Yöntem makalesi

Pluripotent Kök Hücre Farklılaşmasını İzlemek için Canlı Hücre Görüntü Tabanlı Makine Öğrenimi Stratejisi

1.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66823

⸱

4 Ekim 2024

 ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, Peking University, 2MOE Key Laboratory of Cell Proliferation and Differentiation, Peking University, 3Beijing Key Laboratory of Cardiometabolic Molecular Medicine, Institute of Molecular Medicine, College of Future Technology, Peking University, 4Academy for Advanced Interdisciplinary Studies, Peking University, 5College of Engineering, Peking University, 6Peking-Tsinghua Center for Life Sciences, Peking University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Mevcut pluripotent kök hücre (PSC)-fonksiyonel hücre farklılaşma sistemleri şu anda ciddi hattan hatta ve partiden partiye değişkenlik sorunları tarafından engellenmektedir. Burada, kardiyak farklılaşmayı ana örnek olarak kullanarak, görüntü tabanlı makine öğrenimine dayalı PSC farklılaşma sürecini akıllıca izlemek ve modüle etmek için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Pluripotent kök hücre (PSC) teknolojileri, ilaç keşfi, hastalık modellemesi ve rejeneratif tıpta yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, mevcut PSC'den fonksiyona hücre farklılaştırma sistemleri, ciddi hattan hatta ve partiden partiye değişkenlik sorunları tarafından engellenmektedir. Bu nedenle hücre farklılaşmasının gerçek zamanlı olarak hassas kontrolü önemlidir. Bu protokolde, parlak alan görüntü tabanlı makine öğrenimi kullanarak hücre farklılaşmasındaki değişkenliğin üstesinden gelen, invaziv olmayan ve akıllı bir strateji açıklıyoruz. PSC'den kardiyomiyosite farklılaşmayı örnek olarak alan bu metodoloji, ilk PSC durumunun kontrolü, farklılaşma koşullarına erken değerlendirme ve müdahale ve yanlış farklılaşmış hücre kontaminasyonunun ortadan kaldırılması için ayrıntılı bilgi sağlar ve birlikte PSC'lerden fonksiyonel hücrelere sürekli olarak yüksek kaliteli farklılaşmayı gerçekleştirir. Prensip olarak, bu strateji, hücre üretimini desteklemek ve hücre kaderi dönüşümü sırasındaki mekanizmaları daha iyi anlamamızı sağlamak için çok adımlı diğer hücre farklılaşması veya yeniden programlama sistemlerine genişletilebilir.

Giriş

Pluripotent kök hücreler (PSC'ler), in vitro olarak birçok hücre tipine farklılaşma konusunda olağanüstü bir yeteneğe sahiptir. Bu farklılaşmış fonksiyonel hücreler, tümü araştırma veya klinik uygulamalar için değerli olan hücre tedavisi, hastalık modellemesi ve ilaç geliştirme için kullanılabilir 1,2,3. Örneğin, PSC'leri kardiyomiyositlere (CM'ler) ayırmak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir4,5,6,7. Bu CM'ler, ilaçların kardiyotoksisite testi, kalp hastalığının modellenmesi ve hücre nakliiçin uygulanabilir 8,9,10,11.

Bununla birlikte, PSC'den terminal farklılaşmış hücrelere dönüşüm aşamalı bir süreçtir ve farklılaşma işlemi sırasında çoklu bozulmalar hücreleri farklı hücre kaderlerine götürebilir. PSC hatlarının farklı genetik geçmişleri ve epigenetik işaretleri, belirli bir soya farklılaşma potansiyelini etkiler 12,13,14,15; PSC pasajlarının sayısı ve birikmiş gen mutasyonları da PSC heterojenliğinin kaynaklarıdır; Farklı deneyciler tarafından kullanılan deneysel işlemlerdeki farklılıklar da tamamen farklı farklılaşma sonuçlarına yol açabilir 16,17,18,19,20. Bu nedenle, şu anda PSC'den türetilmiş hücre üretimindeki ana sorunlardan biri, hücre hatları ve partileri arasındaki kararsızlıktır 21,22,23,24,25. PSC farklılaşmasındaki kararsızlık genellikle önemli ölçüde zaman ve emek kaynakları tüketen çok sayıda tekrarlanan deneye yol açar. Bu sorunu ele almak için, hücre hatları ve partileri arasındaki değişkenliği en aza indiren ve böylece farklılaşmanın kararlılığını ve sağlamlığını artıran bir strateji geliştirmek çok önemlidir.

