 |
| gerekir 2 mL Cryovials | Globe Scientific | 3012 | PBMC/Plazma/Buffy Coat Collection 20 µ için hasta/tedavi koşulu başına yaklaşık 40 kriyovial gerekir |
| ; L İpuçları | Gilson | F174201 | Hücre sayımında kullanım için; İhtiyaç duyulan hacim, kullanılan hücre sayımı yöntemine bağlıdır. Çözülecek 1 mL havuzlanmamış donmuş PBMC için 1 uç gereklidir |
| 50 mL Konik Tüp | CEM Corporation | 50-187-7683 | PBMC/Plazma/Buffy Coat Koleksiyonu için hasta/tedavi koşulu başına 2 adet gereklidir Çözülecek 1 mL havuzlanmamış donmuş PBMC başına 3 adet gerekir |
| CD14 Antikor | Biyoefsanesi | 325621 | |
| CD16 Antikor | Biyoefsanesi | 360723 | |
| CD19 Antikor | Biyoefsanesi | 363007 | |
| CD3 Antikor | Biyoefsanesi | 300405 | |
| CD56 Antikor | Biyoefsanesi | 318303 | |
| CD66b Antikor | Biyoefsanesi | 305103 | |
| Hücre Süzgeci | Biopioneeer | DGN258367 | Buzunun çözülmesi için 1 mL havuzlanmamış donmuş PBMC başına 1 adet gerekir |
| CPT Mononükleer Hücre Hazırlama Tüpü | BD Biosciences | 362753 | PBMC/Plazma/Buffy Coat Koleksiyonu için hasta/tedavi koşulu başına 6 tüp gerekir |
| Cryo Dondurucu Kutusu Southern | Labware | SB2CC-81 | 81 tüp tutar PBMC/Plazma/Buffy Coat Collection Cryotube |
| 05-669-45 | 50 kriyoviyal'e kadar | ||
| tutar DMSO | Invitrogen | 15575020 | PBMC/Plazma/Buffy Coat Collection için hasta/tedavi koşulu başına yaklaşık 2,5 mL gerekir |
| DNase/RNaz İçermeyen Damıtılmış Su | İnvitrojen | 10977015 | PBMC/Plazma/Buffy Coat Collection için hasta/tedavi durumu başına yaklaşık 2 mL gerekir Çözülecek |
| 1 mL donmuş PBMC başına yaklaşık 9 mL gerekirEDTA Tüpleri | BD Biosciences | 366643 | PBMC/Plazma/Buffy Coat Koleksiyonu için hasta/tedavi koşulu başına 1 tüp gerekir |
| Flavopiridol | Sigma-Aldrich | F3055-5MG | |
| HLA-DR Antikor | Biyoefsanesi | 307609 | |
| İnsan Serumu Albümini | GeminiBio | 800-120 | PBMC/Plazma/Buffy Coat Koleksiyonu için hasta veya tedavi durumu başına yaklaşık 25 mL gerekir |
| İnsan Güveni FcX | Biolegend | 422301 | |
| İzopropanol | Sigma-Aldrich | W292912-1KG-K | Mr. Frosty Etiket Yazıcısında kullanım için |
| Phomemo | M110-WH | ||
| Canlı Ölü Leke | Biyoefsanesi | 423105 | |
| Bay Frosty | Thermo Scientific | 5100-0001 | 18 tüpe kadar tutar. PBMC/Plazma/Buffy Coat Collection Multidispense Pipet için hasta/tedavi durumu başına 2 Mr. Frostys gerekir |
| Brandtech | 705110 | ||
| Çok Dağıtımlı Pipet Uçları | Brandtech | 705744 | PBMC/Plazma/Buffy Coat Koleksiyonu |
| için hasta/tedavi durumu başına yaklaşık 3 uç gerekirP20 Pipet | Gilson | F144056M | Hücre sayımında kullanım için; ihtiyaç duyulan hacim, kullanılan hücre sayımı yöntemine bağlıdır. |
| Yazıcı Etiketleri | Phomemo | PM-M110-3020 | PBMC/Plazma/Buffy Coat Koleksiyonu için hasta/tedavi koşulu başına yaklaşık 45 etiket gerekir Çözülecek 1 mL havuzlanmamış donmuş PBMC başına yaklaşık 5 etiket gerekir |
| RNaz İçermeyen EDTA (0,5 M) | İnvitrojen | AM9260G | Yaklaşık 40 &mikro; Çözülecek 1 mL donmuş PBMC başına L gerekir |
| RNaz İçermeyen PBS (10X) | Invitrogen | AM9625 | Çözülecek 1 mL donmuş PBMC başına yaklaşık 1 mL gerekir |
| RNasin | Promega | N2111 | |
| RPMI | Corning | 10-040-CV | PBMC/Plazma/Buffy Coat Toplama Transfer Pipetleri için hasta veya tedavi koşulu başına yaklaşık 80 mL gerekir |
| Fisherbrand | 13-711-7M | PBMC/Plazma/Buffy Coat Toplama Tüpü Tutucu Endicott-Seymour için hasta/tedavi koşulu başına yaklaşık 5 gereklidir | |
| 14-781-15 | 80 CPT/EDTA Tüpüne kadar |
Kaynaklar
- Mathew, J., Sankar, P., Varacallo, M. Physiology, Blood Plasma. , StatPearls Pubs. Treasure Island, Florida. (2018).
- Van Oost, B., Van Hien-Hagg, I. H., Timmermans, A. P., Sixma, J. J. The effect of thrombin on the density distribution of blood platelets: Detection of activated platelets in the circulat....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