Son zamanlarda, yüksek çözünürlüklü mikroskopi ve makine öğrenimindeki (ML) gelişmeler, hücre biyolojisinde makine öğrenimi tabanlı kantitatif görüntü analizinin uygulanmasını kolaylaştırarak, hücre görüntüleme özelliklerinde değerli bilgilerin kullanılmasını mümkün kılmıştır 26,27,28,29,30,31,32,33,34. Önceki çalışmamızda, PSC farklılaşmasının kararlılığını ve verimliliğini artırmak için PSC farklılaşma durumunu gerçek zamanlı olarak izlemek ve müdahale etmek için canlı hücre görüntü tabanlı bir makine öğrenimi stratejisi önerdik (Şekil 1)35. PSC'den kardiyomiyosit farklılaşmasını örnek alarak, rastgele orman modelleri kullanarak ilk PSC durumunu değerlendirdik, lojistik regresyon modellerini kullanarak optimal farklılaşma durumunu tahmin ettik ve derin öğrenme tabanlı Grad-CAM36 ve pix2pix37 kullanarak başarıyla farklılaşmış hücreleri tanıdık. Makine öğrenimi modelleri, alan, çevre, dışbükeylik, katılık, parlaklık, hareket hızı ve derin evrişimli sinir ağları tarafından çıkarılan diğer örtük özellikler dahil olmak üzere bir dizi parlak alan morfolojik özelliğinden hücre soylarını tanımlamayı öğrendi. Bu yerleşik makine öğrenimi modellerinden elde edilen çıkarımlara dayanarak, ilk PSC durumunun kontrolünü, farklılaşma koşullarında erken değerlendirme ve müdahaleyi ve yanlış farklılaşmış hücre kontaminasyonunun ortadan kaldırılmasını gerçekleştirdik ve birlikte kardiyak farklılaşma sürecinin kapsamlı ve doğru bir modülasyonunu sağladık. Burada stratejiyi geliştirmek için adım adım bir protokol sunuyoruz.

Protokol

1. Hücre farklılaşması ve karakterizasyonu

  1. Kültür reaktiflerinin ve kültür plakalarının hazırlanması
    1. 48 mL bazal ortama 2 mL takviye ve% 0.2 Penisilin-Streptomisin ekleyerek PSC kültür ortamını hazırlayın. Eki alın ve -20 °C'de saklayın. Bu ortamı 4 °C'de 4 haftaya kadar saklayın.
    2. 500 mL bazal ortama 1 mL takviye ve% 0.2 Penisilin-Streptomisin ekleyerek PSC hazırlama ortamını hazırlayın. Kullanırken, ortamı bir kerelik kullanım için önceden ısıtın ve ortamı 4 °C'de 3 haftaya kadar saklayın.
    3. RPMI 1640'a 1x B27 takviyesi eksi insülin ve% 1 Penisilin-Streptomisin ekleyerek CM farklılaşma ortamını hazırlayın. RPMI 1640'a 1x B27 takviyesi ve% 1 Penisilin-Streptomisin ekleyerek CM bakım ortamını hazırlayın. Bu iki tür besiyerini 4 °C'de 2 hafta saklayın.
    4. Matrigel'i buza batırın ve gece boyunca 4 °C'de tutun. Matrigel'in tamamen çözüldüğünden emin olun; daha sonra, daha sonra kullanmak üzere -80 ° C'de saklanan 1 mL alikotlara alikot yapın ve Matrigel çalışma çözeltisini hazırlamak için 4 ° C'de 49 mL DMEM / F12'ye 1 mL Matrigel ekleyin. 6 oyuklu bir kültür plakasının oyuğu başına 850 μL bu Matrigel çalışma solüsyonunu ekleyin ve plakayı 37 °C'de en az 30 dakika inkübe edin. CM farklılaşmasında kullanılan 96 oyuklu kültür plakası için, oyuk başına 35 μL Matrigel çalışma çözeltisi ekleyin.
      NOT: Matrigel'i her zaman buz üzerinde tutun; pipet uçları ve tüpleri 4 °C'de önceden soğutulmalıdır. Matrigel çalışma solüsyonu 4 ° C'de 2 hafta saklanabilir. Matrigel çalışma solüsyonunu pipetlerken kabarcıklardan kaçınma konusunda dikkatli olun.
  2. PSC bakımı ve geçişi
    1. PSC'leri 6 oyuklu kültür plakalarında tutun. Hücre yoğunluğunu mikroskop altında onaylayın ve birleşme ~p'e ulaştığında geçişe hazırlanın (Şekil 2A).
    2. Hücreleri pas geçmek üzere sindirmek için EDTA kullanın. PSC kültür ortamını, PBS'yi ve EDTA'yı 37 ° C'lik bir su banyosunda ısıtın ve ortama 27632 μM'lik bir nihai konsantrasyona kadar Y5 ekleyin.
    3. PSC'leri 1 mL PBS ile yıkayın, oyuk başına 1 mL EDTA ekleyin ve plakayı 37 ° C'lik bir inkübatörde 3 dakika inkübe edin.
    4. Hücreler kültür plakasından ayrılmadan önce EDTA'yı aspire edin, ardından hücreleri yeniden süspanse etmek için kuyu 3-4x'in tabanını nazikçe durulamak için 1 mL PSC kültür ortamını kullanın.
      NOT: Bu, santrifüjleme adımını atlamamıza ve geçiş işlemlerinde hücre hasarını azaltmamıza olanak tanır.
    5. DMEM / F12'yi 6 oyuklu bir kültür plakasının Matrigel kaplı bir kuyusundan aspire edin ve oyuk başına 2 mL taze PSC kültür ortamı ekleyin (Y27632 eklendi). Hücre süspansiyonunu 1:6 ila 1:12 bölme oranıyla kuyucuklara ekleyin. Plakayı %5 CO2 içeren 37 °C inkübatöre yerleştirin.
    6. PSC kültür ortamını (Y27632 olmadan) geçtikten 12 ila 24 saat sonra değiştirin; Ardından, ortamı değiştirin ve hücre durumunu ve birleşmesini her gün kontrol edin.
  3. PSC'lerin Kardiyak Farklılaşması
    1. CM farklılaşması için, PSC'leri PSC hazırlama ortamında (Y27632 eklendi) 96 oyuklu bir kültür plakasına tohumlayın. CM farklılaşması için, PSC'leri PSC hazırlama ortamında (Y27632 eklendi) 96 oyuklu bir kültür plakasına tohumlamak için yukarıdaki adımların aynısını izleyin (adım 1.2.2-1.2.6).
      NOT: Bu aşamada, EDTA tedavi süresi, PSC'leri yeterince ayırmak için uygun şekilde uzatılabilir (5 dakika veya daha fazla), böylece klonlar geçişten sonra daha küçük olabilir. Çalışmamız, aynı alan içinde daha küçük kolonilerin farklılaşmaya elverişli olduğunu göstermiştir.







    2. figure-protocol-1figure-protocol-2










    8. figure-protocol-3figure-protocol-4figure-protocol-5














Sonuçlar

Parlak alan görüntüleme ve makine öğrenimine dayalı olarak, genel farklılaşma süreci akıllı bir şekilde izlenebilir ve optimize edilebilir. PSC aşamasında, farklılaşmayı başlatmak için en uygun veya uygun zaman noktasını belirlemek için ilk PSC kolonilerinin morfolojik özelliklerine göre nihai farklılaşma verimliliğini tahmin edebilen bir makine öğrenimi modeli geliştirdik (Şekil 4A,B). Rastgele orman modeli tarafından tahmin edilen farklılaşma verimliliği, gerçek farklılaşma verimliliği ile yüksek oranda ilişkilidir (Pearson'ın r = 0.76, P < 0.0001) (Şekil 4B). Eğitilen model, farklılaşma için en önemli olan özellikleri de vurgular. Tüm koloni morfolojik özellikleri arasında, merkez kontur mesafelerinin (CCD) standart sapması, minimum ve min/maks oranı ile çevre, alan, alan/çevre oranı, dışbükeylik ve dairesellik en önemli ağırlığa sahip 8 özelliktir. Bu özellikler ve nihai verimlilik arasındaki ilişki, orta alana ve daha uzun, düzensiz periferilere sahip ilk PSC kolonilerinin daha yüksek farklılaşma verimliliğine sahip olma eğiliminde olduğunu göstermektedir (Şekil 4A), bu da bize daha uzun, daha düzensiz sınırlara sahip daha küçük koloniler elde etmek için sindirim çözeltisinin işlem süresini artırarak farklılaşma verimliliğini artırmamız için ilham vermektedir (bakınız Protokol adımı 1.3.1). PSC kolonilerinin makine öğrenimi tabanlı izlenmesi ve optimize edilmiş hücre pasaj işlemleri, ilk hücre durumunun optimizasyonunu gerçekleştirir.

figure-results-1

figure-results-2

figure-results-3

figure-results-4

figure-results-5






















Tartışma

Burada, mevcut PSC uygulaması ve çevirisindeki en büyük sorunlardan biri olan hücre farklılaşmasındaki değişkenliğin üstesinden gelmek için ayrıntılı bir protokol tanımladık. Canlı hücreli parlak alan görüntüleme ve makine öğreniminden yararlanarak, hücre hatları ve partiler arasında tutarlı bir şekilde yüksek verimlilik elde etmek için PSC farklılaşmasını yinelemeli olarak optimize ettik. Bununla birlikte, yukarıdaki farklılaşma sürecinde, protokoldeki birkaç kritik adım, farklılaşmanın başarılı olup olmayacağı üzerinde belirleyici bir etkiye sahiptir. PSC evresi ve evre I'deki hücre durumu çok önemli olduğundan, deneycilerin erken hücre morfolojisine, 0. günde hücre birleşmesine ve CHIR tedavisinin koşullarına özel dikkat göstermeleri gerekir. Ek olarak, deneyciler 0-48 saat boyunca CHIR dozunu modüle ederken orijinal ortamı korumaya ve hücre kültürü ortamının hacmini değiştirmeden tutmaya çalışmalıdır. Ek olarak, fotoğraflama ve saflaştırma sürecinde fototoksisite dikkate alınmalıdır. Floresan görüntüleme yerine parlak alan görüntülemesi seçilerek hücre hasarı azaltılabilir; bu nedenle, hedef hücreler yerine istenmeyen hücreleri fotoaktif hale getirmek için UV de kullandık. Ayrıca, görüntü bilgisine dayalı olarak yukarıda anlattığımız saflaştırma adımları zahmetlidir ve çok sayıda görüntü tahmini, bölgesel fotoaktivasyon, akış ve geçiş adımından geçmesi gerekir, bu da çok sayıda hücrenin saflaştırılmasını gerçekleştirmeyi zorlaştırır. Hücre geçiş adımına olan ihtiyacı ortadan kaldıran, bölge tarafından seçilen diğer hücre öldürme cihazları mevcutsa, yerinde saflaştırma düşünülebilir.

Bununla birlikte, farklılaşma sürecini modüle etmek için makine öğrenimi uygulanırken birkaç husus da göz önünde bulundurulmalıdır. Veri kümelerinin kalitesi ve modellerin ve hiperparametrelerin seçimi, makine öğreniminin performansı üzerinde büyük bir etkiye sahiptir. Özel uygulamamızın tüm farklılaşma sistemleri ve hücre tipleri için optimal olacağı garanti edilmez; bu nedenle, deneyimli makine öğrenimi mühendisleri uygulamayı kendi ihtiyaçlarına göre özelleştirmelidir. Makine öğrenimi modellerini eğitirken ve test ederken, test performansı eğitim performansının çok gerisinde kalırsa, model aşırı sığabilir; Bu durumda, eğitim kümelerini zenginleştirmeyi ve modeli yeniden eğitmeyi deneyin. Model, eğitim setinde bile iyi performans gösteremiyorsa, veri setini inceleyin ve hedef hücrelerin özelliğinin kolayca tanımlanabildiğinden emin olun. Hiper parametrelerin ayarlanması da yardımcı olabilir. Ayrıca, makine öğrenimi modellerini pratik senaryolarda uygularken, mikroskop ve görüntüleme parametrelerinin model eğitimi sırasındakilerle aynı olduğundan emin olun; aksi takdirde, eğitilen ML modellerinin performansı düşecektir. Görüntüleme koşullarının değişmesi kaçınılmazsa, yeni koşullardan etiketli veriler alın ve makine öğrenimi modellerini yeniden eğitin veya ince ayar yapın. Son olarak, makine öğrenimi yardımından sonra hücre farklılaşması başarısız kalırsa, PSC hattının doğal farklılaşma eğilimi veya deneysel reaktiflerdeki parti farklılıkları gibi hususların dikkate alınması gerekir, bu daha temel olabilir ve stratejimiz kullanılarak ele alınamaz. Olası sorunların belirlenmesine ve çözülmesine yardımcı olmak için bir sorun giderme kılavuzu dahildir (Tablo 1).

Bu metodoloji, diğer hücre araştırma alanlarında da uygulanma potansiyeline sahiptir. Değişkenlik, PSC ile farklılaşmış nöronlar, hepatositler, adacıklar ve bağırsaklar40,41,42,43,44 gibi PSC farklılaşma sürecinde yaygın olarak bulunur ve büyük ölçekli hücre üretimini ciddi şekilde tehlikeye atar. Bununla birlikte, hücreler genellikle hücre kaderi geçişleri sırasında zengin ve çeşitli morfolojik özellikler içerir ve bu da görüntü tabanlı makine öğrenimi kullanarak farklılaşma sürecini modüle etmek için ipuçları sağlar. Renal progenitör hücre ve hepatosit farklılaşma sistemleri için stratejinin uygulanmasının değerini daha önce göstermiştik35. Bu yöntem, organoid farklılaşması, doğrudan transdiferansiyasyon veya hücre yeniden programlama gibi diğer hücre kaderi indüksiyon sistemlerini, özellikle çoklu adımlar ve karmaşık indükleyiciler gerektiren kararsız sistemler için standartlaştırmak için uygulanabilir.

Açıklamalar

Yang Zhao, Jue Zhang, Xiaochun Yang, Yao Wang ve Daichao Chen, bu belgede (202210525166.X) bildirilen PSC farklılaşma stratejisi için bir patent başvurusunda bulunuyorlar.

Teşekkürler

Bu stratejinin temelini attıkları için Qiushi Sun, Yao Wang, Yu Xia, Jinyu Yang, Chang Lin, Zimu Cen, Dongdong Liang, Rong Wei, Ze Xu, Guangyin Xi, Gang Xue, Can Ye, Li-Peng Wang, Peng Zou, Shi-Qiang Wang, Pablo Rivera-Fuentes, Salome Püntener, Zhixing Chen, Yi Liu ve Jue Zhang'a teşekkür ederiz. Bu çalışma, Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2018YFA0800504, 2019YFA0110000) ve Çin İnsanlı Uzay Programı (HYZHXM01020) Uzay Tıbbi Deney Projesi tarafından Yang Zhao'ya desteklenmiştir. Şekil 1 , BioRender.com ile oluşturulmuştur.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%0.25 Tripsin-EDTAGibco25200056CPC ve CM sindirimi için seyreltilmiş digestler kullanıldı
KeyGEN BioTECH'te%4 ParaformaldehitKGIHC016
6 Kuyulu Hücre Kültürü PlakasıNEST703001
96 Kuyulu Hücre Kültürü PlakasıNEST701001
B27 TakviyesiGibco17504044
B27 Takviyesi Eksi İnsülinGibcoA1895601
Sığır serum albümini (BSA)GPC BIOTECHAA904-100G
Selleck SelleckS1263
DMEM/F12Gibco
Eşek anti-Fare IgG (H + L) Yüksek Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 488ThermoA-21202İkincil Antikor
FACSAria IIIBD BiosciencesAkış sitometrisi sıralayıcı
Fetal Sığır Serumu (FBS)VISTECHSE100-B
Hoechst 33342YEASEN40732ES03
İnsan Pluripotent Kök Hücre Kimyasal Tanımlı OrtamCauliscell Inc400105PSC hazırlama ortamının bazal ortamı
iPS-18TaKaRaY00300
iPS-B1CellapyCA4025106
iPS-FNuwacellRC01001-B
iPS-MNuwacellRC01001-A
IWR1-1-endoSelleckS7086IWR1
Jupyter NotebookN/ ASürüm 6.4.0https://jupyter.org/
>MATLABMathWorksSürüm R2020aBilimsel hesaplama ve görüntü açıklaması için yazılım
Matrigel MatrixCorning354230Matrigel
Fare monoklonal IgG1 anti-cTnTThermoMA5-12960cTnT birincil antikor
Normal Eşek SerumJackson017-000-121
ORCA-Flash 4.0 V3 dijital CMOS kameraHamamatsuC13440-20CUCelldiscoverer7
PBSNEB21-040-CVR
Penisilin-StreptomisinGibco15140-122
Pluripotency Growth Mater 1 bazal ortaCellapyCA1007500-1PSC bazal ortamı kültür ortamı
Pluripotency Growth Mater 1 takviyesiCellapyCA1007500-2PSC kültür ortamının takviyesi
PrismGraphpadSürüm 8/9İstatistiksel analiz ve çizim için istatistiksel yazılım
PythonN/Asürüm 3.6Python 3 ortamı, bilimsel hesaplama için pytorch (1.9.0), numpy, scipy, pandas, visdom, scikit-learn, scikit-image, Bilimsel hesaplama ve görüntü açıklaması için opencv-python ve matplotlib yazılımı.
RPMI 1640Gibco11875176
Takviyesi hPSC-CDM (500x)Cauliscell Inc00015PSC hazırlama ortamı
TiENikon'unBölge selevtifi saflaştırma için ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu (modifikasyonlu)
Triton  X-100Amresco9002-93-1
Versene ÇözeltisiPSC sindirimi içinThermo15040066
Y27632SelleckS6390
ZenZeissSürüm 3.1Görüntü elde etme, işleme ve analiz için Celldiscoverer7'nin destekleyici bir yazılımı
PBS Celldiscoverer 7 CHIR99021 farklılaşma ve son cTnT görüntüleri boyunca parlak alan görüntüleri almak için kullanılan Zeiss Aletleri 12634010 takviyesi EDTA çözümü

Kaynaklar

  1. Yoshida, Y., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells 10 years later: for cardiac applications. Circ Res. 120 (12), 1958-1968 (2017).
  2. Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nat Rev Drug Discov. 16 (2), 115-130 (2017).
  3. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  4. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  5. Mordwinkin, N. M., Burridge, P. W., Wu, J. C. A review of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for high-throughput drug discovery, cardiotoxicity screening, and publication standards. J Cardiovasc Transl Res. 6 (1), 22-30 (2013).
  6. Vanden Berg, C. W., Elliott, D. A., Braam, S. R., Mummery, C. L., Davis, R. P. Differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes under defined conditions. Methods Mol Biol. 1353, 163-180 (2016).
  7. Burridge, P. W., Holmström, A., Wu, J. C. Chemically defined culture and cardiomyocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Curr Protoc Hum Genet. 87, 1-15 (2015).
  8. Li, J., et al. Human pluripotent stem cell-derived cardiac tissue-like constructs for repairing the infarcted myocardium. Stem Cell Rep. 9 (5), 1546-1559 (2017).
  9. Smith, A. S. T., Macadangdang, J., Leung, W., Laflamme, M. A., Kim, D. -H. Human iPSC-derived cardiomyocytes and tissue engineering strategies for disease modeling and drug screening. Biotechnol Adv. 35 (1), 77-94 (2017).
  10. Sharma, A., et al. Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to assess drug cardiotoxicity. Nat Protoc. 13 (12), 3018-3041 (2018).
  11. Mehta, A., et al. Identification of a targeted and testable antiarrhythmic therapy for long-QT syndrome type 2 using a patient-specific cellular model. Eur Heart J. 39 (16), 1446-1455 (2018).
  12. Cahan, P., Daley, G. Q. Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (6), 357-368 (2013).
  13. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  14. Rouhani, F., et al. Genetic background drives transcriptional variation in human induced pluripotent stem cells. PLoS Genet. 10 (6), e1004432(2014).
  15. Kim, K., et al. Donor cell type can influence the epigenome and differentiation potential of human induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29 (12), 1117-1119 (2011).
  16. Garitaonandia, I., et al. Increased risk of genetic and epigenetic instability in human embryonic stem cells associated with specific culture conditions. PLoS One. 10 (2), e0118307(2015).
  17. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  18. Matoba, N., Yamashita, T., Takayama, K., Sakurai, F., Mizuguchi, H. Optimal human iPS cell culture method for efficient hepatic differentiation. Differentiation. 104, 13-21 (2018).
  19. Volpato, V., et al. Reproducibility of molecular phenotypes after long-term differentiation to human iPSC-derived neurons: A multi-site omics study. Stem Cell Rep. 11 (4), 897-911 (2018).
  20. Anderson, N. C., et al. Balancing serendipity and reproducibility: Pluripotent stem cells as experimental systems for intellectual and developmental disorders. Stem Cell Rep. 16 (6), 1446-1457 (2021).
  21. Sepac, A., et al. Comparison of cardiomyogenic potential among human ESC and iPSC lines. Cell Transplant. 21 (11), 2523-2530 (2012).
  22. Laco, F., et al. Unraveling the inconsistencies of cardiac differentiation efficiency induced by the GSK3β inhibitor CHIR99021 in human pluripotent stem cells. Stem Cell Rep. 10 (6), 1851-1866 (2018).
  23. Volpato, V., Webber, C. Addressing variability in iPSC-derived models of human disease: guidelines to promote reproducibility. Dis Model Mech. 13 (1), 042317(2020).
  24. Hu, B. -Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (9), 4335-4340 (2010).
  25. Huo, J., et al. Evaluation of batch variations in induced pluripotent stem cell-derived human cardiomyocytes from 2 major suppliers. Toxicol Sci. 156 (1), 25-38 (2017).
  26. Rostam, H. M., Reynolds, P. M., Alexander, M. R., Gadegaard, N., Ghaemmaghami, A. M. Image based machine learning for identification of macrophage subsets. Sci Rep. 7 (1), 3521(2017).
  27. Christiansen, E. M., et al. In silico labeling: Predicting fluorescent labels in unlabeled images. Cell. 173 (3), 792-803 (2018).
  28. Buggenthin, F., et al. Prospective identification of hematopoietic lineage choice by deep learning. Nat Methods. 14 (4), 403-406 (2017).
  29. Smith, Z. D., Nachman, I., Regev, A., Meissner, A. Dynamic single-cell imaging of direct reprogramming reveals an early specifying event. Nat Biotechnol. 28 (5), 521-526 (2010).
  30. Fan, K., Zhang, S., Zhang, Y., Lu, J., Holcombe, M., Zhang, X. A machine learning assisted, label-free, non-invasive approach for somatic reprogramming in induced pluripotent stem cell colony formation detection and prediction. Sci Rep. 7 (1), 13496(2017).
  31. Kusumoto, D., et al. Automated deep learning-based system to identify endothelial cells derived from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rep. 10 (6), 1687-1695 (2018).
  32. Zhu, Y., et al. Deep learning-based predictive identification of neural stem cell differentiation. Nat Commun. 12 (1), 2614(2021).
  33. Qian, T., et al. Label-free imaging for quality control of cardiomyocyte differentiation. Nat Commun. 12 (1), 4580(2021).
  34. Ounkomol, C., Seshamani, S., Maleckar, M. M., Collman, F., Johnson, G. R. Label-free prediction of three-dimensional fluorescence images from transmitted-light microscopy. Nat Methods. 15 (11), 917-920 (2018).
  35. Yang, X., et al. A live-cell image-based machine learning strategy for reducing variability in PSC differentiation systems. Cell Discovery. 9 (1), 53(2023).
  36. Selvaraju, R. R., et al. Grad-CAM: Visual explanations from deep networks via gradient-based localization. Proc IEEE Int Conf Computer Vision (ICCV). , 618-626 (2017).
  37. Isola, P., Zhu, J. -Y., Zhou, T., Efros, A. A. Image-to-image translation with conditional adversarial networks. Proc IEEE Conf Computer Vision Pattern Recognition (CVPR). , 5967-5976 (2017).
  38. Zhang, H., et al. ResNeSt: Split-attention networks. Proc IEEE/CVF Conf Computer Vision Pattern Recognition Workshops (CVPRW). , 2735-2745 (2022).
  39. Halabi, E. A., et al. Dual-activatable cell tracker for controlled and prolonged single-cell labeling). ACS Chem. Biol. 15 (6), 1613-1620 (2020).
  40. Hannan, N. R. F., Segeritz, C. -P., Touboul, T., Vallier, L. Production of hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 8 (2), 430-437 (2013).
  41. Zhang, H., Shen, M., Wu, J. C. Generation of quiescent cardiac fibroblasts derived from human induced pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. 2454, 109-115 (2022).
  42. Harding, M. J., McGraw, H. F., Nechiporuk, A. The roles and regulation of multicellular rosette structures during morphogenesis. Development. 141 (13), 2549-2558 (2014).
  43. Najm, F. J., et al. Rapid and robust generation of functional oligodendrocyte progenitor cells from epiblast stem cells. Nat Methods. 8 (11), 957-962 (2011).
  44. Hogrebe, N. J., Maxwell, K. G., Augsornworawat, P., Millman, J. R. Generation of insulin-producing pancreatic β cells from multiple human stem cell lines. Nat Protoc. 16 (9), 4109-4143 (2021).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Pluripotent K k H crelerCanl H cre G r nt lemeBright Field G r nt lemeH cre Kader D n mKardiyomiyosit DiferansiyasyonuG r nt Tabanl AnalizH cre Hatt De i kenli iY ksek z n rl kl G r nt leme
Pluripotent Kök Hücre Farklılaşmasını İzlemek için Canlı Hücre Görüntü Tabanlı Makine Öğrenimi Stratejisi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.